CN104164372B - 一种长孢洛德酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长孢洛德酵母及其应用，属微生物应用技术领域。本发明的菌株分类命名为长孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus OF‑08；于2012年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6645。OF‑08菌株的生理生化特征及26S rDNA基因序列(此序列在GeneBank数据库中的序列号为JQ916053)是鉴别该菌株的主要特征依据。喷施该菌株制剂可以使烟叶香气品质、还原糖含量增加,使蛋白质、纤维素、总氮、烟碱含量下降。因而，糖氮比、糖碱比和氮碱比的比值趋于上升,使化学品质更为协调，烟叶评吸品质得到提升。
Description
技术领域
本发明属于应用微生物技术领域，更具体说，本发明涉及一种能提高烤烟品质的长孢洛德酵母。同时，本发明还涉及所述的长孢洛德酵母在烟草生产中的用途。
背景技术
烟草是我国财政的重要支柱之一。近二十年来，每年烟草税收占国家财政收入的10％左右，对我国的社会和经济发展作出了巨大贡献。要推进我国烟草进程，实现卷烟工业可持续发展，就必须走烟草科技创新之路。国家烟草专卖局在“十一五”中国卷烟科技发展纲要第7条明确指出,要“攻克影响烟叶香气质、香气量的关键技术”，缩小与国外烟叶质量差距,以提高国内外市场竞争力。
烟叶发酵是烟草加工过程中的主要工艺环节。改进烟叶发酵技术，增进烟叶的香吃味质量，已成为卷烟工业提高加工工艺技术水平的重要手段。特别是在醇化发酵过程中,烟叶主要化学成分会发生相应的变化,青杂气和刺激性逐渐降低,香气显露,吃味醇和,色泽均匀并加深，故而烟叶醇化在卷烟工业中对烟叶质量的改变起着非常重要的作用。
研究表明，烟草中存在大量的微生物群落,包括细菌、放线菌、真菌和酵母等,其中以细菌为主，且芽孢杆菌属是优势菌属。烟叶中的微生物种类、数量不仅因不同烟草品种和不同时期而有所不同，而且与醇化条件和醇化效果密切相关。微生物的作用贯穿烟草发酵、醇化的始终，对改善烟叶品质起着重要的作用。
国内外烟草工作者在烟草微生物分离和利用微生物发酵改善烟草品质、改进烟叶发酵进程、缩短烟叶发酵周期等方面做了很多工作,特别是通过施加选育的微生物及制剂于烟草中,通过微生物的代谢活动降低烟碱等有害成分,增加烟草香吃味,提高烟草质量等。
目前，关于添加微生物提高烟叶品质的研究已有报道。但经文献检索，尚未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，从烟叶表面筛选具有工业化生产前景的菌株，提供一种能提高烤烟品质的长孢洛德酵母。
本发明的目的还在于提供一种所述长孢洛德酵母在烟草生产中的应用，即提供一种能有效提高烤烟品质的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
A.本发明从烤烟新鲜烟叶中分离了一株优势微生物OF-08作为试验菌种，对其进行了26S rDNA分析，鉴定结果表明该细菌属于长孢洛德酵母，其分类命名为Lodderomyces elongisporus.OF-08，保藏号为CGMCCNo.6645。
本发明所述的长孢洛德酵母OF-08(L.elongisporus OF-08)菌株的形态学特征为：菌落较大，呈卵球形，奶白色凸起，菌落比较粗糙，边缘整齐；在液体培养基中，培养液澄清有沉淀，且有菌蹼。
本发明所述的长孢洛德酵母OF-08的分子鉴定特征为：利用通用引物NL-1(5'CATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 3')和NL-4(5'GGTCCGTGTTTCAAGACGG3')，以长孢洛德酵母OF-08的基因组DNA作为模板扩增得到600 bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的OF-08菌株的部分26S rDNA基因序列578bp,该序列已经提交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列索引号为：JQ916053。
本发明提供了一种长孢洛德酵母制剂，该制剂按常规方法制备，即将长孢洛德酵母OF-08(L.elongisporus OF-08)扩大发酵培养后制成菌剂。
B.本发明还提供了一种所述长孢洛德酵母在烟草生产中的应用，即所述长孢洛德酵母提高烤烟品质的方法。其具体作法如下：
称取预先平衡水分至13％的烟丝，喷施长孢洛德酵母OF-08(L.elongisporus OF-08)菌剂，以烟丝重量计，每100克烟丝喷施菌剂量为15～30mL，然后将处理后的烟丝放入22℃，60％的恒温恒湿箱内发酵24h，即可。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1.试验数据表明，所述的长孢洛德酵母能有效提高烤烟品质和增加烟叶香气。本发明成功地将生物技术引入烟草生产中，是烟草生产技术的一个重要突破；
2.通过改善烟叶品质，大大提高烟叶可用性。加速烟叶发酵，提高烟叶等级质量。使烟叶可溶性还原糖含量增加；而蛋白质、纤维素、总氮、烟碱含量下降。因而糖氮比、糖碱比和氮碱比的比值趋于上升,使化学品质更为协调，烟叶评吸品质得到明显提升。
3.工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，对促进卷烟工业健康发展具有积极意义。
保藏生物材料的说明
本发明的菌株，已于2012年10月08日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG)；该中心地址：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。该菌株分类命名为长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus).OF-08；保藏号为CGMCC No.6645。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
——试验烟叶样品的采集
本研究所用的烟叶样品均采自红云烟草(集团)有限公司原料部烟叶醇化车间，烟叶的具体情况见表1。
表1.供试烟叶样品
——长孢洛德酵母OF-08(L.elongisporus OF-08)的培养方法。
1)试管斜面培养
采用Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(YPD)培养基，配方为(克/升，g/v)：20克蛋白胨，20克葡萄糖，10克酵母提取物，20克琼脂，蒸馏水定容到1000毫升。121℃灭菌25分钟，摆成斜面。接种L.elongisporus OF-08，28℃培养24小时，获得试管种。
2)菌剂的制备
A.种子培养(YPD培养基)，配方为(克/升，g/v)：20克蛋白胨，20克葡萄糖，10克酵母提取物，蒸馏水定容到1000毫升。121℃灭菌25分钟。接种L.elongisporus OF-08，28℃培养48小时，获得液体菌种。
B.将液体菌种按1％(液体菌种体积百分比，v/v)接种量转接到1 L的YPD液体培养基中，28℃，150r/min振荡培养48h。培养液以3500r/min离心10min，用无菌水洗涤沉淀、离心，最后用20mL无菌水振荡均匀，使用时稀释10倍即为菌剂。
——烟叶发酵
称取预先平衡水分至13％的烟丝200g，喷施OF-08(L.elongisporusOF-08)菌剂40mL，对照组喷施等量无菌水。本实验处理四种烟叶，每个处理三次重复。然后将处理后的烟叶样品放入22℃，60％的恒温恒湿箱内发酵30天，取样品测其主要化学成分，测得数据取平均值进行分析。
——样品处理及烟叶主要化学成分分析
1)样品处理：取烟叶样品，先用旋风磨粉碎，烟末样品在40℃下干燥约3h(含水率6％-8％)，过40目筛，装入样品瓶，盖紧瓶盖，常温下避光贮存。
2)烟叶主要化学成分分析：Nicolet Antaris型傅立叶变换近红外光谱仪,配备TQ analyst 6.2定量分析软件(美国Thermo Nicolet公司)。
——化学成分测定结果
烟叶的化学成分检测结果如下(详见表2，3，4)实验结果表明，从单一化合物看，经菌剂处理的各类烟叶内的化学成分比值发生了显著变化。总糖含量比对照增加0.63％-1.30％，变化不是很明显。总还原糖含量比对照增加29.01％-40.77％，其中昆明K326 C2F的增加率最明显，为40.77％。纤维素含量比对照降低12.22％-17.53％，其中昆明K326 B2F的减少为17.53％。总氮含量比对照降低3.38％-5.42％，其中昆明红大B2F的减少为5.42％。蛋白质含量降低2.21％-5.71％，昆明K326 C2F的减少为5.71％。烟碱含量与对照相比降低2.74％-5.78％，昆明红大C2F的变化最显著，为5.78％。钾的含量比对照增加3.72％-8.02％，其中昆明K326 B2F的增加为8.02％。
由表4结果表明，从化合物比例关系看，喷施菌剂对糖氮比、糖碱比、氮碱比均有促进升高的作用。
系统的试验数据说明，经菌剂处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表2.菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表3.菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表4.菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
——处理烟样感官评吸:
将处理组和对照组的烟丝制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％，温度22℃条件下平衡24h后，由卷烟专业评吸专家组成的评吸小组进行评吸。
经专家评吸认为：利用长孢洛德酵母OF-08(L.elongisporus OF-08)处理后的烟叶样品，具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激、掩盖杂气和改善卷烟吸味的良好效果，结果见表5。
表5.菌剂对感官评吸的影响
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种长孢洛德酵母，其特征在于：该菌株的分类命名为长孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus OF-08，保藏编号为CGMCC No.6645。
2.权利要求1所述的长孢洛德酵母的应用，其特征在于，将该长孢洛德酵母作为提高烤烟品质的生物催化剂使用，具体做法如下：称取预先平衡水分至13％的烟丝，喷施长孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus.OF-08菌剂，以烟丝重量计，每100克烟丝喷施菌剂量为15～30mL，然后将处理后的烟丝放入22℃，60％的恒温恒湿箱内发酵24小时。
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