CN114376257A - 一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法 - Google Patents

一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属提供了一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法，所述方法使用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和类胡萝卜素9,10’双加氧酶协同混合处理烟叶。经菌酶协同生物技术处理后烟叶的致香成分总体含量提高8.1％，由170.444ug/g提高到184.286ug/g。经感官质量评价，经菌酶协同处理后烟叶香气质有所改善，香气量和香气浓度增加，刺激性减少，杂气减少，余味干净舒适，烟叶的品质得到明显改善，可以较好的解决广西烟叶存在杂气重等问题。

Description

一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法
技术领域
本发明属于烟草加工技术领域，具体涉及一种使用短小芽孢杆菌和类胡萝卜素9,10’双加氧酶协同处理广西烟叶提高烟叶品质的方法。
背景技术
部分烟叶，例如广西河池地区部分烟叶杂气重，吸味品质较差，影响其在卷烟配方中的可用性，为了提高其在卷烟中的使用比例，需要对该部分烟叶吸味品质进行提升研究，通过微生物或生物酶技术处理烟叶，建立提高这些烟叶可用性的生物处理技术。在一定条件下，微生物或生物酶可以将烟叶中的大分子化合物如淀粉、蛋白质、果胶和纤维素等降解为单糖和氨基酸等小分子化合物，然后这些小分子化合物经过一系列转化生成醇、醛、酸、酯和酮等类香味成分，从而可以有效提高烟叶的吸食品质，对于解决库存烟叶和其质量问题具有重要价值和意义。
β-胡萝卜素是烟叶中存在的重要香味前体物质之一，其降解产物β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮衍生物等是烟叶中重要香味物质。来源于肠杆菌HC-3的类胡萝卜素9,10’双加氧酶可以有效将β-胡萝卜素降解为β-紫罗兰酮，降解率为达到79.4％。短小芽孢杆菌Bacillus pumilus是微生物固态发酵改善烟叶品质的常用菌株(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：1.8088)，可以有效提高烟叶中大马酮、茄酮、巨豆三烯酮、二氢大马酮等香味物质含量的变化较大。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种菌酶协同处理改善广西烟叶品质的方法，以解决广西河池地区烟叶杂气重，吸味品质较差，影响其在卷烟配方中的可用性。
一方面，本申请提供了一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法，所述方法使用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和类胡萝卜素9,10’双加氧酶协同混合处理烟叶。
进一步地，所述烟叶为广西河池烟叶，优选广西河池CF4烟叶。
进一步地，所述短小芽孢杆菌为CGMCC NO：1.8088菌株。
进一步地，所述方法中加入的短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液的体积比为3:3-3:1。
进一步地，所述短小芽孢杆菌菌液按照以下方法制备：从-80℃冰箱中取出保存短小芽孢杆菌B.pumilus，转接固体LB培养基，在30℃培养箱里培养12h；挑选较大的菌落，接入30mL的LBC培养基中，在30℃，180rpm的条件下培养12h，获得种子液；以2％接种量接种于300mL LBC液体培养基中，在相同条件下培养12～16h；将菌液在8000rpm下离心10min，去除上清，将沉淀溶于30ml无菌水中，重复2次，收集菌体，溶于适量的无菌水中，将菌体的密度稀释至1x108cfu/mL。
进一步地，所述LB液体培养基包含：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl 1％。
进一步地，所述类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液按照以下方法制备：将构建好的类胡萝卜素9,10’双加氧酶的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，构建重组酶的表达菌株；表达菌在50mL含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，然后按1％接种量接到1000mL含氨苄青霉素的LB液体培养基培养2h，使OD600nm达到0.6，加入终浓度0.5mmol/L IPTG于37℃继续培养4h，4℃12,000g离心15min。使用50mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,50mmol/L NaCl的破壁缓冲液悬浮收集菌体，超声波破碎菌体，12,000g离心15min，得到粗酶液；采用镍柱亲和层析和分子筛Sephacryl TM S-200HRcolumn纯化后，得到纯化的酶蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳来检测纯化效果；其中镍柱亲和层析洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl,pH 7.5,500mM NaCl,300mM imidazole；分子筛Sephacryl TM S-200HR column洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 7.5，100mM NaCl；洗脱速度为：1mL/min；所得类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液类胡萝卜素9,10’双加氧酶浓度为0.5mg/mL。
进一步地，所述方法包括，取短小芽孢杆菌菌液，均匀喷洒在烟叶上，在温度20-35℃，相对湿度40-70％恒温恒湿箱中培养12-48h；然后继续将类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶液均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度30-45℃下继续处理12-36h
另一方面，本申请提供了一种改善烟叶品质的菌酶协同制剂，包含短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液。
进一步地，本申请提供了上述制剂在烟叶发酵和/或提高烟叶的香气品质中的应用。
本申请中的烟叶优选广西河池CF4烟叶，但不排除其他烟叶，特别是广西所产的，有杂气和吸味品质问题的烟叶。
本申请方法或者制剂中的含短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液可以被制备在同一组合物中，也可以在独立的包装中提供后联合使用。
有益效果：
本发明的菌酶协同处理技术可有效改善广西河池C4F烟叶的感官品质，经菌酶协同处理后烟叶香气质有所改善，香气量和香气浓度增加，刺激性减少，杂气减少，余味干净舒适，烟叶的品质得到明显改善。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明做进一步详细的描述，但所述实施例不构成对本发明的限制。
菌株与培养基：
短小芽孢杆菌B.pumilus(郑州轻工业大学提供)；。
LB固体培养基：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％和琼脂2％；LB液体培养基：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl 1％；LBC液体培养基：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％和2％β-胡萝卜素。
类胡萝卜素9,10’双加氧酶的制备：
将构建好的类胡萝卜素9,10’双加氧酶的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，构建重组酶的表达菌株。表达菌在50mL含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，然后按1％接种量接到1000mL含氨苄青霉素的LB液体培养基培养2h，使OD600nm达到0.6，加入终浓度0.5mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)于37℃继续培养4h，4℃12,000g离心15min。使用破壁buffer(50mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,50mmol/L NaCl)悬浮收集菌体，超声波破碎菌体,12,000g离心15min，得到粗酶液。采用镍柱亲和层析(洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl,pH 7.5,500mM NaCl,300mMimidazole)和分子筛Sephacryl TM S-200HR column(洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl,pH7.5,100mM NaCl；洗脱速度为：1mL/min)纯化后，得到纯化的酶蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳来检测纯化效果。采用考马斯亮蓝的方法测定所纯化酶的浓度，纯化后类胡萝卜素9,10’双加氧酶浓度需要达到0.5mg/mL。
广西河池C4F烟叶，由广西中烟工业有限责任公司提供。
实验设备及检测方法：
(1)感官质量评价
采用单料烟评价方法对烟叶的感官质量评价。将烟叶感官质量评价指标香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、浓度和劲头分别打分，单项指标满分为10分，分值越高，品质越高。
(2)烟叶常规化学成分测定
使用AA3型连续流动分析仪(德国SEALAnalytical)对烟叶常规化学成分进行分析；方法采用：《YCT 159-2002烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》、《YCT160-2002烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》、《YC/T217-2007烟草及烟草制品钾的测定连续流动法》、《YCT162-2011烟草及烟草制品氯的测定连续流动法》、测定烟叶中的总植物碱、总糖、还原糖、烟碱、钾和氯的含量。
(3)烟叶致香成分分析
使用GC-MS对烟叶中的致香成分进行测定分析。GC-MS分析条件设定如下：
色谱条件：HP-5MS毛细管柱(60m×250μm×0.25μm)；进样口温度：240℃；载气：99.999％高纯度氦气，流速：1.0mL/min；分流模式为不分流进样，进样量为1.0μL。
升温程序：设置50℃(4min)后以3℃/min升温到70℃(5min)，再以2℃/min升温到100℃(17min)，然后以2℃/min升温到120℃(10min)，最后以6℃/min升温到280℃(0min)
质谱条件：传输线温度280℃；离子源温度280℃；四级杆温度150℃；电子倍增器电压2.28kV；电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70eV；溶剂延迟10min；全扫描检测，扫描质量范围(m/z)35-500u。
实施例1
(1)短小芽孢杆菌B.pumilus菌悬液的制备。
从-80℃冰箱中取出保存短小芽孢杆菌B.pumilus，转接固体LB培养基，在30℃培养箱里培养12h。挑选较大的菌落，接入30mL的LBC培养基中，在30℃，180rpm的条件下培养12h，获得种子液。以2％接种量接种于300mL LBC液体培养基中，在相同条件下培养12～16h。将菌液在8000rpm下离心10min，去除上清，将沉淀溶于30ml无菌水中，重复2次，收集菌体，溶于适量的无菌水中，将菌体的密度稀释至1x108cfu/mL。
(2)类胡萝卜素9,10’双加氧酶的制备。
将构建好的类胡萝卜素9,10’双加氧酶的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，构建重组酶的表达菌株。表达菌在50mL含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，然后按1％接种量接到1000mL含氨苄青霉素的LB液体培养基培养2h，使OD600nm达到0.6，加入终浓度0.5mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)于37℃继续培养4h，4℃12,000g离心15min。使用破壁buffer(50mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,50mmol/L NaCl)悬浮收集菌体，超声波破碎菌体,12,000g离心15min，得到粗酶液。采用镍柱亲和层析(洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl,pH 7.5,500mM NaCl,300mMimidazole)和分子筛Sephacryl TM S-200HR column(洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl,pH7.5,100mM NaCl；洗脱速度为：1mL/min)纯化后，得到纯化的酶蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳来检测纯化效果。采用考马斯亮蓝的方法测定所纯化酶的浓度，纯化后类胡萝卜素9,10’双加氧酶浓度需要达到0.5mg/mL。
实施例2
取出1mL无菌水，均匀喷洒在50g在广西河池C4F烟叶上，在温度28℃，相对湿度60％恒温恒湿箱中培养36h。然后继续将1mL无菌水均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度40℃下继续处理24h，得到样品A0。
实施例3
取出1mL无菌水，均匀喷洒在50g在广西河池C4F烟叶上，在温度28℃，相对湿度60％恒温恒湿箱中培养36h。然后继续将1mL类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶液(20mM Tris-HCl,pH 8.0 20mM NaCl)均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度40℃下继续处理24h，得到样品A1。
实施例4
取出1mL短小芽孢杆菌B.pumilus菌液，均匀喷洒在50g在广西河池C4F烟叶上，在温度28℃，相对湿度60％恒温恒湿箱中培养36h。然后继续将1mL无菌水均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度40℃下继续处理24h，得到样品A2。
实施例5
取出1mL短小芽孢杆菌B.pumilus菌液，均匀喷洒在50g在广西河池C4F烟叶上，在温度28℃，相对湿度60％恒温恒湿箱中培养36h。然后继续将3mL类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶液(20mM Tris-HCl,pH 8.0 20mM NaCl)均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度40℃下继续处理24h，得到样品A3。
实施例6
取出2mL短小芽孢杆菌B.pumilus菌液，均匀喷洒在50g在广西河池C4F烟叶上，在温度28℃，相对湿度60％恒温恒湿箱中培养36h。然后继续将3mL类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶液(20mM Tris-HCl,pH 8.0 20mM NaCl)均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度40℃下继续处理24h，得到样品A4。
实施例7
取出3mL短小芽孢杆菌B.pumilus菌液，均匀喷洒在50g在广西河池C4F烟叶上，在温度28℃，相对湿度60％恒温恒湿箱中培养36h。然后继续将3mL类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶液(20mM Tris-HCl,pH 8.0 20mM NaCl)均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度40℃下继续处理24h，得到样品A5。
实施例8
取出3mL短小芽孢杆菌B.pumilus菌液，均匀喷洒在50g在广西河池C4F烟叶上，在温度28℃，相对湿度60％恒温恒湿箱中培养36h。然后继续将2mL类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶液(20mM Tris-HCl,pH 8.0 20mM NaCl)均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度40℃下继续处理24h，得到样品A6。
实施例9
取出3mL短小芽孢杆菌B.pumilus菌液，均匀喷洒在50g在广西河池C4F烟叶上，在温度28℃，相对湿度60％恒温恒湿箱中培养36h。然后继续将1mL类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶液(20mM Tris-HCl,pH 8.0 20mM NaCl)均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度40℃下继续处理24h，得到样品A7。
实施例10
将以上实施2-9中处理的烟叶置于烘箱中40℃条件下烘干至含水量12％，对烟叶进行切丝、卷制，然后将各组卷烟样品(每支烟只总重0.80±0.01g)在温度(22±2)℃、相对湿度(60±5)％的恒温恒湿箱中平衡24h后，依据单料烟评价方法对卷烟进行质量评吸鉴定和评价，评价结果如表1所示。优选到实施7、实施8、实施9中处理过的烟叶有比较明显的提升效果，即样品A5、A6、A7。随后选取优选到的3种酶菌混合比例进行重复以上实验，经感官质量评价，进一步优选到样品A6(菌：酶体积比例为3:2)为最佳混合比例。酶菌协同处理后烟叶香气质有所改善，香气量和香气浓度增加，刺激性减少，杂气减少，余味干净舒适，烟叶的品质得到明显改善。
表1酶菌协同处理前后广西C4F烟叶的评吸结果
类型 香气质 香气量 浓度 刺激性 杂气 劲头 余味 总分
A0 6.0 6.0 6.0 5.5 5.5 5.5 5.5 40.0
A1 6.2 6.2 6.0 5.6 5.7 6.0 5.6 41.3
A2 6.2 6.2 6.0 5.6 5.7 6.0 5.6 41.3
A3 6.4 6.4 6.0 5.8 5.9 6.0 5.8 42.3
A4 6.5 6.5 6.0 5.8 5.9 6.0 5.8 42.5
A5 6.8 6.6 6.1 6.0 6.0 6.0 5.9 43.4
A6 7.0 6.8 6.2 6.2 6.2 6.2 6.0 44.6
A7 6.8 6.6 6.1 6.0 6.0 6.2 5.9 43.6
注：单项指标满分10分，分数越高，品质越好。
实施例11
将通过感官质量评价优选到样品A6与空白样品A0进行常规化学成分含量检测的对比。如表2所示，菌酶协同处理后烟叶总糖含量由23.10％降低到23.00％，而还原糖含量由22.10％提高到22.90％，处理后烟叶的糖碱比升高，可以降低烟气中刺激性物质的生成；钾、氯和钾氯比变化不大。
表2菌酶协同处理前后C4F烟叶常规化学成分含量
处理 总糖/％ 还原糖/％ 烟碱/％ 钾/％ 氯/％ 钾氯比 糖碱比
A0 23.10 22.10 2.40 2.08 0.60 3.47 9.63
A6 23.00 22.90 2.34 2.09 0.61 3.43 9.83
实施例12
将通过感官质量评价优选到样品A6与空白样品A0进行致香成分含量的检测的对比。将上述检测实验重复三次，进行统计学分析，如表3所示，可以发现经菌酶协同处理后的烟叶致香成分总体含量提高8.1％，由170.444ug/g提高到184.286ug/g。其中大马酮、茄酮、巨豆三烯酮、二氢大马酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯等香味物质含量的变化较大，巨豆三烯酮和茄酮是烟叶香气的重要组成部分，能显著增强烟香，改善吸味，调和烟气，并减少刺激感；大马酮、二氢大马酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯是烟叶香气前体物类胡萝卜素裂解物，是形成卷烟细腻，增加烟香和清新香气的主要成分。新检出苯甲醛和β-环柠檬醛2种醛类物质，β-环柠檬醛具有甜香可以增加烟气浓度和刺激性，而苯甲醛具有独特甜味，具有醇和烟气的作用。
表3菌酶协同处理后前后烟叶中致香成分含量
Figure BDA0003495776720000081
Figure BDA0003495776720000091
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种菌酶协同处理改善烟叶品质的方法，其特征在于，所述方法使用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和类胡萝卜素9,10’双加氧酶协同混合处理烟叶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述烟叶为广西河池烟叶，优选广西河池CF4烟叶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述短小芽孢杆菌为CGMCC NO：1.8088菌株。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述方法中加入短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液，所述短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液体积比为3:3-3:1。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述短小芽孢杆菌菌液按照以下方法制备：从-80℃冰箱中取出保存短小芽孢杆菌B.pumilus，转接固体LB培养基，在30℃培养箱里培养12h；挑选较大的菌落，接入30mL的LBC培养基中，在30℃，180rpm的条件下培养12h，获得种子液；以2％接种量接种于300mL LBC液体培养基中，在相同条件下培养12～16h；将菌液在8000rpm下离心10min，去除上清，将沉淀溶于30ml无菌水中，重复2次，收集菌体，溶于适量的无菌水中，将菌体的密度稀释至1x108cfu/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述LB液体培养基包含：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％和NaCl 1％。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液按照以下方法制备：将构建好的类胡萝卜素9,10’双加氧酶的重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21-codonPlus(DE3)-RIL，构建重组酶的表达菌株；表达菌在50mL含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，然后按1％接种量接到1000mL含氨苄青霉素的LB液体培养基培养2h，使OD600nm达到0.6，加入终浓度0.5mmol/L IPTG于37℃继续培养4h，4℃12,000g离心15min，使用50mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,50mmol/L NaCl的破壁缓冲液悬浮收集菌体，超声波破碎菌体，12,000g离心15min，得到粗酶液；采用镍柱亲和层析和分子筛Sephacryl TM S-200HR column纯化后，得到纯化的酶蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳来检测纯化效果；其中镍柱亲和层析洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl,pH 7.5,500mM NaCl,300mM imidazole；分子筛Sephacryl TM S-200HR column洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl；洗脱速度为：1mL/min；所得类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液类胡萝卜素9,10’双加氧酶浓度为0.5mg/mL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述方法包括，取短小芽孢杆菌菌液，均匀喷洒在烟叶上，在温度20-35℃，相对湿度40-70％恒温恒湿箱中培养12-48h；然后继续将类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶液均匀喷洒在以上处理过的烟叶上，在温度30-45℃下继续处理12-36h。
9.一种改善烟叶品质的菌酶协同制剂，包含短小芽孢杆菌菌液和类胡萝卜素9,10’双加氧酶溶液。
10.根据权利要求9所述的制剂在烟叶发酵和/或提高烟叶的香气品质中的应用。
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