CN114621901B - 一株烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌及其在雪茄烟叶发酵中的应用 - Google Patents

一株烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌及其在雪茄烟叶发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌及其在雪茄烟叶发酵中的应用，该菌株的分类命名为Mixta calida LYS12，已保藏于中国典型培养物保存中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022321。该菌株来源于烟草本身，48℃高温培养下依然具有较好生长特性，亚硝酸盐耐受浓度可达2g/L，且44℃高温培养7.5h后，可将1g/L亚硝酸盐降解97.77％，具有亚硝酸盐降解速率快等优点。该菌株能够降低雪茄烟叶发酵过程中的亚硝酸盐和TSNAs含量，降低雪茄烟对人体的危害。还可降低雪茄烟叶调制过程中产生的亚硝酸盐，解决雪茄烟叶高温发酵过程中难以有效应用微生物降解亚硝酸盐及降低TSNAs含量的问题，对提高雪茄烟制品的安全性及保护消费者健康有着重要的意义。

Description

一株烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌及其在雪茄烟叶发酵中的 应用
技术领域
本发明涉及一株烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌及其在雪茄烟叶发酵中的应用，属于生物工程领域。
背景技术
亚硝酸盐，是指含有亚硝酸根离子(NO2 -)的盐，常见的有亚硝酸钠、亚硝酸钾等。亚硝酸盐具有防腐性，常在食品加工业被添加在香肠和腊肉中作为保色剂，以维持良好外观；其次，它可以防止肉毒梭状芽孢杆菌的产生，提高食用肉制品的安全性。但是，人体吸收过量亚硝酸盐，会令血液不能运送氧气，口唇、指尖会变成蓝色，即俗称的“蓝血病”，严重会令脑部缺氧，甚至死亡。亚硝酸盐本身并不致癌，但亚硝酸盐可与氨基酸降解反应，生成有强致癌性的亚硝胺。
目前，亚硝酸盐降解菌的筛选及应用集中在食品领域，王英等从发酵酸豆角中分离得到了一株具有强降解亚硝酸盐能力的植物乳杆菌SD-7，该菌株在30℃、亚硝酸盐浓度200mg/L条件下24h和48h亚硝酸盐降解率分别为为58.56％、64.56％(植物乳杆菌SD-7的分离鉴定及其亚硝酸盐降解特性[J].中国食品学报,2016,16(07):97-104)；李霜等从市售泡菜中分离得到一株具有强亚硝酸盐还原能力的乳酸菌SA-4，该菌株在30℃、亚硝酸盐浓度150mg/L条件下培养48h后亚硝酸盐降解率为84.21％(泡菜中亚硝酸盐降解菌的降解特性及条件优化[J].当代化工研究,2018(09):164-165)。上述研究表明，当前亚硝酸盐降解菌存在亚硝酸盐耐受能力差(报道最高耐受浓度为1.1g/L)，培养温度多为普通中温培养(超过37℃后亚硝酸盐降解效率大幅降低)，因此在实际应用时面临诸多限制。
烟草特有亚硝胺(Tobacco Specific N-nitrosamines，TSNAs)是烟草中特有的致癌物质，TSNAs是由亚硝酸盐及亚硝酸盐分解产生的氮氧化物(NO、NO2、N2O3)与烟草生物碱发生亚硝化反应产生的，目前已鉴定出的TSNAs主要有8种，其中，N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)是烟草和烟气中主要的烟草特有亚硝胺。烟叶中烟草特有亚硝胺的含量一般在1μg～10μg之间，相较于烤烟，雪茄烟叶烟碱及其他含氮化合物的含量更高，导致雪茄烟叶更易产生TSNAs，因此，降低雪茄烟叶在高温发酵过程中TSNAs对提高雪茄烟制品的安全性，保护雪茄烟制品消费者的健康具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一株烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌及其在雪茄烟叶发酵中的应用，该菌株能够降低雪茄烟叶发酵过程中的亚硝酸盐和TSNAs含量，降低雪茄烟对人体的危害。还可以降低雪茄烟叶调制过程中产生的亚硝酸盐，解决雪茄烟叶高温发酵过程中难以有效应用微生物降解亚硝酸盐及降低TSNAs含量的问题，对提高雪茄烟制品的安全性及保护消费者健康有着重要的意义。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一株烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌，所述烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌的分类命名为Mixta calida LYS12，已保藏于中国典型培养物保存中心，保藏日期为2022年3月28日，保藏编号为CCTCC NO:M 2022321。
所述烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌的生长耐受温度为37℃～48℃，亚硝酸盐耐受浓度为1g/L～2g/L。
所述的烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将雪茄烟叶样品剪碎后置于0.9％(wt％)的无菌生理盐水中，所述雪茄烟叶样品的质量与无菌生理盐水的体积比为1g：40mL；在37℃于200r/min的速度振荡30min后，置于磁力搅拌器上搅拌30min，获得微生物菌悬液，备用；
将微生物菌悬液于5000r/min的速度离心10min收集沉淀，并进一步采用0.9％(wt％)的无菌生理盐水重悬沉淀菌体；重悬后取1mL重悬液接种至灭菌后的TSB液体培养基，在37℃于200r/min的速度振荡培养12～15h；培养后的菌液经10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的梯度稀释后涂布于TSB固体培养基上，于37℃培养8～12h，得到初筛菌株；
(2)挑取单菌落接种于以亚硝酸盐为唯一氮源的培养基中，在37℃于200r/min的速度振荡培养48h，在第0h、12h、24h、36h、48h测定菌液中菌体密度，得到生长良好的复筛菌株。
所述雪茄烟叶为海南昌江雪茄烟叶。
按质量百分比计，所述TSB液体培养基的配方组成为：胰酪蛋白胨1.7％、大豆蛋白胨0.3％、葡萄糖0.25％、NaCl 0.5％、K2HPO4 0.25％，余量为蒸馏水。
按质量百分比计，所述TSB固体培养基的配方组成为：胰酪蛋白胨1.7％、大豆蛋白胨0.3％、葡萄糖0.25％、NaCl 0.5％、K2HPO4 0.25％、琼脂2％，余量为蒸馏水。
按质量百分比计，所述以亚硝酸盐为唯一氮源的培养基的配方组成为：葡萄糖1.0％、NaNO2 0.01％、K2HPO4 1％、KH2PO4 0.5％、CaCl2 0.00151％、MnSO4 0.00218％、FeSO40.00109％，余量为蒸馏水。
所述的烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌在雪茄烟叶发酵中的应用。
所述的烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌在污水脱氮处理中的应用。
所述的烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌在发酵食品中的应用。
本发明有益效果：
本发明以筛选烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌为目标，从雪茄烟叶中筛选出耐高温菌株Mixta calida LYS12。相较于已报道的亚硝酸盐降解菌，该菌株来源于烟草本身，具有生长耐高温(48℃高温培养依然具有较好生长特性)，耐高浓度亚硝酸盐(最高耐受浓度可达2g/L)，且在高温培养条件下仍具有亚硝酸盐降解速率快(44℃培养7.5h后，可将1g/L亚硝酸盐降解97.77％)等优点。
本发明的亚硝酸盐降解菌(Mixta calida LYS12)能够在以亚硝酸钠为唯一氮源的培养基中生长，能够在37～48℃的条件下高效降解亚硝酸盐，并且具有较高的亚硝酸盐耐受性。将该菌株应用于雪茄烟叶发酵，发酵温度选择48℃，相对湿度90％，发酵周期为28d。和未加菌空白对照相比，发酵后雪茄烟叶亚硝酸盐含量相对于未加菌空白对照降低了72.58％，TSNAs含量相对于未加菌空白对照降低了52.76％，说明该菌株在提升雪茄烟叶发酵安全性上具有广泛应用价值。
本发明菌株不仅可以应用于降解雪茄烟叶和烤烟烟叶发酵过程中产生的亚硝酸盐以降低TSNAs的生成，提高雪茄产品安全性，还可用于污水脱氮、降解发酵食品如酱腌菜、发酵香肠和腌制肉制品中的亚硝酸盐，提高发酵食品安全性，简化生产流程，节约生产成本，具有广泛应用价值。
附图说明
图1为Mixta calida LYS12菌株分别在37℃(A)、44℃(B)、48℃(C)条件下培养的显微镜检图(结晶紫染色)。
图2为Mixta calida LYS12菌株的16S rDNA基因系统发育树图谱。
图3为Mixta calida LYS12菌株分别在37℃(A)、44℃(B)、48℃(C)条件下培养过程中生长情况和亚硝酸盐含量变化曲线图。
图4为Mixta calida LYS12菌株在不同浓度亚硝酸钠(1g/L(A)、2g/L(B))条件下生长情况和亚硝酸盐含量变化曲线图。
图5为雪茄烟叶发酵过程(48℃，RH90％)中亚硝酸盐(A)和TSNAs(B)含量变化图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。如无特别说明，实施例中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备；涉及试剂均为市售常规试剂；涉及试验方法均为常规方法。
实施例1烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌的Mixta calida LYS12初筛方法
本发明涉及菌株从海南昌江雪茄烟叶筛选而来。取雪茄烟叶样品5.0g，剪碎后置于含有200mL 0.9％(wt％)无菌生理盐水的三角瓶中，200r/min、37℃振荡30min，加入转子放置于磁力搅拌器上搅拌30min，获得微生物菌悬液。
采用直接离心法，将菌悬液于5000r/min离心10min收集沉淀，并进一步采用0.9％(wt％)无菌生理盐水重悬沉淀菌体。取1mL重悬液接种至灭菌后的TSB液体培养基，于200r/min、37℃振荡培养12～15h。扩大培养后的菌液经梯度稀释(10-1、10-2 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)后涂布于TSB固体培养基上，37℃培养8～12h，得到初筛菌株。
按质量百分比计，TSB液体培养基的配方为：胰酪蛋白胨1.7％、大豆蛋白胨0.3％、葡萄糖0.25％、NaCl 0.5％、K2HPO4 0.25％，余量为蒸馏水；TSB固体培养基是在TSB液体培养基的基础上额外加入2％琼脂得到。
实施例2烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌Mixta calida LYS12的复筛方法
将实施例1中筛选得到的初筛菌株划线于TSB固体培养基，37℃培养12～15h。挑取平板上的单菌落接种于以亚硝酸盐为唯一氮源的培养基中，37℃、200r/min培养48h，在第0h、12h、24h、36h、48h测定菌体密度，判断菌株生长情况，复筛最终得到生长良好的一株菌株。
按质量百分比计，以亚硝酸盐为唯一氮源的培养基的配方为：葡萄糖1.0％、NaNO20.01％、K2HPO4 1％、KH2PO4 0.5％、CaCl2 0.00151％、MnSO4 0.00218％、FeSO40.00109％，余量为蒸馏水。
液体种子培养物的制备：将复筛得到的菌株，在无菌条件下挑取单菌落接种于含有100mL TSB液体培养基的250mL三角瓶中，分别于37℃、44℃、48℃，200r/min培养12～15h，即得种子培养物。
实施例3亚硝酸盐降解菌菌株的形态学鉴定及分子生物学鉴定
将培养获得的种子培养物进行细菌染色处理，观察细菌的形态，如图1所示。
采用细菌16S rDNA通用PCR引物
27F(5′-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3′)，
1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，进行扩增，PCR产物4℃保藏。测序由上海生物工程有限公司完成，采用16S rDNA测序方法对实施例2复筛得到的菌株进行分子学生物鉴定。经BLAST比对后，采用Neighbor-Joining算法构建目标菌株系统发育树，结果如图2所示。所筛选菌株与Mixta属标准菌株Mixta calida 1400/07处于同一分支且进化距离最近，因此鉴定所筛选菌株种属为Mixta calida并命名为Mixta calida LYS12。
该菌株已保藏于中国典型培养物保存中心，保藏地址为武汉大学，保藏日期：2022年3月28日，保藏编号为CCTCC NO:M 2022321。
实施例4菌株Mixta calida LYS12的耐高温降解实验
发酵流程：取实施例2中液体种子培养物2mL(分别于37℃、44℃、48℃培养所得)接种至已灭菌的100mL亚硝酸盐还原培养基中，置于37℃、44℃、48℃温度条件(和相应种子培养物温度一致)，于200r/min培养20h～36h，在第0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h，分别测定菌液OD600及亚硝酸盐含量，计算亚硝酸盐降解率。
按质量百分比计，亚硝酸盐还原培养基的配方为：葡萄糖1.0％、NaNO2 0.01％、酵母浸粉0.5％、K2HPO4 1％、KH2PO4 0.5％、CaCl2 0.00151％、MnSO4 0.00218％、FeSO40.00109％，余量为蒸馏水。
亚硝酸盐含量测定采用紫外分光光度法：取0.1mL菌液于试管中，加入900mL去离子水，混匀，加入1.5mL、1g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后加入1.5mL、1g/L盐酸萘乙二胺溶液，混匀静置15min，取600μL加入1cm比色池中，以水为参比，于538nm处测定吸光值。
在上述条件下，菌株生长情况及亚硝酸盐降解曲线如图3所示。温度为37℃，发酵4h时，亚硝酸降解率为93.34％；温度为44℃，发酵4h时，亚硝酸盐降解率为93.47％；温度为48℃，发酵12h时，亚硝酸盐降解率为94.05％。说明该菌株Mixta calida LYS12具有耐高温特性。
实施例5菌株Mixta calida LYS12对高浓度亚硝酸盐耐受性实验
发酵流程：取2份菌株的液体种子培养物各2mL(实施例2中44℃培养所得)，分别接种至已灭菌的100mL亚硝酸盐还原培养基中(亚硝酸钠浓度分别为1g/L、2g/L)的，均置于44℃，200r/min培养20h，在第0h、2.5h、5h、7.5h、10h、12h、16h、20h，分别测定菌液OD600及亚硝酸盐含量并计算亚硝酸盐降解率。
菌株生长情况及亚硝酸盐降解曲线如图4所示。亚硝酸钠浓度为1g/L时，7.5h时亚硝酸盐降解率达到97.77％。亚硝酸钠浓度为2g/L时，发酵16h时亚硝酸盐降解率为47.87％。说明该菌株Mixta calida LYS12具有耐高浓度亚硝酸盐的特性，且在高温培养条件下仍具有亚硝酸盐降解速率快的优点。
实施例6菌株Mixta calida LYS12降低雪茄烟叶发酵过程亚硝酸盐及TSNAs实验
发酵是雪茄烟叶特有的初加工工艺，调制后的新烟需经过3～5周的高温发酵和18～36个月的醇化来改善烟叶品质，因此本实施例选择28d恒温恒湿发酵过程。具体实验步骤如下：
菌株活化：将菌株Mixta calida LYS12接种至含100mL TSB液体培养基的250mL三角瓶中，44℃、200r/min培养至OD600为2。
雪茄烟样品准备：烟叶在22℃，相对湿度90％条件下平衡2d。
烟叶发酵：取活化后的菌液10mL，5000r/min离心20min，无菌生理盐水重悬后稀释至25mL喷洒于100g烟叶上，对照组喷洒等量无菌生理盐水。发酵条件为48℃，RH90％发酵28d，第0d，第7d，第14d，第21d，第28d分别取样测定亚硝酸盐和TSNAs含量。发酵过程中亚硝酸盐和TSNAs含量变化情况如图5。由图5可知，添加本发明菌株Mixta cali da LYS12和未加菌的空白对照相比，添加本发明菌株Mixta calida LYS12发酵后雪茄烟叶亚硝酸盐含量相较于未加菌的空白对照降低了72.58％，TSNAs含量相较于未加菌的空白对照降低了52.76％，说明该菌株在提升雪茄烟叶发酵安全性上具有广泛应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不表示用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，本领域技术人员所作的类似修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一株烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌，其特征在于，所述烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌的分类命名为Mixta calida LYS12，已保藏于中国典型培养物保存中心，保藏日期为2022年3月28日，保藏编号为CCTCC NO:M 2022321。
2.如权利要求1所述的烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌在雪茄烟叶发酵中的应用。
3.如权利要求1所述的烟草源耐高温亚硝酸盐降解菌在污水脱氮处理中的应用。
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