CN107893045B - 一种菌株Bacillus nealsoniiYFM3及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种菌株Bacillus nealsoniiYFM3及其在料液保质提质中的应用，属于微生物应用技术领域。本发明所用Bacillus nealsonii YFM3菌株已于2017年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M 2017704。用YFM3菌株制备的浓缩发酵液在料液中添加1‑10%时，能够抑制腐败细菌的增殖延缓料液的腐败变质，延长保质期，还能够降低卷烟烟气刺激性和杂气，使烟气圆润、柔和，提升津润感和舒适性。本发明方法成本低，操作易行，高效，在延长料液保质期、防止料液变质方面具有很大应用潜力。

Description

一种菌株Bacillus nealsoniiYFM3及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种菌株Bacillus nealsonii YFM3及其制备方法和该菌株在料液保质提质中的应用，属于微生物应用技术领域。

背景技术

烟用香精是由多种香原料、适量溶剂和其他成分调配而成的，分为表香（加香香精）和料液（加料香精），被广泛用于烟草及烟草制品，能够赋予卷烟产品独特的风格，也是构成卷烟品牌风格的重要因素[1-2]。料液在卷烟生产过程中用量较大，一般由蔗糖、蜂蜜和果糖等糖类，水果浓缩物等天然提取物，甘油和柠檬酸等多种添加剂，加入大量水调配而成[3-4]。料液的复杂成分组成和加工工艺等导致其质量稳定性较差，易发生变质，保质期非常短[5]。卷烟企业实际生产过程中，因生产计划调整等原因不可避免存在料液剩余情况，这些剩余料液在贮存过程中经常出现变质，给企业造成了经济损失[6]。

在食品贮存过程中，防腐剂是常用的延缓食品腐败变质的有效手段，但有些化学防腐剂对人体健康有负面影响[7]。因此，天然防腐剂的研发成为食品保藏领域的热点。微生物及其次生代谢产物是天然防腐剂的重要来源。细菌和放线菌产生的抑菌物质，例如，乳酸链球菌素（nisin）、纳他霉素（natamycin）等，具有天然、安全和有效等特点，被广泛用于肉制品、乳制品和蔬菜等领域[8]。本发明从烟用香精香料中分离得到一种Bacillus nealsonii YFM3，产酶活性研究表明该菌株具有较强的纤维素酶和淀粉酶活性，抑菌活性显示该菌对对常见腐败菌大肠杆菌具有较强的抑制作用，该菌株的发酵液用作料液的添加剂，能延缓料液的腐败变质，显著延长保质期，还能够降低卷烟烟气刺激性和杂气，使烟气圆润、柔和，提升津润感和舒适性。该菌在料液中的应用尚未见公开报道。

参考文献

[1] YC/T 164-2012. 烟用香精[S]. 国家烟草专卖局, 2012.

[2]Sokol N A, Kennedy R D, Connolly G N. The Role of Cocoa as aCigarette Additive: Opportunities for Product Regulation[J]. Nicotine &Tobacco Research Official Journal of the Society for Research on Nicotine &Tobacco, 2014, 16(7):984.

[3]钟庆辉. 浅谈卷烟加香加料技术的应用[J]. 烟草科技, 1996(4):30-30.

[4] Lynm D, Lawrence BM. 加香技术─料液和香精[J]. 中国烟草学报, 1999(4):12-15.

[5]张丽娜, 许利平, 许式强, 等. 生产退回烟用香精香料保质期研究[J]. 安徽农学通报, 2013, 19(16): 143-146.

[6]张廷贵, 刘泽春, 张峰,等. pH值在烟用料液质量稳定性评价中的应用[J].湖南农业科学, 2014(6):61-63.

[7]罗傲霜, 淳泽, 罗傲雪,等. 食品防腐剂的概况与发展[J]. 中国食品添加剂, 2005(4):55-58.

[8] Duran M, Aday M S, Zorba N N D, et al. Potential of antimicrobialactive packaging ‘containing natamycin, nisin, pomegranate and grape seedextract in chitosan coating’ to extend shelf life of fresh strawberry[J].Food &Bioproducts Processing, 2016, 98:354-363.

发明内容

本发明的目的在于提供一种菌株Bacillus nealsoniiYFM3及其制备方法和在料液保质提质中的应用。其发酵液能延缓料液的腐败变质，显著延长保质期，为烟用料液提供一种天然、安全和有效的保质提质技术方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一、本发明分别采用纤维素刚果红培养基和可溶性淀粉培养基，对烟用香精香料中分离到的69株细菌进行了筛选，筛选得到4株同时具有较强纤维素酶活性和淀粉酶活性的菌株，再利用纸片抑菌实验法以大肠杆菌（Escherichia coli）为实验对象，筛选到具有较强的大肠杆菌抑菌活性的YFM3菌株，经形态学、生理生化和16S rRNA序列系统发育分析将YFM3菌株鉴定为Bacillus nealsonii YFM3,于2017年11月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CCTCC No.M2017704。

Bacillus nealsonii YFM3的分离和筛选

1）培养基配制：胰蛋白大豆琼脂培养基：胰蛋白胨15 g/L、大豆胨5 g/L、氯化钠5g/L、琼脂15 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min；刚果红纤维素培养基：硝酸钠1 g/L、磷酸氢二钠1.2 g/L、磷酸二氢钾0.9 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、酵母浸出粉0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、刚果红0.2 g/L、纤维素粉5 g/L、琼脂15.0 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min；可溶性淀粉培养基：可溶性淀粉10 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁1 g/L、氯化钠1 g/L、硫酸铵2 g/L、碳酸钙2 g/L、硫酸亚铁0.001 g/L、氯化锰0.001g/L、硫酸锌0.001g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min。

2）菌株的分离和筛选

（1）细菌分离：从若干份烟用香精香料样品中，利用胰蛋白大豆培养基，采用稀释涂布平板法分离细菌，挑取单菌落经多次划线得到纯的菌株，经菌落形态和显微形态判断获得69株纯的细菌；

（2）菌株的纤维素酶活性筛选：将纯的菌株分别接种于刚果红纤维素培养基，30℃培养7-14d后，可溶性淀粉酶培养基使用碘液染色后观察，刚果红纤维素培养基直接观察，从69株菌中筛选得到4株具有较强纤维素酶活性的菌株；

（3）菌株的抑菌活性筛选：接种液体培养的菌株，于含有大肠杆菌的胰蛋白大豆肉汤中，采用试管抑菌法筛选菌株的抑菌活性，最终筛选获得具有较强抑菌活性的YFM3菌株。

二、YFM3的浓缩发酵液的制备：

（1）YFM3菌株的复苏和液体活化：取甘油管长期保存菌株，于37℃水浴中复苏，或取斜面短期保存菌株，接种于胰蛋白大豆肉汤培养基中，于36℃，130-140rpm培养14-20h，获得种子培养液；

（2）YFM3菌株的液体发酵扩大培养：将种子培养液以1%-3%（v/v）接种量接种于添加纤维素粉1-5 g/L和可溶性淀粉3-10 g/L的胰蛋白大豆肉汤培养基中，于36℃，130-140rpm培养25-32h，获得发酵液；

（3）发酵液的收集和浓缩：于4℃，10000rpm离心15-20min，收集上清液，将上清液在旋转蒸发仪上浓缩至20-30倍，获得浓缩发酵液。

所述的YFM3菌株的保存：长期保存（＞1月）采用10%（v/v）甘油管于-80℃保存，短期保存（＜7d）采用胰蛋白大豆琼脂斜面培养基（胰蛋白胨 17.0g，大豆蛋白胨 3.0g，氯化钠 5.0g，磷酸氢二钾 2.5g，葡萄糖 2.5g，补水至1000 ml，pH 7.2）于4℃保存。

三、YFM3菌株的浓缩发酵液的应用：将YFM3菌株的浓缩发酵液以1%-10%（v/v）的使用量加入烟用料液中的，通过抑制腐败细菌的增殖延缓料液的腐败变质，显著延长保质期，还能够降低卷烟烟气刺激性和杂气，使烟气圆润、柔和，提升津润感和舒适性。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

（1）本发明提供了一种在料液中具有保质提质作用的YFM3菌株；

（2）本发明所述YFM3菌株应用到烟用料液中，能够抑制腐败细菌的增殖延缓料液的腐败变质，显著延长保质期，还能够降低卷烟烟气刺激性和杂气，使烟气圆润、柔和，提升津润感和舒适性；

（3）本发明方法具有成本低，操作易行和高效的优点，在延长料液保质期、提升料液品质方面具有很大应用潜力。

附图说明

图1是 YFM3菌株的革兰氏染色图。

图2是YFM3菌株的系统发育树图。

所述的菌株Bacillus nealsoniiYFM3保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期2017年11月17日，保藏缟号：CCTCC NO.M2017704。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是对本发明一部分实例，而不是全部的实例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：

Bacillus nealsonii YFM3的分离和筛选

1、培养基配制：胰蛋白大豆琼脂培养基：胰蛋白胨15 g/L、大豆胨5 g/L、氯化钠5g/L、琼脂15 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min；刚果红纤维素培养基：硝酸钠1 g/L、磷酸氢二钠1.2 g/L、磷酸二氢钾0.9 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、酵母浸出粉0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、刚果红0.2 g/L、纤维素粉5 g/L、琼脂15.0 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min；可溶性淀粉培养基：可溶性淀粉10 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁1 g/L、氯化钠1 g/L、硫酸铵2 g/L、碳酸钙2 g/L、硫酸亚铁0.001 g/L、氯化锰0.001g/L、硫酸锌0.001g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min。

2、菌株的分离和筛选

（1）细菌分离：从若干份烟用香精香料样品中，利用胰蛋白大豆培养基，采用稀释涂布平板法分离细菌，挑取单菌落经多次划线得到纯的菌株，经菌落形态和显微形态判断获得69株纯的细菌。

（2）菌株的纤维素酶活性筛选：将纯的菌株分别接种于刚果红纤维素培养基，30℃培养7-14d后，可溶性淀粉酶培养基使用碘液染色后观察，刚果红纤维素培养基直接观察，从69株菌中筛选得到4株具有较强纤维素酶活性的菌株。

（3）菌株的抑菌活性筛选：接种液体培养的菌株，于含有大肠杆菌的胰蛋白大豆肉汤中，采用试管抑菌法筛选菌株的抑菌活性，最终筛选获得具有较强抑菌活性的YFM3菌株。

菌株YFM3的鉴定

1 、材料和方法：（1）革兰氏染色采用革兰氏染色试剂盒进行；（2）生理生化鉴定采用梅里埃API 20NE微生物生理生化鉴定条进行；（3）16S rRNA序列系统发育分析：利用细菌基因组提取试剂盒提取YFM3基因组DNA，用16S rRNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增保守序列，并在华大基因有限公司进行测序，序列信息提交至NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行在线比对分析，采用Clustal x进行YFM3序列和近缘种序列的多重比对，再Mega 6进行系统发育树分析。

2 、结果：菌株YFM3在胰蛋白大豆琼脂培养基平板上的菌落特征：黄色，圆形，透明，光滑，边缘整齐，含水量大。经革兰氏染色显微鉴定，YFM3菌株革兰氏阳性、细胞杆状。β半乳糖苷酶阳性，精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、色氨酸脱羧酶阴性，吲哚产生阴性，柠檬酸和硫化氢阴性，能够利用葡萄糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷，但不能利用3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇、肌醇、阿拉伯糖，细胞色素氧化酶阴性，明胶阴性，硝酸还原盐和亚硝酸盐还原均为阴性。

表1 YFM3菌株的生理生化结果

注：“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。

将菌株YFM3的16S rRNA序列进行同源性比对，该菌株与Bacillus nealsoniiEU65611具有98%的相似性，结合生理生化结果，将该菌株鉴定为Bacillus nealsoniiYFM3，见YFM3菌株的16S rRNA序列表。

实施例2：

Bacillus nealsonii YFM3浓缩发酵液的制备

1、诱导及发酵培养基配制：含纤维素和可溶性淀粉的胰蛋白大豆肉汤诱导培养基：胰蛋白胨15 g/L、大豆胨5 g/L、氯化钠5 g/L、纤维素粉1-5 g/L，可溶性淀粉3-10 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min。

2、所述的YFM3菌株的保存：长期保存（＞1月）采用10%（v/v）甘油管于-80℃保存，短期保存（＜7d）采用胰蛋白大豆琼脂斜面培养基（胰蛋白胨 17.0g，大豆蛋白胨 3.0g，氯化钠 5.0g，磷酸氢二钾 2.5g，葡萄糖 2.5g，补水至1000 ml，pH 7.2）于4℃保存。

3、浓缩发酵液的制备：

（1）YFM3菌株的复苏和液体活化：取甘油管长期保存菌株，于37℃水浴中复苏，或取斜面短期保存菌株，接种于添加胰蛋白大豆肉汤培养基中，于36℃，130-140rpm培养14-20h，获得种子培养液；

（2）YFM3菌株的液体发酵扩大培养：将种子培养液以1%（v/v）接种量接种于添加纤维素粉2 g/L和可溶性淀粉3 g/L的胰蛋白大豆肉汤培养基中，于36℃，130-140rpm培养32h，获得YFM3菌株的发酵液；

（3）发酵液的收集和浓缩：于4℃，10000rpm离心15min，收集上清液，将上清液在旋转蒸发仪上浓缩至20倍，获得浓缩发酵液。

实施例3：

Bacillus nealsonii YFM3浓缩发酵液的制备

1、2与实施例2相同。

3、浓缩发酵液的制备：

（1）YFM3菌株的复苏和液体活化：取甘油管长期保存菌株，于37℃水浴中复苏，或取斜面短期保存菌株，接种于添加胰蛋白大豆肉汤培养基中，于36℃，130-140rpm培养14-20h，获得种子培养液；

（2）YFM3菌株的液体发酵扩大培养：将种子培养液以3%（v/v）接种量接种于添加纤维素粉5 g/L和可溶性淀粉9 g/L的胰蛋白大豆肉汤培养基中，于36℃，130-140rpm培养25h，获得YFM3菌株的发酵液；

（3）发酵液的收集和浓缩：于4℃，10000rpm离心20min，收集上清液，将上清液在旋转蒸发仪上浓缩至30倍，获得浓缩发酵液。

实施例4：

Bacillus nealsonii YFM3的应用

将实施例2或实施例3的YFM3菌株的浓缩发酵液以1%-10%（v/v）的使用量加入烟用料液中的，通过抑制腐败细菌的增殖延缓料液的腐败变质，显著延长保质期。

1、抑菌活性的测定

（1）烟用料液样品及处理：Y1002、Y1015和Y1043烟用料液，由某香精香料企业提供。采用0.22μm的一次性无菌滤膜过滤，备用；（2）浓缩发酵液的添加：以没有添加浓缩发酵液的料液为阴性对照，实验组添加浓缩发酵液，添加量分别为0.1%，0.5%，1%，5%，10%（v/v）；；（3）腐败细菌的添加：以没有添加浓缩发酵液、添加大肠杆菌菌液的烟用料液为阳性对照，将大肠杆菌采用胰蛋白大豆肉汤活化后，以10⁴CFU/mL接种于烟用料液中；（4）抑菌活性考察：采用试管抑菌法考察抑菌活性，将试管置于36℃培养48h；（5）结果显示：与阳性对照和阴性对照相比，在Y1002、Y1015和Y1043三种料液中，添加0.1%和0.5%的浓缩发酵液对大肠杆菌没有抑制作用，添加1%，5%和10%的浓缩发酵液能够有效抑制大肠杆菌的生长，具有显著的大肠杆菌抑制活性。

2、感官评吸

将浓缩发酵液分别以1%，5%，10%（v/v）的添加量分别添加至Y1002、Y1015和Y1043料液中，然后将料液均匀喷施于烟丝上，按常规方法制成卷烟，平衡后用于感官评吸。对照样品为用等量料液。

感官评吸结果显示，与对照卷烟相比，添加1%，5%，10%（v/v）浓缩发酵液后，卷烟烟气的刺激性显著下降，杂气减少，余味更加柔和，津润感和舒适性明显提升。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种菌株Bacillus nealsoniiYFM3及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 菌株YFM3(Bacillus nealsonii)

<400> 1

tgcagtcgag cggacttaaa aagcttgctt tttaagttag cggcggacgg gtgagtaaca 60

cgtgggcaac ctgcctgtaa gactgggata acttcgggaa accggagcta ataccggata 120

atcctttcct actcatgtag gaaagctgaa agacggttta cgctgtcact tacagatggg 180

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gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtacgag agtaactgct 420

cgtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480

atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggcggtcct 540

ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctgggggact 600

tgagtgcaga agagaagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga 660

ggaacaccag tggcgaaggc gactctttgg tctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt 720

ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780

ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag caaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840

acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatctcc tgacaatcct 960

agagatagga cgttcccctt cgggggacag gatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080

agcatttagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca 1200

aagggcagca aaaccgcgag gtcgagccaa tcccataaaa ccattctcag ttcggattgt 1260

aggctgcaac tcgcctacat gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380

cgaagtcggt ggggtaa 1397

<210> 2

<211> 3

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 23

<210> 3

<211> 3

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 22

Claims (2)

1.一种菌株 Bacillus nealsonii YFM3，其特征在于，所述菌株 Bacillus nealsoniiYFM3于2017年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2017704。

2.权利要求1所述的菌株 Bacillus nealsonii YFM3的应用，其特征在于：

1）YFM3的浓缩发酵液的制备：

（1）YFM3菌株的复苏和液体活化：取甘油管长期保存菌株，于37℃水浴中复苏，或取斜面短期保存菌株，接种于胰蛋白大豆肉汤培养基中，于36℃，130-140rpm培养14-20h，获得种子培养液；

（2）YFM3菌株的液体发酵扩大培养：将种子培养液以1%-3%（v/v）接种量接种于添加纤维素粉1-5 g/L和可溶性淀粉3-10 g/L的胰蛋白大豆肉汤培养基中，于36℃，130-140rpm培养25-32h，获得发酵液；

（3）发酵液的收集和浓缩：于4℃，10000rpm离心15-20min，收集上清液，将上清液在旋转蒸发仪上浓缩20-30倍，获得浓缩发酵液；

2）YFM3菌株的浓缩发酵液的应用：将YFM3菌株的浓缩发酵液以1%-10%（v/v）的使用量加入烟用料液中的，通过抑制腐败细菌的增殖延缓料液的腐败变质和提质。

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