CN112899179A - 一种耐低温高效农作物腐解菌液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种耐低温高效农作物腐解菌液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐低温高效农作物腐解菌液及其制备方法，所述一种耐低温高效农作物腐解菌液，所述菌液中含有如下腐解菌：假单胞菌（Pseudomonas sp.）PS3‑1、假单胞菌（Pseudomonas sp.）SC6‑1、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PS1‑1、有效活菌数≥1×109cfu/mL。本发明的优势在于制备的菌肥液中已含有微生物生长代谢所需的充足氮源，施用时无需额外补充氮源就能有效提高秸秆的腐熟效率；另一方面，融合了不同菌株的多种代谢途径以及不同降解酶系上的互补，戊糖片球菌能够有效降解秸秆木质纤维素的中间代谢产物，如低分子寡聚糖、乳酸和乙醇等，解除秸秆碳代谢过程中产物积累引起的阻遏效应。

Description

一种耐低温高效农作物腐解菌液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于耐低温液体菌肥领域，具体涉及一种耐低温高效农作物腐解菌液及其制备方法和应用。
背景技术
浙江省是我国华东地区典型的双季轮作种植区，该区冬季湿冷，茬口期短，秸杆在短时间内不易腐解。现有市售微生物秸秆降解菌剂产品虽多，但多数存在如下问题。
一、菌剂中的功能微生物由中温型或中高温型菌种组成，在低温条件下，微生物生长缓慢甚至停滞不能有效发挥降解功能。
二、菌株组成单一或不合理，有的菌剂产品中菌种组成单一，仅由纤维素降解细菌或2~3种纤维素降解细菌加真菌组成，缺乏木质纤维素中间代谢产物降解菌，容易造成产物累积引起的代谢阻遏效应，限制纤维素降解菌的降解功能。
针对该问题现有技术如名称为一种耐低温降解纤维素复合菌剂及其制备方法，申请号201811581735.2的专利所示，该专利的菌剂中功能菌虽然耐低温，但是菌种组成简单，仅由约氏黄杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌组成，该菌剂在8-16°C℃条件下45 d对秸秆的降解率才能达到50%以上，降解效率较低。
发明内容
针对上述低温条件下的秸秆降解效率问题，本发明以常年秸秆还田土壤为菌源，以农作物秸秆粉作为唯一碳源结合降温诱导筛选到3株高效且耐低温的纤维素降解菌，将其与秸秆腐解过程中的其他耐冷功能型真菌哈茨木霉、皮壳正青霉，以及木质纤维素中间产物降解菌戊糖片球菌进行复配，得到一种耐低温高效农作物秸秆腐解菌液，可以有效提高低温环境下的秸秆降解效率。
本发明技术方案的第一目的在于提供一种耐低温高效农作物腐解菌液，所述菌液中含有如下腐解菌：
假单胞菌（Pseudomonas sp.）PS3-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020037；
假单胞菌（Pseudomonas sp.）SC6-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020038；
不动杆菌（Acinetobactersp.）PS1-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020036；
所述菌剂中有效活菌数≥1×109cfu/mL。
本发明提供的一种耐低温高效农作物腐解菌液进一步设置为，所述菌液中还含有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCCNo.20191062。所述的戊糖片球菌属于乳酸菌中的一种，它能够有效降解秸秆木质纤维素的中间代谢产物，如低分子寡聚糖和乙醇等。
本发明提供的一种耐低温高效农作物腐解菌液进一步设置为，所述液体菌剂中还包含有哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）、皮壳正青霉（Eupenicillium crustaceum），所述哈茨木霉和皮壳正青霉购买于北京北纳创联生物技术研究院，所述哈茨木霉的保藏编号为BNCC336568、所述皮壳正青霉的保藏编号为BNCC146720。
所述的假单胞菌、不动杆菌、哈茨木霉和皮壳正青霉均为耐低温型纤维素降解功能菌，在低温条件下（5 ℃）其纤维素酶与木聚糖酶也能保持较好的酶活性。
本发明的第二目的在于提供一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 ：
步骤1，富集驯化
按无菌操作取土壤菌悬液接入富集培养基中，以农作物秸秆粉作为唯一碳源，振荡条件下进行富集驯化和传代培养，所述传代培养中每代降低5 ℃的温度梯度，按体积分数5%（V/V）接种量进行富集和驯化耐低温且高效降解秸秆的菌种；
步骤2，筛选分离
将步骤1中的富集培养液按梯度法稀释得到稀释液，吸取所述稀释液涂布于刚果红纤维素钠平板上倒置培养，选取菌落直径和水解圈直径较大且形态不同的菌落编号，重复液体培养和固体平板划线分离，将获得的纯菌转接到LB斜面培养基上，4 ℃冰箱保存；
步骤3，扩大培养
首先将步骤2的纯菌斜面用无菌接种环刮取适培养物接种于LB液体培养基；
根据各株菌的生长速率调整接菌和培养时间，按10~20%（V/V）接种量转接于对应类型的液体培养基中，进行扩繁，以便在同一时间获得对数生长中后期浓度基本一致的菌液，扩大培养后的菌液依然按无菌操作，进行离心浓缩；
步骤4，混合发酵
将步骤3离心浓缩收集的菌体/孢子，用无菌水制成浓度一致的重悬，将混合菌液接种到液体发酵培养基中，按照体积比1:1进行混合，得到性质功能稳定、有效活菌数≥1×109cfu/mL的复合微生物液体菌剂。
本发明提供的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法进一步设置为，菌种的筛选分离，将步骤1中的富集培养液按10倍梯度法稀释得到10-3~10-8稀释液，各吸取100 μL稀释液涂布于刚果红纤维素钠平板，于20~25 ℃温度下倒置培养，选取菌落直径和水解圈直径较大且形态不同的菌落编号，重复液体培养和固体平板划线分离，将获得的纯菌转接到LB斜面培养基上，4 ℃冰箱保存。
本发明提供的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法进一步设置为，扩大培养，首先将步骤2的纯菌斜面用无菌接种环刮取适培养物接种于LB液体培养基；哈茨木霉和皮壳正青霉经过活化后，用无菌水制成浓度一致的孢子液；根据各株菌的生长速率调整接菌和培养时间，按10~20%（V/V）接种量转接于对应类型的液体培养基中，进行扩繁，以便在同一时间获得对数生长中后期浓度基本一致的菌液，扩大培养后的菌液依然按无菌操作，进行离心浓缩。
本发明提供的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法进一步设置为，LB培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、 氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5~7，配制固体培养基时添加琼脂20 g；
PDA培养基：200 g去皮土豆煮汁1000 ml、蔗糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5g、维生素B1 10 mg，pH自然；配制固体培养基时添加琼脂20 g；
MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-801.0 m L、磷酸氢二钾2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000 m L，调pH 6.2~6.4。
8．根据权利要求 4 所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，液体发酵培养基：0.5%胰蛋白胨、0.5%NaCl、0.2%CaC03、0.1%酵母粉、0.3%沼液、水稻秸秆浸提液1000 mL，pH自然条件下，121℃下，灭菌20min。
本发明的第三目的在于提供一种耐低温高效农作物腐解菌液的应用，所述耐低温高效农作物腐解菌液应用于水稻秸秆的低温腐解，所述水稻秸秆产自冬季湿冷的华东地区的双季轮作种植区。
本发明提供的一种耐低温高效农作物腐解菌液的应用进一步设置为，所述菌液应用的田间温度范围为5～25℃，所述菌液的应用方法为喷洒于水稻秸秆表面，并做堆发酵。
有益效果
1、本发明提供的一种耐低温高效农作物腐解菌液中含有假单胞菌（Pseudomonassp.）PS3-1、假单胞菌（Pseudomonas sp.）SC6-1、不动杆菌（Acinetobacter sp.）PS1-1、且三种菌种均由实验室自行筛选并保藏，各菌株之间均不存在拮抗作用，满足组配条件，提高对纤维质降解能力。
2、本发明提供的耐低温高效农作物腐解菌液通过微生物菌复配并发酵而成，有效活菌数≥1×109cfu/mL，其低温性质功能稳定、秸秆腐解速度快，具有较高的市场推广和应用价值。
3、本发明提供的提供一种多菌种组配的水稻秸秆耐低温高效农作物腐解菌液剂的制备方法，制备的菌肥液中已含有微生物生长代谢所需的充足氮源，施用时无需额外补充氮源就能有效提高秸秆的腐熟效率；
4、本发明提供的提供一种多菌种组配的耐低温高效农作物腐解菌液剂的制备方法，菌肥融合了不同菌株的多种代谢途径以及不同降解酶系上的互补，戊糖片球菌能够有效降解秸秆木质纤维素的中间代谢产物，如低分子寡聚糖、乳酸、乙醇等，解除代谢产物积累引起的阻遏效应。
5. 本发明提供的提供一种多菌种组配的耐低温高效农作物腐解菌液剂通过以水稻秸秆为唯一碳源结合降温驯化，低温环境下可以高效降解秸秆，与秸秆腐解过程中的其他关键耐低温功能真菌（哈茨木霉和皮壳正青霉）、木质纤维素中间代谢产物降解菌（戊糖片球菌）之间无拮抗作用，液体菌剂可适用于华东地区的气候条件，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为耐低温降解菌在不同温度下、内切葡聚糖酶（a）的变化规律。
图2为耐低温降解菌在不同温度下外切葡聚糖酶（b）的变化规律。
图3为耐低温降解菌在不同温度下β-葡萄糖苷酶（c）的变化规律。
图4为耐低温降解菌在不同温度下木聚糖酶（d）的变化规律。
图5为耐低温降解菌在不同温度下滤纸酶活（e）的变化规律。
图6为耐低温降解菌在不同温度下的滤纸失重率。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，显然，下述的实施例是本发明一部分实施例，以更好的理解本发明，不用于限定本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供一种耐低温高效农作物秸秆腐解菌液的制备方法，包括如下步骤 ：
步骤1，富集驯化
按无菌操作取土壤菌悬液10 mL接入90 mL PCS 富集培养基中，于30 ℃、150r/min摇床振荡条件下进行富集培养，从中选取滤纸条颜色变化明显或发生崩解的处理转接入下一代富集培养基中进行传代培养，每代降低5℃的温度梯度传代培养按体积分数5%（V/V）接种量进行富集和驯化高效降解秸秆的菌种。
步骤2，筛选分离
将步骤1中的富集培养液按10倍梯度法稀释得到10-3~10-8稀释液，各吸取100 μL稀释液涂布于刚果红纤维素钠平板，于20~25℃温度下倒置培养，选取菌落直径和水解圈直径较大且形态不同的菌落编号，重复液体培养和固体平板划线分离，将获得的纯菌转接到LB斜面培养基上，4℃冰箱保存。
步骤3，扩大培养
首先将步骤2的纯菌斜面用无菌接种环刮取适培养物接种于LB液体培养基；哈茨木霉和皮壳正青霉经过活化后，用无菌水制成浓度一致的孢子液；根据各株菌的生长速率调整接菌和培养时间，按10~20%（V/V）接种量转接于对应类型的液体培养基中，进行扩繁，以便在同一时间获得对数生长中后期浓度基本一致的菌液，扩大培养后的菌液依然按无菌操作，进行离心浓缩。
LB培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、 氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH6.5~7，配制固体培养基时添加琼脂20 g；
PDA培养基：200 g去皮土豆煮汁1000 mL、蔗糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5g、维生素B1 10 mg，pH自然；配制固体培养基时添加琼脂20 g；
MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-801.0 m L、磷酸氢二钾2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000 m L，调pH 6.2~6.4。
步骤4，混合发酵
将步骤3离心浓缩收集的菌体/孢子，用无菌水制成浓度一致的重悬，按照体积比1:1进行混合，将混合菌液接种到液体发酵培养基中，室温下自然发酵10 d左右，得到性质功能稳定、有效活菌数≥1×109cfu/mL的复合微生物菌肥剂。
液体发酵培养基：0.5%胰蛋白胨、0.5%NaCl、0.2%CaC03、0.1%酵母粉、0.3%沼液、水稻秸秆浸提液1000 mL，pH自然，121 ℃下，灭菌20 min。
实施例2
本发明所述的一种耐低温高效农作物秸秆腐解菌液，选用了如下6种有效活性微生物：假单胞菌（Pseudomonas sp.）、不动杆菌（Acinetobactersp.）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）、皮壳正青霉（Eupenicillium crustaceum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），菌肥剂中有效活菌数≥1×109cfu/mL。
耐低温高效农作物秸秆降解菌的筛选。
按无菌操作，用无菌水将2株假单胞菌、1株不动杆菌、1株哈茨木霉、1株皮壳正青霉制成浓度为一致的菌悬液/孢子液，各取5mL接种于装有45mL产酶培养基的三角瓶中，在5~30℃，150r/min摇床振荡培养，于不同时段取发酵液测定β-葡萄糖苷酶活、内切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活、滤纸酶活和木聚糖酶活。
酶活力定义：在指定条件下，1mL酶液每分钟催化底物水解生成1μg还原糖的酶量为一个酶活力单位，用U表示。
产酶培养基：0.5%蛋白胨、0.5%水稻秸秆粉、0.5%NaCl、0.2%CaC03、0.1%酵母粉、蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。
测定结果如图1-图5所示。
如图1-图5所示，PS1-1在25℃下内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶活和滤纸酶活最高，分别为508.3、410.4、258.1、243.1和464.7U，在5℃低温条件下仍分别对应保持44.8%、60.4%、79.5%和51.70%的酶活力。PS3-1和SC6-1最适产酶温度为20℃，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活分别为404.9和457.6U、467.2和397.0U、263.5和196.4U 、500.9和399.2U，低温条件下（5℃）仍保持48.2%~63.8%和45.0~72.9%的酶活力。
实施例3
按无菌操作，用无菌水将2株假单胞菌、1株不动杆菌制成浓度为一致的菌悬液/孢子液，各取5mL接种于以滤纸为底物培养基中，5~30℃范围、150r/min摇床振荡培养10d取样，并加入适量的（5~10mL）的硫酸和硝酸钠混合溶液以去除菌体和不溶性碳酸钙后，过80目筛，筛上剩余底物用蒸馏水轻缓冲洗干净，80℃烘箱中烘干至恒重，称重，计算失重率，每组3个平行。
测定结果如图6所示。
如图6所示，在5℃下3株耐低温纤维素降解菌滤纸失重率同处于最低水平约为7%；在最适生长温度25℃下，PS1-1的滤纸失重率（21.6%）是5℃下的3倍，菌株PS3-1与SC6-1在20℃下对滤纸的降解能力最好，滤纸失重率分别为16.2%和21.6%。
通过以水稻秸秆为唯一碳源结合降温驯化，筛选得到了3株可适用于低温环境下具有高效降解秸秆的耐低温菌株，与秸秆腐解过程中的其他关键耐低温功能真菌（哈茨木霉和皮壳正青霉）、木质纤维素中间代谢产物降解菌（戊糖片球菌）之间，经平板对峙实验表明，6种有效活菌之间无拮抗作用，满足构建复合菌系的先决条件。复配扩繁后的液体菌剂可适用于华东地区干燥寒冷的气候条件，具有良好的应用前景。
液体菌肥的应用方法为喷洒于秸秆表面，并做堆发酵。发酵方法使用常规发酵手段和装置即可，整个操作简单，使用方便，易于推广使用。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种耐低温高效农作物腐解菌液，其特征在于，所述菌液中含有如下腐解菌：
假单胞菌（Pseudomonas sp.）PS3-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020037；
假单胞菌（Pseudomonas sp.）SC6-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020038；
不动杆菌（Acinetobacter sp.）PS1-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020036；
所述菌剂中有效活菌数≥1×109cfu/mL；。
2.根据权利要求1所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液，其特征在于，所述菌液中还含有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），所述戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.20191062。
3.根据权利要求1所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液，其特征在于，所述液体菌剂中还包含有哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）、皮壳正青霉（Eupenicillium crustaceum），所述哈茨木霉和皮壳正青霉购买于北京北纳创联生物技术研究院，所述哈茨木霉的保藏编号为BNCC336568、所述皮壳正青霉的保藏编号为BNCC146720。
4.一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 ：
步骤1，富集驯化
按无菌操作取土壤菌悬液接入富集培养基中，以农作物秸秆粉作为唯一碳源，振荡条件下进行富集驯化和传代培养，所述传代培养中每代降低5 ℃的温度梯度，按体积分数5%（V/V）接种量进行富集和驯化耐低温且高效降解秸秆的菌种；
步骤2，筛选分离
将步骤1中的富集培养液按梯度法稀释得到稀释液，吸取所述稀释液涂布于刚果红纤维素钠平板上倒置培养，选取菌落直径和水解圈直径较大且形态不同的菌落编号，重复液体培养和固体平板划线分离，将获得的纯菌转接到LB斜面培养基上，4 ℃冰箱保存；
步骤3，扩大培养
首先将步骤2的纯菌斜面用无菌接种环刮取适培养物接种于LB液体培养基；
根据各株菌的生长速率调整接菌和培养时间，按10~20%（V/V）接种量转接于对应类型的液体培养基中，进行扩繁，以便在同一时间获得对数生长中后期浓度基本一致的菌液，扩大培养后的菌液依然按无菌操作，进行离心浓缩；
步骤4，混合发酵
将步骤3离心浓缩收集的菌体/孢子，用无菌水制成浓度一致的重悬，将混合菌液接种到液体发酵培养基中，按照体积比1:1进行混合，得到性质功能稳定、有效活菌数≥1×109cfu/mL的复合微生物液体菌剂。
5.如权利要求 4所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，菌种的筛选分离，将步骤1中的富集培养液按10倍梯度法稀释得到10-3~10-8稀释液，各吸取100 μL稀释液涂布于刚果红纤维素钠平板，于20~25 ℃温度下倒置培养，选取菌落直径和水解圈直径较大且形态不同的菌落编号，重复液体培养和固体平板划线分离，将获得的纯菌转接到LB斜面培养基上，4 ℃冰箱保存。
6.根据权利要求4所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，扩大培养，首先将步骤2的纯菌斜面用无菌接种环刮取适培养物接种于LB液体培养基；哈茨木霉和皮壳正青霉经过活化后，用无菌水制成浓度一致的孢子液；根据各株菌的生长速率调整接菌和培养时间，按10~20%（V/V）接种量转接于对应类型的液体培养基中，进行扩繁，以便在同一时间获得对数生长中后期浓度基本一致的菌液，扩大培养后的菌液依然按无菌操作，进行离心浓缩。
7.根据权利要求4所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，LB培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、 氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5~7，配制固体培养基时添加琼脂20 g；
PDA培养基：200 g去皮土豆煮汁1000 ml、蔗糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、维生素B1 10 mg，pH自然；配制固体培养基时添加琼脂20 g；
MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、蒸馏水1000 m L，调pH 6.2~6.4。
8.根据权利要求 4 所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，液体发酵培养基：0.5%胰蛋白胨、0.5%NaCl、0.2%CaC03、0.1%酵母粉、0.3%沼液、水稻秸秆浸提液1000 mL，pH自然，121℃下，灭菌20min。
9.一种耐低温高效农作物腐解菌液的应用，其特征在于，所述耐低温高效农作物腐解菌液应用于水稻秸秆的低温腐解，所述水稻秸秆产自冬季湿冷的华东地区的双季轮作种植区。
10.根据权利要求 9所述的应用，其特征在于，所述菌液应用的田间温度范围为5～25℃，所述菌液的应用方法为喷洒于水稻秸秆表面，并做堆发酵。
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