CN107574125A

CN107574125A - 一种高产蛋白酶的米曲霉菌种及其在酱油中的应用

Info

Publication number: CN107574125A
Application number: CN201710699097.3A
Authority: CN
Inventors: 宋绪磊; 舒冬梅; 宋涛; 王德良
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明公开了一种高产蛋白酶的酱油米曲霉菌种，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.14145，该菌种产孢子能力强，蛋白酶活性高。同时本发明在参考各种文献的基础上结合生产实践创新试验方法，利用新型ARTP诱变育种方法诱变米曲霉，采用透明圈法和96孔板法建立高通量筛选突变菌株的方法，获得高产蛋白酶的米曲霉突变株，提高米曲霉分解蛋白的能力，提高了酱油中氨基酸含量和原料利用率。

Description

一种高产蛋白酶的米曲霉菌种及其在酱油中的应用

技术领域

本发明涉及一种高产蛋白酶的米曲霉菌种及其高效筛选方法和在酱油中的应用，该菌种已经保存到中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.14145，属于微生物技术领域。同时本发明还建立高通量筛选突变菌株的的方法，提高米曲霉分解蛋白的能力，提高了酱油中氨基酸含量和原料利用率。

背景技术

酱油的酿造是通过以微生物为动力，将原料中的蛋白质、糖类、脂类等经过复杂的生物化学反应，生成多糖、单糖、氨基酸、多肽、酯类、风味物质等的一系列过程。目前酱油微生物中研究较多的微生物是米曲霉，主要是因为米曲霉产生的酶系丰富并且各种酶系综合作用对酱油风味的形成起重要作用，其中起关键作用的是蛋白酶，米曲霉分泌的蛋白酶使原料中的蛋白质降解生成氨基酸，提高酱油氨基酸含量。目前我国大多数酱油厂采用沪酿3.042以及经过诱变后选育的新菌株，但是其蛋白酶活力依然不够高，导致我国酱油原料蛋白利用率在75%左右，而日式酱油这个指标已经达到90%。

米曲霉菌种的诱变方法包括物理、化学、生物诱变，前人对于米曲霉菌种诱变方法有多种。袁艳玲等人以米曲霉Y0为出发菌株，通过紫外线与DES 复合诱变，0.4%干酪素培养基初步筛选，获得一株高产中性蛋白酶菌株 H2-5，其中性酶活力为 2158 U/g，经10 代培养，菌株中性蛋白酶活力具有良好的遗产稳定性。近几年ARTP（常压室温等离子体）诱变方法比较新颖，ARTP诱变产生等离子体均匀、射流温度低、需氦气装置、操作简便、对细胞与生物大分子作用明显等优势。因此，ARTP诱变方法应用广泛，如化学净化剂、热敏感性医疗仪器消毒以及生物方面。生物方面已应用于酵母、大肠杆菌、刺糖多孢菌、米曲霉等微生物诱变并取得良好效果。目前存在的问题是现有的筛选方法还是停留在基本的水解圈固体平板等手段，普遍的筛选效率偏低，并且目前的蛋白质分解能力也普遍偏低。本试验在参考各种文献的基础上结合生产实践创新试验方法，利用新型ARTP诱变育种方法诱变米曲霉，建立96孔板液体法建立高通量筛选突变菌株的的方法，并获得高产蛋白酶的米曲霉突变株，提高米曲霉分解蛋白的能力，从而提高酱油中氨基酸含量，提高酱油质量和国际竞争力。

发明内容

本发明的内容是一种高产蛋白酶的酱油米曲霉菌种及其高效筛选方法，该菌种已经保存到中国普通微生物菌种保藏中心，保藏日期：2017.8.7，分类命名：Aspergillusoryzae,保藏地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO. 14145。

本发明针对高产蛋白酶的酱油米曲霉菌种所用的筛选方法如下：

1、将活化好的米曲霉菌种接种PDA培养基上，培养温度28℃，当培养18-24小时是对数期，本试验采用对数期36小时时的米曲霉，将对数期的米曲霉用0.8%生理盐水调其浓度，在光学显微镜下计数，将菌浓度调至2×10⁶个/mL。将配制的2×10⁶个/mL孢子悬浮液取95ul，取50%甘油5ul，两者均匀混合，以保护米曲霉孢子。

2、采用氦气为工作气体，使载片与等离子体发生器射流出口间距约为 2mm，功率为120w，气流量10SLM，对10uL孢子（10⁶CFU/mL）悬液进行诱变，处理完毕后，梯度稀释孢子悬液为，取 100uL 各稀释倍数孢子悬浮液涂布选择培养皿，培养皿采用茚三酮蛋白显色培养基，28℃培养三天后，挑选蓝色水解圈比较大的菌落，完成初筛过程，然后将水解圈较大的菌落孢子制作成孢子悬液。

3、在96孔板中加入一定比例豆粕和面粉，调成浆液，高温下加热30分钟，冷却到室温后，按照一定比例加入以上孢子悬液，于28℃恒温生化培养箱摇床培养36h后，加入10uL茚三酮，100℃水浴准确加热16min，在20℃±0.1℃水浴中冷却20min，再各加入稀释溶液50uL，充分摇匀。用空白试管水调节仪器零点，于波长570nm下，测量吸光度，测量应在30min内完成。吸光度大的菌种选为目标菌种，完成复筛。

4、将本发明得到的高产蛋白酶的酱油米曲霉菌种在酱油制曲和酱油发酵中的应用，显著提高了原料的蛋白利用率。

本发明有以下优点和显著进步：

1、本发明得到一种高产蛋白酶的酱油米曲霉菌种，比现有的菌株蛋白酶活力更高，能显著提高原料的利用率。

2、本发明涉及到一种米曲霉高效筛选方法，筛选效率更高，比目前的平板方法更为实用。

3、本发明得到的菌株在酱油酿造中的应用，该菌种可以提高米曲霉分解蛋白的能力，提高了酱油中氨基酸含量和原料利用率，从78%达到87%。

具体实施方式

实施例1：

1、生长曲线绘制:

将米曲霉从试管斜面转接到PDA平板上，28℃培养72h。将活化好的米曲霉用接种环接3环到装有已灭菌12°麦汁的三角瓶中，自保藏斜面中挑取三环米曲霉孢子接入装有10mL无菌麦汁培养基的试管中，摇匀，制成孢子悬液，于28℃培养箱中培养活化24h。将10mL菌悬液倒入装有300mL无菌麦汁培养基的三角瓶中，摇匀，制成孢子悬液，于28℃培养箱中摇床培养。

取14个2ml的离心管，称重并分别记录离心管的重量，精确到0.0001g。吸取1ml的12°麦汁和200ul的1.5×10⁵的活化菌液，置于28℃摇床培养。于培养后的第0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、48、52、56h取出相应的标号的离心管，置于4℃冰箱保存。待全部离心管取出，统一8000r/min，离心15min。60℃烘干3h，称量重量，精确到0.0001g。

计算公式：孢子数/mL=

2、ARTP诱变

2.1菌悬液制作

将活化好的米曲霉菌种接种PDA培养基上，培养温度28℃，当培养18-24小时是对数期，本试验采用对数期36小时时的米曲霉，将对数期的米曲霉用0.8%生理盐水调其浓度，在光学显微镜下计数，将菌浓度调至1×10⁶个/mL至1×10⁸个/mL。本试验最终米曲霉菌孢子浓度为2×10⁶个/mL。将配制的2×10⁶个/mL孢子悬浮液取95ul，取50%甘油5ul，两者均匀混合，以保护米曲霉孢子。

1.6.2ARTP照射剂量的确定

采用氦气为工作气体，使载片与等离子体发生器射流出口间距约为 2mm，功率为120w，气流量10SLM，对10uL孢子（10⁶CFU/mL）悬液进行诱变，处理时间设置0、20、60、80、100、120、150、180、210、240完毕后，稀释孢子悬液为2×10⁴ CFU/mL、2×10³ CFU/mL、2×10² CFU/mL取 100uL 各稀释倍数孢子悬浮液涂布选择培养皿，28℃培养3d计数，计算致死率（三个重复的平均值）。

致死率计算=致死率=100%

2.2初筛方法

挑选ARTP诱变140s的平板上的菌落点种于茚三酮蛋白显色培养基，28℃培养72h观察记录变色圈和菌落大小，计算出K值。挑取K值较大并且孢子数较多的菌落接种于马铃薯试管斜面培养基于30℃，培养72小时，试管内布满淡绿色米曲霉菌丝停止。然后4℃冰箱保存备用。

2.3高通量复筛方法

将初选的15个菌株PDA平板培养72h，制备每个菌株的菌悬液，菌浓度为2.5×10⁶个/ml。采用18cm×18mm的试管加入1-15号诱变菌株菌悬液1mL和1mL0.1%干酪素培养基，以试管中加入2mL为对照试验，每个处理重复三次。

于28℃恒温生化培养箱摇床培养36h后，从每个试管中取出40uL液体置于96孔板中，加入10uL发色剂，100℃水浴准确加热16min，在20℃±0.1℃水浴中冷却20min。再各加入稀释溶液50uL，充分摇匀。用空白试管水调节仪器零点，于波长570nm下，测量吸光度，测量应在30min内完成。

样品中的α-氨基氮含量按公式（8）计算。

式中：

X-麦芽汁的α-氨基氮含量，单位为毫克每升（mg/L）；

A1-样液的平均吸光度；

A2-甘氨酸标准使用液的平均吸光度；

2-甘氨酸标准使用液中α-氨基氮的含量，单位为毫克每升（mg/L）；

n-样液的稀释倍数

2.4高通量复筛方法的验证

采用福林酚法对高通量复筛出的5、12、15三个菌株进行蛋白酶活力测定。

3.筛选结果

采用吸光度法测定α-氨基氮含量，根据甘氨酸标准曲线得到α-氨基氮含量在0-10mg/L的范围内，吸光值范围在0-1.6内，吸光度随其浓度增大而增大，并且遵循y = 0.1677x +0.0643（R² = 0.992）直线关系。米曲霉蛋白酶活越高，分解酪蛋白变成α-氨基酸的含量就越高，α-氨基酸与茚三酮反应。所以可以依据米曲霉与酪蛋白反应后测得的吸光值来判断米曲霉的综合蛋白酶活力。从上表可知ARTP诱变后菌5、12、15菌株总蛋白酶活力明显高于出发菌株0菌株。菌株5的酸性、中性和碱性蛋白酶活力分别为197.48U/g、1536.94 U/g 、3486.25 U/g；12的三种蛋白酶活分别为169.42 U/g、1603.59 U/g、3724.56 U/g；15的三种蛋白酶活分别为208.43 U/g、1792.79 U/g、3825.36 U/g。根据米曲霉酶活力测定最终三个菌株的蛋白酶活与采用96孔板筛选结果一致，即5、12、15菌株总蛋白酶活力明显高于出发菌株0并且高于其他菌株。

4、酱油酿造实验

本发明得到的菌株在酱油酿造中的应用，该菌种通过制曲、发酵、压寨等工序，提高米曲霉分解蛋白的能力，提高了酱油中氨基酸含量和原料利用率，从78%达到87%。

Claims

1.一种高产蛋白酶的酱油米曲霉菌种，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO. 14145。

2.如权利要求1所述的米曲霉菌种，所用的筛选方法如下：

1）制作孢子液，将活化好的米曲霉菌种接种PDA培养基上，培养温度28℃，当培养18-24小时是对数期，本试验采用对数期36小时时的米曲霉，将对数期的米曲霉用0.8%生理盐水调其浓度，在光学显微镜下计数，将菌浓度调至2×10⁶个/mL,配制的2×10⁶个/mL孢子悬浮液取95ul，取50%甘油5ul，两者均匀混合，以保护米曲霉孢子;

2) 初筛，采用氦气为工作气体，使载片与等离子体发生器射流出口间距约为 2mm，功率为120w，气流量10SLM，对10uL孢子（10⁶CFU/mL）悬液进行诱变，处理完毕后，梯度稀释孢子悬液为，取 100uL 各稀释倍数孢子悬浮液涂布选择培养皿，培养皿采用茚三酮蛋白显色培养基，28℃培养三天后，挑选蓝色水解圈比较大的菌落，完成初筛过程，然后将水解圈较大的菌落孢子制作成孢子悬液;

3) 复筛，在96孔板中加入一定比例豆粕和面粉，调成浆液，高温下加热30分钟，冷却到室温后，按照一定比例加入以上孢子悬液，于28℃恒温生化培养箱摇床培养36h后，加入10uL茚三酮，100℃水浴准确加热16min，在20℃±0.1℃水浴中冷却20min，再各加入稀释溶液50uL，充分摇匀,用空白试管水调节仪器零点，于波长570nm下，测量吸光度，测量应在30min内完成,吸光度大的菌种选为目标菌种，完成复筛。

3.如权利要求1所述的高产蛋白酶的酱油米曲霉菌种在酱油制曲和酱油发酵中的应用。