CN108410945A - 餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法 - Google Patents

餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法 Download PDF

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胡孔兴
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张敏敏
杨浩毅
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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Abstract

本发明提供了餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，方法为：1)增菌：称取样品至氯化钠肉汤中，均质后，厌氧培养；2)分离：将增菌后的培养物，划线接种到金黄色葡萄球菌选择性平板上，厌氧培养；3)初步鉴定：根据形貌初步确定金黄色葡萄球菌菌落；4)确证鉴定：挑取金黄色葡萄球菌选择性平板上可疑菌落接种到血平板上，培养，观察是否溶血，选取溶血的菌落利用VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析系统进行生化鉴定；得到结果。与现有技术相比，本发明利用了金黄色葡萄球菌为需氧兼性厌氧菌以及其代谢产物中能产生血浆凝固酶的特点，对于不溶血的可疑菌落不用再做鉴定试验，缩短了金黄色葡萄球菌的检测时间，减小了检测难度。

Description

餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法。
背景技术
餐饮是人们赖以生存的基础，随着生活节奏的加快，工作压力的增加，特别是互联网销售的突起，人们对于大众化餐饮的需求每年都在呈现上升趋势，线上订餐已经成为一种流行。
餐饮食品中的致病菌常规检测项目为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。金黄色葡萄球菌(Staphylococous aureus)系微球菌科，兼性厌氧菌，抵抗能力较强，分布较广，广泛存在于空气、尘埃、水以及人和动物的排泄物中,是引起食物中毒的常见致病菌之一，也是在餐饮食品检测中检出率最高的致病菌。
据美国疾病控制中心报告，在美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒数量仅次于大肠埃希菌，居第2位，占细菌性食物中毒的33％，而在加拿大则占45％。日本的调查结果表明，平均32.5％的食品存在金黄色葡萄球菌的污染。2010—2012年北京市共报告细菌性食物中毒27起,其中金黄色葡萄球菌食物中毒占22％。
现有的金黄色葡萄球菌的检测方法为GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》，该标准中第一法金黄色葡萄球菌定性检验从样品增菌到最后确证鉴定，需要5天时间，而且由于餐饮中大多含有大肠菌群、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌等其他微球菌的干扰，且微球菌属在Baird-Parker平板上菌落形态极其相似，不宜区分，增加了检测难度。
发明内容
为解决现有检测标准GB 4789.10-2016检测餐饮中金黄色葡萄球菌时间长，干扰大、对检验人员要求高等问题，本发明提供了餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法。
本发明具体技术方案如下：
餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括以下步骤：
1)增菌：称取待测样品至氯化钠肉汤中，均质后，厌氧培养；
2)分离：将增菌后的培养物，划线接种到金黄色葡萄球菌选择性平板上，厌氧培养；
3)初步鉴定：根据形貌初步确定金黄色葡萄球菌菌落；
4)确证鉴定：挑取金黄色葡萄球菌选择性平板上至少5个可疑菌落接种到血平板上，培养，观察是否溶血，选取溶血的菌落利用VITEK 2COMPACT全自动微生物分析系统进行生化鉴定；得到结果。
步骤1)中所述均质为8000r/min-10000r/min均质1-2min；所述厌氧培养具体为：36±1℃厌氧培养18h-24h。
步骤1)具体为：称取25g样品至225mL 7.5％氯化钠肉汤中，8000r/min-10000r/min均质1-2min后，于36±1℃厌氧培养18h-24h。
步骤2)中所述金黄色葡萄球菌选择性平板制备方法为：
取Baird-Parker培养基于蒸馏水中加热煮沸至完全溶解，高压灭菌后，加入亚碲酸钾卵黄增菌液，再加入冻干兔血浆，混匀后倾注平板备用。
步骤2)中所述金黄色葡萄球菌选择性平板制备方法具体为：
称取6.3g Baird-Parker培养基于95mL蒸馏水中加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min后，再加入5mL亚碲酸钾卵黄增菌液，冷却至50±1℃后加入0.5mL冻干兔血浆，混匀后立即倾注平板备用。
步骤2)中所述厌氧培养是指：36±1℃厌氧培养24h-48h。
步骤3)初步鉴定方法为：
金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌选择性平板上呈圆形，表面光滑、凸起，菌落直径为2-3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色的边缘，周围绕以不透明圈，其外有一清晰透明带。
步骤4)中所述培养是指于36±1℃培养18h-24h。
步骤4)中可疑菌落不足5个全都挑选。
其余培养基和试剂参照GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》。
本发明通过对2015年-2017年3年餐饮食品中微生物检验结果的分析，利用了金黄色葡萄球菌为需氧兼性厌氧菌以及其代谢产物中能产生血浆凝固酶的特点，将传统的国标检测方法进行了改进，缩短了餐饮食品中金黄色葡萄球菌的检测时间，减小了检测难度。
本发明提供的方法在增菌和分离时采用厌氧培养，有效阻止了餐饮中其他需氧菌(主要为大肠菌群)的生长，在分离时采用的金黄色葡萄球菌选择性平板对金黄色葡萄球菌有很好的选择性，餐饮易污染的其他微球菌，如：表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌等在该平板上生长情况较差，甚至不生长。将血平板的接种放在金黄色葡萄球菌选择性平板接种之后进行，对于不溶血的可疑菌落不用再做鉴定试验，减少了工作量并缩短了检验周期。最终生化鉴定采用VITEK 2COMPACT(全自动微生物分析系统)仪，而不是国标法的血浆凝固酶试验，又可以减去每半小时观察凝固现象的繁琐环节和结果不理想的重复试验次数。
与现有技术相比，本发明利用了金黄色葡萄球菌为需氧兼性厌氧菌以及其代谢产物中能产生血浆凝固酶的特点，对于不溶血的可疑菌落不用再做鉴定试验，缩短了金黄色葡萄球菌的检测时间，减小了检测难度。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌在本发明制备的金黄色葡萄球菌选择性平板上的菌落形态；
图2为金黄色葡萄球菌在国标法Baird-Parker平板上的菌落形态；
图3为表皮葡萄球菌在金黄色葡萄球菌选择性平板上的菌落形态；
图4为表皮葡萄球菌在国标法Baird-Parker平板上的菌落形态；
图5为实施例1检测时VITEK 2COMPACT全自动微生物分析系统仪进行生化鉴定生化结果。
具体实施方式
实施例1
先选购和制备培养基和试剂：
金黄色葡萄球菌选择性平板的制备方法：
Baird-Parker培养基、亚碲酸钾卵黄增菌液和冻干兔血浆均采购于北京陆桥。
称取6.3g Baird-Parker培养基于95mL蒸馏水中加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min后，加入5mL亚碲酸钾卵黄增菌液，冷却至50±1℃后加入0.5mL冻干兔血浆，混匀后立即倾注平板备用。
其余培养基和试剂参照GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》。
餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括以下步骤：
1)增菌：称取25g待测餐饮样品至225mL7.5％氯化钠肉汤中，10000r/min均质1.5min后，于36℃厌氧培养24h；
2)分离：将增菌后的培养物，划线接种到金黄色葡萄球菌选择性平板上，36℃厌氧培养48h；
3)初步鉴定：金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌选择性平板上呈圆形，表面光滑、凸起、菌落直径为2-3mm,颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外有一清晰透明带。
4)确定鉴定：步骤3)挑取选择性平板上的可疑菌落(如图1)至少5个(不足5个全挑)接种到血平板上，于36℃培养24h后，观察是否溶血。不溶血即可报告在25g样品中未检出金黄色葡萄球菌。溶血的菌落需挑取菌落0.5-1个溶于3mL 0.45％的Nacl溶液中，配置成麦氏浊度为0.5-0.63McF的菌悬液，选用GP卡片，上VITEK 2COMPACT(全自动微生物分析系统)仪进行生化鉴定(生化结果见图)。
实施例2
先选购和制备培养基和试剂：
同实施例1
餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括以下步骤：
1)增菌：称取25g待测餐饮样品至225mL7.5％氯化钠肉汤中，8000r/min均质2min后，于37℃厌氧培养20h；
2)分离：将增菌后的培养物，划线接种到金黄色葡萄球菌选择性平板上，37℃厌氧培养30h；
3)初步鉴定：金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌选择性平板上呈圆形，表面光滑、凸起、菌落直径为2-3mm,颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外有一清晰透明带。
4)确定鉴定：步骤3)挑取选择性平板上的可疑菌落(如图1)至少5个(不足5个全挑)接种到血平板上，于37℃培养20h后，观察是否溶血。不溶血即可报告在25g样品中未检出金黄色葡萄球菌。溶血的菌落需挑取菌落0.5-1个溶于3mL 0.45％的Nacl溶液中，配置成麦氏浊度为0.5-0.63McF的菌悬液，选用GP卡片，上VITEK 2COMPACT(全自动微生物分析系统)仪进行生化鉴定，得到鉴定结果。

Claims (9)

1.餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)增菌：称取待测样品至氯化钠肉汤中，均质后，厌氧培养；
2)分离：将增菌后的培养物，划线接种到金黄色葡萄球菌选择性平板上，厌氧培养；
3)初步鉴定：根据形貌初步确定金黄色葡萄球菌菌落；
4)确证鉴定：挑取金黄色葡萄球菌选择性平板上至少5个可疑菌落接种到血平板上，培养，观察是否溶血，选取溶血的菌落利用VITEK 2COMPACT全自动微生物分析系统进行生化鉴定；得到结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述厌氧培养具体为：36±1℃厌氧培养18h-24h。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述均质为8000r/min-10000r/min均质1-2min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述金黄色葡萄球菌选择性平板制备方法为：
取Baird-Parker培养基于蒸馏水中加热煮沸至完全溶解，高压灭菌后，加入亚碲酸钾卵黄增菌液，再加入冻干兔血浆，混匀后倾注平板备用。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述金黄色葡萄球菌选择性平板制备方法具体为：
称取6.3g Baird-Parker培养基于95mL蒸馏水中加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min后，再加入5mL亚碲酸钾卵黄增菌液，冷却至50±1℃后加入0.5mL冻干兔血浆，混匀后立即倾注平板备用。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述厌氧培养是指：36±1℃厌氧培养24h-48h。
7.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤3)初步鉴定方法为：
金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌选择性平板上呈圆形，表面光滑、凸起，菌落直径为2-3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色的边缘，周围绕以不透明圈，其外有一清晰透明带。
8.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述培养是指于36±1℃培养18h-24h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中可疑菌落不足5个全都挑选。
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