CN110800913B - 一种替代加工肉制品中亚硝酸盐的发色剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种替代加工肉制品中亚硝酸盐的发色剂，属于食品科学中的肉品科学技术领域。本发明一种发色剂为凝固酶阴性葡萄球菌的菌粉剂或菌悬液，使用时在肉制品加工中的接种量为106～107 CFU/g肉；本发明的另一种发色剂由凝固酶阴性葡萄球菌的菌粉剂或菌悬液和L‑精氨酸组成；使用时，凝固酶阴性葡萄球菌在肉制品加工中的接种量为106～107 CFU/g肉，L‑精氨酸在肉制品加工中的添加量为其质量的0.6～1.2%。所述菌粉剂或菌悬液由凝固酶阴性葡萄球菌通过液体培养基培养制得。本发明使用了具有一氧化氮合酶的凝固酶阴性葡萄球菌，可以在加工肉制品中产生一氧化氮，从而形成红色的亚硝基肌红蛋白，使加工肉制品呈现红色泽；同时添加L‑精氨酸，可以进一步提升红色泽。
Description
技术领域
本发明属于食品科学／肉品科学技术领域，具体涉及一种替代加工肉制品中亚硝酸盐的发色剂。
背景技术
色泽是衡量肉制品品质的重要指标。肉制品的色泽主要由肌红蛋白的含量及其状态所决定。亚硝酸盐是肉制品发色剂，在还原物质的作用下反应生成一氧化氮（Nitricoxide; NO），NO和肌红蛋白反应生成亚硝基肌红蛋白，使肉制品呈现红色泽。然而，由于亚硝酸盐的自身毒性和潜在致癌性，其应用受到限制。因此，人们迫切需要一种新物质来替代亚硝酸盐。
发明内容
为了提高肉制品的安全性，替代亚硝酸盐在加工肉制品中的使用，本发明提供一种替代加工肉制品中亚硝酸盐的发色剂。
一种替代加工肉制品中亚硝酸盐的发色剂由凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulasenegative staphylococcus）通过液体培养基培养制得的菌粉剂或菌悬液，在肉制品加工中具体使用时凝固酶阴性葡萄球菌直接接种，接种量为106～107 CFU/g肉。
一种替代加工肉制品中亚硝酸盐的发色剂由凝固酶阴性葡萄球菌和L-精氨酸组成；所述凝固酶阴性葡萄球菌通过液体培养基培养制得的菌粉剂或菌悬液；在肉制品加工中具体使用时凝固酶阴性葡萄球菌直接接种，接种量为106～107 CFU/g肉；在肉制品加工中L-精氨酸直接添加使用，加入量为加工肉制品质量的0.6～1.2%。
进一步限定的技术方案如下：
所述凝固酶阴性葡萄球菌的菌悬液或菌粉剂的制备操作步骤如下：
（1）将活化好的凝固酶阴性葡萄球菌接种于7.5%氯化钠肉汤培养基或其他适宜葡萄球菌生长的培养基中，接种量为3%～4%(V/V)，37℃培养18h，连续转接培养3次，得到第三代发酵菌液；
（2）将第三代发酵菌液在4℃下，10,000g离心5min，取沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，并将沉淀重悬浮，得到菌悬液；
（3）将菌悬液冷冻干燥，得到菌粉剂。
所述凝固酶阴性葡萄球菌具有一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase; NOS)，包括但不限于木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus），或小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1. 本发明使用了具有一氧化氮合酶的凝固酶阴性葡萄球菌和L-精氨酸，提供了两种发色剂，一种是单独添加具有NOS的凝固酶阴性葡萄球菌，另一种是同时添加具有NOS的凝固酶阴性葡萄球菌与L-精氨酸。其中凝固酶阴性葡萄球菌是肉制品常见的一类发酵剂，有报道指出部分菌株具有NOS活性，而具有NOS基因（nos）则是菌株具有NOS活性的生物学基础。NOS广泛存在于哺乳动物中，可催化L-精氨酸代谢产生NO。近年来，人们在细菌体内发现了NOS，发现其在细菌的氧化应激中扮演着重要的作用。考虑到NOS催化产生的NO与肌红蛋白结合后可产生亚硝基肌红蛋白，这使得具有NOS的细菌添加到加工类肉制品中以替代亚硝酸盐发色成为可能。具有NOS的凝固酶阴性葡萄球菌，可以在加工肉制品中产生NO，从而形成红色的亚硝基肌红蛋白，使加工肉制品的色泽显著提升。L-精氨酸是NOS的底物，在加工类肉制品中添加L-精氨酸可以有助于NO的生成。将具有NOS的凝固酶阴性葡萄球菌和L-精氨酸共同使用作为发色剂，可进一步提升产品颜色，使其达到添加亚硝酸盐产品的红度值。
2. 本发明使用的L-精氨酸还具有多种保健功能，例如：减少肥胖人群的代谢紊乱、预防心血管疾病、改善肠道功能等，具有很大的应用价值。
附图说明
图1-1为木糖葡萄球菌nos基因PCR扩增结果电泳图；
图1-2为木糖葡萄球菌中NO荧光探针检测图；
图1-3为不同处理对香肠颜色的影响图；
图1-4为不同处理对香肠中提取的色素的光谱分析图；
图1-5为不同处理香肠的电子自旋共振光谱图；
图2-1为小牛葡萄球菌nos基因PCR扩增结果电泳图；
图2-2为小牛葡萄球菌中NO荧光探针检测图；
图2-3为不同处理对香肠颜色的影响图；
图2-4为不同处理对香肠中提取的色素的光谱分析图；
图2-5为不同处理香肠的电子自旋共振光谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。应当理解，这下面的描述的实施例是示例性的，仅是用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下述实施例中的具体实施方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的原辅料、试剂，如无特殊说明，均来自商店或试剂销售公司。
实施例1
单独添加木糖葡萄球菌作为发色剂，或与L-精氨酸一起添加作为发色剂，用于无亚硝酸盐添加香肠的色泽形成
一、试验设计
通过PCR实验以及荧光发光实验对木糖葡萄球菌基因以及表型进行鉴定，判定其是否具备发色的理论基础。进一步，单独添加木糖葡萄球菌作为发酵香肠发色剂，或与L-精氨酸同时添加作为发色剂。通过对香肠色泽的测定、亚硝基肌红蛋白的鉴定及其含量的测定来考察其色泽形成能力。木糖葡萄球菌Staphylococcus xylosus，购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号为：No.5049。
二、实验方法
（一）nos基因在木糖葡萄球菌中的鉴定
（1）引物设计
根据NCBI中木糖葡萄球菌的基因组序列设计引物。
（2）木糖葡萄球菌的基因组DNA提取
取对数生长期的木糖葡萄球菌菌体，使用TIANampBcteria DNA Kit提取木糖葡萄球菌基因组DNA，以NanoDrop2000测定DNA浓度，置于-20℃备用；
（3）基因扩增（PCR）
本实验PCR反应反应体系为50 µL（正反引物各2 µL（10 uM）、2 X Taq PCR MasterMix（生工生物工程（上海）股份有限公司）25 µL、ddH2O 20 µL、DNA模板 1 µL）。引物见表1与表2。引物反应条件:94℃预变性5 min后，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃充分延伸10 min。取5 µL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外成像仪下进行拍照。
（二）木糖葡萄球菌产生NO的检测
木糖葡萄球菌菌体细胞内的NO通过DAF-FM DA（NO特异性荧光探针）进行检测。取第三代培养的木糖葡萄球菌菌液，10,000g离心5min后得到沉淀，用NOS检测缓冲液重悬浮细菌，然后加入DA-FM DA荧光探针在37℃下避光孵育1h。通过荧光显微镜（Nikon 80i）在100倍油镜下进行观察并拍照。
（三）木糖葡萄球菌菌悬液的制备
将活化好的木糖葡萄球菌接种于7.5%氯化钠肉汤培养基中，接种量为3%～4%(V/V), 37℃培养18h，连续转接培养3次，得到第三代发酵菌液；将第三代发酵菌液在4℃下，10,000g离心5min，取沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，并将沉淀重悬浮，得到菌悬液。
（四）香肠的制作
所述香肠为发酵香肠。
进一步技术方案如下：
S1：将原料肉在4℃下绞碎，制得肉馅，将辅料加入；
S2：将上述的木糖葡萄球菌菌悬液作为发酵香肠发色剂，或与L-精氨酸同时添加作为发色剂，添加到上述肉馅中，木糖葡萄球菌接种量为107CFU/g，L-精氨酸添加量为1.05%；
S3：干燥：25 ± 2℃，RH 30-50%条件下发酵1天；
S4：发酵成熟：25 ± 2℃，RH 75% -80%条件下成熟6天；
S5：将香肠进行修剪，真空包装后得到成品。
进一步的S1中所述原料肉为新鲜猪后腿瘦肉，将瘦肉中的筋膜剔除；所述辅料添加质量百分比为：氯化钠2.5%、葡萄糖5%、亚硝酸钠0.009%（仅亚硝酸钠组加入）。
（五）色差测定
固体香肠颜色测定选用反射模式，仪器经自检及零点、标准（L*=99.99,a*=-0.20，b*=0.23）校正后，试样装满样品皿置于载样台上进行测定。
实验重复三次，结果表示为平均值±标准差。实验数据统计采用Statistix8.1软件包中Linear Models程序进行，差异显著性（P < 0.05）分析使用Tukey HSD程序。
（六）紫外-可见（UV-Vis）光谱扫描
不同肌红蛋白衍生物的UV-Vis吸收光谱不同。通过光谱扫描可对肌红蛋白的转化情况进行鉴定和转化过程跟踪。利用紫外-可见分光光度计对样品进行光谱扫描，以75%丙酮调整系统基线，扫描范围为350-650 nm，扫描间隔为1 nm。
（七）电子自旋共振（ESR）测定
电子自旋共振（ESR）可以对NO中的孤对电子进行分析，因此可以利用EPR技术可以区分氧合肌红蛋白（MbO2）和亚硝基肌红蛋白两种红色肌红蛋白衍生物。EPR测定方法如下：取大约0.4 g样品放入核磁管中，浸入液氮中迅速冷却。使用装配有低温样品池的 JEOLJES-FA200 电子自旋共振仪进行测定，测定条件如下：调制频率：100 kHz；调制幅度：0.35mT；微波功率1 mW；微波频率9.44 GHz；温度150 k；扫描范围：223-423 mT。
三、实验结论
根据表1的引物设计进行PCR检测。PCR结果显示出的条带与预期的相符，大约为852bp。由此说明木糖葡萄球菌中具有nos基因（图1-1）。同时，通过NO特异性荧光探针DAF-FM DA检测木糖葡萄球菌中NO的产生，结果显示在木糖葡萄球菌中可以产生NO（图1-2）。由此说明了木糖葡萄球菌具有NOS，因此其具备了在香肠中形成稳定色泽的理论基础。
从图1-3可知，无论是单独添加木糖葡萄球菌作为发色剂还是同时添加L-精氨酸作为发色剂，香肠的a*值都要显著高于空白对照组、L-精氨酸对照组以及亚硝酸盐(P <0.05)，这表明无论是单独添加木糖葡萄球菌还是同时添加木糖葡萄球菌和L-精氨酸作为发色剂，都可以替代亚硝酸盐的发色作用，达到了预期效果。此外，木糖葡萄球菌与精氨酸一起作为发色剂时，香肠色泽会比单独添加木糖葡萄球菌作为发色剂的香肠会更“红”一些。由此说明，L-精氨酸的添加有利于木糖葡萄球菌发色能力的提升。
进一步，通过UV-Vis扫描光谱判断肌红蛋白的种类以及含量，由此验证发色剂发色的原理。空白组在350-450 nm处没有吸收峰（图1-4中A），在450-650 nm内有两个吸收峰分别为538 nm和590 nm（图1-4中B），这都不是亚硝基肌红蛋白的特征吸收峰。L-精氨酸组在350-650 nm内没有明显的峰值。亚硝酸钠组在香肠中形成了亚硝基肌红蛋白，其特征吸收峰为394 nm（图1-4中A），476，534，565 nm（图1-4中B）。无论是否加入L-精氨酸，接种木糖葡萄球菌后都会在394，476，542，578 nm处形成吸收峰，基本与亚硝基肌红蛋白的吸收峰相吻合。这说明了无论是单独添加木糖葡萄球菌作为发色剂还是同时添加木糖葡萄球菌和L-精氨酸作为发色剂都会在肉制品中产生亚硝基肌红蛋白，而亚硝基肌红蛋白正是亚硝酸盐在肉中产生的稳定红色物质。由此说明，我们所发明的发色剂与亚硝酸盐形成稳定红色的原理相同，更说明了我们发明的发色剂替代亚硝酸盐的可行性。
由于其它种类的肌红蛋白也可能会影响UV-Vis的谱图，造成峰值的差异。我们进一步通过电子自旋共振特异性检测亚硝基肌红蛋白的产生，并通过峰强度判断其在不同组别香肠中的相对含量。由图1-5可知，无论是单独添加木糖葡萄球菌还是同时添加木糖葡萄球菌和L-精氨酸作为发色剂，都会产生顺磁性物质的信号，且峰形与亚硝基肌红蛋白的特征峰一致。这进一步证实了发色剂的添加产生了NO。同时，可以从峰强度推测出亚硝基肌红蛋白的大致含量。从图中可以看出，单独添加木糖葡萄球菌作为发色剂时产生的峰强度低于同时添加木糖葡萄球菌和L-精氨酸组别的峰强度。由此证明，L-精氨酸是通过提升木糖葡萄球菌产生亚硝基肌红蛋白的能力，从而提高产品色泽。
以上结果表明，利用具有NOS，且可以产生NO的木糖葡萄球菌作为发色剂，可以提升产品色泽，以达到替代亚硝酸盐进行发色的效果。此外，L-精氨酸作为发色剂的一部分时，可以进一步提升木糖葡萄球菌的发色能力，使得香肠色泽进一步得到提升。
实施例2
单独添加小牛葡萄球菌作为发色剂，或与L-精氨酸一起添加作为发色剂，用于无亚硝酸盐添加香肠的色泽形成
本实施例的实验设计与实验方法同实施例1。小牛葡萄球菌Staphylococcus vitulinus，购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），菌种保藏编号：No.10850。
实验结论如下。
根据表2的引物设计进行PCR检测。PCR结果显示出的条带与预期的相符，大约为861bp。由此说明小牛葡萄球菌中具有nos基因（图2-1）。同时，通过NO特异性荧光探针DAF-FM DA检测小牛葡萄球菌中NO的产生，结果显示在小牛葡萄球菌中可以产生NO（图2-2）。因此小牛葡萄球菌具有NOS，因此其具备了在香肠中形成稳定色泽的理论基础。
从图2-3可知，在单独添加小牛葡萄球菌作为发色剂时，香肠的红度值显著高于空白对照组和L-精氨酸对照组(P < 0.05)，同时显著低于添加亚硝酸盐的组别(P < 0.05)。在同时添加小牛葡萄球菌和L-精氨酸作为发色剂时，香肠的红度值与添加亚硝酸盐的组别没有显著性差异(P > 0.05)。因此，单独添加小牛葡萄球菌作为发色剂和同时添加小牛葡萄球菌和L-精氨酸作为发色剂都可以使产品变“红”。但同时添加小牛葡萄球菌和L-精氨酸的发色剂具有更高的发色能力，可以达到亚硝酸盐的发色水平。因此，同时添加小牛葡萄球菌和L-精氨酸可以替代亚硝酸盐的发色作用，但单独添加小牛葡萄球菌只能部分替代亚硝酸盐的发色作用。由此说明，为了确保小牛葡萄球菌具有充足的发色能力，加入L-精氨酸作为发色剂的一部分是必要的。
进一步，通过UV-Vis扫描光谱判断肌红蛋白的种类以及含量，由此验证发色剂发色的原理。空白组在350-450 nm处没有吸收峰（图2-4中A），在450-650 nm内有两个吸收峰分别为538 nm和590 nm（图2-4中B），这都不是亚硝基肌红蛋白的特征吸收峰。L-精氨酸组在350-650 nm内没有明显的峰值。亚硝酸钠组在香肠中形成了亚硝基肌红蛋白，其特征吸收峰为394 nm（图2-4中A），476，534，565 nm（图2-4中B）。无论是否加入L-精氨酸，接种小牛葡萄球菌后都会在394，476，534，569 nm处形成吸收峰，基本与亚硝基肌红蛋白的吸收峰相吻合。这说明了无论是单独添加小牛葡萄球菌作为发色剂还是同时添加小牛葡萄球菌和L-精氨酸作为发色剂都会在肉制品中产生亚硝基肌红蛋白，而亚硝基肌红蛋白正是亚硝酸盐在肉中产生的稳定红色物质。由此说明，我们所发明的发色剂与亚硝酸盐形成稳定红色的原理相同，更说明了我们发明的发色剂替代亚硝酸盐的可行性。
由于其它种类的肌红蛋白也可能会影响UV-Vis的谱图，造成峰值的差异。我们进一步通过电子自旋共振特异性检测亚硝基肌红蛋白的产生，并通过峰强度判断其在不同组别香肠中的相对含量。由图2-5可知，无论是单独添加小牛葡萄球菌还是同时添加小牛葡萄球菌和L-精氨酸作为发色剂，都会产生顺磁性物质的信号，且峰形与亚硝基肌红蛋白的特征峰一致。这进一步证实了发色剂的添加产生了NO。同时，可以从峰强度推测出亚硝基肌红蛋白的大致含量。从图中可以看出，单独添加小牛葡萄球菌作为发色剂时产生的峰强度低于同时添加小牛葡萄球菌和L-精氨酸组别的峰强度。由此证明，L-精氨酸是通过提升小牛葡萄球菌产生亚硝基肌红蛋白的能力，从而提高产品色泽。
以上结果表明，利用具有NOS，且可以产生NO的小牛葡萄球菌作为发色剂，可以提升产品色泽，以达到替代亚硝酸盐进行发色的效果。此外，L-精氨酸作为发色剂的一部分时，可以进一步提升小牛葡萄球菌的发色能力，使得香肠色泽进一步得到提升。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，包括不同具有NOS的凝固酶阴性葡萄球菌的替换、不同类型肉制品的替换等，这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。
Claims (1)
1.一种替代加工肉制品中亚硝酸盐的发色剂，其特征在于：所述发色剂由凝固酶阴性葡萄球菌和L-精氨酸组成，所述凝固酶阴性葡萄球菌通过液体培养基培养制得的菌粉剂或菌悬液，在肉制品加工中具体使用时凝固酶阴性葡萄球菌直接接种，在加工肉制品中的接种量为106～107 CFU/g肉；
在肉制品加工中L-精氨酸直接添加使用，加入量为加工肉制品质量的0.6～1.2%；
所述凝固酶阴性葡萄球菌的菌悬液或菌粉剂的制备操作步骤如下：
（1）将活化好的凝固酶阴性葡萄球菌接种于液体培养基中，接种量为3%～4%(V/V)，37℃培养18h，连续转接培养3次，得到第三代发酵菌液；
（2）将第三代发酵菌液在4℃下，10,000g离心5min，取沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，并将沉淀重悬浮，得到菌悬液；
（3）将菌悬液冷冻干燥，得到菌粉剂；
所述液体培养基为7.5%氯化钠肉汤培养基；
所述凝固酶阴性葡萄球菌具有一氧化氮合酶，为小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）。
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