CN114568644A - 一种促进发酵香肠红色泽提升的加工方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进发酵香肠红色泽提升的加工方法，属于食品科学中的肉品科学技术领域。本发明方法通过低强度高静水压处理接种凝固酶阴性葡萄球菌后的发酵香肠，并经过发酵，使香肠成品的红度值达到6.5～7.0。使用时，凝固酶阴性葡萄球菌在香肠肉中的接种量为106～108 CFU/g肉；高静水压处理压力为200～300 MPa，处理时间为3～7 min。低强度的高静水压处理通过提高凝固酶阴性葡萄球菌中一氧化氮合酶的表达量进而促进发酵香肠中亚硝基肌红蛋白的产量，提升发酵香肠色泽。本发明的加工方法有效的提升了发酵香肠的色泽，为亚硝酸盐在发酵香肠中的发色替代提供了一个可行的方案，满足了人们对于健康、安全的发酵香肠产品的需求。
Description
技术领域
本发明属于食品科学中的肉品科学技术领域，具体涉及一种促进发酵香肠红色泽提升的加工方法。
背景技术
色泽是衡量发酵香肠品质的重要指标。在工业生产发酵香肠中，亚硝酸盐通常被用来巩固发酵香肠的颜色。然而，亚硝酸盐的潜在致畸致癌性引起了消费者的极大的担忧，因此为有效降低亚硝酸盐在发酵香肠中的使用，大量的研究着力于寻找亚硝酸盐替代物或替代加工方式，以提高发酵香肠的安全性。
在众多亚硝酸盐发色替代方法中，微生物发酵促进发酵香肠颜色形成的方法具有巨大潜力。其中，凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative staphylococcus, CNS）作为一种安全的食品发酵剂，被发现普遍具有nos基因，可以表达出一氧化氮合酶（nitricoxide synthase, NOS），后者催化精氨酸产生一氧化氮（nitric oxide，NO）和瓜氨酸。一氧化氮可与肉中肌红蛋白作用产生具有红色的亚硝基肌红蛋白（nitrosomyoglobin，NO-Mb），从而促进发酵香肠呈色。但由于凝固酶阴性葡萄球菌中一氧化氮合酶的表达量与酶活性普遍不足，在发酵香肠中产生亚硝基肌红蛋白的能力相对较弱，呈色能力有限。因此，为进一步提高凝固酶阴性葡萄球菌在发酵香肠中的呈色能力，提高其一氧化氮合酶的表达与酶活性显得十分重要。
发明内容
为了代替潜在危险物亚硝酸盐在发酵香肠中的发色应用，提高发酵香肠产品安全性，本发明提供一种促进发酵香肠红色泽提升的加工方法。
一种促进发酵香肠红色泽提升的加工操作步骤如下：
（1）将原料肉于4℃条件下绞碎，获得肉糜；在肉糜中加入辅料并搅匀，得到辅料肉糜；
（2）温度4℃条件下，在辅料肉糜中接入凝固酶阴性葡萄球菌并混匀，接种量为106～108 CFU/g肉，用肠衣灌制，得到香肠；
（3）将香肠进行真空包装，随后立即进行较低强度高静水压处理；处理压力为200～300 MPa，时间为3～7 min；
（4）打开真空包装，取出香肠进行控温控湿发酵，发酵结束，获得香肠成品；
使用3nh TS7600型分光测色仪测定，所述香肠成品的红度值为6.5～7.0。
进一步的技术方案是：
步骤（2）中，所述凝固酶阴性葡萄球菌具有一氧化氮合酶（Nitric oxidesynthase; NOS），具体为小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）中的一种。
步骤（4）中，发酵条件：于25℃、45%湿度条件下干燥1 d；接着于25℃、75%湿度条件下发酵6 d。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1. 本发明使用低强度的超高压处理（HHP）处理接种凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）后的发酵香肠。这种低强度的超高压处理（HHP）处理不仅对发酵剂的存活率影响极小，而且能够有效提高凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）菌株中一氧化氮合酶（NOS）的表达量，促进一氧化氮（NO）的产生，进而提升亚硝基肌红蛋白（NO-Mb）含量，有效促进发酵香肠红色泽的形成。
2.本发明将凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）接种与超高压处理（HHP）处理联合应用于发酵香肠中，保留了凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）的发酵作用，并且使其发色达到了接近亚硝酸盐处理的效果，有效的减少了亚硝酸盐的使用，提高了发酵香肠产品的安全性。
附图说明
图1为不同处理组香肠红度值。
图2为不同处理组香肠色素提取液的紫外可见吸收光谱图。
图3、图4为不同处理组香肠电子自旋共振光谱图。
图5为200 MPa HHP处理后小牛葡萄球菌活性氧含量图。
图6为200 MPa HHP处理后小牛葡萄球菌katA基因表达图。
图7为200 MPa HHP处理后小牛葡萄球菌sod基因表达图。
图8为200 MPa HHP处理后小牛葡萄球菌nos基因表达图。
图9为不同处理组香肠色素提取液的紫外可见吸收光谱图。
图10为300 MPa HHP处理后小牛葡萄球菌活性氧含量图。
图11为300 MPa HHP处理后小牛葡萄球菌katA基因表达图。
图12为300 MPa HHP处理后小牛葡萄球菌sod基因表达图。
图13为300 MPa HHP处理后小牛葡萄球菌nos基因表达图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明进一步说明。
实施例1
一、试验设计
200 MPa 超高压处理接种小牛葡萄球菌的香肠，经过一段时间发酵成熟后，对香肠进行红度值、血红素的紫外-可见光谱分析及电子自旋共振分析，判断200 MPa 超高压处理是否会对香肠红色泽形成具有促进作用；通过200 MPa 超高压处理小牛葡萄球菌，并对其胞内活性氧水平及katA（编码过氧化氢酶A），sod（编码超氧化物歧化酶）和nos（编码一氧化氮合酶）基因表达进行分析，探究其促发色机理。实验菌株为S. vitulinus CICC 10850，购于中国工业微生物保藏中心。
二、实验方法
1. 小牛葡萄球菌菌悬液的制备
将S. vitulinus于7.5%氯化钠肉汤培养基中进行培养并传代，培养至第三代时，将菌液于10,000 g，4℃条件下，离心5 min，去上清获得菌沉淀。用浓度20 mM的PBS溶液（pH值7.0）将沉淀洗涤3次后用PBS溶液重悬，获得S. vitulinus菌悬液。S. vitulinus菌悬液用于香肠的制备及HHP后胞内活性氧及基因表达量的研究。
2. 香肠的制作
（1）取猪后腿肉，在4℃条件下去脂肪和结缔组织，切成小块于孔径3 mm的绞肉机中搅碎获得肉糜。取1000 g肉糜，加入25 g氯化钠和50 g的葡萄糖搅拌均匀。
（2）温度4℃条件下，向Sv + P200组接种步骤1制备好的S. vitulinus菌悬液混合均匀，接种量为7.5 log CFU/g肉；向Nitrite 组添加20 mg/kg肉的亚硝酸钠并混匀；对照组不添加其他物质。最后用羊肠衣进行灌制，香肠分组及发酵剂和辅料添加参考表1。
（3）其中Sv + P200组香肠制作完成后，立即用无菌包装袋真空包装，用600 ml-HHP加压舱设备（包头科发高压科技有限公司）进行超高压处理。香肠样品放入盛有冰水混合物的加压舱内，200 MPa压力处理5 min，其余组别不进行HHP处理。处理结束后打开包装取出香肠。
（4）将各香肠于25℃、45%湿度条件下干燥1 d；接着于25℃、75%湿度条件下发酵6d。发酵结束后的香肠用于红度值测定、血红素的紫外-可见光谱分析和电子自旋共振（ESR）分析。
表1香肠配料表
其中，“+”表示“添加”，“–”表示“不添加”。
3. 香肠红度值的测定
将步骤2所述的3组香肠剁碎成边长约3 mm的正方体形状，混匀并用3nh TS7600型分光测色仪进行测量，测量采用反射模式，光源为D65，观察角度为10°，每组香肠9个平行。
4. 亚硝基肌红蛋白的紫外-可见光谱（UV-vis）分析
分别称取5.0 g步骤2所述的3组香肠，剁碎，分别加入到45 ml的75%（v/v）预冷的丙酮中，用均质机4600 rpm均质1 min，然后于4℃、4000 g离心5 min，取上清液经0.45-µm过滤膜过滤，滤液即为亚硝基肌红蛋白提取液。亚硝基肌红蛋白提取液的紫外-可见光谱分析以75%的丙酮作为空白对照，以1 nm的间隔从350 nm到650 nm波长范围进行扫描，整个过程在冰上、黑暗处进行。
5. 超高压处理S. vitulinus菌悬液
用PBS将步骤1制备好的S. vitulinus菌悬液的OD值调整至0.5，并分成两组，用无菌包装袋真空包装。其中一组作为对照，不经任何处理，另一组用超高压设备200 MPa压力强度处理5 min。处理后的菌悬液用于胞内活性氧和katA，sod和nos基因表达量的测量。
6. S. vitulinus胞内活性氧水平的测量
将步骤5描述的2组样品于25℃孵育2 h，并立即用碧云天活性氧检测试剂盒按照说明书各组样品S. vitulinus内活性氧水平进行测量，每组做3个平行。
7. S. vitulinus中katA，sod和nos基因表达量的测定
将步骤5所述的2组样品在25℃孵育4h和12h后，立即对katA，sod和nos基因表达量进行分析。
将样品在10,000 g，4℃条件下、离心5 min，去上清并用DEPC处理水洗涤沉淀两次。洗涤后的菌体加入200 µL的溶葡球菌酶（100 µg/mL，用DEPC处理水溶解）于37℃孵育15min使菌体裂解。裂解后的样品参照说明书用生工Spin Column Bacteria Total RNAPurification Kit进行提取获得RNA样品。提取的RNA样品立即进行cDNA的合成，cDNA合成参照说明书用天根FastKing RT Kit进行，合成后的cDNA用于荧光定量PCR试验。
荧光定量PCR试验以16s基因作为内参基因，对katA，sod和nos基因表达量进行检测。试验采用20 μL Fast-SYBR Green反应体系，体系包括2µL cDNA、0.2µM primer和10µL2× SG Fast qPCR Master Mix （Sangon Biotech, Shanghai, China），反应中使用的引物如表2所示。荧光定量PCR试验在CFX96荧光定量PCR仪器（Bio-Rad, Hercules, CA,USA）.上进行，反应条件：95℃ 3 min预变性；95℃ 2 s和57.2℃20 s为一个循环，共循环40次。反应结束后获得的Cq值用2-ΔΔCq法计算基因的相对表达量，其中以16s作为内参基因。
表2用于荧光定量PCR的引物序列
三、实验结论
参见图1，对照组、Nitrite组和Sv + P200组香肠的红度值分别为5.34 ± 0.28、7.41 ± 0.44和6.97 ± 0.14。与对照组相比，经小牛葡萄球菌接种和200 MPa HHP联合处理的香肠具有更高的红度值，且呈现出与Ntrite组无显著性差异（P < 0.05）。
参照图2，除对照组外，其余样品均在394、480、540和565 nm处出现最高峰，这是亚硝基肌红蛋白的典型特征吸收峰，表明在Nitrite和Sv + P200组香肠中均有NO-Mb的存在，且从峰值来看，Nitrite组香肠具有最高的亚硝基肌红蛋白含量，Sv + P200组其次，这与红度值结果相对应。电子自旋共振（ESR）光谱分析可以确定亚硝基肌红蛋白中铁的配位态，参照图3、图4及表3呈现的结果可得，Nitrite组和Sv + P200组香肠中形成了五配位的亚硝基肌红蛋白，且Sv + P200组比对照组组信号强度高很多，进一步证明了Sv + P200组香肠中形成了更多的五配位亚硝基肌红蛋白。
表3 ESR信号中三个g因子值表
| 样品 | <i>g</i>1 | <i>g</i>2 | <i>g</i>3 |
| Nitrite | 2.0179 | 2.0084 | 1.9968 |
| Sv | 2.0178 | 2.0074 | 1.9968 |
| Sv + P<sub>200</sub> | 2.0178 | 2.0074 | 1.9968 |
总的来说，在本次研究中，经200 MPa 超高压处理的接种组香肠具有更高的发色能力，红色泽远高于对照组，并且与亚硝酸钠添加没有显著性差异。
参照图5，与未经超高压处理的对照组相比，200 MPa 超高压处理会提高S. vitulinus胞内活性氧含量，这说明这一水平的超高压处理提高了S. vitulinus的氧化压力。参照图6、图7、图8，200 MPa 超高压处理后S. vitulinus中katA（编码过氧化氢酶A的基因）基因在4 h后表达量提升11.21 ± 1.06倍，12 h后提升11.97 ± 1.88倍；sod（编码超氧化物歧化酶的基因）基因在4 h后表达量提升6.8 ± 1.14倍，12 h后提升4.71 ± 0.26倍；nos（编码NOS的基因）基因在4 h后表达量提升3.01 ± 0.63倍，12 h后提升1.70 ±0.03倍。两种抗氧化基因表达被上调，且在4 h和12 h时都呈现出较高水平，说明氧化压力的增加使得S. vitulinus出现应激反应，提高了两种主要抗氧化酶的表达，并且这种抵抗作用持续较长时间。与以上两种基因类似，与对照组相比，nos（编码NOS的基因）基因在200MPa 超高压处理组中出现上调，并且同样持续较长时间。
以上图1-图8中不同大写字母表示相同处理时间不同处理组的差异显著（P <0.05）；不同小写字母表示相同处理组不同处理时间的差异显著（P <0.05）。
由实施例1可知，200 MPa压力处理小牛葡萄球菌接种的发酵香肠的红度值达到6.97 ± 0.14，且其发色能力接近亚硝酸钠的添加。其中可能的原因是，200 MPa超高压处理有效提高了小牛葡萄球菌的氧化压力，为抵抗氧化压力，一些抗氧化基因被上调。除了过氧化氢酶A与超氧化物歧化酶两种典型的抗氧化酶，一氧化氮合酶也被证明具有抗氧化作用，一氧化氮合酶催化产生的一氧化氮能够激活katA与sod基因的表达，间接的抵抗氧化压力。因此，当氧化压力增加时，nos基因也被相应的上调。一氧化氮合酶的过表达促进了一氧化氮的形成，一氧化氮与香肠中肌红蛋白结合形成的亚硝基肌红蛋白总量被提高，最终使得香肠的红色泽获得了提升。
实施例2
一、试验设计
300 MPa 超高压处理接种小牛葡萄球菌的香肠，经过一段时间发酵成熟后，对香肠进行红度值测量及血红素的紫外-可见光谱分析，判断300 MPa 超高压处理是否会对发酵香肠的红色泽形成具有促进作用；通过300 MPa 超高压处理小牛葡萄球菌，对其胞内活性氧水平及katA（编码过氧化氢酶A），sod（编码超氧化物歧化酶）和nos（编码一氧化氮合酶）基因表达进行分析，探究其促发色机理。实验菌株为S. vitulinus CICC 10850，购于中国工业微生物保藏中心。
二、实验方法
1. 小牛葡萄球菌菌悬液的制备
小牛葡萄球菌菌悬液的制备参考实施例1中的实验方法1的步骤进行。
2. 香肠的制作
（1）取猪后腿肉，在4℃条件下去脂肪和结缔组织，切成小块于孔径3 mm的绞肉机中搅碎获得肉糜。取1000 g肉糜，加入25 g氯化钠和50 g的葡萄糖搅拌均匀。
（2）温度4℃条件下，向Sv + P300组接种步骤1制备好的S. vitulinus菌悬液混合均匀，接种量为7.5 log CFU/g肉；向Nitrite 组添加20 mg/kg肉的亚硝酸钠并混匀；对照组不添加其他物质。最后用羊肠衣进行灌制，香肠分组及发酵剂和辅料添加参考表4。
（3）其中Sv + P300组香肠制作完成后，立即用无菌包装袋真空包装，放入盛有冰水混合物的加压舱内，用600 ml-HHP加压舱设备进行300 MPa压力处理，时间为5 min，其余组别不进行超高压处理。处理结束后打开包装取出香肠。
（4）将各香肠于25℃、45%湿度条件下干燥1 d；接着于25℃、75%湿度条件下发酵6d。发酵结束后的香肠用于红度值测定和血红素的紫外-可见光谱分析。
表4香肠配料表
其中，“+”表示“添加”，“–”表示“不添加”。
3. 香肠红度值的测定
将步骤2所述的3组香肠剁碎成边长约3 mm的正方体形状，混匀并用3nh TS7600型分光测色仪进行测量，测量采用反射模式，光源为D65，观察角度为10°，每组香肠做9个平行。
4. 亚硝基肌红蛋白的紫外-可见光谱（UV-vis）分析
准确称取5.0 g步骤2所述的3组香肠，参考实施例1中的实验方法4的步骤进行亚硝基肌红蛋白的提取和紫外-可见光谱分析。
5. 超高压处理S. vitulinus菌悬液
用PBS将步骤1制备好的S. vitulinus菌悬液的OD值调整至0.5，并分成两组，用无菌包装袋真空包装。其中一组作为对照，不经任何处理，另一组用超高压设备300 MPa压力强度处理5 min。处理后的菌悬液用于胞内活性氧和katA，sod和nos基因表达量的测量。
6. S. vitulinus胞内活性氧水平的测量
将步骤5描述的2组样品于25℃孵育2 h，并立即用碧云天活性氧检测试剂盒按照说明书各组样品S. vitulinus内活性氧水平进行测量，每组做3个平行。
7. S. vitulinus中katA，sod和nos基因表达量的测定
将步骤5所述的2组样品在25℃孵育4h和12h后，立即对katA，sod和nos基因表达量进行分析。
三种基因表达量的测定参考实施例1中实验方法7的步骤进行。
三、实验结论
参照图1，对照组、Nitrite组和Sv + P300组香肠的红度值分别为5.34 ± 0.28、7.41 ± 0.44和6.51 ± 0.50。与对照组相比，经小牛葡萄球菌接种和300 MPa 超高压联合处理的香肠具有更高的红度值，与Sv + P200组无显著性差异（P >0.05）。与Ntrite组相比，虽然该组香肠呈现的红度值略低，但差距较小。
参照图9，除对照组组外，其余样品均在394、480、540和565 nm处出现最高峰，表明在Nitrite和Sv + P300组香肠中均有亚硝基肌红蛋白的存在，且Nitrite组依然具有最高的亚硝基肌红蛋白含量，而Sv + P300组次之，这与红度值结果相对应。
总的来说，在本次研究中，经300 MPa HHP处理的接种组香肠具有较好的呈色能力，红色泽远高于对照组，在替代亚硝酸盐发色作用上具有较大潜力。
参照图10，与未经超高压处理的对照组相比，300 MPa 超高压处理同样会提高S. vitulinus胞内活性氧含量，进而提升了S. vitulinus的氧化压力。参照图11、图12、图13，300 MPa 超高压处理后S. vitulinus中katA（编码过氧化氢酶A的基因）基因在4 h后表达量提升19.45 ± 1.65倍，12 h后提升50.71 ± 7.66倍；sod（编码超氧化物歧化酶的基因）基因在4 h后表达量提升16.95 ± 2.63倍，12 h后提升21.74 ± 2.33倍；nos（编码NOS的基因）基因在4 h后表达量提升2.08 ± 0.18倍，12 h后提升1.68 ± 0.20倍。KatA与sod两种抗氧化基因表达被上调，且在4 h和12 h时都呈现出较高水平，说明300 MPa 超高压处理后，S. vitulinus产生的氧化应激同样促使了这两种主要抗氧化基因的表达，且过表达依然持续较长时间。对于nos基因，与对照组相比，其在300 MPa 超高压处理组中也出现上调，并且同持续较长时间。
以上图9-图13中不同大写字母表示相同处理时间不同处理组的差异显著（P <0.05）；不同小写字母表示相同处理组不同处理时间的差异显著（P <0.05）。
由实施例2可知，300 MPa压力处理小牛葡萄球菌接种的发酵香肠的红度值达到6.51 ± 0.5，且其呈色能力接近200 MPa压力处理和亚硝酸钠的添加。其中可能的机理与实施例1中描述的相似。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例提供了对本发明的原理的描述，在符合该原理合理范围内，本发明还会有各种变化和改进，包括不同具有NOS的凝固酶阴性葡萄球菌的替换、不同发酵香肠种类的替换等。更换色差计和测量参数，可能会导致测得红度值结果的变化。这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。
Claims (3)
1.一种促进发酵香肠红色泽提升的加工方法，其特征在于，操作步骤如下：
（1）将原料肉于4℃条件下绞碎，获得肉糜；在肉糜中加入辅料并搅匀，得到辅料肉糜；
（2）温度4℃条件下，在辅料肉糜中接入凝固酶阴性葡萄球菌并混匀，接种量为106～108CFU/g肉，用肠衣灌制，得到香肠；
（3）香肠进行真空包装，随后立即进行较低强度高静水压处理；处理压力为200～300MPa，时间为3～7 min；
（4）打开真空包装，取出香肠进行控温控湿发酵，发酵结束，获得香肠成品；
使用3nh TS7600型分光测色仪测定，所述香肠成品的红度值为6.5～7.0。
2.根据权利要求1所述一种促进发酵香肠红色泽提升的加工方法，其特征在于：步骤（2）中，所述凝固酶阴性葡萄球菌具有一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase; NOS），具体为小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）中的一种。
3.根据权利要求1所述一种促进发酵香肠红色泽提升的加工方法，其特征在于：步骤（4）中，发酵条件：于25℃、45%湿度条件下干燥1 d；接着于25℃、75%湿度条件下发酵6 d。
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