CN106566780A - 一种牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细菌的富集方法，属于生物技术领域，尤其涉及一种牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法。一种牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，包括以下步骤：A、生乳样品的采集；B、配制金黄色葡萄球菌富集的选择性培养基；C、金黄色葡萄球菌的分离培养，将采集的乳样进行划线接种于选择性培养基中；D、革兰氏染色镜检，对选择性培养基中的疑似菌落进行提取，提取的金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌；E、金黄色葡萄球菌的富集培养，将步骤D中提取的革兰氏阳性球菌转移至营养琼脂培养基中进行纯培养，对金黄色葡萄球菌进行富集，并且获取富集后的金黄色葡萄球菌，本发明建立了一种经济、快速、特异的牛奶中金黄色葡萄球菌富集的方法，采用此方法可以快速简便地分离牛奶中金黄色葡萄球菌，进而为后续对金黄色葡萄球菌的鉴定提供可靠的依据。

Description

一种牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法

技术领域

本发明涉及一种细菌的富集方法，属于生物技术领域，尤其涉及一种牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法。

背景技术

目前牛奶作为全球的饮品，深受人们喜爱，但由于鲜奶中存在各种各样的菌群，并且有些菌群可能会影响人身体的健康，其不但严重影响奶品质量，甚至严重危害人类的健康，造成奶牛养殖业和乳品业的巨大经济损失。

所以对牛奶中有害菌群的检测成为必要解决的问题，由于各种原因可能会导致牛奶被感染，例如奶牛被病原微生物感染、外伤、环境因素、管理因素等综合作用的结果。当病原微生物的对奶牛奶感染后，牛奶会含有有对人体有害的菌群。病原细菌有金黄色葡萄球菌、无乳金黄色葡萄球菌、牛支原体等等，其中金黄色葡萄球菌对人体危害较大，因此需要对对这些病原菌进行富集，并进行快速检测和鉴定，才能够切实有效提高牛奶的奶品质量。微生物学方法是鉴定牛奶中病原菌的“金标准”，该标准方法包括牛奶中致病菌的分离培养和生化鉴定。传统的方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌首先要根据样品进行富集培养，使被检测金黄色葡萄球菌的数量在样品中达到可检测水平，然后才能根据微生物检验方法对金黄色葡萄球菌进行分离，形态学观察及生化特性鉴定。GB 4789.18-2010食品安全国家标准中，其中乳与乳制品的检验方法中，需要对乳和乳制品进行处理，牛奶的成分极其复杂，且有些成分可干扰试验结果，为提高检测的敏感性，可选用合适的增菌液对乳样中可能存在的细菌进行短暂的增菌培养，但从操作的简便性、劳动量及鉴定时间上说，传统的增菌培养需要时间长，一般情况下需要5至7天左右，并且金黄色葡萄球菌敏感性较低，不利于对金黄色葡萄球菌进行鉴定。

发明内容

为解决上述问题，本发明的主要目的在于，提供一种经济、快速、特异的牛奶中金黄色葡萄球菌富集的方法，可以快速简便地分离鉴定牛奶中金黄色葡萄球菌，进而为牛奶质量的提升的提供依据。

为了解决上述技术问题，本发提供了一种牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：A、生乳样品的采集；B、配制金黄色葡萄球菌富集的选择性培养基；C、金黄色葡萄球菌的分离培养，将采集的乳样进行划线接种于选择性培养基中；D、革兰氏染色镜检，对选择性培养基中的疑似菌落进行提取，提取的金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌；E、金黄色葡萄球菌的富集培养，将步骤D中提取的革兰氏阳性球菌转移至营养琼脂培养基中进行纯培养，对金黄色葡萄球菌进行富集，并且获取富集后的金黄色葡萄球菌。

于本发明的一实施例中，所述营养琼脂培养基的制作方法包括：量取95mL的营养肉汤培养基加入1.5的琼脂粉高压灭菌。

于本发明的一实施例中，所述步骤B中的选择性培养基为高盐甘露醇培养基，所述高盐甘露醇培养基的制作方法包括：蛋白胨10g、牛肉膏1g、D-甘露醇10g、氯化钠75g、酚红0.025g、琼脂13g，加入1L蒸馏水中加热并且搅拌均匀，调整pH值并且高压灭菌。

于本发明的一实施例中，将步骤C中的选择性培养基置入培养箱中培养，培养条件为37℃中恒温培养18～24h。

于本发明的一实施例中，所述营养肉汤培养基的制作方法包括：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、加水至1L后混合均匀，调节pH值并且高压灭菌。

于本发明的一实施例中，所述营养琼脂培养基的制作方法还包括冷却步骤，将营养琼脂培养基高压灭菌后冷却至50～60℃后，制备固体培养基。

于本发明的一实施例中，所述高盐甘露醇培养基的pH值为7.4±0.2，并且高压灭菌30min，高压灭菌的温度为121℃，然后冷却至45～50℃且制备固体培养基。

于本发明的一实施例中，所述营养肉汤培养基的pH值为7.2±0.2，pH值调节剂为氢氧化钠。

于本发明的一实施例中，其特征在于，还包括F、鉴定步骤，所述步骤F的鉴定方法为生化试验鉴定或者PCR鉴定。

综上所述，本发明提供的对牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其可以快速、经济、特异的从牛奶中实现对金黄色葡萄球菌的富集，采用此方法不仅可以快速简便地分离鉴定牛奶中金黄色葡萄球菌，而且分离出的金黄色葡萄球菌敏感性较高，可简便有效地对金黄色葡萄球菌进行富集及分离培养，以便于进一步的对金黄色葡萄球菌的鉴定提供可靠的依据，从而切实有效提高牛奶的奶品质量。

附图说明

图1为本发明提供的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法的流程图。

具体实施方式

体现本发明特征与优点的典型实施例将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施例上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。

下面结合附图，详细描述本发明的具体实施例，图1为本发明提供的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法的流程图。如图1中所示，本发明提供的一种牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其主要可包括以下几个步骤：A、生乳样品的采集；B、配制金黄色葡萄球菌富集的选择性培养基；C、金黄色葡萄球菌的分离培养，将采集的乳样进行划线接种于选择性培养基中；D、革兰氏染色镜检，对选择性培养基中的疑似菌落进行提取，提取的金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌；E、金黄色葡萄球菌的富集培养，将步骤D中提取的革兰氏阳性球菌转移至营养琼脂培养基中进行纯培养，对金黄色葡萄球菌进行富集，并且获取富集后的金黄色葡萄球菌。

步骤A为生乳样品的采集，具体的操作条件为无菌操作的条件下进行，采集可以采用本领域的普通技术人员所公知的仪器采集，或者其它采集方法，本发明并不限制，但是一般应该先弃掉头三把奶之后，再开始收集样品，以免样品受到污染，样品采集完成后保存备用。另外采集的数量以及方法可以根据具体的要求进行，本发明并不限制其具体的样品数量以及采集方法。

步骤B为配制金黄色葡萄球菌富集的选择性培养基，该选择性培养基具体可以为为高盐甘露醇培养基。于本发明的一实施例，高盐甘露醇培养基的制作方法具体为，将蛋白胨10g、牛肉膏1g、D-甘露醇10g、氯化钠75g、酚红0.025g、琼脂13g，加入1L蒸馏水后，加热并且充分搅拌均匀。然后调整pH值，具体的pH值范围可以为7.4±0.2。然后再将混合溶液高压灭菌30min，并且高压灭菌的温度为121℃。最后冷却至45～50℃后，制备成高盐甘露醇培养基的固体培养基，也就是选择性培养基的固体培养基。当然上述实施例仅为举例用，而并非用以限制本发明。另外本发明并不限制上述步骤的顺序，本领域技术可灵活调整顺序。

步骤C为对金黄色葡萄球菌的分离培养，首先将采集到的生乳样品接种，接种的方式采用划线的方式接种于上述的固体的高盐甘露醇培养基中。具体操作方法为，按照常规微生物检验方法，在无菌的条件下操作，选取采集的生乳样品在上述高盐甘露醇培养基上进行划线接种，当然其也可以采用其它的接种方式，本发明并不限制其具体的接种方式。然后将上述选择性培养基置入培养箱中进行恒温培养，具体的培养条件为在37℃中恒温状态下培养18～24h后，再对菌落形态进行观察，当然其具体的培养的时间，可根据所观察到的结果调整，本发明并不限制具体的培养时间。使用上述选择性培养基即高盐甘露醇培养基，主要是考虑到金黄色葡萄球菌具有耐高盐的性质，在高盐甘露醇培养基上，金黄色葡萄球菌的颜色呈金黄色，用接种环接触菌落有黏稠感。采用本发明的方法比国标GB 4789.18-2010中使用的琼脂平板(Baird-Parker)培养基用来富集的方法的不周之处在于，不仅时间较短，而且疑似菌落颜色呈金黄色，更加易于观察和区分，从而更加便于对金黄色葡萄球菌分离培养。

步骤D为革兰氏染色镜检，对上述选择性培养基中的疑似菌落进行提取，提取的金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，具体的操作方法为挑取高盐甘露醇培养基上的疑似菌落进行革兰氏涂片染色镜检，在显微镜下观察金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。

步骤E为金黄色葡萄球菌的富集培养，将步骤D中提取的革兰氏阳性球菌转移至营养琼脂培养基中进行划线接种，进行大量的富集纯培养，并且获取富集后的金黄色葡萄球菌。而营养琼脂培养基需要使用营养肉汤培养基，但是本发明并不限制其具体为哪种营养肉汤培养基，一般认为只要适合金黄色葡萄球菌生长的营养肉汤培养基即可。于本发明的一实施例中，本发明提供的营养肉汤培养基的制作方法具体为，在无菌条件下，将蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、放置于容器中，并且加水至1L然后充分的混合均匀，并且使用氢氧化钠作为调节剂来调节pH值，将pH值调节至7.2±0.2，然后分装至200mL不同的三角瓶内进行高压灭菌后备用。当然上述实施例仅为举例用，而并非用以限制本发明。

本发明中营养琼脂培养基的具体制作方法为，在无菌条件下，采用上述营养肉汤培养基95mL、琼脂粉1.5g混合均匀后，采用高压灭菌的方式灭菌，然后待上述混合液冷却至50～60℃之后，混合均匀后倾注于平板上，以制备成固体培养基备用。当然上述实施例仅为举例用，而并非用以限制本发明。当然此培养基可与步骤C同时进行，以减少本发明对牛奶中金黄色葡萄球菌富集的时间。然后将革兰氏阳性球菌转移至营养琼脂培养基中进行纯培养，最后进行富集，采用此方法可以简便有效的对牛奶中的金黄色葡萄球菌进行富集及分离，大大的节省了金黄色葡萄球菌富集的时间。

步骤F为对金黄色葡萄球菌鉴定，本发明中可以采用生化试验的方式进行富集后的金黄色葡萄球菌进行进一步的检测鉴定，或者可以采用PCR对富集后的金黄色葡萄球菌作进一步的检测鉴定，当然本发明并不限制其对富集后的金黄色葡萄球菌进行检测鉴定方式。需要说明的是本发并不限制各步骤之间的顺序，本领域普通技术人员可灵活调整各步骤的顺序，上述步骤顺序仅作为举例说明用，并非用以限制本发明。

通过上述实施例的说明，本发明实施例富集方法与国标中的对样品进行增菌后进行鉴定相比，本发明的方法对金黄色葡萄球菌的富集后进行细菌的分离培养，两者的鉴定结果表明差异不显著。因此运用该方法富集金黄色葡萄球菌后，可快速有效地对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定，排除了其他细菌的干扰，节省了培养时间、大量富集、易于培养。

综上所述，本发明提供的对牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，对牛奶中金黄色葡萄球菌的富集一般可在3天左右即可完成，由此可见其不仅可以快速、经济、特异的从牛奶中实现对金黄色葡萄球菌的富集，采用此方法还可以快速简便地分离鉴定牛奶中金黄色葡萄球菌，而且分离出的金黄色葡萄球菌敏感性较高，可简便有效地对金黄色葡萄球菌进行富集及分离培养，以便于进一步的对金黄色葡萄球菌的鉴定提供可靠的依据，从而切实有效提高牛奶的奶品质量。另外本发明的方法还可用于对奶牛乳房炎的鉴定提供依据，从而指导奶牛乳房炎的治序。

虽然已参照几个典型实施例描述了本发明，但应当理解，所用的术语是说明和示例性、而非限制性的术语。由于本发明能够以多种形式具体实施而不脱离发明的精神或实质，所以应当理解，上述实施例不限于任何前述的细节，而应在随附权利要求所限定的精神和范围内广泛地解释，因此落入权利要求或其等效范围内的全部变化和改型都应为随附权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、生乳样品的采集；

B、配制金黄色葡萄球菌富集的选择性培养基；

C、金黄色葡萄球菌的分离培养，将采集的乳样进行划线接种于选择性培养基中；

D、革兰氏染色镜检，对选择性培养基中的疑似菌落进行提取，提取的金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌；

E、金黄色葡萄球菌的富集培养，将步骤D中提取的革兰氏阳性球菌转移至营养琼脂培养基中进行纯培养，对金黄色葡萄球菌进行富集，并且获取富集后的金黄色葡萄球菌。

2.如权利要求1所述的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，所述营养琼脂培养基的制作方法包括：量取95mL的营养肉汤培养基加入1.5的琼脂粉高压灭菌。

3.如权利要求1所述的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，所述步骤B中的选择性培养基为高盐甘露醇培养基，所述高盐甘露醇培养基的制作方法包括：蛋白胨10g、牛肉膏1g、D-甘露醇10g、氯化钠75g、酚红0.025g、琼脂13g，加入1L蒸馏水中加热并且搅拌均匀，调整pH值并且高压灭菌。

4.如权利要求1所述的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，将步骤C中的选择性培养基置入培养箱中培养，培养条件为37℃中恒温培养18～24h。

5.如权利要求2所述的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，所述营养肉汤培养基的制作方法包括：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、加水至1L后混合均匀，调节pH值并且高压灭菌。

6.如权利要求2所述的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，所述营养琼脂培养基的制作方法还包括冷却步骤，将营养琼脂培养基高压灭菌后冷却至50～60℃后，制备固体培养基。

7.如权利要求3所述的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，所述高盐甘露醇培养基的pH值为7.4±0.2，并且高压灭菌30min，高压灭菌的温度为121℃，然后冷却至45～50℃且制备固体培养基。

8.如权利要求5所述的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，所述营养肉汤培养基的pH值为7.2±0.2，pH值调节剂为氢氧化钠。

9.如权利要求1至8的任一所述的牛奶中金黄色葡萄球菌的富集方法，其特征在于，还包括F、鉴定步骤，所述步骤F的鉴定方法为生化试验鉴定或者PCR鉴定。