CN106916875B - 一种醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的鉴别培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种适于醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的检测培养基，所提供的培养基中的检测的功能性成分为酵母膏、葡萄糖、无机盐、乙醇和放线菌酮。本发明培养基的组分在检测醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属菌落时呈现特征红色，提高分离鉴别的效果。而且本发明添加氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁作为鉴别培养基的成分，缩短醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属菌落呈色时间，提高分离鉴别的效率。本发明添加碳酸钙作为鉴别培养基的成分，可用于高产乙酸的醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属分离鉴别，适用于食醋、醋酸行业。

Description

一种醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的鉴别培养基
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种适用于醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的鉴别培养基及其应用。
背景技术
醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属广泛存在于自然界中，是食醋、醋酸和大曲白酒工业中的重要微生物，也是葡萄酒、啤酒工业中常见的污染菌。醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属是严格的好氧菌，繁殖速度快，产酸能力和耐酸能力强，可将酒精迅速氧化为醋酸，并且分解醋酸和其它有机酸的能力弱，可在较高温度下生长、发酵，使酒精充分转化为醋酸。
随着人们生活水平的提高，对发酵产品品质的要求与日俱增，醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属微生物是决定食醋、大曲白酒产量与质量的主要菌种，良好菌种的分离、筛选与选育，是提高原料利用率、提高质量、增进感官接受性的基础，也是菌种固定化、先进生产工艺应用的基础。另外，醋酸菌污染水平的监控对葡萄酒、啤酒工业的意义重大。因此，建立快速高效的醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属微生物分离、检验和鉴别技术在食醋、葡萄酒等发酵工业中具有重要地位，是决定发酵产品过程成败的关键，对于提高发酵产品的品质具有重大意义。
目前，醋酸菌的分离通常在以酵母膏和葡萄糖配成的基础培养基中添加酒精、醋酸、碳酸钙的琼脂培养基中进行，这些琼脂平板只能分离出产酸、耐酸或耐乙醇细菌，而是否为醋酸菌还需要进行醋酸液体发酵定性实验、生理生化实验等一系列实验来检验和鉴别，时间长达5-7天，存在耗时、费力等缺点。另外，16SrRNA序列分析和MIDI微生物鉴定系统等技术虽然已经在醋酸菌的检验、鉴定中有所应用，但这些技术对仪器设备要求高、成本高、周期长，还无法在发酵调味品、葡萄酒等企业和科研机构中广泛应用推广。因此，快速、高效、准确、廉价的醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基的开发受到食醋、大曲白酒、葡萄酒等发酵工业和醋酸菌研究学者的高度关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的检测和计数用鉴别培养基及其应用，所述培养基能准确鉴别醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属，可作为醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属分离培养基、检测培养基和计数培养基，广泛应用于食醋、大曲白酒、醋酸、葡萄酒等行业及其研究领域。
本发明提供了一种醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属快速鉴别培养基，所述培养基中的检测的功能性成分为酵母膏、葡萄糖、无机盐、乙醇和放线菌酮；
其中酵母膏、葡萄糖、无机盐、乙醇和放线菌酮的浓度满足体系中乙酸浓度达到1ng时就呈现红色。
作为实施例的优选，酵母膏、葡萄糖、无机盐、乙醇和放线菌酮的一种具体浓度为酵母膏1～1.5％、葡萄糖1～1.5％、无机盐1.49～3.15％、乙醇3～5％、放线菌酮50～200μg/mL。
所述的无机盐为氯化铁、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和碳酸钙中的任一种或几种。
所述培养基，其一种具体组成如下：酵母膏1～1.5％、葡萄糖1～1.5％、碳酸钙1～2％、氯化铁0.05～0.25％、氯化钠0.2～0.3％、乙醇3～5％、放线菌酮50～200μg/mL、磷酸氢二钾0.04～0.1％、硫酸镁0.2～0.5％、琼脂1.5～2.0％。
本发明的醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基，其pH值为4.0～4.5。
本发明的培养基可应用于食醋、醋酸、大曲白酒、葡萄酒、啤酒行业的醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的检测应用；其一种具体操作方法如下：
1)配制醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基；
2)取10g或10mL样品，放入盛有90mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，摇振20分钟混匀，为10-1稀释度，然后，从10-1稀释度中吸取1mL放入盛有9mL无菌水的试管种，为10-2稀释度，以此类推，制成不同稀释度的样品稀释液；
3)取3个稀释梯度，分别涂布于醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基，于30℃培养36-48h，菌落呈现红色的菌落为醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属。
本发明的培养基可实现36-48h分离鉴别醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属，缩短分离鉴别时间72-120h，使筛选和计数更加快速便捷。
本发明培养基的组分在检测醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属菌落时呈现特征红色，提高分离鉴别的效果。而且本发明添加氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁作为鉴别培养基的成分，缩短醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属菌落呈色时间，提高分离鉴别的效率。本发明添加碳酸钙作为鉴别培养基的成分，可用于高产乙酸的醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属分离鉴别，适用于食醋、醋酸行业。
附图说明
图1：醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属培养基鉴别实验图，其中1为巴氏醋酸杆菌沪酿1.01；2为植物乳杆菌；
图2：醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属培养基醋醅应用实验图；
图3：实施例2的检测图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。
本发明发现，醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的检测分析易与乳酸菌等其他产酸细菌产生混淆。建立的鉴别培养基可以准确鉴别醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌，呈现特征红色且无透明圈，而乳酸菌等其他产酸细菌菌落不呈现红色且部分产生透明圈。
实施例1：醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属培养基鉴别实验
1、菌株
巴氏醋酸杆菌沪酿1.01(Acetobacter pasteurianus Huniang 1.01)。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
2、培养基
(1)传统分离培养基：酵母粉1％，葡萄糖1％，碳酸钙2％，琼脂1.5～2.0％，pH4.5，121℃灭菌15min。
(2)醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基：酵母膏1～1.5％，葡萄糖1～1.5％，碳酸钙1～2％，氯化铁0.05～0.25％，氯化钠0.2～0.3％，磷酸氢二钾0.04～0.1％，硫酸镁0.2～0.5％，琼脂1.5～2.0％，pH4.0～4.5，121℃灭菌15min。在灭菌后加入乙醇3～5％，放线菌酮50～200μg/mL。
3、筛选
取巴氏醋酸杆菌沪酿1.01和植物乳杆菌斜面，分别将沪酿1.01和植物乳杆菌接种于传统分离培养基和鉴别培养基，于30℃培养36-48h，在传统分离培养基平板上沪酿1.01和植物乳杆菌生长后形成的透明圈，而在醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上沪酿1.01生长后菌落呈现特征性红色(图1)，植物乳杆菌生长后形成透明圈。
实施例2：醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基在固体醋醅中醋酸菌分离、检测和计数应用实验
1、培养基：
(1)醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基：酵母膏1～1.5％，葡萄糖1～1.5％，碳酸钙1～2％，氯化铁0.05～0.25％，氯化钠0.2～0.3％，磷酸氢二钾0.04～0.1％，硫酸镁0.2～0.5％，琼脂1.5～2.0％，pH4.0～4.5，121℃灭菌15min。在灭菌后加入乙醇3～5％，放线菌酮50～200μg/mL。
(2)醋酸发酵培养基：葡萄糖1％，酵母膏1％，pH4.5，121℃灭菌15min。在灭菌后加入乙醇5％。
2、固体醋醅处理
称取固体醋醅10g，放入盛有90mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，摇振20分钟混匀，为10-1稀释度，然后，从10-1稀释度中吸取1mL放入盛有9mL无菌水的试管种，为10-2稀释度，以此类推，制成不同稀释度的固体醋醅溶液。
3、固体醋醅中醋酸菌分离实验
取固体醋醅稀释梯度，分别涂布于醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基，于30℃培养36-48h，在醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上长出两类细菌菌落，一类菌落呈现红色；第二类菌落无红色(图2)。
4、醋酸发酵验证实验
对醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上细菌菌落共76株菌株(无红色菌落菌株数43个，红色菌落菌株数33个)，分别接入100mL醋酸发酵培养基，于30℃培养96h后，利用高效液相色谱法检测发酵液中醋酸进行定性，测定条件：示差折光检测器，Aminex HPX-87H色谱柱，检测器温度45℃，柱温65℃，流动相5mmol/L硫酸，流速0.6mL/min，20μL进样量。醋酸发酵和醋酸检测均设置3个平行。(表1)
表1醋酸发酵验证实验
Figure BDA0001287972750000051
从本实验结果来看，醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上33株产生红色菌落的菌株均能利用乙醇产乙酸，为醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属；醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上43株无红色菌落的菌株均不能利用乙醇产乙酸，不是醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属细菌。该鉴别培养基仅需要36-48h就可以实现醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的分离鉴别，比传统醋酸菌分离鉴别方法缩短了3-5天，具有快速、高效、准确、廉价的特点。
从本实验结果来看，固体醋醅中醋酸菌数量为3.6×104CFU/g。
实施例2：醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基葡萄酒中醋酸菌分离、检测和计数应用实验
1、培养基：
醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基；
醋酸发酵培养基；
2、固体醋醅处理
称取葡萄酒发酵液10mL，放入盛有90mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，摇振20分钟混匀，为10-1稀释度，然后，从10-1稀释度中吸取1mL放入盛有9mL无菌水的试管种，为10-2稀释度，以此类推，制成不同稀释度的葡萄酒溶液。
3、固体醋醅中醋酸菌检测和计数实验
取葡萄酒稀释梯度，分别涂布于醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基，于30℃培养36-48h，在醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上长出两类细菌菌落，一类菌落呈现红色；第二类菌落无红色(图3)。
4、醋酸发酵验证实验
对醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上细菌菌落共69株菌株(无红色菌落菌株数24个，红色菌落菌株数45个)，分别接入100mL醋酸发酵培养基，于30℃培养96h后，利用高效液相色谱法检测发酵液中醋酸进行定性，测定条件：示差折光检测器，Aminex HPX-87H色谱柱，检测器温度45℃，柱温65℃，流动相5mmol/L硫酸，流速0.6mL/min，20μL进样量。醋酸发酵和醋酸检测均设置3个平行。
从本实验结果来看，醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上45株产生红色菌落的菌株100％产乙酸，均为醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属。醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基上24株无红色菌落的菌株均不能利用乙醇产乙酸，不是醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属细菌。从本实验结果来看，葡萄酒发酵液中醋酸菌数量为1.2×102CFU/mL。

Claims (3)

1.一种醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属快速鉴别培养基，其特征在于，所述的培养基的组成如下：酵母膏1～1.5％、葡萄糖1～1.5％、碳酸钙1～2％、氯化铁0.05～0.25％、氯化钠0.2～0.3％、乙醇3～5％、放线菌酮50～200μg/mL、磷酸氢二钾0.04～0.1％、硫酸镁0.2～0.5％、琼脂1.5～2.0％；
所述的培养基的pH值为4.0～4.5。
2.权利要求1所述的培养基在检测醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属中的应用。
3.一种检测醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属的方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：
1)配制权利要求1所述的醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基；
2)取10g或10mL样品，放入盛有90mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，摇振20分钟混匀，为10-1稀释度，然后，从10-1稀释度中吸取1mL放入盛有9mL无菌水的试管中 ，为10-2稀释度，以此类推，制成不同稀释度的样品稀释液；
3)取3个稀释梯度，分别涂布于醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属鉴别培养基，于30℃培养36-48h，菌落呈现红色的菌落为醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属。
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