CN111961704A - 一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法 - Google Patents

一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，通过准备、制样、培养和计数四个步骤，其中，制样后，每个稀释度样品分别吸取1mL样品匀液至培养皿中，然后每个培养皿中加入15‑20mL添加了亚碲酸钾卵黄增菌液的Baird‑Parker培养基液，混匀，然后进行培养，培养后对可疑菌落进行计数并将可疑菌落通过血浆凝固酶试验进行确证鉴定。本发明与现有的涂布法不同，能够能够快速、简便、准确的测定食品中金黄色葡萄球菌。

Description

一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法
技术领域
本发明涉及一种食品检测技术领域，尤其是涉及一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是最常见的食物中毒病原菌之一，在自然界中随处可见。因此，食品受其污染的机率很大。据美国疾病控制中心报告，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒仅次于大肠杆菌，占第二位，占整个细菌性食物中毒的33%。金黄色葡萄球菌是引起临床感染及手术切口感染的主要致病菌之一，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感，但抗生素的广泛应用致使金黄色 葡萄球菌耐药菌株的大量出现，使其造成的感染成为与乙型肝炎，艾滋病并列的世界三大感染顽疾。
目前定量检测金黄色葡萄球菌的标准是传统涂布法，该方法需吸取制备好的1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL和0.4mL接种量分别加入已制备好的三块Baird-Parker培养基平板上，涂布均匀。此方法操作繁琐，涂布所需时间较长，效率低，样液在Baird-Park培养基平板上难吸收，涂布棒上残留样液多，针对1ml检测结果准确性偏低。因此，迫切需要改进和提高食品中金黄色葡萄球菌检测方法，提高金黄色葡萄球菌的检测准确度，对食源性致病菌的检测具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，能够快速、简便、准确的测定食品中金黄色葡萄球菌。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，步骤如下：
步骤1：准备
1.1、按照生理盐水的配制要求，称取8.5g氯化钠于1000mL三级水中，完全溶解后，高压灭菌，冷却，制备成生理盐水备用；
1.2、按照Baird-Parker培养基基础配制要求，称取63.0g于950mL三级水中，加热煮沸至完全溶解，高压灭菌，46℃保温，制备Baird-Parker培养基液，按比例取亚碲酸钾卵黄增菌液加入到Baird-Parker培养基液中，混匀，备用；
步骤2：制样
2.1、制样，无菌称取25g待测样品置于盛有225mL如步骤1.1制备的生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1min-5min，制成1:10的样品匀液；
2.2、稀释，将样品均液用如步骤1.1制备的生理盐水10倍系列稀释，选择2-3个适宜的连续稀释度样品；
步骤3：培养
3.1、将步骤2.2选择的每个稀释度样品分别吸取1mL样品匀液至培养皿中，每个稀释度样品做2个，然后每个培养皿中加入15-20mL添加了亚碲酸钾卵黄增菌液的Baird-Parker培养基液，混匀，得到培养平板。
3.2、待培养平板凝固后倒置放入培养箱中，恒温36℃，培养48h；
步骤4：计数
4.1、计数可疑菌落；
4.2、将可疑菌落通过血浆凝固酶试验进行确证鉴定。
进一步的，所述步骤1中的高压灭菌使用型号为GI180TW立式自动压力蒸汽灭菌器。
进一步的，所述步骤1中高压灭菌的温度为121℃，保持时间为15min。
进一步的 ，所述步骤1.2中的亚碲酸钾卵黄增菌液与Baird-Parker培养基液的比例（容积比）为1:20。
进一步的，所述步骤3.2中，如果培养平板中的样品均液不被吸收，则将培养平板放置培养箱中，恒温36℃，培养1小时，等样品匀液吸收后翻转培养平板进行培养。
进一步的，所述吸取稀释度样品的工具为移液枪。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明的一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，制备的样品均匀稀释后直接用移液枪将稀释度样品移到培养皿中，此种方法远比涂布法将样品转移的培养皿中更加准确，因此，得到的结果也更精确。
2、本发明的一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，通过直接对样品的菌落进行培养，然后肉眼观察计数可疑菌落，最后用血浆凝固酶试验进行确证鉴定，准确性高。
3、本发明的一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，用专用的金黄色葡萄球菌培养基对样品进行培养，能快速有效的识别金黄色葡萄球菌，整个检验过程耗时短，效率高，成本低。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例以检测法式小面包中的金黄色葡萄球菌为例。
一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，包括以下步骤：
步骤1：准备
1.1、按照生理盐水的配制要求，称取8.5g氯化钠于1000mL三级水中，完全溶解后，用美国ZEALWAY公司的型号为GI180TW立式自动压力蒸汽灭菌器高压灭菌，灭菌温度为121℃，保持15min，冷却，备用；
1.2、Baird-Parker培养基为北京陆桥技术股份有限公司生产的商用培养基，按照Baird-Parker培养基基础配制要求，称取63.0g于950mL三级水中，加热煮沸至完全溶解，用美国ZEALWAY公司的型号为GI180TW立式自动压力蒸汽灭菌器高压灭菌，灭菌温度为121℃，保持15min，46℃保温，制备Baird-Parker培养基液，按亚碲酸钾卵黄增菌液与Baird-Parker培养基液的比例（容积比）为1:20的比例取亚碲酸钾卵黄增菌液加入到Baird-Parker培养基液中，混匀，备用；
步骤2：取样
2.1、无菌称取25g的法式小面包置于盛有225mL生理盐水的无菌均质袋内，在生物安全柜（型号NU-543-600S）中无菌加入1mL金黄色葡萄球菌标准菌株CICC23656制成的菌浓度约为1.0*108CFU/mL的菌悬液，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液；
2.2、用9mL无菌盐水管进行10倍系列稀释，选择10-4和10-5两个适宜的连续稀释度；
步骤3：培养
3.1、将步骤（2）选择的每个稀释度用移液枪各吸取1mL至培养皿中，每个稀释度做两个，然后每个培养皿中加入15-20mL添加了亚碲酸钾卵黄增菌液的Baird-Parker培养基液，混匀，得到培养平板，平置待凝固；
同时用涂布法制备对比样的培养平板：将步骤（2）选择的每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL和0.4mL接种量分别加入已制备好的三块Baird-Parker平板，涂布均匀，涂布时不要触及培养基平板边缘；
3.2、待培养平板凝固后倒置放入上海一恒科学仪器有限公司的DHP-9602型培养箱中，恒温36℃，培养48h，
如果培养平板中的样品均液不被吸收，则将培养平板放置培养箱中，恒温36℃，培养1小时，等样品匀液吸收后翻转培养平板进行培养；
步骤4：计数
计数可疑菌落；
金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm-3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色的边缘，所述浅色不包括白色，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度平板所有菌落数在10CFU-100CFU范围内，计数典型菌落数；
涂布法计算同一稀释度3个平板之和。
计算单个平板上菌落数将可疑菌落通过血浆凝固酶试验进行确证鉴定：挑取Baird-Parker平板上至少5个可疑菌落（小于5个全选），分别接种到北京陆桥技术股份有限公司生产的5mLBHI和营养琼脂小斜面，在培养箱中36℃培养24h，取北京陆桥技术股份有限公司生产冻干血浆，每支西林瓶中加入0.5mL如步骤1.1制备的生理盐水至完全溶解，然后加入0.3mL待检液，置培养箱中保持温度36℃，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块或凝固体积大于原体积的一半，则判定为阳性结果。
涂布法和本发明的方法结果对比如表1：
表1：
实验序号 涂布法（×10<sup>4</sup>CFU/mL） 本发明方法（×10<sup>4</sup>CFU/mL）
1 35 45
2 39 48
3 37 43
4 34 49
由实验结果可见，使用本发明方法检测样品中金黄色葡萄球菌，其检出率高于国标方法，提高了食品中检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和检出限，降低了食品中因污染金黄色葡萄球菌而引起的食品安全风险。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：准备
1.1、按照生理盐水的配制要求，称取8.5g氯化钠于1000mL三级水中，完全溶解后，高压灭菌，冷却，制备成生理盐水备用；
1.2、按照Baird-Parker培养基基础配制要求，称取63.0g于950mL三级水中，加热煮沸至完全溶解，高压灭菌，46℃保温，制备Baird-Parker培养基液，按比例取亚碲酸钾卵黄增菌液加入到Baird-Parker培养基液中，混匀，备用；
步骤2：制样
2.1、制样，无菌称取25g待测样品置于盛有225mL如步骤1.1制备的生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1min-5min，制成1:10的样品匀液；
2.2、稀释，将样品均液用如步骤1.1制备的生理盐水10倍系列稀释，选择2-3个适宜的连续稀释度样品；
步骤3：培养
3.1、将步骤2.2选择的每个稀释度样品分别吸取1mL样品匀液至培养皿中，每个稀释度样品做2个，然后每个培养皿中加入15-20mL添加了亚碲酸钾卵黄增菌液的Baird-Parker培养基液，混匀，得到培养平板；
3.2、待培养平板凝固后倒置放入培养箱中，恒温36℃，培养48h；
步骤4：计数
4.1、计数可疑菌落；
4.2、将可疑菌落通过血浆凝固酶试验进行确证鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，其特征在于：所述步骤1中的高压灭菌使用型号为GI180TW立式自动压力蒸汽灭菌器。
3.根据权利要求2所述的一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，其特征在于：所述步骤1中高压灭菌的温度为121℃，保持时间为15min。
4.根据权利要求1所述的一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，其特征在于：所述步骤1.2中的亚碲酸钾卵黄增菌液与Baird-Parker培养基液的比例（容积比）为1:20。
5.根据权利要求1所述的一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，其特征在于：所述步骤3.2中，如果培养平板中的样品均液不被吸收，则将培养平板放置培养箱中，恒温36℃，培养1小时，等样品匀液吸收后翻转培养平板进行培养。
6.根据权利要求1所述的一种食品中金黄色葡萄球菌定量检测方法，其特征在于：所述吸取稀释度样品的工具为移液枪。
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