CN108841915A - 一种食品中大肠杆菌的检验检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,涉及食品检验检测技术领域,包括以下步骤:(1)制备样品;(2)培养试验;(3)染色试验。采用本发明对食品中的大肠杆菌进行检测,方便、快捷,成本低,灵敏度高,便于操作食品样品处理不用多次离心,不用多次膜过滤,只需离心一次,过滤一次,省时省力,就能达到现有技术多次过滤的效果。本发明提供特异性LB培养基,大肠杆菌在无氧条件下,把乳糖分解成乳酸等酸性物质,抑制除大肠杆菌以外其他细菌的生长。同时,本发明采用多个LB培养基进行对比试验,本检测方法灵敏度高,特异性好,直接根据菌落颜色就能判断出是否含有大肠杆菌,检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及食品检验检测技术领域,具体涉及一种食品中大肠杆菌的检验检测方法。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli),分类于肠杆菌科,归属于埃希氏菌属,与人类疾病有关的大肠杆菌一般包括五种,即肠毒素性大肠杆菌(ETEC),致病性大肠杆菌(SPEC)、出血性大肠杆菌(EHEC),侵袭性大肠杆菌(EIEC)和粘附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌常随粪便从人及动物体排出,广泛散播于自然界中,所以一旦检出大肠杆菌,即意味着直接或间接地被粪便污染,在卫生学上被用于饮水,牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标;并且由于大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近,它的出现也可能预示着某些肠道病原菌的存在,因此该细菌是国际上公认的卫生监测指示菌。
大肠杆菌是水体污染程度的重要指示菌,是肠道中最普遍、数量最多的一类细菌,近年来,由于大肠杆菌引发的食品安全事件层出不穷,每年由大肠杆菌引发的病例多达6.4亿。在我国,大肠杆菌是引起我国居民腹泻的首要病源,环境中的大肠杆菌己经成为人类病原存在的一个重要指标,成为环境保护、食品卫生、饮水卫生和流行性病学领域中最重要的研究对象之一。饮用水或食物中的大肠杆菌可引发霍乱、伤寒、痢疾等肠道疾病。
现有技术,一般采用无菌操作,将食品检样经过相应的处理后,做一定的倍比稀释,然后在一定条件下培养(如培养基成分、培养温度和时间、PH值、需氧性质等),最后在电镜、显微镜下观察,根据菌落的颜色、形态等生化指标进行分辨,并计算平板的菌落数。该方法成本低,特别是对检测实验室的硬件设备要求低,曾一度被认为是微生物检测的经典方法,也是后来各种检测方法的基础平台,在各个国家都被认可,该标准在我国一直沿续至今,特别是一些病原细菌的检测。特别是一些病原细菌的检测。但是,该方法非常繁琐,需要耗费大量的人力物力,而且检测周期长、灵敏度低,难以满足目前国内外对食品安全检测的要求。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种方便、快捷,成本低,灵敏度高,便于操作的大肠杆菌的检测方法。
本发明解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现:
一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,包括以下步骤:
(1)制备样品:
a.在无菌条件下,将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗,然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散,加入生理盐水,充分混匀,高速分散机的转速为8500r-9500r/min,离心35-50s,离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤,过滤后得滤液,将滤液分装至5个无菌试管中;
b.在无菌条件下,将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释,依次做成1:4梯度的稀释液,所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5;
(2)培养试验:
c.在无菌条件下,取出5份1mL的稀释液a1,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a2,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a3,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a4,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a5,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;
(3)染色试验:
d.观察所述步骤c中的LB培养基有无气体产生,若无气体产生,则为大肠杆菌阴性;若有气体产生,则将培养基上的菌落进行革兰氏染色,同时接种在乳糖发酵管中培养,观察菌落,若乳糖发酵管中产气,革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌,即为大肠杆菌阳性。
进一步的,所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为3-6层。
进一步的,所述步骤a中过滤膜的厚度为0.3-0.4μm。
进一步的,所述步骤a中食品与生理盐水的质量比为1:6。
进一步的,所述步骤b中,所述培养基由如下原料组成:乳糖15~20g/L,琼脂16~22g/L,胆盐2~6g/L,氯化钠3~6g/L,亚碲酸钾3~7g/L,山梨醇12~18g/L,肌醇5g/L;
所述培养基由如下方法制备:按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇,加热溶解后,加去离子水定容至1L,混匀,280-300℃灭菌6-8min,即得。
优选的,所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
优选的,所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h;5份稀释液a2的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h。
优选的,所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h;5份稀释液a4的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h;5份稀释液a5的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果是:
1)采用本发明对食品中的大肠杆菌进行检测,方便、快捷,成本低,灵敏度高,便于操作食品样品处理不用多次离心,不用多次膜过滤,只需离心一次,过滤一次,省时省力,就能达到现有技术多次过滤的效果。
2)本发明提供特异性LB培养基,大肠杆菌在无氧条件下,把乳糖分解成乳酸等酸性物质,抑制除大肠杆菌以外其他细菌的生长。同时,本发明采用多个LB培养基进行对比试验,使得试验的结果对比明显,更加准确。
3)本检测方法灵敏度高,特异性好,直接根据菌落颜色就能判断出是否含有大肠杆菌,检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于工业化生产,可对食品中大肠杆菌进行初步鉴定,为微生物快速检测提供了新的途径。
具体实施方式
为了本技术领域的人员更好的理解本发明,下面结合以下实施例对本发明作进一步详细描述:
实施例1:
一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,包括以下步骤:
(1)制备样品:
a.在无菌条件下,将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗,然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散,加入生理盐水,所述食品与生理盐水的质量比为1:6。充分混匀,高速分散机的转速为8500r/min,离心35s,离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤,过滤后得滤液,将滤液分装至5个无菌试管中;
b.在无菌条件下,将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释,依次做成1:4梯度的稀释液,所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5;
(2)培养试验:
c.在无菌条件下,取出5份1mL的稀释液a1,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a2,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a3,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a4,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a5,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;
(3)染色试验:
d.观察所述步骤c中的LB培养基有无气体产生,若无气体产生,则为大肠杆菌阴性;若有气体产生,则将培养基上的菌落进行革兰氏染色,同时接种在乳糖发酵管中培养,观察菌落,若乳糖发酵管中产气,革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌,即为大肠杆菌阳性。
为了达到更好的检测效果,所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为3层。
为了达到更好的检测效果,所述步骤a中过滤膜的厚度为0.3μm。
实施例2:
(1)制备样品:
a.在无菌条件下,将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗,然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散,加入生理盐水,充分混匀,高速分散机的转速为9500r/min,离心50s,离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤,过滤后得滤液,将滤液分装至5个无菌试管中;
b.在无菌条件下,将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释,依次做成1:4梯度的稀释液,所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5;
(2)培养试验:
c.在无菌条件下,取出5份1mL的稀释液a1,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a2,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a3,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a4,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a5,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;
(3)染色试验:
d.观察所述步骤c中的LB培养基有无气体产生,若无气体产生,则为大肠杆菌阴性;若有气体产生,则将培养基上的菌落进行革兰氏染色,同时接种在乳糖发酵管中培养,观察菌落,若乳糖发酵管中产气,革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌,即为大肠杆菌阳性。
作为优选,所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为6层。
作为优选,所述步骤a中过滤膜的厚度为0.4μm。
为了达到快速、方便和更加灵敏的检测结果,所述步骤b中,所述培养基由如下原料组成:乳糖15~20g/L,琼脂16~22g/L,胆盐2~6g/L,氯化钠3~6g/L,亚碲酸钾3~7g/L,山梨醇12~18g/L,肌醇5g/L;
所述培养基由如下方法制备:按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇,加热溶解后,加去离子水定容至1L,混匀,280-300℃灭菌6-8min,即得。
优选的,所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
优选的,所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为18℃,培养时间为22h;5份稀释液a2的培养温度为18℃,培养时间为22h。
优选的,所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为18℃,培养时间为22h;5份稀释液a4的培养温度为18℃,培养时间为22h;5份稀释液a5的培养温度为18℃,培养时间为22h。
实施例3:
一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,包括以下步骤:
(1)制备样品:
a.在无菌条件下,将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗,然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散,加入生理盐水,充分混匀,高速分散机的转速为9000r/min,离心40s,离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤,过滤后得滤液,将滤液分装至5个无菌试管中;
b.在无菌条件下,将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入10倍质量的蒸馏水进行稀释,依次做成1:4梯度的稀释液,所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5;
(2)培养试验:
c.在无菌条件下,取出5份1mL的稀释液a1,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a2,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a3,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a4,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a5,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;
(3)染色试验:
d.观察所述步骤c中的LB培养基有无气体产生,若无气体产生,则为大肠杆菌阴性;若有气体产生,则将培养基上的菌落进行革兰氏染色,同时接种在乳糖发酵管中培养,观察菌落,若乳糖发酵管中产气,革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌,即为大肠杆菌阳性。
为了达到更好的检测效果,所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为5层。
为了达到更好的检测效果,所述步骤a中过滤膜的厚度为0.35μm。
为了达到更好的检测效果,所述步骤a中食品与生理盐水的质量比为1:6。
为了达到更好的检测效果,所述步骤b中,所述培养基由如下原料组成:乳糖18g/L,琼脂20g/L,胆盐4g/L,氯化钠5g/L,亚碲酸钾5g/L,山梨醇15g/L,肌醇5g/L;
所述培养基由如下方法制备:按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇,加热溶解后,加去离子水定容至1L,混匀,290℃灭菌7min,即得。
优选的,所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
优选的,所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为23℃,培养时间为25h;5份稀释液a2的培养温度为23℃,培养时间为25h。
优选的,所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为20℃,培养时间为23h;5份稀释液a4的培养温度为23℃,培养时间为25h;5份稀释液a5的培养温度为23℃,培养时间为25h。
实施例4:
一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,包括以下步骤:
(1)制备样品:
a.在无菌条件下,将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗,然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散,加入生理盐水,充分混匀,高速分散机的转速为9500r/min,离心35s,离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤,过滤后得滤液,将滤液分装至5个无菌试管中;
b.在无菌条件下,将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释,依次做成1:4梯度的稀释液,所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5;
(2)培养试验:
c.在无菌条件下,取出5份1mL的稀释液a1,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a2,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a3,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a4,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a5,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;
(3)染色试验:
d.观察所述步骤c中的LB培养基有无气体产生,若无气体产生,则为大肠杆菌阴性;若有气体产生,则将培养基上的菌落进行革兰氏染色,同时接种在乳糖发酵管中培养,观察菌落,若乳糖发酵管中产气,革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌,即为大肠杆菌阳性。
进一步的,所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为6层。
进一步的,所述步骤a中过滤膜的厚度为0.3μm。
进一步的,所述步骤a中食品与生理盐水的质量比为1:6。
进一步的,所述步骤b中,所述培养基由如下原料组成:乳糖15g/L,琼脂22g/L,胆盐6g/L,氯化钠3g/L,亚碲酸钾7g/L,山梨醇12g/L,肌醇5g/L;
所述培养基由如下方法制备:按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇,加热溶解后,加去离子水定容至1L,混匀,300℃灭菌6min,即得。
优选的,所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
优选的,所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为24℃,培养时间为26h;5份稀释液a2的培养温度为24℃,培养时间为26h。
优选的,所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为24℃,培养时间为26h;5份稀释液a4的培养温度为24℃,培养时间为26h;5份稀释液a5的培养温度为24℃,培养时间为26h。
采用本发明对食品中的大肠杆菌进行检测,方便、快捷,成本低,灵敏度高,便于操作食品样品处理不用多次离心,不用多次膜过滤,只需离心一次,过滤一次,省时省力,就能达到现有技术多次过滤的效果。
本发明提供特异性LB培养基,大肠杆菌在无氧条件下,把乳糖分解成乳酸等酸性物质,抑制除大肠杆菌以外其他细菌的生长。同时,本发明采用多个LB培养基进行对比试验,使得试验的结果对比明显,更加准确。
本检测方法灵敏度高,特异性好,直接根据菌落颜色就能判断出是否含有大肠杆菌,检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于工业化生产,可对食品中大肠杆菌进行初步鉴定,为微生物快速检测提供了新的途径。
如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式,任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化,凡是与本发明具有相同或相近的技术方案,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备样品:
a.在无菌条件下,将样品用生理盐水溶解并进行反复清洗,然后将清洗好的样品通入到高速分散机中进行分散,加入生理盐水,充分混匀,高速分散机的转速为8500r-9500r/min,离心35-50s,离心后再用过滤膜进行多膜离心过滤,过滤后得滤液,将滤液分装至5个无菌试管中;
b.在无菌条件下,将步骤a中的五个无菌试管内的滤液分别加入8倍质量的蒸馏水进行稀释,依次做成1:4梯度的稀释液,所述五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5;
(2)培养试验:
c.在无菌条件下,取出5份1mL的稀释液a1,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a2,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a3,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a4,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;取出5份1mL的稀释液a5,分别移至LB培养基上培养;无氧条件下36℃培养18h;
(3)染色试验:
d.观察所述步骤c中的LB培养基有无气体产生,若无气体产生,则为大肠杆菌阴性;若有气体产生,则将培养基上的菌落进行革兰氏染色,同时接种在乳糖发酵管中培养,观察菌落,若乳糖发酵管中产气,革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌,即为大肠杆菌阳性。
2.根据权利要求1所述的一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,其特征在于:所述步骤a中多膜离心过滤用的过滤膜为3-6层。
3.根据权利要求1所述的一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,其特征在于:所述步骤a中过滤膜的厚度为0.3-0.4μm。
4.根据权利要求1所述的一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,其特征在于:所述步骤a中食品与生理盐水的质量比为1:6。
5.根据权利要求1所述的一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,其特征在于:所述步骤b中,所述培养基由如下原料组成:乳糖15~20g/L,琼脂16~22g/L,胆盐2~6g/L,氯化钠3~6g/L,亚碲酸钾3~7g/L,山梨醇12~18g/L,肌醇5g/L;所述培养基由如下方法制备:按配方量取乳糖、琼脂、胆盐、氯化钠、亚碲酸钾、山梨醇和肌醇,加热溶解后,加去离子水定容至1L,混匀,280-300℃灭菌6-8min,即得。
6.根据权利要求5所述的一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,其特征在于,所述胆盐为牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠、混合胆盐中的一种或几种的混合物。
7.根据权利要求1所述的一种食品中大肠杆菌的检验检测方法,其特征在于:所述步骤c中5份稀释液a1的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h;5份稀释液a2的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h。
8.根据权利要求1所述的大肠杆菌的检测方法,其特征在于:所述步骤c中5份稀释液a3的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h;5份稀释液a4的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h;5份稀释液a5的培养温度为18-24℃,培养时间为22-26h。
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