CN106282305A - 一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，包括：培养基的配制：培养基含有酵母膏、大豆胨、琼脂、氯化钠、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、4‑甲基伞型酮‑β‑D‑葡萄糖苷、对硝基β‑D‑葡萄糖苷、对硝基酚‑α‑D‑吡喃半乳糖；（2）称取10g待测样品至100ml培养基中，于37℃培养36h，获得增菌液；当肉眼观察增菌液显示黄色菌落颜色，将增菌液吸入无菌注射器中，用滤膜过滤，回收过滤液，更换无菌注射器，用PBS洗涤1～3次，用PBST洗涤1～3次，洗涤物在紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌。本发明快速，简便，准确。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是最常见的食物中毒病原菌之一，在自然界中随处可见。因此，食品受其污染的机率很大。据美国疾病控制中心报告，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒仅次于大肠杆菌占第二位，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则高达45%。金黄色葡萄球菌是引起临床感染及手术切口感染的主要致病菌之一，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感，但抗生素的广泛应用致使金黄色葡萄球菌耐药菌株的大量出现，使其造成的感染成为与乙型肝炎，艾滋病并列的世界三大感染顽疾。
目前检测金黄色葡萄球菌的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时（3～7天）；ELISA法、PCR方法以及生物传感器法对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度高，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简便、准确的食品中金黄色葡萄球菌的检测方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
（1）培养基的配制：按照每1000ml培养基含有酵母膏12～14g、大豆胨3～3.5g、琼脂13～16g、氯化钠17～19g、丙酮酸钠4～4.2g、甘氨酸0.8～1.1g、氯化锂0.3～0.5g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷5.5～6.2g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.2～0.5g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.2～1.5g，按比例将酵母膏、大豆胨、琼脂、氯化钠、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷、对硝基β-D-葡萄糖苷加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，待混合物冷却至42～45℃时，继续加入过滤除菌的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，混匀，得培养基，备用；
（2）称取10g待测样品至100ml步骤（1）配制的培养基中，于37℃培养36h，获得增菌液；当肉眼观察增菌液显示无菌落或者非黄色菌落时，判定待测样品中无金黄色葡萄球菌；当肉眼观察增菌液显示黄色菌落颜色，则进行下一步；
（3）将步骤（2）的增菌液吸入1ml的无菌注射器中，用0.22μm的滤膜过滤，回收过滤液，然后更换无菌注射器，用PBS洗涤1～3次，然后用PBST洗涤1～3次，洗涤后的剩余物在紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌，反之则没有金黄色葡萄球菌。
作为本发明进一步的方案：所述的步骤（1）中，每1000ml培养基含有酵母膏13～14g、大豆胨3.2～3.4g、琼脂14～16g、氯化钠17～18g、丙酮酸钠4～4.1g、甘氨酸0.9～1.0g、氯化锂0.3～0.4g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷5.6～6.0g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.3～0.4g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.2～1.4g。
作为本发明进一步的方案：所述的步骤（1）中，每1000ml培养基含有酵母膏13g、大豆胨3.2g、琼脂15g、氯化钠18g、丙酮酸钠4.1g、甘氨酸0.92g、氯化锂0.4g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷5.8g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.4g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.3g。
作为本发明进一步的方案：所述的步骤（1）中，待混合物冷却至44℃。
作为本发明进一步的方案：所述的步骤（3）中，用PBS洗涤2次，然后用PBST洗涤2次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
酵母膏、大豆胨、琼脂、氯化钠为葡萄球菌生长提供适宜的生长环境，利于其快速增长。高盐条件可以促进金黄色葡萄球菌生长，同时抑制杂菌生长。
丙酮酸钠是金黄色葡萄球菌的生长促进剂。
甘氨酸和氯化锂可以抑制非黄色葡萄球菌的生长。
对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖为α-D-半乳糖苷酶的显色底物，可以被非金黄色葡萄球菌降解，产生对硝基酚。
金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌可以作用于4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷，生成具有强烈荧光的4-甲基伞型酮，产生荧光显微镜下可见菌落。金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌产生的碱性磷酸酶作用于对硝基β-D-葡萄糖苷，生成对硝基苯，产生黄色菌落。但是金黄色葡萄球菌不能分解对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖。而其他葡萄球菌可以分解对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，产生黄色产物，从而产生与金黄色葡萄球菌一样的表观菌落颜色。
本发明采用的特定的培养基中，非葡萄球菌显菌落本身的颜色，葡萄球菌显示黄色菌落颜色，金黄色葡萄球菌显示黄色菌落颜色并在荧光显微镜下可见。
本发明首先对待测样品进行培养基培养得到增菌液，通过肉眼观察增菌液中有无菌落以及菌落颜色，可以初步判断有无金黄色葡萄球菌，当肉眼观察到有黄色菌落时，接着采用无菌注射器和滤膜组合进行信号富集，借助紫外进行检测，从而确定有无金黄色葡萄球菌，本发明方法快速，简便，准确。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
（1）培养基的配制：按照每1000ml培养基含有酵母膏12g、大豆胨3.5g、琼脂13g、氯化钠19g、丙酮酸钠4g、甘氨酸1.1g、氯化锂0.3g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷6.2g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.2g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.5g，按比例将酵母膏、大豆胨、琼脂、氯化钠、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷、对硝基β-D-葡萄糖苷加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，待混合物冷却至42℃时，继续加入过滤除菌的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，混匀，得培养基，备用；
（2）称取10g待测样品至100ml步骤（1）配制的培养基中，于37℃培养36h，获得增菌液；当肉眼观察增菌液显示无菌落或者非黄色菌落时，判定待测样品中无金黄色葡萄球菌；当肉眼观察增菌液显示黄色菌落颜色，则进行下一步；
（3）将步骤（2）的增菌液吸入1ml的无菌注射器中，用0.22μm的滤膜过滤，回收过滤液，然后更换无菌注射器，用PBS洗涤3次，然后用PBST洗涤1次，洗涤后的剩余物在紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌，反之则没有金黄色葡萄球菌。
实施例2
本发明实施例中，一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
（1）培养基的配制：按照每1000ml培养基含有酵母膏14g、大豆胨3g、琼脂16g、氯化钠17g、丙酮酸钠4.2g、甘氨酸0.8g、氯化锂0.5g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷5.5g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.5g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.2g，按比例将酵母膏、大豆胨、琼脂、氯化钠、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷、对硝基β-D-葡萄糖苷加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，待混合物冷却至45℃时，继续加入过滤除菌的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，混匀，得培养基，备用；
（2）称取10g待测样品至100ml步骤（1）配制的培养基中，于37℃培养36h，获得增菌液；当肉眼观察增菌液显示无菌落或者非黄色菌落时，判定待测样品中无金黄色葡萄球菌；当肉眼观察增菌液显示黄色菌落颜色，则进行下一步；
（3）将步骤（2）的增菌液吸入1ml的无菌注射器中，用0.22μm的滤膜过滤，回收过滤液，然后更换无菌注射器，用PBS洗涤1次，然后用PBST洗涤3次，洗涤后的剩余物在紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌，反之则没有金黄色葡萄球菌。
实施例3
本发明实施例中，一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
（1）培养基的配制：按照每1000ml培养基含有酵母膏13g、大豆胨3.2g、琼脂15g、氯化钠18g、丙酮酸钠4.1g、甘氨酸0.92g、氯化锂0.4g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷5.8g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.4g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.3g，按比例将酵母膏、大豆胨、琼脂、氯化钠、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷、对硝基β-D-葡萄糖苷加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，待混合物冷却至44℃时，继续加入过滤除菌的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，混匀，得培养基，备用；
（2）称取10g待测样品至100ml步骤（1）配制的培养基中，于37℃培养36h，获得增菌液；当肉眼观察增菌液显示无菌落或者非黄色菌落时，判定待测样品中无金黄色葡萄球菌；当肉眼观察增菌液显示黄色菌落颜色，则进行下一步；
（3）将步骤（2）的增菌液吸入1ml的无菌注射器中，用0.22μm的滤膜过滤，回收过滤液，然后更换无菌注射器，用PBS洗涤2次，然后用PBST洗涤2次，洗涤后的剩余物在紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌，反之则没有金黄色葡萄球菌。
本发明采用的特定的培养基中，非葡萄球菌显菌落本身的颜色，葡萄球菌显示黄色菌落颜色，金黄色葡萄球菌显示黄色菌落颜色并在荧光显微镜下可见；首先对待测样品进行培养基培养得到增菌液，通过肉眼观察增菌液中有无菌落以及菌落颜色，可以初步判断有无金黄色葡萄球菌，当肉眼观察到有黄色菌落时，接着采用无菌注射器和滤膜组合进行信号富集，借助紫外进行检测，从而确定有无金黄色葡萄球菌，本发明方法快速，简便，准确。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养基的配制：按照每1000ml培养基含有酵母膏12～14g、大豆胨3～3.5g、琼脂13～16g、氯化钠17～19g、丙酮酸钠4～4.2g、甘氨酸0.8～1.1g、氯化锂0.3～0.5g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷5.5～6.2g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.2～0.5g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.2～1.5g，按比例将酵母膏、大豆胨、琼脂、氯化钠、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷、对硝基β-D-葡萄糖苷加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，待混合物冷却至42～45℃时，继续加入过滤除菌的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，混匀，得培养基，备用；
（2）称取10g待测样品至100ml步骤（1）配制的培养基中，于37℃培养36h，获得增菌液；当肉眼观察增菌液显示无菌落或者非黄色菌落时，判定待测样品中无金黄色葡萄球菌；当肉眼观察增菌液显示黄色菌落颜色，则进行下一步；
（3）将步骤（2）的增菌液吸入1ml的无菌注射器中，用0.22μm的滤膜过滤，回收过滤液，然后更换无菌注射器，用PBS洗涤1～3次，然后用PBST洗涤1～3次，洗涤后的剩余物在紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌，反之则没有金黄色葡萄球菌。
2.根据权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，每1000ml培养基含有酵母膏13～14g、大豆胨3.2～3.4g、琼脂14～16g、氯化钠17～18g、丙酮酸钠4～4.1g、甘氨酸0.9～1.0g、氯化锂0.3～0.4g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷5.6～6.0g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.3～0.4g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.2～1.4g。
3.根据权利要求2所述的食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，每1000ml培养基含有酵母膏13g、大豆胨3.2g、琼脂15g、氯化钠18g、丙酮酸钠4.1g、甘氨酸0.92g、氯化锂0.4g、4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷5.8g、对硝基β-D-葡萄糖苷0.4g、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖1.3g。
4.根据权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，待混合物冷却至44℃。
5.根据权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，用PBS洗涤2次，然后用PBST洗涤2次。
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