CN1714156A

CN1714156A - 检测和计数样品中微生物的方法

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Publication number: CN1714156A
Application number: CNA2003801040400A
Authority: CN
Inventors: B·韦德里纳; A·拉雪兹; V·卡雷
Original assignee: METIS BIOTECHNOLOGIES
Current assignee: METIS BIOTECHNOLOGIES
Priority date: 2002-10-01
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2005-12-28
Anticipated expiration: 2023-10-01
Also published as: AU2003283484A1; JP2006500940A; EP1546366B9; EP1546366A1; DE60323652D1; AU2003283484B2; DK1546366T3; FR2845097B1; FR2845097A1; CA2500464A1; ATE408706T1; WO2004031403A1; WO2004031403A8; CN100392095C; US20050202518A1; EP1546366B1; JP4634148B2; CA2500464C; US8883441B2; AU2003283484C1

Abstract

本发明涉及检测和计数样品中微生物的方法，包括以下步骤：(a)选择性富集样品中所探寻的微生物，(b)调控所述微生物，(c)免疫磁性浓缩调控微生物，(d)荧光标记浓缩微生物，和(e)检测和分析荧光。

Description

检测和计数样品中微生物的方法

本发明涉及检测和计数样品中微生物的方法以及用于所探寻微生物的选择性富集培养基。

本发明用于微生物如单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeriamonocytogenes)、沙门氏菌(Salmoella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium paratuberculosis)，和侵肺军团菌(Legionellapneumophilla)的检测。优选通过许多种样品如食品、固体、液体、植物、动物等样品以及来自动物尤其是人组织样品的流式细胞术(flowcytometry)来进行该检测。

微生物污染对食品加工工业是主要的利害因素，因为污染可以导致严重的产品降解并耽搁了等待所需质量分析的库存的运输。微生物分析所要求的标准涉及两个方面。首先，必须尽可能早地监控污染状态，因此需要高度灵敏和差别悬殊的分析方法。其次，这些方法必须是快速的以致成批产品可以按时间表输送，且它们必须使预言性的微生物分析成为可能。

如果要避免销售产品污染的风险，快速判据是决定性的。传统分析技术总是需要培养步骤，其相对于高效率的食品加工需要是冗长的。此外，传统分析不考虑已经失去繁殖能力的细菌，即使这样的细菌如果将其暴露于特定条件下如提高食物链中一些点不充分的必须冷冻的温度在或当穿过消费者的生物体时保留着能够复活的代谢活性。

此外，在环境中，用于技术上的或饮用水的快速和灵敏的微生物分析方法是决定性标准，因为这些水源可以直接(在饮用水的情况中)或通过环境污染间接(如空调系统中的军团菌和接触食品表面的污染)地传染人。

在微生物检测和计数的传统微生物技术中，广泛使用培养皿培养。

培养皿计数方法是常规手段，通过其计算微生物数量。生长和分化是这种用于寻找有生存能力细菌的微生物分析方法的基础。在这种情况下，可培养性和生存能力相关。实际上，可培养性定义为单个细胞在培养皿表面引起可观察的或可见数量的能力。

该技术已经使用了数十年，并显示了其自身以相对低的成本对保护人类健康的有效性。近年来，已经引入关于培养基(显色培养基)、培养基制备的自动化、培养基中地面取样的稀释、以及培养皿上菌落扩展和计数的许多新方法(Garcia-Armesto等，1993)。然而，传统技术在两个方面仍然是弱势的。首先，由于细菌在培养皿中培养基上生长的基本需求，它们不是非常灵敏，上述培养基根据所测试的食品对于细菌选择性生长的有效性是易变地。其次，培养皿中的培养需要所探寻的细菌处于最佳生理状态以致能够在选择性培养基上生长。然而，通过传统微生物技术即通过在标准培养基中培养在后来经常不能检测到起初存在于样品中的细菌。这可以从两方面来解释：作为极端紧张状态(热休克或渗透压休克，营养缺失，等等)的结果细菌死亡或它们失去了在标准培养基中繁殖的能力并因此认为其是有活力的但是非可培养的细菌(Barer等，1999)。因此重要的是能够检测样品中的这些细菌。

最近已经显示了细菌的数个可培养种，当它们受到营养缺失或另一个物理紧张状态(热、氢，等等)时可以进入细胞存活状态，在该过程中它们通过可培养测试(例如通过培养皿培养)是不能检测的。

这就是为什么发展了DNA扩增技术，其对于所探寻的微生物给予了较高的特异性，且其是可自动化的。这些技术包括微生物特异性核苷酸序列的检测(基因扩增后)。然而，该方法仍然不能够使计数样品中微生物成为可能。

就特异性而言，基因探针(DNA、RNA、PNA、分子信标，等等)是使用荧光抗体的替换方案。这些探针必须使用荧光染料来标记，并和所研究的细胞杂交，而后者没有预先溶解：这是原位杂交。在这种情况下，使用的探针对抗16S或23S PARN，其可以同时确保检测的特异性和增强连接该细胞RNA复本数目的信号(Moter等，2000)。

其它技术，如免疫学方法(包括ELISA)，包括通过发光或荧光检测微生物抗原的抗体。即使这些方法是容易自动化的和灵敏的，由于它们不可能计数存在的微生物，它们提供了有限的信息。此外，有时候这些方法关于它们的特异性存在不足，因为使用的抗体可能存在于有限的微生物抗原识别范围内(Tortorello等，1994)。

不管使用何种方法，为了获得合意的灵敏度和特异性它们都需要所探寻的细菌经历富集阶段。

细胞计数分析，其中流式细胞术是一个实例，存在的优势是允许直接检测预先用荧光分子标记的细菌。此外，该标记可以显示细菌的生存能力。使用流式细胞计数器的检测是直接的、定量的，且仅需几分钟。

流式细胞术，通过其对生物学和医学成功的应用，将其很好地定位至适于高产量的微生物分析(Alvarez-Barrientos等，2000；Davey等，1996)。流式细胞术的技术特征之一是可以在少于24或48小时分析通过特定生长特征所限定的群体(44℃的粪便大肠菌(fecalcoliform)，嗜冷菌群)，其在选择性肉汤中富集后可以通过流式细胞术直接检测，而不用等待其在特异性培养基中生长。

过去几年中，许多用于真核细胞分析的商业细胞计数器已经得到了发展，但是其不适于微生物的检测。然而，光电倍增管的发展、激光的引入，以及光学系统的改良(聚焦、石英分析细胞)使今天大多数的细胞计数器能够定量细菌和病毒成为可能(Salzman等，1982，Steen等，1986)。最显著的进步包括测量所分析的真核或原核细胞大小的能力，首先通过光电二极管然后通过光电倍增管。因此，现在可以选择限定大小的细胞群体(例如微生物)用于分析其发出的荧光。因此创造的分析窗口可以将细胞计数器的分析能力集中于预定事件上，其依次可以获得微生物发出的荧光信号和基体背景干扰之间的可靠差别。

使用的荧光标记普遍地标记微生物群体且具有宽的作用范围。这些包括DNA嵌入剂以及用于细菌膜电位或呼吸能力的标记(Lopez-Amoros等，1995；Crepori等，2001)。细胞内内容物的大小和颗粒团的测定可以结合荧光信号。目前通过流式细胞术使用荧光分子来检测有活力的微生物是公知的(Davey等，1996；Nebe-von Caron等，1995)。原理是检测存在于所有微生物中的酶活性。在所有情况中，这些活性是非常宽范围的并对细胞存活是必需的。文献所述的多个实例中，最相关的包括总体显示酯酶活性的底物，如荧光素二乙酸酯(FDA)或其同系物羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)(Breeuwer等，1995)。

Drocourt等(FR2764305)描述了标记(FDA和CFDA)复合样品中所有有活力微生物的方法，基于酯酶活性的检测，且尤其是使用对样品自体荧光复染色的检测。

Breeuwer等(WO05/00660)描述了使用荧光标记测量样品中微生物活力的方法。该方法包括测量这些微生物所发出的荧光失去一半所需的时间。

Inoue等(EP1203825)使用聚次甲基来显示微生物中亚硝酸根离子的还原活性。这是在所有细菌中可检测的先验细胞活性。

Rocco等(WO00/34509)使用抗生素，在其上结合荧光分子来显示微生物。

Fazzi等(WO00/067065)已经发展了可以通过细菌的革兰氏染色来区分它们的方法，通过使用吖啶橙和荧光素的混合物。通过流式细胞术来完成标记微生物群体的检测。

Jespersen等(WO02/00036)也发展了革兰氏染色方法，基于使用识别革兰氏阳性细菌(细胞表面的聚糖结构)和革兰氏阴性细菌(脂多糖的存在)之间结构差异的分子。然而，该方法不可以测量细菌的活力。

Pyle等(WO95/31481)使用CTC作为用于微生物呼吸能力的指示剂分子。该检测是联合免疫磁性富集和/或使用荧光素标记抗体的免疫学检测。

然而，显示上述活力的荧光标记具有太宽的范围以致不能提供检测特异性微生物所需的特异性。

分子生物技术(使用荧光标记的核苷酸探针)和流式细胞术的结合是相当新的方法(Amann等，1995；Wallner等，1995)。

然而，即使该方法适于革兰氏阴性微生物，为了特异性标记革兰氏阳性细菌仍然需要做工作。Vlieger等，(1992)，描述了使用流式细胞术来检测通过PCR扩增的核酸，通过将上述片段杂交至珠子。

特别地，流式细胞术已经用于计数牛奶中的，以及包括肉、发酵奶、速冻蔬菜，或鲜奶制品中总的细菌或酵母。对于这些，使用了活力标记(Breeuwer等，1995)。将可以通过流式细胞术分析的大小和结构的形态学标准加入这个首要的选择标准中。

在食品中更特别地涉及微生物(属和种)尤其是致病性菌群如沙门氏菌、单核细胞增多性李司忒氏菌、大肠杆菌0157：H7、金黄色葡萄球菌，和流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的检测(McCelland等，1994；Iannelli等，1998；Pinder等，1994；Skjerve等，1990，1991；Tomayasu等，1998；Tortorello等，1998)。

用于鉴定细菌属的最常见荧光标记仍然是抗生素，对于其规程是多样和可变的，但是如果直接使用于食品中其不是非常灵敏。实际上，由于基质和内生菌群中高水平背景干扰的存在，食品样品中小量细胞活动的计数是困难的，并因为选择合适的荧光标记来获得准确的细胞活力数据不是无价值的。因此，建议使用多个荧光标记(抗生素、化学计量的探针、DNA嵌入剂、酶底物，等等)来鉴别荧光细菌和不同细菌种之间的粒子。

为了提高细菌属和种的检测，已经成功使用免疫磁性分离来分离复合食品基质中的致病性微生物。两个公司，Dynal(挪威，奥斯陆)和Vicam(美国，沃特敦)，销售磁性珠子，其上结合了识别致病性细菌的抗体。然而，常规应用在用选择性富集培养基培养后仍然需要分布于培养皿上，且由于所用抗体缺少选择性或天然菌群和磁性珠子载体的非特异性相互作用，有时必需需要进行确认测试(Tomayasu等，1998)。例如，其识别的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌株可以非特异性地吸收至磁性珠子表面且该吸收能力依赖于弧菌(Vibrio)菌株的同一性。对这些顺磁性珠子的结构改良包括将珠子密封入与培养基较少反应的化学结构中(胶囊化的毫微珠子，Estapor)。

免疫磁性分离已经显示了从液体回收真核细胞和从各种各样的如食品、牛奶，和排泄物样品中分离微生物的有效性(Grant等，1998；Skjerve等，1990，1991，Pinder等，1994；Seo等，1998)。在其表面上存在对抗膜表面抗原的抗体的顺磁性珠子是可购得的。它们可以浓缩复合样品中的细菌并提高随后技术如PCR、核酸探针杂交、免疫荧光，和流式细胞术的灵敏度。通过分离管壁上的细菌-珠子结合物来进行的免疫浓缩可以同时除去存在于样品中的抑制剂。此外，其构成了选择阶段。

免疫荧光结合流式细胞术的使用对特异性问题反应良好。对食品中致病性细菌的免疫学特性已经知道了一段时间并广泛用于快速检测测试中。这些特异性FITC标记的抗体已经用于标记加入牛奶和鸡蛋样品中的和来自污染鸡畜体洗涤水的沙门氏菌(McClelland等，1994)。免疫荧光和流式细胞计数合作使用也已经应用至检测消除肉天然菌群后人为污染的肉样品中的大肠杆菌0157：H7(Seo等，1998)。

然而，所有的情况中，分析之前需要预处理(化学或免疫分离)样品且检测极限不能低于10000个细胞每克产品，其对于检测食品中致病性细菌的需要太高了。

Forrest等，1979，(US4,141,687)和Ithakissios等，1978，(US4,115,534)描述了磁性颗粒的合成，当其和识别分子结合时可以通过使用磁场从复杂混合物中提取真核和原核细胞。

Coulter Electronics(UK1,561,042)描述了使用流式细胞术来分离和分析与这些珠子连接的颗粒和细胞。

Pinder等(WO98/20214)已经发展了尺寸小于1微米(100nm是优选大小)的荧光磁性珠子。

这样的珠子用于提取和标记微生物的重要性在于其极小。为了使用流式细胞术检测微生物不需要从微生物分离上述珠子。

Pyle等(WO95/31481)使用磁性珠子从复合样品中浓缩细菌。然后用荧光抗体(例如荧光素)将这些细菌标记成绿色并通过在细胞中诱导红色荧光的CTC(氰基四唑氯)来检测细胞的呼吸能力；使用荧光显微镜进行检测。

Senyal等(EP/0016552)已经将磁性珠子和可以连接大量抗体的蛋白质A结合，以随后回收表面带有连接抗体的细胞。

Vesey等，(WO96/31777)使用流式细胞术来分析复合物，复合物由乳胶珠子通过荧光抗体介质粘着微生物而形成。他们描述了使用荧光抗体来标记已经从样品中免疫磁性提取的微生物。

Fortin等，(WO99/47933)使用0.08至0.5微米大小的乳胶珠子，其结合了细胞识别抗体。根据大小和结构特性，因此形成通过流式细胞术可观察的复合物。

还可以通过检测特异性的酶活性或通过使用发色的或荧光底物来进行样品中微生物的检测。Manafi(2000)的评论是基于微生物中特定酶活性的存在或缺失来鉴定微生物所用策略的相当完整的更新。分叉式检索表的原理是通过酯酶(其只水解限定脂肪链长度的脂肪酸)、糖苷酶(各种糖的水解)、磷酸酯酶，和硫酸酯酶表现的特定活性。使用的底物包括一个目标部分和标记部分，目标部分是通过所探寻酶识别的。当该标记部分连接目标时，其只在目标-标记衔接物水解后发出可见的信号(产色的或荧光的)。这些代谢活性使用最广泛的显示方法包括将这些底物加入培养基中。当通过菌落中微生物同化时，底物给予了菌落有区别的颜色。选择性培养基和底物(每个培养基一种或多种)的结合通过观察细菌的形式和颜色可以获得所探寻微生物的精确鉴定。

因此，使得菌落在发色培养基上变色，底物必须排出菌落内的微生物体外。

Schbert等(WO99/48899)描述了用于荧光底物的合成途径(在UV激发下)，其通过磷酸酯酶C可以显示特异性磷酰基肌醇活性。该底物(其具有4-甲基伞形酮作为其荧光分子)用于可以鉴定单核细胞增多性李司忒氏菌和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的两个培养基的设计中。然而，该底物对于细菌属的特异性不足以用于本发明的范围中。

Conrad等，(WO00/03034)发展了七叶苷作为荧光分子的荧光底物。没有描述使用这些底物来鉴定微生物的检测方法和精确性。

Berg等(US5,292,644)描述了使用4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷酶，其通过UV光(λexc＝365nm)是可激发的，用于检测细菌中的半乳糖苷酶活性，而与这些微生物是在液体或固体培养基中生长无关。从外部培养基中沉淀后通过UV光激发甲基伞形酮来进行检测。

Nelis等(WO98/13515)描述了UV激发后发色或荧光底物的使用，其可以证明微生物中β-D-半乳糖苷酶或β-D-葡萄糖醛酸酶活性。当它们标记于固体培养基上或保留于滤器上时，所描述的技术限于上述微生物的检测。

Rambach Alain(WO00/53799)使用葡萄糖和磷酸盐底物结合发色分子来检测含有去铁胺的特定培养基中的金黄色葡萄球菌。该检测是基于观察已经通过菌落内部细菌排出的细菌菌落中的发色化合物。金黄色葡萄球菌的鉴定是基于观察磷酸酯酶和葡糖醛酸酶的酶作用引起的发色化合物。

Cooke等(WO00/41409)使用上述微生物辛酸酯(octanoate)-酯酶(或辛酸酯(caprylate)-酯酶)活性特异性的发色底物来特异性标记沙门氏菌。使用辛酸酯-酯酶作为沙门氏菌的鉴定方式已经描述了好多年(Humbert等，1989)且当结合固体培养基使用时显示了极小的效能。Cooke等的专利申请中，为了获得更高的特异性将可以检测β-D-半乳糖苷酶的底物加入培养基中。

本发明打算通过在显著改进时间和特异性条件下提供检测和读数或计数固体或液体培养基中微生物的方法来改善现有技术的不便之处。

在本发明范围内，可以进行食品加工来源的样品，如肉制品、蛋制品、水、包括牛奶的奶制品、果汁、农作物产品及其衍生物，以及动物来源包括人来源的样品，如所有类型的组织、排泄物和血液中的微生物探寻。

本发明的方法特别包括对样品中所探寻的微生物是选择性和特异性的三个步骤，即所述微生物的选择性富集，上述微生物在调节培养基中的活化，和上述微生物的荧光标记。

事实上，根据本发明的样品中微生物检测和读数或计数方法包括五个步骤，其肯定是相互伴随的且根据所探寻的微生物可以改变其顺序。

根据本发明的检测方法包括步骤：

a)选择性地富集样品中所探寻的微生物，

b)调控上述微生物，

c)免疫磁性地浓缩调控的微生物，

d)荧光标记浓缩的微生物，和

e)检测和分析荧光。

本发明的一个目的是克服现有技术中缺乏的微生物检测方法的灵敏度和特异性。根据本发明的方法可以获得非常低的检测极限，大约10至100个微生物每克样品，其所说的极限比现有技术的那些低100至1000倍。

本发明的另一个目的是可以在少于24小时内检测微生物，尤其是通过少于18小时的所探寻微生物的富集和调控步骤，少于3小时的荧光标记，和几分钟内的流式细胞术检测而获得的。

根据本发明方法的第一步是样品中所探寻微生物的选择性富集步骤，该步骤具有双重目的。例如，该步骤不仅可以使上述微生物繁殖还可以在上述微生物受到胁迫的情况下使上述微生物复活。该富集步骤在含有适于所探寻微生物生长营养素的组合物中进行8至15小时。该组合物还含有用于破坏存在于样品中的氧活性菌种以及抗氧化剂的试剂。

该组合物还用于恢复和保存微生物的活力，该微生物的可培养性标准是无论出于什么原因的暂时丢失，例如胁迫如加热处理后。

这样步骤的意义是为了将它们包括于样品分析中然后能够检测和计数所述的微生物。这是重要的，因为这样的微生物在特定事件如温度改变后是容易活化的，因此这些微生物可以成为消费者健康的危险物或可以引起对上述样品污染或感染水平的估计不足。

本发明的优选实施例中，样品中所探寻微生物的选择性富集步骤中所用的组合物包括：

-浓度为1至20g/L的丙酮酸钠，优选1至10g/L，更优选4至6g/L，

-浓度为0.5至5g/L的硫代硫酸钠，优选0.5至3g/L，甚至更优选约2g/L，

-浓度为500至20000u/L的过氧化氢酶，优选2000至8000u/L，甚至更优选约5000u/L。

上述组合物除了达到所提及的两个目的以外，如果根据样品或上述微生物包括这样的步骤，破坏所探寻微生物的竞争菌群也是可能的。因此，根据本发明的组合物此外可以包括至少一种抗微生物剂。

“抗微生物”剂或“选择性试剂”意思是能够破坏或抑制所探寻微生物竞争菌群的所有化合物。强调的是上述抗微生物或选择性试剂可以是抗生素。

当然，因此使用的抗微生物制剂(包括至少一种抗微生物剂)对所探寻微生物是特异性的。

事实上，根据本发明方法的后续步骤之一包括通过荧光检测所探寻微生物的至少一种特异性活性，并因此上述荧光必须是限于所探寻的活性。

此外，抗微生物剂可以起改变目标微生物膜完整性和因此可测量参数如膜电势、氧化还原电势，、或脱氢酶活性的作用。例如，用于选择李司忒氏菌的抗微生物剂至少包括多粘菌素B、氧氟沙星、两性霉素B、5-氟代胞嘧啶，以及氯化锂。用于沙门氏菌的选择性试剂包括煌绿和磺胺吡啶。用于金黄色葡萄球菌的选择性试剂包括甘氨酸、氯化锂，和去铁胺。通过胆汁盐获得大肠杆菌的选择。用于鸟分枝杆菌杆菌副结核亚种的选择性试剂包括盐酸万古霉素和萘啶酮酸。用于侵肺军团菌的选择性抗生素包括多粘菌素B、万古霉素和放线菌酮混合物。

根据本发明的方法“调控”样品中所探寻微生物的意思是“诱导”或“激活”上述微生物的至少一种特异性活性或特征。该步骤是重要的且可以用来用荧光标记检测所述特异性活性或特征。

例如，所探寻微生物的调控包括所探寻微生物酶活性的诱导，其是通过将上述酶特异性的非荧光底物添加至微生物富集培养基中。

应该强调的是调控可以包括一种或数种酶活性的诱导。

例如，对所探寻酶特异性的非荧光底物是异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷和蜜二糖-甲基-β-D-半乳糖吡喃糖苷来激活β-D-半乳糖苷酶；甲基-α-D-半乳糖吡喃糖苷用于诱导半乳糖苷酶；对-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸，异丙醇β-葡糖苷酸，或甲基β-D-葡糖苷酸钠盐用于诱导葡糖醛酸酶；甲基-β-D-葡糖苷、纤维二糖，和水杨苷用于诱导β-D-葡糖苷酶；甲基-辛酸酯用于诱导辛酸酯酶；4-硝基苯基-棕榈酸酯和甲基-棕榈酸酯用于诱导棕榈酸酯酶；以及2-甲基-丙酸用于诱导丙酸酯酶。

在本发明的一个优选实施方案中和包括诱导所探寻微生物至少一种特异性酶活性的调控情况中，本发明的步骤a)和步骤b)可以同时进行。这样，可以提高分析的灵敏度和速度。在这种情况下，同时进行这两个阶段的总过程为6h至48h，优选12h至24h，更优选为15h至18h。

在样品中所探寻微生物是革兰氏阳性细菌的情况下，调控步骤还可以包括诱导上述微生物特异性的或特有的至少一种表面抗原的步骤，包括将浓度为5至50g/L的酵母提取物加入微生物的富集培养基中，优选10至20g/L，更优选约为10g/L。

在所探寻微生物是革兰氏阳性细菌的情况下，还通过如下事实来解释除了酶的诱导以外的至少一种表面抗原的诱导，即通过现有技术使用对抗细胞膜抗原或细胞壁抗原的抗体来进行免疫磁性分选是可能的。在这些典型的培养条件下，革兰氏阳性细菌合成外多糖荚膜来免于外部侵袭，其可以遮掩细胞壁和细胞膜，因此致使它们不能够接近抗体。在本发明优选实施方案中，这是为什么通过将酵母提取物加入富集培养基中来抑制该荚膜合成的原因，因此激活了细胞壁和细胞膜抗原的表达，因此致使它们接近抗体。

所探寻微生物的免疫磁性浓缩步骤是从调控培养基进行的。通过抗原-抗体反应的免疫浓缩包括从条件调控培养基中浓缩上述微生物。

和磁性珠子结合并放置于与所探寻微生物接触的抗体，是对抗上述微生物特异性抗原的。接着，将微生物-抗体-珠子复合体从培养基中分离然后将微生物从剩下的复合物中分离。

可以根据制造商的介绍用Dynabeads牌珠子来进行该免疫磁性浓缩步骤，除了样品体积是两倍。还可以用共价连接至对抗兔抗体(主要)的抗体(次要)的珠子来进行反应(Dynabeads MP-280绵羊抗兔IgG)。

作为例子，所用的规程如下：样品体积1至50ml，优选1至5ml，优选2ml，在室温下与1至250μg，优选1至50μg，更优选10μg对抗所探寻细菌的抗体接触30分钟。Dynabeads牌珠子(李司忒氏菌、沙门氏菌，等等)的量为1×10⁶个至250×10⁶，优选10×10⁶至20×10⁶，优选10×10⁶，预先用0.1％PBS(14190-094，Invitrogen SARL)/BSA(ID-BIOSA)洗涤，将其加入并将所有成分在连续轻度搅拌下一起室温培养30分钟。使用磁性颗粒浓缩器(MPC-E，Dynal Biotech SA，或任何其他的磁性分选装置)，通过除去残余液体回收微管上的珠子。用大量PBS洗涤珠子然后使用颗粒浓缩器再次回收。

当完成免疫浓缩反应时，将珠子回收于225μl PBS中。然后从珠子上分离细菌。然后将磁性浓缩器用来除去珠子，且将含有浓缩细菌的分离上清液回收于5ml管中用于荧光标记反应。

免疫浓缩步骤，除了浓缩所关心细菌的事实以外，还因此提高了检测灵敏度10倍，使得无论选择性要素如何，都可以消除能够在富集培养基或调控培养基中发展的细菌。

在本发明的另一个实施方案中，和磁性珠子结合的抗体对抗所探寻微生物特异性的抗原。换句话说，通过将所探寻微生物与对抗对该微生物特异性抗原的称为“主要”的抗体接触来进行第一个抗原-抗体反应，并通过将“主要”抗体与称为“次要”抗体接触来进行第二个抗原-抗体反应，“次要”抗体与磁性珠子结合并对抗上述主要抗体。

在本发明的一个优选实施方案中，磁性珠子的直径为1至20μm，优选2至8μm。更优选，所示实施例中所用的珠子直径为2.8μm或4.5μm。

本发明中所用珠子的大小是重要的，因为其可以更有效地从复合培养基中提取细菌。现有技术中，已经使用了比本发明所述那些小得多的珠子(纳米珠)，但是发明者已经表明了这些引起了太大的背景干扰，其不可能清楚地从培养基其他元素中分辨出微生物。

优选在免疫磁性浓缩后获得的所探寻微生物的荧光标记是通过将至少一种底物加入含有上述微生物培养基中来进行的，该底物包括一个对所示酶活性特异性的部分和一个标记部分。

通过这些底物的选择，根据微生物是否利用了它们，可以区分和表征所给微生物属的种或亚种。

在本发明的一个优选实施方案中，标记部分包括在488nm激发的荧光标记，其选自呫吨、吖啶、藻胆蛋白、花青、或七叶苷。

在呫吨中，对于以下所给的实施例，荧光素和荧光素衍生物，以及若丹明是可以作为更优选的。在藻胆蛋白中，藻红蛋白是十分优选的。

在使用数种底物的情况中，每个可以包括相互不同的标记部分，这样，例如，可以表达荧光的数种颜色。

在本发明的范围中，重要的是细菌内部发生的底物转化且荧光产物保留在细胞中。

或者，如果通过加入15％异丙醇并在37℃培养15分钟细胞，可以实现暂时渗透性。

荧光标记的选择是基于它们保留在细胞内部的能力。例如，在细胞内酶作用将这些自由荧光产物固定于细胞中后，荧光素的羧化、胺化，和五氟苯甲酰化形式尤其能很好地保留于细胞中(Haugland，1995)。

在本发明的另一个实施方案中，对所指的酶活性特异性的底物部分包括脂肪酸、单糖、磷酸酯、肽和/或硫酸酯。

由2至20个碳原子长度的碳链来表征脂肪酸。优选地，底物选自荧光素-二-辛酸酯、荧光素-二-棕榈酸酯、荧光素-二-二丁酸酯、荧光素-二-二己酸酯、荧光素-二-二月桂酸酯、荧光素-二-丙酸酯，或5(6)-羧基-二氯-荧光素-二醋酸酯。

糖类化合物是戊糖或葡糖醛酸。优选地，底物选自荧光素-二-β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素-α-D-吡喃半乳糖苷、荧光素-二-β-D-吡喃葡糖苷、荧光素-二-β-D-单吡喃糖苷、荧光素-二-β-D-岩藻糖苷、荧光素-二-β-D-N-乙酰氨基半乳糖苷、荧光素-二-β-D-N-乙酰氨基葡糖苷，和荧光素-二-β-D-木糖苷。

优选地，肽底物是结合若丹明110的氨基酸链(1至10个氨基酸)。

优选地，磷酸酯和硫酸酯底物各自是荧光素-二磷酸酯和荧光素-二硫酸酯。

优选地，将可以检测酯酶、糖苷酶(osidase)、磷酸酯酶、肽酶，或硫酸酯酶活性的荧光底物以0.1μM至1mM的浓度加入调控培养基中，优选1μM至100μM。

作为实例，以下底物是特别合乎需要的：

-5，6-羧基-二氯-荧光素-二醋酸酯来显示单核细胞增多性李司忒氏菌的强酯酶活性并用于该细菌细胞内内容物的酸性条件；

-5-(五氟苯甲酰氨基)荧光素或荧光素-二-β-D-吡喃葡糖苷来显示单核细胞增多性李司忒氏菌的β-D-糖苷活性；上述活性在单核细胞增多性李司忒氏菌中得到增强，优选将浓度为1至10mM的水杨苷底物加入调控培养基中；

-荧光素-二丙酸酯来显示单核细胞增多性李司忒氏菌的丙酸酯酶活性；优选通过将1至10mM浓度的2-甲基-丙酸加入调控培养基中进行该酶的诱导；

-荧光素二磷酸酯作为金黄色葡萄球菌的碱性磷酸酯酶活性的指示剂；通过将0.3％的无机磷酸盐加入调控培养基中来进行非金黄色葡萄球菌中酶的抑制；

-荧光素-二-β-D-葡糖醛酸或5-(五氟苯甲酰氨基)荧光素-二-β-D-葡糖醛酸作为大肠杆菌中葡糖醛酸酶的指示剂；通过将1至10mM的4-硝基苯基β-D-葡糖苷酸加入条件培养基中来进行微生物中的酶诱导；

-荧光素-二-棕榈酸盐或5-(6)羧基荧光素-二-棕榈酸盐作为棕榈酸酯酶的指示剂；通过将1至10mM的4-硝基苯基棕榈酸盐或甲基棕榈酸盐加入调控培养基中来进行微生物中酶的诱导；

-荧光素-二-辛酸盐或5-(6)羧基荧光素-二-辛酸盐作为沙门氏菌中辛酸酯酶的指示剂；通过将1至10mM甲基辛酸盐加入调控培养基中来进行微生物中的酶诱导。

取决于微生物，酶反应可以在25至45℃之间不同的温度下进行，远离光并保持不超过1h。标记反应一完成，就将微生物保存于4℃来限制它们的生长且最重要的是防止标记流出至微生物的外部。

此外，必须强调的是当根据本发明方法的调控步骤包括诱导对所探寻微生物特异性的至少一种酶活性的步骤时，可以在进行所述微生物调控步骤之前或微生物荧光标记步骤之后进行免疫磁性浓缩步骤。

换句话说，所探寻微生物的调控步骤可以在含有免疫磁性预先浓缩的上述微生物的培养基中进行。因此，荧光标记将在调控步骤后进行；但也可能的是在调控步骤之后立即进行微生物地荧光标记步骤且微生物的免疫磁性浓缩只在上述荧光标记后进行。

在本发明的一个优选实施方案中，可以读数或计数所探寻微生物的检测和分析通过选自以下的技术来进行：使用荧光显微镜的流式细胞术和过滤细胞计数，优选流式细胞术。

作为根据本发明方法的最后步骤，已经证明流式细胞术自身特别合乎需要，以便能够产生可靠而快速的结果，也就是说24h内，甚至12h内。

微生物学领域中，最近已知流式细胞术具有数项改进：使用非特异性细胞标记来计数总的微生物并使用结合荧光染料的特异性标记(免疫球蛋白或基因标记)来检测和鉴定微生物(Robinson J.P.，1999)。

此外，该技术很好地应用于上述不同类型的样品中，而且应用于兽医诊断和环境分析中。

致病性微生物污染的动物中，使用直接或间接的方法来显示这些病原体的存在。直接方法包括通过在合适培养基中培养(培养皿方法)来检测活体解剖或组织中的上述微生物，通过ELISA技术检测微生物抗原，或寻找目标DNA序列。间接方法包括检测对抗微生物抗原的抗体，该抗原是通过这些微生物的动物传染相应产生的。目标是尽可能早地诊断出动物的健康状态，以便避免其他动物的污染。因此该分析方法必须快并可以应用于疾病的早期。因此，需要提高检测在培养基中生长非常缓慢(例如分枝细菌)或在家畜中繁殖非常快而有时察觉不到就过去了的细菌，在该期间相当于无症状阶段(例如，副结核和牛粘膜病)。

如之前所示，通过根据本发明方法分析的样品可以是不同来源的而且是不同相容性和/或性质的。因此，上述样品的物理特性需要本发明方法中步骤a)、b)、c)、d)和e)的预备步骤。更优选，所述预备步骤是分析样品的过滤步骤。

例如，在分析样品是固体或半固体样品，或样品包括浑浊液体的情况下，上述的过滤也涉及减小颗粒大小，通过20至150微米孔隙度的过滤器来进行，优选30至100微米，更优选约为63微米。

通过实施例，固体样品的过滤可以在塑料袋中进行，其中嵌入一个具有上述孔隙度的全表面塑料过滤器。

在根据本发明方法分析的样品是清液的情况下，可以通过0.2至10μm孔隙度的膜来过滤，优选0.2至5μm，更优选为0.2至0.5μm。

本发明还涉及对样品中所探寻微生物是特异性的富集培养基，包括可以使上述微生物繁殖的营养成分，使上述微生物复活的成分，以及可能破坏上述微生物竞争菌群的成分。

在本发明的一个优选实施方案中，富集培养基包括：

-浓度为1至20g/L的丙酮酸钠，优选1至10g/L，更优选为4至6g/L，

-浓度为0.5至5g/L的硫代硫酸钠，优选0.5至3g/L，更优选为约2g/L，

-浓度为500至20000u/L的过氧化氢酶，优选为2000至8000u/L，更优选为约5000u/L。

用于分析样品中所探寻微生物的上述富集培养基中还可以包括至少一种抗生素。

最后，本发明还涉及试剂盒，通过其实施上述检测和计数微生物的方法，该试剂盒包括：

-液体或脱水形式的根据本发明的富集培养基，

-塑料袋，其中是一体化的全表面过滤器，优选由约63μm孔隙度的塑料制得，

-磁性珠子，其上结合了对上述微生物特异性的抗体，如上所述，保存于液体培养基中，例如在另一个玻璃容器中，

-一种或数种底物，如上述微生物的上述那些荧光标记，以冻干的形式，和

-合适的溶剂，例如在另一个玻璃容器中。

根据以下实施例将更好地理解本发明的说明。这些实施例既不是限定所分析样品的性质也不是限定来源。它们鉴定所探寻微生物和说明了该微生物的检测，可以理解描述的规程同样与样品的性质和来源无关。只有在富集步骤之前的样品颗粒减小或过滤步骤没有描述。

实施例

实施例1：单核细胞增多性李司忒氏菌的检测

激活单核细胞增多性李司忒氏菌的β-D-葡糖苷酶以及1型和4型菌体抗原的方法，并通过细胞计数来检测。

单核细胞增多性李司忒氏菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性、无孢子、无荚膜杆菌，对人致病，其是造成李司忒氏菌病的原因，可以导致流产、败血病，和脑膜脑炎的疾病。

其形成包括六个种(单核细胞增多性李司忒氏菌、伊氏李司忒氏菌(ivanovii)、威氏李司忒氏菌(welshimeri)、斯氏李司忒氏菌(seeligeri)和格氏李司忒氏菌(grayi))的李司忒氏菌属的一部分。基于菌体抗原(从1至15)和鞭毛抗原(从A至E)将单核细胞增多性李司忒氏菌菌株分成17个血清型，其中三个(1/2a、1/2b，和4b)表示分离菌株的95％并是造成人李司忒氏菌病的原因(Swaminathan等，1995)。

该细菌的存活和增殖特征解释了其广泛的分布。其可以在缺氧下、在5.6至9.6的pH下和1℃至45℃的温度下繁殖；其对盐(特定菌株高达20％)、干燥，和冰冻是耐受性的。最后，其可以形成或参与不管清洁和消毒而支持其持续性的生物膜。

为了在大多数其它细菌的敌对条件下继续存在，其并不是非常竞争性的和通过复合微生物菌群来抑制。食品基质中，单核细胞增多性李司忒氏菌有时候数量是非常低的并和复合菌群结合，复合菌群通常包括链球菌、肠球菌、微球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌，和普通变形菌(Kramer和Jones，1969)。

李司忒氏菌主要通过污染的食品传播。导致临床情况的感染剂量是高于100个细菌每克或每毫升。

β-D-葡糖苷酶存在于所有李司忒氏菌菌种中但是只有单核菌种具有磷脂酰肌醇磷脂酶C(Notermans等，1991)。磷脂酰肌醇磷脂酶C活性液发现于其它微生物菌种中如芽孢杆菌。

单核细胞增多性李司忒氏菌关于生长、血清学、和生物化学的特征规定了用于复活和繁殖复合样品中单核细胞增多性李司忒氏菌的富集培养基的组成，而同时抑制竞争细菌，以便刺激1型和4型菌体抗原的产生并诱导β-D-葡糖苷酶的表达，其用于使用荧光底物的细菌检测中。

通常用于李司忒氏菌的选择性培养液是1/2Fraser。该培养基的组成作为我们培养液的基底用做非选择性富集基底。将复活补充物加入该基底中来弥补1/2Fraser的不足，其是显示受胁迫细菌的能力。此外，加入用于诱导β-D-葡糖苷酶活性的补充物。改变1/2Fraser选择性补充物使其对所有复合产物有效，在其上可以进行完整的单核细胞增多性李司忒氏菌的检测程序。

另一个用于单核细胞增多性李司忒氏菌的特定程序包括将2mM丙酸加入调控培养基中来激活丙酸酯酶。该活性在那些可以在培养液中非特异性地生长的肠球菌或其它革兰氏阳性球菌中是不存在的。

1) 组合物

a.非选择性富集基底。

5至15g/L的胰蛋白胨，优选浓度为10g/L；5至15g/L的酵母提取物，优选浓度为10g/L；9.6g/L的Na₂HPO4；1.35g/L的KH₂PO4；10至30g/L的NaCl，优选浓度为20g/L。

胰蛋白胨和酵母提取物是氮、碳、维生素、和矿物质的来源。它们使产生抗原成为可能。盐Na₂HPO和KH₂PO₄可以将培养基的pH调节至7±0.2，其是李司忒氏菌生长的最佳pH，并在富集过程中来缓冲培养基。高浓度NaCl的目的是抑制肠球菌，肠球菌是经常与李司忒氏菌结合的菌群并具有相同的特征，尤其是β-D-葡糖苷酶活性。

b.复活(revivication)补充物。

1至10g/L的丙酮酸钠，优选浓度为5g/L；0.5至5g/L的巯基乙酸钠，优选浓度为2.5g/L；和5000u/L的过氧化氢酶。

加入丙酮酸钠和巯基乙酸钠来参与刺激受胁迫生物体的代谢。过氧化氢酶用来消除对氧为活性、对微生物为毒性、且可能存在于食品中的菌种。

c.β-D-葡糖苷酶活性诱导补充物。

1至20mM的水杨苷，优选2mM。

同样地如真菌(Birk等，1997；Perez-Pons J.A.1995；Venturi等，2002)或细菌(Yang等，1996)中的一些β-D-葡糖苷酶，单核细胞增多性李司忒氏菌中的β-D-葡糖苷酶是可诱导的。富集阶段中不存在诱导剂时，酶活性是不可检测的。

水杨苷是β-D-葡糖苷酶的底物；其在富集培养液中的存在可以诱导该酶的表达并通过流式细胞术检测(也可以使用纤维二糖或甲基β-D-葡糖苷)。

d.丙酸酯酶诱导活性补充物。

1至20mM的2-甲基-丙酸，优选浓度为2mM。

2-甲基-丙酸在调控培养液中的存在可以诱导单核细胞增多性李司忒氏菌中的丙酸酯酶活性，通过荧光标记和流式细胞术对其进行检测。

e.选择性补充物。

5mg/L的多粘菌素B；1mg/L的氧氟沙星；2mg/L的两性霉素B；4mg/L的5-氟代胞嘧啶；以及可能地9g/L的氯化锂。

多粘菌素B对革兰氏阴性细菌是杀菌性抗生素活性的，尤其作用于大肠杆菌和铜绿假单胞菌。氧氟沙星补充多粘菌素B对革兰氏阴性细菌的作用，特别是对普通变形菌具有杀菌活性。在1/2Fraser中，氯化锂结合萘啶酸来抑制革兰氏阴性细菌；它们对假单胞菌或变形菌没有效果。氧氟沙星活性也存在于链球菌和葡萄球菌的一些菌种中。两性霉素B根据菌株是抑制真菌的或杀真菌的，和5-氟代胞嘧啶是杀真菌的。1/2Fraser的组成中没有杀真菌剂。一些产品，尤其是蔡珀拉特(chipolata)香肠中，带有干扰β-D-葡糖苷酶反应和检测的酵母。抑制革兰氏阳性球菌的吖啶黄，没有将其加入调控培养基中，因为其导致培养基中的要素产生荧光，因此创造细胞上的背景干扰，其干扰对于它们的阅读。对于程序最麻烦的球菌是那些带有β-D-葡糖苷酶活性且这些球菌生长是通过培养液中高浓度的NaCl来抑制的。革兰氏阳性球菌标记葡糖苷酶活性引起的假阳性可以通过现实丙酸酯酶活性来消除，其在球菌中不存在且在单核细胞增多性李司忒氏菌中是可诱导的。

将样品以5至10倍(w/w)稀释于没有选择性补充物的肉汤培养液中。使用的培养温度是30℃和培养时间是12h。4小时复活后，加入选择性补充物，然后在30℃选择性富集8h。

2) 免疫浓缩

按照制造商的指导使用磁性珠子(例如，Dynabeads-Listeria，Dynal Biotech，直径2.8μm)来进行反应，尽管该抗体对单核细胞增生菌种是非特异性的。

可以用于珠子上的各种抗体：

-特异性抗体“李司忒氏菌O抗血清聚血清型1，4”(“ListeriaO antiserum poly Serotypes 1，4”)(BD诊断系统，编号223021)，其对导致人李司忒氏病的单核细胞增多性李司忒氏菌菌株是特异性的，其表达1型和4型抗原。

-用钝化细菌接种兔子来产生单核细胞增多性李司忒氏菌特异性血清，上述细菌已经预先在调控培养液中培养过。

可以在未与珠子结合的主要抗体(上述两个中的一个)存在下通过第一个反应来间接进行该步骤，然后用覆盖识别主要抗体的次要抗体的珠子(例如，Dynabeads M-280绵羊抗兔子IgG，直径2.8μm，编号112-01，Dynal Biotech)来进行免疫浓缩。

3) 酶标记

a.酯酶活性的检测。

底物5，6-羧基-二氯-荧光素-二醋酸盐(Fluka Sigma-AldrichChemistry SARL，编号21884)以10mM的浓度制备于二甲基甲酰胺中，然后稀释于PBS中至10μM。将25μl的稀释液加入来自免疫浓缩分离步骤的上清液中于37℃15分钟来完成标记反应。在反应过程中，5(6)-羧基-二氯-荧光素-双醋酸盐在微生物中释放并变成荧光的。该分子的特征是当其在酸性pH范围内时发射绿色荧光(Nedergaard等，1990)。

当其以终浓度1μM使用时，该标记显示了单核细胞增多性李司忒氏菌相对于许多其它菌株的特异性，(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、普通变形菌、芽孢杆菌、Yersinia alvei)。毫无疑问该细菌的特定特征，该观察涉及该细菌具有比其它李司忒氏菌菌种高的酯酶活性的事实，在更酸性的胞内pH中是双倍的特征(个人观察)。如果选择水杨苷用于流式细胞术的李司忒氏菌检测中，注意不是用于富集培养基中。

b.β-D-葡糖苷酶活性的检测。

按照分子探针(Molecular Probes)的说明将底物荧光素二-β-D-吡喃葡糖苷或五氟苯甲酰氨基荧光素-二-β-D-吡喃葡糖苷以20mM制备于水中。在其以500μM使用之前将其稀释于水中至4mM。

在底物是荧光素-二-β-D-吡喃葡糖苷的情况中，通过免疫浓缩回收的细菌可以通过添加15μL异丙醇，接着在底物添加之前通过在37℃下5分钟的短培养成为可渗透的。

在所有情况下，酶反应在37℃进行1h，然后立即放置于4℃。

c.丙酸酯酶活性检测。

底物荧光素-二丙酸盐以10mM的浓度制备于10mM DMSO中。将其加入样品中以致底物的终浓度为100μM。因此将样品在37℃培养15分钟，然后立即放置于4℃等待分析。

实施例2：沙门氏菌检测

激活辛酸酯酶、沙门氏菌表面抗原的表达、通过细胞计数检测的过程。

Daniel E.Salmon，其是美国的兽医，于1885年发现了第一株沙门氏菌。迄今，已经知道了2213个菌株并且目录继续在增长。沙门氏菌是革兰氏阴性、兼性厌氧(氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，无孢子)，将硝酸盐还原成亚硝酸盐并发酵葡萄糖的杆状菌。沙门氏菌属包括多于2500个血清型，其中约50个在我们范围内是确实重要的。抗原公式是基于菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)，或荚膜抗原(K/Vi)的性质。该荚膜抗原遮掩了O抗原且在加热后显露出来。O抗原对应于LPS脂多糖。一些菌株，R或T形式，可以丢失全部或部分的该抗原能力。抗原H受到阶段可变现象：其可以发现两种形式，相当于1和2。

集体食物中毒的主要原因，单独沙门氏菌病就代表了约2/3的这些情况。近些年，已经可见人沙门氏菌病数量和严重程度的惊人增加。和1980年相比较，某些国家在过去10至15年有了20倍的增长。流行病学更深的观点揭露了多数情况来源于肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株，或更准确，血清型。自从1990年代开始情况更糟糕：出现了对大多数抗生素抗性的鼠伤寒沙门氏菌菌株，并可能成为严重的公共健康问题。

人们最常接触沙门氏菌病是通过消费动物来源、粗制或未完全煮熟的受污染食品(主要是肉、家禽、鸡蛋，和牛奶)，尽管大多数其他食品涉及传播。因果试剂(causal agent)从初级生产穿过食品链移动，或由于家中食物的交叉污染，或在集体食物供应或机构中如医院。细菌在5℃-12℃，甚至在低于5℃的温度下仍然繁殖。它们能很好地耐受冷冻、盐，和干燥。

在发达国家个人对个人的传播是极少的但仍然会发生，尤其在如新生儿看护设备或废弃设备的设施中。

流行病学上，按照对人或动物寄主适应的作用和O血清型抗原将沙门氏菌分为三组：

-B组(51.8％的情况)，例如鼠伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B)，只在人类和高等灵长类中导致伤寒。该组根据所涉及亚种系统地表达血清型抗原4和抗原1、5、12，和27的菌株来表征，

-D组(19.1％的情况)，导致某些动物但极少人类中的疾病：牛的都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)，猪的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)，鸡蛋中的肠炎沙门氏菌。然而，当这样的传染接触人时，其经常是侵袭性的且可以是致命的。包括该组的沙门氏菌通常表达抗原9且根据亚种表达抗原1和12，

-C组(20.3％的情况)表达抗原6和7，6和8，或8；E组(6.2％的情况)的那些表达抗原3和10，3和15，1和3，或19；G组(1.2％的情况)的那些表达抗原13和22，或13和23；K组的那些表达抗原18；以及A组的甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)(0.24％的情况)表达抗原1和2。

沙门氏菌的感染剂量约为100000个细菌。当涉及的血清型是伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和甲型、乙型和丙型副伤寒时，由这样剂量引起的症状是伤寒(House等，2001)。在培养1至25天后，在进入带有发热和麻痹的淋巴、败血病阶段之前疾病引起消化道症状(腹泻、腹痛、呕吐)。该现象是大脑中嗜神经性内毒素、脂多糖(LPS)活动的结果。少数致病性血清型如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、都柏林沙门氏菌等是引起不太严重食品中毒如沙门氏菌病的那些。

可以在抑制革兰氏阳性细菌生长和部分抑制大肠杆菌、变形菌和其他革兰氏阴性细菌的选择性培养基上直接探寻组成沙门氏菌一部分的致病性肠细菌。为该目的的培养基含有多种组合的胆汁提取物、脱氧胆酸柠檬酸盐、硫酸盐，和煌绿。

β-半乳糖苷酶的测试可以分辨沙门氏菌(β-革兰氏阴性)和那些志贺氏菌(Shigella)(β-革兰氏阳性)的菌株。这两个细菌微生物具有相似的培养条件并因此经常碰在一起。沙门氏菌的明显特征是代谢辛酸的能力(C8酯酶活性)。使用通过UV光激发发出荧光的4-甲基伞形酮测试测量辛酸酯酶活性(Humbert等，1989；Olsson等，1991)。某些培养基使用两种荧光底物的组合因为沙门氏菌是β-半乳糖苷酶阴性和葡糖醛酸阳性(SMID培养基)。

1)组合物

a.非选择性富集基底。

5至15g/L的胰蛋白胨，优选浓度为10g/L；10至30g/L的NaCl，优选浓度为20g/L；5至15g/L的酵母提取物，优选浓度为10g/L；0.5至3g/L的D-葡萄糖，优选浓度为1g/L；5至15g/L的Na₂HPO₄，优选浓度为9.6g/L；和0.5至3g/L的KH₂PO₄，优选浓度为1.35g/L。

胰蛋白胨和酵母提取物是氮、碳、维生素、和矿物质的来源。它们使产生抗原成为可能。盐Na₂HPO₄和KH₂PO₄可以将培养基的pH调节至7±0.2，其是沙门氏菌的最佳生长pH，并在富集过程中缓冲培养基。高浓度NaCl的目的是抑制肠球菌

b.复活补充物。

加入丙酮酸钠和巯基乙酸钠来参与刺激胁迫生物体的代谢(Bailey和Cox，1992)。过氧化氢酶用来消除对氧活性、对微生物毒性，并可能存在于食品中的菌种。培养温度是20至40℃，优选35℃。

c.辛酸酯酶活性诱导补充物。

4-硝基苯基辛酸盐是辛酸酯酶的底物；它在富集培养液中的存在可以诱导该酶的表达和通过流式细胞术的检测。

d.选择性补充物。

1至10mg/L的煌绿，优选浓度为5mg/L，来抑制革兰氏阳性细菌的生长；和1g/L的磺胺吡啶来抑制尤其是大肠杆菌的生长。

与传统使用的在培养基中引起自身荧光并在细菌中形成被壳(反光体)的补充物(例如，牛磺胆酸钠或其它胆盐、酚红、柠檬酸铁)相比，这些补充物不产生自身荧光。在诱导补充物、辛酸酯酶活性补充物和选择性补充物的存在下，培养温度为20至40℃(优选35℃)。这些补充物存在下的培养过程为6至15小时，作为所需检测极限的函数。

2)免疫浓缩

按照制造商的指导使用磁性珠子(例如，Dynabeads-Listeria，Dynal Biotech，直径2.8μm)来进行反应

可以用于珠子上的各种抗体：

-可商业购得的沙门氏菌特异性抗体(例如，BD诊断系统，编号2302-50)用于直接标记。该抗体，直接对抗抗原1、4、5，和12，可以检测D组沙门氏菌，

-通过给兔子接种钝化细菌来产生对沙门氏菌特异性的血清，上述微生物已经预先在调控培养液中培养。

可以在未与珠子结合的主要抗体(上述两个中的一个)存在下通过第一个反应来间接进行该步骤，然后用识别主要抗体的次要抗体覆盖的珠子(例如，Dynabeads M-280绵羊抗兔子IgG，直径2.8μm，编号112-01，Dynal Biotech)来进行免疫浓缩。

3)酶标记：辛酸酯酶活性的检测

优选使用的底物是荧光素-二辛酸盐。以10至400μM的浓度在丙酮中制备储液。使用的终浓度是1至40μM，优选10μM。在底物存在下，优选在37℃下进行培养30分钟至1小时，然后立即将微生物放置于4℃。

实施例3：金黄色葡萄球菌的特异性检测

激活磷酸酯酶、表达金黄色葡萄球菌表面抗原，和通过流式细胞术检测的过程。

金黄色葡萄球菌是细球菌科家族的成员。其是不能动的，无孢子，革兰氏阳性球菌，平均直径范围为0.8至1μm。其呼吸代谢是发酵性的。其是过氧化氢酶阳性且大多数菌株是凝固酶阳性。其引起多种疾病，如败血症、结膜炎、心内膜炎，和骨髓炎(Sheagren J.N.，1984)。

当菌株在胞外多糖诱导培养基上生长时，蛋白质A和金黄色葡萄球菌细胞壁的特殊成分被遮掩。这些多糖形成荚膜并约有90％金黄色葡萄球菌菌株产生。已经描述了十一个荚膜血清型但是分离的多数菌株属于血清型5和8(Arbeit等，1984；Sompolinsky等，1985)。

金黄色葡萄球菌血清型CP5和CP8的表达受到环境条件和细菌生长条件的极大影响。通过高含量的酵母提取物来抑制CP5的产生。Dassy等，(1991)，和Ouyang等，(1999)，显示了相同的酵母提取物抑制CP8微荚膜生成的效果。

对抗金黄色葡萄球菌产生的抗体可以是有荚膜的或膜状的。对于这些细菌的免疫检测，必须使用这两种抗体的混合物(如对于PastorexStaph Plus测试，Biorad)或在进行抗原-抗体识别反应之前防止胞外多糖荚膜的生成。这是我们选择来发展的第二个策略，并关注抑制多糖荚膜产生的复活组合物。

1)组合物

a.非选择性富集基底。

肉蛋白胨：优选浓度为8g/L；酪蛋白胨：优选浓度为2g/L；；酵母提取物：优选浓度为10g/L；肉提取物：优选浓度为5g/L。肉蛋白胨、酪蛋白胨、酵母提取物和肉提取物是氮、碳、维生素、和矿物质的来源。这使金黄色葡萄球菌的生长和抑制荚膜形成成为可能。

b.复活补充物。

加入丙酮酸钠和巯基乙酸钠来参与刺激胁迫生物体的代谢(Bailey和Cox，1992)。过氧化氢酶用来消除对氧活性，对微生物毒性，并可能存在于食品中的菌种。

c.碱性磷酸酯酶活性抑制补充物。

0.3％无机磷酸盐。

磷酸酯酶活性是与细菌的肠毒性能力相关的活性之一并因此用于金黄色葡萄球菌检测的显示。

碱性磷酸酯酶活性在金黄色葡萄球菌中是组成的(Soro等，1990)。然而，由于其在一些非金黄色葡萄球菌菌株中受到磷酸盐的抑制(Soro等，1990)，将磷酸盐离子加入培养基中是有利的。

d.选择性补充物。

12g/L的甘氨酸；5g/L的LiCl；和0.05g/L的去铁胺。

氯化锂是革兰氏阴性细菌的抑制剂。甘氨酸是革兰氏阳性细菌的抑制剂并刺激葡萄球菌的生长。去铁胺抑制表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)的生长，其是除了金黄色葡萄球菌以外唯一具有磷酸酯酶活性的葡萄球菌。

2)免疫浓缩

可以用于珠子上的各种抗体：

-可商业购得的金黄色葡萄球菌特异性血清(编号50-L030，AGROBIO)用于抗体和膜抗原直接结合，

-通过已经在调控培养基中培养的钝化细菌接种兔子来产生对金黄色葡萄球菌特异性的抗体。

3)酶标记。

a.碱性磷酸酯酶活性的检测

底物荧光素-二磷酸盐(编号F-2999，Molecular Probes)可以检测碱性磷酸酯酶活性。通过溶解于100mM pH8.0 Tris-HCl制得10mM的浓度，然后稀释于PBS中至1mM。将25μl稀释液加125μlPBS加入免疫浓缩分离步骤的上清液中于37℃15分钟来完成标记反应。在反应过程中，荧光素得到释放并成为荧光的(激发/发射490/514nm)。

该标记显示了一些葡萄球菌种(金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)的特异性，相对于藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，大肠杆菌和数个葡萄球菌菌种。培养液和免疫浓缩的组合可以消除对荧光标记阳性敏感的菌株。去铁胺抑制表皮葡萄球菌的生长。

实施例4：大肠杆菌的检测

激活葡糖苷酸酶、表达大肠杆菌表面抗原、和通过细胞计数检测的过程。

Thomas Escherich于1855年发现了该细菌。大肠杆菌是肠杆菌(Enterobacteriaceae)家族的成员，是细菌属，其中只发现一个种；但是有超过1000个抗原型。根据它们的O-菌体抗原(171)、K-荚膜抗原(80)，和H-鞭毛抗原(56)来定义这些血清型。此外，K抗原再细分成A、B和L型。与婴儿腹泻相关的菌株中专门发现B型。

相当短(2-3μm×0.7μm)，单个、成对，或很少地成团地发现它们。它们以球菌或杆菌形式，或在较久的培养基中以丝状出现。它们周生鞭毛的活动性是无关紧要的或例如在血清型O111的情况中是不存在的。培养它们非常容易因为它们能很好地耐受pH的改变(最佳pH为7.5)。生长的最佳温度是37℃但是它们可以在15℃至45℃生长，且在5℃仍然可以繁殖。它们能很好地耐热：在45℃培养它们发酵葡萄糖、甘露醇、乳糖并产生大量气体。它们对酸和冷冻是耐受性的。它们保持对抗生素的相对敏感性并和所有肠细菌一样它们将硝酸盐还原成亚硝酸盐。它们发酵葡萄糖和乳糖，有时为蔗糖和水杨苷。大多数具有赖氨酸脱羧酶活性。

大肠杆菌是所有动物包括人类的常见肠菌群细菌。其是肠共生的，代表80％需氧肠菌群。在排泄物质中发现该细菌。从那，其通过土壤和水分布于自然中。它在环境中的存在通常暗示了排泄物污染。设计了比色试验来鉴定其在水中的存在。

主要在动物或人来源的原料或未充分煮熟的肉(牛肉、家禽)和排泄物中发现大肠杆菌。碎肉操作通常是该细菌污染的来源。通常，大肠杆菌的主要作用是抑制有害细菌和促进多种维生素的合成，仅有少数大肠杆菌菌株能够导致人传染。

根据大肠杆菌的致病性将它们分成数个组或致病变种。该致病性通常基于和各种细胞受体粘着的能力。大肠杆菌属于这些致病变种是通过如下血清学分辨的：

-O血清型抗原：180个变种中的大约30个在I型EPEC(026、055、086、0111、0119、0125-0128、0142，等)，II型EPEC(018、044、0112、0114，等)，EIEC(028、029、0124、0136、0143、0152，等)，ETEC(06、08、015、020、025，等)，和EHEC(026、0113、0121、0145、0157，等)致病性菌株中是经常碰到的，

-多糖A或B天然(EPEC中若干重要的B型)或蛋白质L天然(伞毛，尤其是CFA抗原)的K-荚膜抗原，

-H-鞭毛抗原，其对EHEC是重要的，其中最常见的血清型是0157：H7。

大多数致病性菌株是通过特定OxKyHz型血清型来表征的。

当大肠杆菌引起急性腹泻时，可以根据四个致病型来分类：肠致病性的(EPEC)，肠侵袭性的(EIEC)，肠出血的(EHEC)，和肠毒性的(ETEC)。通过它们产肠毒素的能力来表征菌株，肠毒素作用于肠细胞来破坏通常由肠粘膜提供的吸收功能。这些微生物可以存在于如碎肉的特定食品中和水里在其中它们显示了排泄物的污染。

如果它们穿过肠粘膜(肠壁机能障碍)，它们可以变成致病性的并可以导致泌尿系统感染和胆感染、称为大肠杆菌病的生殖器感染，以及很少的败血症。其充当条件性致病菌。

1) 组合物

a.非选择性富集基底。

10至30g/L的胰蛋白胨，优选浓度为20g/L；5至15g/L的酵母提取物，优选浓度为10g/L；1至10g/L的NaCl，优选浓度为5g/L；1至10g/L的D-乳糖，优选浓度为5g/L；5至15g/L的Na₂HPO₄，优选浓度为9.6g/L；0.5至3g/L的KH₂PO₄，优选浓度为1.35g/L。

胰蛋白胨和酵母提取物是氮、碳、维生素和矿物质的来源。它们使产生抗原成为可能。盐Na₂HPO₄和KH₂PO₄缓冲培养基。

b.复活补充物。

1至10g/L的丙酮酸钠，优选浓度为5g/L；0.5至5g/L的巯基乙酸钠，优选浓度2.5g/L；和5000u/L的过氧化氢酶。

加入丙酮酸钠和巯基乙酸钠来参与刺激胁迫生物体的代谢(Bailey和Cox，1992)。过氧化氢酶用来消除对氧活性、对微生物毒性，并可能存在于食品中的菌种。

c.葡糖醛酸酶活性诱导补充物。

4-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸是葡糖醛酸酶的底物；其在调控培养基中的存在可以诱导该酶的表达和通过流式细胞术来检测。将其以0.5至5mM的浓度加入调控培养基中，优选最终为1mM。

d.选择性补充物。

0.5至5g/L的胆盐，优选1.5g/L。

它们用来抑制革兰氏细菌的生长，尤其是有孢子的细菌和粪便链球菌(fecal streptococci)，并用来刺激大肠杆菌的生长。在诱导葡糖醛酸酶活性补充物和选择性补充物的存在下，培养温度为20至50℃，优选37℃。

在这些补充物的存在下培养阶段为6至15小时，作为所需检测极限的函数。

2) 免疫浓缩

可用的并与珠子结合的各种抗体：

-可商业购得的金黄色葡萄球菌特异性抗体用于直接标记，

-通过将预先在调控培养基中培养的钝化细菌接种兔子来产生对金黄色葡萄球菌特异性的抗体。

3) 酶标记：葡糖醛酸酶活性的检测

优选使用的底物是荧光素-二-β-D-葡糖醛酸，更优选为五氟苯甲酰氨基-荧光素-二-β-D-葡糖醛酸。于水中制备浓度为10mM的储液。于水中制备浓度为2mM的使用液。使用的终浓度为50至500μM，优选160μM。

在底物存在下优选在37℃进行培养30分钟至1小时。

在底物是荧光素-二-β-D-葡糖醛酸的情况中，通过添加15μL的异丙醇于37℃5分钟使细菌是暂时可渗透的。

在所有情况下，随后在分析之前将荧光微生物立即放置于4℃。

实施例5：鸟分枝杆菌副结核亚种的检测

激活棕榈酸酯酶、表达鸟分枝杆菌副结核亚种表面抗原、和通过流式细胞术检测的过程。

鸟分枝杆菌副结核亚种是乙醇耐受性革兰氏阳性细菌，大小为0.5至1.5μm。其在Herrold’s蛋黄培养基上(HEYM)形成粗糙的白色菌落。其是生长非常缓慢的微生物：菌落在固体培养基上培养三或四个月后才是可见的。培养基中营养补充物的存在没有加快其生长速度(Cocito等，1994)。

分枝杆菌尤其对物理和化学因素有耐受性。鸟分枝杆菌副结核亚种显然是该家族中最具耐受性的细菌之一，其解释了它在环境中存活这么长的能力。一些因素可能减少了它在环境中的存活时间：干燥、暴露于阳光、pH高于7.0、以及缺铁的土壤。

鸟分枝杆菌副结核亚种在系统发生上与属于同一家族的其它种相关：其显示了和鸟分枝杆菌副结核亚种高于99％的DNA同源性。因此，该强大的基因同源性转化成大量共同的抗原。当使用直接免疫测试来特异性检测鸟分枝杆菌副结核亚种菌株时，这不是无价值的问题。

存在三种技术，形成了目前用于检测细菌鸟分枝杆菌副结核亚种的分析试验技术基础：血清学、聚合酶链式反应(PCR)方法、和排泄物培养。

血清学分析是检测抗鸟分枝杆菌副结核亚种抗体的间接方法；其可以在24小时内获得结果但是对抗抗分枝杆菌抗体抗原特异性的缺乏使这些测试的灵敏度比排泄物培养低(37％)。

PCR技术是直接、快速(24小时)、灵敏的分析但是不可以测量或从活细菌中分辩死细菌。当所需的是接受灭菌的食品分析时这是重要问题。实际上，来自死细菌的DNA问题可能继续存在于已经接受充分应力的产品中。因此，DNA检测结果中产生了假阳性。

排泄物培养是灵敏、可靠，但是非常长的方法：在3至4个月内获得结果。

以下提供的规程描述了分析方法，使用牛排泄物，其可以测定鸟分枝杆菌副结核亚种的存在并在短时间内(5至7天)将其定量。

此外，存在于排泄物中的致病性细菌数量在传染循环中改变很大；还有，引入了用于细菌的复活/富集步骤以便提高检测的灵敏度，尤其是在鸟分枝杆菌副结核亚种传染发展的早期阶段。

1) 组成物

a.非选择性富集基底。

37g/L的脑心浸液；2.7％的甘油，2g/L的天冬酰胺；0.1％的吐温(Tween)80；2ml的分枝杆菌素J(Synbiotics Corporation，编号ACME)，和10％的胎儿牛血清(FCS，Invitrogen)。该调控培养基一方面可以复活受到胁迫的或代谢活性降低细菌，另一方面是选择性支持培养基中鸟分枝杆菌副结核亚种生长的制剂。

b.复活补充物。

c.选择性补充物。

50mg/L的萘啶酮酸；50mg/L的万古霉素。

d.诱导补充物。

浓度为0.5至5mM的4-硝基苯基-棕榈酸盐，优选浓度为2mM。

在鸟分枝杆菌副结核亚种中棕榈酸酯酶是可诱导的。4-硝基苯基-棕榈酸盐是该酶的底物。将其添加至调控培养液中可以诱导该酶的表达并通过流式细胞术检测。

鸟分枝杆菌副结核亚种存在于牛排泄物中，尽管它们具有显著的传染潜在性，但是在大多数情况下在合适的培养基中不易于很快地生长。它们生长非常缓慢的原因是环境胁迫或降低的代谢活性。在MCD8培养基中使用的丙酮酸钠由于作用于三羧酸循环同样具有复活特性。此外，可以理解富含脂肪酸特别是棕榈酸和油酸(吐温80)的培养基尤其支持鸟分枝杆菌副结核亚种的生长。分枝杆菌素J，当充当Fe²⁺的螯合剂时，帮助提供分枝杆菌生长的这个必需离子。最后，鸟分枝杆菌副结核亚种的生长通常伴随有毒的过氧化氢(H₂O₂)分子的释放。存在于培养基中的过氧化氢酶可以消除这些细胞代谢产物。将两种宽谱的抗生素加入培养基中可以限制开始就存在于排泄物中的其它细菌的生长。建议在调控培养基中的富集阶段进行最小时间或5天；培养7天后可以获得非常好的结果。

2) 免疫浓缩

各种可用并与珠子结合的抗体：

-用于直接标记的可商业购得的鸟分枝杆菌副结核亚种特异性的抗体(Biodesign International)，

-通过用钝化细菌接种兔子来产生对鸟分枝杆菌副结核亚种特异性的抗体，上述细菌已经预先在调控培养基中生长。

可以在未与珠子结合的主要抗体(上述两个中的一个)存在下通过第一个反应来间接进行该步骤，然后用识别主要抗体的次要抗体覆盖的珠子(例如，Dynabeads M-450山羊抗鼠IgG，直径4.5μm，编号112-01，Dynal Biotech)来进行免疫浓缩。

3) 酶标记

磁性免疫浓缩步骤后，通过对其全部酶活性特异的荧光素来显示鸟分枝杆菌副结核亚种。该标记可显示活细菌，其是潜在感染性和毒性的。

a.棕榈酸酯酶活性的检测

优选使用的底物是荧光素-二-棕榈酸盐。

于丙酮中制备浓度为10至400mM的储液。使用的最终浓度是1至40μM，优选10μM。在底物存在下优选于37℃进行培养30分钟至1小时。然后在分析之前将荧光的微生物立即放置于4℃。

实施例6：侵肺军团菌的检测

军团菌是无孢子、严格厌氧、革兰氏阴性细菌，大小为0.2至0.5μm。在感染组织中为球杆菌形式，在人工培养基上是丝状或浅灰色多态群体。军团菌属通常包括43个种和64个血清型。它们的天然栖所是水且它们通常认为是变形虫中的胞内寄生菌。对人是致病性的(军团病)，侵肺军团菌是最常见的致病性血清群(80％的情况)。

支持军团菌繁殖的因素是水温、生物膜的存在、变形虫的存在、和水停滞。

特别地通过军团菌在支链脂肪酸中的富集度来对其表征，其对于革兰氏阴性细菌是不寻常的。它的生长需要L-半胱氨酸和焦磷酸铁，其是必需生长因子，但是其不水解糖也不在血琼脂培养基上生长。最后，其耐热处理和强酸(100℃10分钟；0.2M HCl)。

在人造培养基上，在36℃进行军团菌培养10天，在3天、7天、和10天读数；通过2.5％的CO₂促进其生长。

可以以两条途径来进行军团菌的鉴定：使用多克隆或单克隆抗体通过乳胶免疫凝集实验或通过免疫荧光来直接检测；或在选择性培养基上培养。直接检测具有高度特异性的优势，因此其可以精确地鉴定血清型；然而，该方法不是非常灵敏并需要10000个细菌/mL的最小量来产生结果。因此，使用这些技术以便在选择培养基上培养后鉴定种和血清型。

在选择性琼脂糖培养基上培养具有相对灵敏(最小检测极限是50CFU/mL)的优势，但是只可能推断军团菌的存在。必然地，该技术必需通过直接检测(直接免疫荧光或乳胶珠子免疫凝集)或通过分子生物技术(PCR)来完成。结果，这两种技术主要的不方便是长，在获得阴性结果之前需要10天。

1) 组合物

a.非选择性富集基底。

10g/L的酵母提取物；10g/L的ACES；1g/L的α-酮戊二酸盐；4g/L的活性碳；pH6.9±0.2；0.4g/L的L-半胱氨酸；0.25g/L的焦磷酸铁。

b.复活补充物。

c.选择性补充物。

5mg/L的多粘菌素B；2mg/L的盐酸万古霉素；和16mg/L的放线菌酮。

军团菌调控培养基配方是基于Pine等(1979)描述的成分；酵母提取物、ACES缓冲剂、甘氨酸、和L-半胱氨酸是典型的培养基成分，提供了军团菌生长必需的生长因子、矿物盐，和氨基酸；α-酮戊二酸盐是公知的强烈细菌生长激活剂。

最后，在侵肺军团菌生长过程中产生了大量的游离原子团，这和其生长是不相容的，因此活性碳可以消除这些毒性分子。在调控培养基中的培养阶段为24至72小时，优选48小时，培养温度为20至50℃，优选约37℃。

2)免疫浓缩

各种可用的并与珠子结合的抗体：

-用于直接标记的可商业购得的侵肺军团菌特异性抗体，

-用钝化细菌接种兔子来产生侵肺军团菌特异性的抗体，上述细菌已经预先在调控培养基中培养。

可以在未与珠子结合的主要抗体(上述两个中的一个)存在下通过第一个反应来间接进行该步骤，然后用识别主要抗体的次要抗体覆盖的珠子(例如，Dynabeads M-450山羊抗鼠IgG，直径4.5μm，DynalBiotech)来进行免疫浓缩。

3)酶标记

200mM的若丹明123。

若丹明123是膜电势荧光标记。膜电势的改变导致该荧光素较弱地并入细胞中。该探针的分布是细胞外部1单位，细胞质间隔中为10000。结合并入方式(电势依赖性)，该细胞特异性确保了发射的荧光反映了全部细胞活性。

若丹明123，调控培养基的成分，将在繁殖过程中并入微生物中，且可以获得带有633nm最佳发射波长的荧光细菌。

此外，加入宽谱抗生素可以消除通常和军团菌相关细菌如金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌的可能的样品细菌污染。通过去耦膜电势来作用的这些抗生素诱导弱的或不存在的若丹明123标记。

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Claims

1.一种用于检测和计数样品中微生物的方法，包括步骤：

a)选择性地富集样品中所探寻的微生物，

b)调控上述微生物，

c)免疫磁性浓缩调控的微生物，

d)荧光标记浓缩的微生物，和

e)检测和分析荧光。

2.根据权利要求1的方法，其中所述富集步骤是在组合物中进行的，该组合物包括：

-浓度范围为1至20g/L的丙酮酸钠，优选为1至10g/L，更优选为4至6g/L，

-浓度范围为0.5至5g/L的硫代硫酸钠，优选为0.5至3g/L，更优选约为2g/L，

3.根据权利要求2的方法，其中上述组合物另外包括至少一种抗生素。

4.根据权利要求1至3之一的方法，其中调控步骤是对所探寻微生物特异性的至少一种酶活性的诱导步骤，包括将至少一种对上述酶特异性的非荧光底物加入微生物的富集培养基中。

5.根据权利要求4的方法，其中所述步骤a)和b)可以同时进行。

6.根据权利要求4或5的方法，其中步骤c)可以在步骤b)之前进行或步骤c)可以在步骤d)之后进行。

7.根据权利要求1至3之一的方法，其中在所探寻微生物是革兰氏阳性细菌的情况下，调控步骤另外包括所探寻微生物的至少一种表面抗原特征的诱导步骤，包括将浓度为5至50g/L的酵母提取物加入微生物的富集培养基中，优选10至20g/L，更优选为约10g/L。

8.根据权利要求1至7之一的方法，其中免疫磁性浓缩步骤包括如下步骤：

a)将存在于调控培养基中的所探寻微生物与对抗微生物特异性抗原的抗体接触，上述抗体与磁性珠子结合，

b)从培养基中分离珠子-抗体-微生物复合体，

c)从剩下的复合物中分离微生物。

9.根据权利要求8的方法，其中与磁性珠子结合的抗体是对抗一种抗体的，后一抗体是自身对抗微生物特异性抗原的。

10.根据权利要求8或9的方法，其中所述磁性珠子具有1至20μm的直径，优选2至8μm。

11.根据权利要求1至10之一的方法，其中所探寻微生物的荧光标记是通过将至少一种底物加入含有上述微生物的培养基中来进行的，底物包括一个对释放的酶活性特异性的部分和一个标记部分。

12.根据权利要求11的方法，其中所述标记部分包括在488nm激发的荧光标记，该荧光标记选自呫吨、吖啶、藻胆蛋白、花青或七叶苷。

13.根据权利要求11或12的方法，其中对释放的酶活性特异性的底物部分选自脂肪酸、单糖、磷酸盐、和/或硫酸盐。

14.根据权利要求1至13之一的方法，其中可以计数微生物的荧光素检测和分析是通过选自以下的技术来进行的：流式细胞术、过滤细胞计数或荧光显微镜。

15.根据权利要求1至14之一的方法，其中在如权利要求1中所限定的步骤a)、b)、c)，和e)之前为分析样品的过滤步骤。

16.根据权利要求15的方法，其中所述过滤是通过孔隙度为20至150微米的过滤器来进行的，优选30至100微米，更优选约为63微米。

17.根据权利要求15的方法，其中所述过滤是通过孔隙度为0.2至10μm的膜来进行的，优选0.2至5μm，更优选为0.2至0.5μm。

18.用于样品中所探寻微生物的选择性富集培养基，包括：

-使上述微生物繁殖的营养组合物，和

-用于上述微生物的选择性复活组合物，其中其包括：

-浓度为1至20g/L的丙酮酸钠，优选为1至10g/L，更优选为4至6g/L，

-浓度为0.5至5g/L的硫代硫酸钠，优选为0.5至3g/L，更优选约为2g/L，

19.根据权利要求18的富集培养基，其中其进一步包括至少一种抗微生物剂。

20.用来实施根据权利要求1至17之一的检测和计数微生物方法的试剂盒，包括：

-液体或脱水形式的根据权利要求18或19的富集培养基，用约为63μm孔隙度的全面积过滤器排列的塑料袋，

-如权利要求8所限定的磁性珠子，

-如权利要求11所限定的一种或数种冻干形式的底物

-合适的溶剂。