JP2006500940A - 試料中の微生物を検出して、計数するための方法 - Google Patents
試料中の微生物を検出して、計数するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
a)試料中の調査される微生物を選択的に濃縮することと、
b)上述した微生物を馴化することと、
c)馴化した微生物を免疫磁気的に濃縮することと、
d)濃縮された微生物を蛍光でラベルすることと、および、
e)蛍光を検出し、解析すること。
- 1〜20g/Lの間、好ましくは1〜10g/Lの間、およびより好ましくは4〜6g/Lの間の範囲の濃度のピルビン酸ナトリウム
- 0.5〜5g/Lの間、好ましくは0.5〜3g/Lの間、およびさらにより好ましくは約2g/Lの範囲の濃度のチオ硫酸ナトリウム
- 500〜20000u/Lの間、好ましくは2000〜8000u/Lの間、およびさらにより好ましくは約5000u/L濃度のカタラーゼ。
- リステリア菌の強力なエステラーゼ活性を示すための、およびこの細菌の細胞内含有物の酸性条件のための、5,6-カルボキシ-ジクロロ-フルオレセイン-ジアセテート;
- リステリア菌のβ-D-グルコシド活性(上記した活性は、好ましくは1〜10mMの濃度で馴化培地にサリシン基質を添加することによってリステリア菌内で増幅される)を示すための、5-(ペンタフルオロベンゾイルアミノ)フルオレセインまたはフルオレセイン-ジ-β-D-グルコピラノシド;
- リステリア菌のプロピオン酸エステラーゼ活性を示すためのフルオレセイン-ジプロピオナート;この酵素の誘導は、好ましくは1〜10mMの濃度で馴化培地に2-メチル-プロピオン酸を添加することによって行われる;
- 黄色ブドウ球菌のアルカリホスファターゼ活性の指標としてのフルオレセインジ-ホスフェート;非黄色ブドウ球菌の酵素の阻害は、0.3%の無機リン酸塩を馴化培地に添加することによって行うことができる;
- 大腸菌のグルクロニダーゼの指標としてのフルオレセイン-ジ-β-D-グルクロン酸または5-(ペンタフルオロベンゾイルアミノ)フルオレセイン-ジ-β-D-グルクロン酸;微生物中での、酵素誘導は、1〜10mMの4-ニトロフェニル-β-D-グルクロニドを馴化培地に添加することによって行われる。
- パラ結核菌のパルミタートエステラーゼのための指標としてのフルオレセイン-ジ-パルミタートまたは5-(6)カルボキシフルオレセイン-ジ-パルミタート;微生物中での酵素誘導は、1〜10mMの4-ニトロフェニルパルミタートまたはメチル-パルミタートを馴化培地に添加することによって行われる;
- サルモネラ菌のカプリラートエステラーゼの指標としてのフルオレセイン-ジ-カプリラートまたは5-(6)カルボキシフルオレセイン-ジ-カプリラート;微生物中での酵素誘導は、1〜10mMのメチルカプリラートを馴化培地に添加することによって行われる。
- 1〜20g/Lの間、好ましくは1〜10g/Lの間、およびより好ましくは4〜6g/Lの間の範囲の濃度のピルビン酸ナトリウム
- 0.5〜5g/Lの間、好ましくは0.5〜3g/Lの間、およびさらにより好ましくは約2g/Lの範囲の濃度のチオ硫酸ナトリウム
- 500〜20000u/Lの間、好ましくは2000〜8000u/Lの間、およびさらにより好ましくは約5000u/Lの範囲の濃度のカタラーゼ。
- 液体または脱水形態の本発明に従った濃縮培地、
- 約63μmの空隙率を有する全表面フィルター(好ましくはプラスチックでできている)に沿って並べられたプラスチック袋、
- 上述した微生物に特異的な抗体が結合された磁気ビーズであって、上記の通り、液体培地、たとえばもう一つのガラス容器内に貯蔵されたもの、
- 凍結乾燥された形態の、上記したものなどの上述した微生物の蛍光ラベリングの1つまたはいくつかの基質、および、
- たとえばもう一つのガラス容器内の適切な溶媒。
実施例1:リステリア菌の検出
リステリア菌の酵素β-D-グルコシダーゼ並びに1型および4型体細胞抗原を活性化するための方法、並びにサイトメトリーによる検出。
a.非選択的な濃縮基剤
5〜15g/Lのトリプトン・ペプトン、好ましい濃度10g/L;5〜15g/Lの酵母抽出物、好ましい濃度10g/L;9.6g/LのNa2HPO4;1.35g/LのKH2PO4;10〜30g/LのNaCl、好ましい濃度20g/L。
1〜10g/Lのピルビン酸ナトリウム、好ましい濃度5g/L;0.5〜5g/Lのチオグリコール酸ナトリウム、好ましい濃度2.5g/L;および5000u/Lのカタラーゼ。
1〜20mMのサリシン、好ましくは2mM。
1〜20mMの2-メチル-プロピオン酸、好ましい濃度2mM。
5mg/LのポリミキシンB;1mg/Lのオフロキサシン;2mg/LのアンフォテリシンB;4mg/Lの5-フルオロサイトシン;およびおそらく9g/Lの塩化リチウム。
反応は、磁気ビーズ(たとえば、Dynabeads(登録商標)リステリア、Dynal Biotech、2.8μm直径)を用いて製造業者の説明書に従って行ったが、この抗体は、種モノサイトゲネスに特異的ではない。
- ヒトのリステリア症の原因となり、かつ1型および4型抗原を発現するリステリア菌の株に特異的な、特異抗体「リステリアO抗血清ポリ血清型1,4」(BD Diagnostics Systems, item 223021)、
- 不活性細菌をウサギに接種することによって発生したリステリア菌に特異的な血清であって、上述した細菌は馴化ブロス中で予め培養されている血清。
a.エステラーゼ活性の検出
基質5,6-カルボキシ-ジクロロ-フルオレセイン-ジアセテート(Fluka sigma-Aldrich Chemistry SARL, item 21884)を10mMの濃度でジメチルホルムアミドに調製し、次いでPBS中に10μMに希釈する。ラベリング反応は、37℃で15分間、免疫濃縮分離工程からの上清に添加した25μlの希釈剤によって達成される。反応の間、5(6)-カルボキシ-ジクロロ-フルオレセイン-ジアセテートが微生物中に放出され、蛍光性になる。この分子の特徴は、酸性のpH範囲の場合に、緑の蛍光を発光することである(Nedergaard et al., 1990)。
基質フルオレセインジ-β-D-グルコピラノシドまたはペンタフルオロベンゾイルアミノフルオレセイン-ジ-β-D-グルコピラノシドを、Molecular Probesからの説明書に従って、20mMの水溶液に調製する。これを500μMで最終的に使用する前に、H2Oで4mMに希釈する。
基質フルオレセイン-ジプロピオナートは、10mMのDMSO溶液に10mMの濃度で調製する。基質の終濃度が100μMであるように、これを試料に添加する。こうして、試料を37℃で15分間インキュベートし、次いで直ちに4℃において解析を待つ。
酵素カプリル酸エステラーゼを活性化するための手順、サルモネラ表面抗原の発現、およびサイトメトリーによる検出。
- B群(51.8%のケース)、例えばネズミチフス菌およびパラチフスB菌(Salmonella paratyphi B)は、ヒトおよび高等霊長類のみで腸チフスを引き起こす。この群は、系統的に体細胞の抗原4並びに関与する亜種に応じて抗原1、5、12、および27を発現する株によって特徴づけられる。
- D群(19.1%のケース)は、特定の動物において疾患を引き起こすが、人ではまれである:ウシのサルモネラ・ダブリン(Salmonella dublin)、ブタの豚コレラ菌(Salmonella cholerae-suis)、および卵の腸炎菌。しかし、このような感染がヒトに接触すると、たいてい侵襲性であり、致命的なこともある。この群を含むサルモネラは、常に抗原9を発現し、亜種に応じて抗原1および12を発現する。
- C群細菌(20.3%のケース)は、抗原6および7、6および8、または8を発現する;E群(6.2%のケース)のものは、抗原3および10、3および15、1および3、または19を発現する;G群(1.2%のケース)のものは、抗原13および22、または13および23を発現する;K群のものは、抗原18を発現する;並びに、A群のパラチフスA菌(0.24%のケース)は、抗原1および2を発現する。
a.非選択的な濃縮基剤
5〜15g/Lのトリプトン・ペプトン、好ましい濃度10g/L;10〜30g/LのNaCl、好ましい濃度20g/L;5〜15g/Lの酵母抽出物、好ましい濃度10g/L;0.5〜3g/LのD-グルコース、好ましい濃度1g/L;5〜15g/LのNa2HPO4、好ましい濃度9.6g/L;および、0.5〜3g/LのKH2PO4、好ましい濃度1.35g/L。
1〜10g/Lのピルビン酸ナトリウム、好ましい濃度5g/L;0.5〜5g/Lのチオグリコール酸ナトリウム、好ましい濃度2.5g/L;および5000u/Lのカタラーゼ。
4-ニトロフェニルカプリラートは、カプリラートエステラーゼの基質であり;濃縮ブロス中にこれが存在すると、この酵素の発現の誘導およびフローサイトメトリーによるその検出が可能となる。
グラム陽性菌の増殖を阻害するための、1〜10mg/Lのブリリアントグリーン、好ましい濃度5mg/L;および、特に大腸菌の発生を阻害するための、1g/Lのスルファピリジン。
反応は、磁気ビーズ(たとえば、Dynabeads(登録商標)サルモネラ、2.8μm、Dynal Biotech)を用いて製造業者の説明書に従って行った。
- 直接のラベリングのためのサルモネラに特異的な商業的に入手可能な抗体(たとえばBD Diagnostic Systems, item 2302-50)。この抗体は、抗原1、4、5、および12に対して向けられており、D群のサルモネラを検出することができる。
- 不活性細菌をウサギに接種することによって発生したサルモネラに特異的な血清であって、上述した細菌は馴化ブロス中で予め培養した血清。
好んで使用される基質は、フルオレセインジカプリラートである。原液は、10〜400μMの濃度のアセトン溶液に調製する。使用する終濃度は、1〜40μM、好ましくは10μMである。基質の存在下において、好ましくは37℃で30分〜1時間インキュベーションを行い、次いで微生物を直ちに4℃に置く。
酵素ホスファターゼを活性化するための手順、黄色ブドウ球菌の表面抗原の発現、およびフローサイトメトリーによる検出。
a.非選択的な濃縮基剤
肉ペプトン:好ましい濃度8g/L;カゼイン・ペプトン:好ましい濃度2g/L;酵母抽出物:好ましい濃度10g/L;肉抽出物:好ましい濃度5g/L。肉およびカゼインのペプトン、並びに酵母および肉の抽出物は、窒素、炭素、ビタミン、およびミネラルの供与源である。黄色ブドウ球菌の増殖およびカプセル形成の阻害を可能にする。
1〜10g/Lのピルビン酸ナトリウム、好ましい濃度5g/L;0.5〜5g/Lのチオグリコール酸ナトリウム、好ましい濃度2.5g/L;および5000u/Lのカタラーゼ。
0.3%の無機ホスフェート
12g/Lのグリシン;5g/LのLiCl;および、0.05g/Lのデフェロキサミン。
種々の抗体をビーズ上で使用することができる。
- 膜抗原と抗体を直接結合するための、黄色ブドウ球菌に特異的な商業的に入手可能な血清(item 50-L030, AGROBTO)、
- 不活性細菌をウサギに接種することによって発生した黄色ブドウ球菌に特異的な抗体であって、上述した細菌は馴化ブロス中で予め培養されている抗体。
a.アルカリホスファターゼ活性の検出
基質フルオレセイン-ジホスフェート(item F-2999, Molecular Probes)により、アルカリホスファターゼ活性を検出することができる。これは、100mMのpH8.0のトリス-HClで10mMの濃度に溶解し、次いでPBS溶液に1mMに希釈することによって調製される。ラベリング反応は、25μlの希釈剤プラス免疫濃縮分離工程からの上静に添加した125μlのPBSで、37℃で15分間で達成される。反応の間に、フルオレセインが放出されて、蛍光性になる(励起/発光490/514nm)。
酵素グルクロニダーゼを活性化するための手順、大腸菌表面抗原の発現、およびサイトメトリーによる検出。
- O体細胞の抗原:180の多様性があり、そのうちの約30は、I型EPBC(O26、O55、O86、O111、O119、O125〜O128、O142、その他)、II型EPEC(O18、O44、O112、O114、その他)、EIEC(O28、O29、O124、O136、O143、O152、その他)、ETEC(O6、O8、O15、O20、O25、その他)、およびEHEC(O26、O113、O121、O145、O157、その他)の病原性株で頻繁に遭遇され、
- 多糖体AもしくはB性質(12の有意なEPECのBタイプ)の、またはタンパク質L性質(線毛、特にCFA抗原)のKカプセル抗原、
- EHECに重要であるH鞭毛抗原、そのうちの最も一般的な血清型はO157:H7である。
a.非選択的な濃縮基剤
10〜30g/Lのトリプトン・ペプトン、好ましい濃度20g/L;5〜15g/Lの酵母抽出物、好ましい濃度10g/L;1〜10g/LのNaCl、好ましい濃度5g/L;1〜10g/LのD-ラクトース、好ましい濃度5g/L;5〜15g/LのNa2HPO4、好ましい濃度9.6g/L、0.5〜3g/LのKH2PO4、好ましい濃度1.35g/L。
1〜10g/Lのピルビン酸ナトリウム、好ましい濃度5g/L;0.5〜5g/Lのチオグリコール酸ナトリウム、好ましい濃度2.5g/L;および5000u/Lのカタラーゼ。
4-ニトロフェニル-β-D-グルクロニドは、グルクロニダーゼの基質であり;馴化培地中にこれが存在すると、この酵素の発現を誘導およびフローサイトメトリーによるその検出ができる。これを0.5〜5mMの範囲、好ましくは最終1mMの濃度の条件培地に添加する。
0.5〜5g/Lの胆汁の塩類、好ましくは1.5g/L。
種々の抗体をビーズと共に使用し、および結合することができる:
- 直接のラベリングのための大腸菌に特異的な商業的に入手可能な抗体、
- 不活性細菌をウサギに接種することによって発生した大腸菌に特異的な抗体であって、上述した細菌は馴化ブロス中で予め培養されている抗体。
使用した基質は、フルオレセイン-ジ-β-D-グルクロン酸が好ましく、およびさらにより好ましくは、ペンタフルオロベンゾイルアミノ-フルオレセイン-ジ-β-D-グルクロン酸である。原液は水中で10mMの濃度に調製する。使用液はH2O中で2mMに調製する。使用する終濃度は、50〜500μM、好ましくは160μMである。
酵素パルミタートエステラーゼを活性化するための手順、パラ結核菌の表面抗原の発現、およびフローサイトメトリーによる検出。
1)組成
a.非選択的な濃縮基剤
37g/Lのブレインハートインフュージョン;2.7%のグリセリン、2g/Lのアスパラギン;0.1%のツウィーン80;2mlのミコバクチンJ(Synbiotics Corporation, item ACME)、および10%のウシ胎児血清(FCS, Invitrogen)。この馴化培地は、一方ではストレスを与えられ、または代謝活性が減少した細菌を蘇生させ、他方では選択的に培地中のパラ結核菌の増殖を支持することができる標品である。
1〜10g/Lのピルビン酸ナトリウム、好ましい濃度5g/L;0.5〜5g/Lのチオグリコール酸ナトリウム、好ましい濃度2.5g/L;および、5000u/Lのカタラーゼ。
50mg/Lのナリジクス酸;50mg/Lのバンコマイシン。
0.5〜5mMの濃度、好ましくは2mMの濃度の4-ニトロフェニル-パルミタート。
種々の抗体をビーズと共に使用し、および結合することができる:
- 直接のラベリングのためのパラ結核菌に特異的な商業的に入手可能な抗体(Biodesign International)、
- 不活性細菌をウサギに接種することによって発生したパラ結核菌に特異的な抗体であって、上述した細菌は、馴化ブロス中で予め培養されている抗体。
3)酵素によるラベリング
磁気免疫濃縮の工程の後、パラ結核菌を、その全体の酵素活性に特異的な蛍光色素によって明らかにする。このラベリングにより、潜在的に感染性および有毒である生細菌を示すことができる。
好んで使用される基質は、フルオレセイン-ジ-パルミタートである。
レジオネラは、非芽胞形成性の、厳しい好気的な、グラム陰性細菌であり、0.2〜0.5μmで測定される。感染した組織中で球杆菌の形態であり、人工の培地では、糸状の形態で、または灰色がかった多型性のコロニーに存在する。属レジオネラは、現在43種および64の血清型を含む。これらの自然生息地は、水であり、これらは現在アメーバの細胞内寄生体として認識されている。ヒトの病態(在郷軍人病)の原因である、レジオネラ・ニューモフィラ1は、最も一般的な病理学的血清型(80%のケース)である。
a.非選択的な濃縮塩基
10g/Lの酵母抽出物;10g/LのACES;1g/Lのα-ケトグルタル酸;4g/Lの活性炭;pH 6.9±0.2;0.4g/LのL-システイン;0.25g/Lのピロリン酸第二鉄。
1〜10g/Lのピルビン酸ナトリウム、好ましくは5g/Lの濃度;0.5〜5g/Lのチオグリコール酸ナトリウム、好ましくは2.5g/Lの濃度;および、5000u/Lのカタラーゼ。
5mg/LのポリミキシンB;2mg/Lの塩酸バンコマイシン;および、16mg/Lのシクロヘキシミド。
種々の抗体をビーズと共に使用し、結合することができる:
- 直接のラベリングのためのレジオネラ・ニューモフィラに特異的な商業的に入手可能な抗体(Abcam, UK)、
- 不活性細菌をウサギに接種することによって発生したレジオネラ・ニューモフィラに特異的な抗体であって、上述した細菌は、馴化ブロス中で予め培養されている抗体。
200mMのローダミン123。
Claims (20)
- 以下の工程を含む、試料中の微生物を検出して計数するための方法:
a)試料中の調査される微生物を選択的に濃縮する工程;
b)上述した微生物を馴化する工程;
c)馴化した微生物を免疫磁気的(immunomagnetically)に濃縮する工程;
d)濃縮された微生物を蛍光でラベルする工程;および、
e)蛍光を検出し、解析する工程。 - 濃縮工程が以下を含む組成物中で行われる、請求項1記載の方法:
- 1〜20g/Lの間、好ましくは1〜10g/Lの間、およびより好ましくは4〜6g/Lの間の範囲の濃度のピルビン酸ナトリウム
- 0.5〜5g/Lの間、好ましくは0.5〜3g/Lの間、およびさらにより好ましくは約2g/Lの範囲の濃度のチオ硫酸ナトリウム
- 500〜20000u/Lの間、好ましくは2000〜8000u/Lの間、およびさらにより好ましくは約5000u/Lの範囲の濃度のカタラーゼ。 - 上述した組成物が、加えて少なくとも1つの抗生物質を含む、請求項2記載の方法。
- 馴化工程が、調査される微生物に特異的な少なくとも1つの酵素活性の誘導工程であり、上述した酵素または酵素群に特異的な少なくとも1つの非蛍光性基質を微生物濃縮培地に添加することを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 工程a)およびb)を同時に行うことができる、請求項4記載の方法。
- 工程c)を工程b)の前に行うことができるか、または工程c)を工程d)の後に行うことができる、請求項4または5記載の方法。
- 馴化工程が、調査される微生物がグラム陽性菌である場合には、調査される微生物に特徴的な少なくとも1つの表面抗原の誘導工程であって、5〜50g/Lの間、好ましくは10〜20g/Lの間、およびさらにより好ましくは約10g/Lの範囲の濃度で微生物の濃縮培地に酵母抽出物を添加することを含む誘導工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 免疫磁気濃縮工程が以下の工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法:
a)馴化培地中に存在する調査される微生物を、微生物に特異的な抗原に対して向けられた抗体(上述した抗体は、磁気ビーズに結合されている)と接触して配置する工程;
b)ビーズ-抗体-微生物の複合体を培地から分離する工程;
c)微生物を残りの複合体から分離する工程。 - 磁気ビーズに結合された抗体が、それ自体が調査される微生物に特異的な抗原に対して向けられた抗体に向けられている、請求項8記載の方法。
- 磁気ビーズが、1〜20μmの間、好ましくは2〜8μmの間の範囲の直径を有する、請求項8または9記載の方法。
- 調査される微生物の蛍光ラベリングが、上述した微生物を含む培地に、示される酵素活性に特異的な部分および1つのラベル部分を含む少なくとも1つの基質を添加することによって行われる、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- ラベル部分が、キサンテン、アクリジン、フィコビリンタンパク質、シアニン、およびエスクリンを含む群から選択される488nmで励起される蛍光発生ラベルから成る、請求項11記載の方法。
- 示される酵素活性に特異的な基質部分が、脂肪酸、単糖、ホスフェート、および/またはサルフェートから選択される、請求項11または12記載の方法。
- 微生物の計数を可能にする蛍光の検出および解析が、フローサイトメトリー、濾過サイトメトリー、および蛍光顕微鏡観察を含む群から選択される技術によって行われる、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1において定義した工程a)、b)、c)、d)、およびe)が、解析する試料のための濾過工程より前に行われる、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
- 濾過が、その空隙率が20〜150ミクロンの間、好ましくは30〜100ミクロンの間、およびさらにより好ましくは約63ミクロンの範囲であるフィルターによって行われる、請求項15記載の方法。
- 濾過が、0.2〜10μmの間、好ましくは0.2〜5μmの間、およびさらに好ましくは0.2〜0.5μmの間の範囲の空隙率を示す膜上で行われる、請求項15記載の方法。
- 以下を含む、試料中の調査される微生物のための選択濃縮培地:
- 上述した微生物の増殖を可能にする栄養素組成物、および、
- 上述した微生物のための選択的な蘇生組成物であって:
- 1〜20g/Lの間、好ましくは1〜10g/L、およびより好ましくは4〜6g/Lの間の範囲の濃度のピルビン酸ナトリウム、
- 0.5〜5g/Lの間、好ましくは0.5〜3g/Lの間、およびさらにより好ましくは約2g/Lの範囲の濃度のチオ硫酸ナトリウム、
- 500〜20000u/Lの間、好ましくは2000〜8000u/Lの間、およびさらにより好ましくは約5000u/Lの範囲の濃度のカタラーゼを含む蘇生組成物。 - 少なくとも1つの抗菌薬をさらに含む、請求項18記載の濃縮培地。
- 請求項1〜17のいずれか1項記載の微生物を検出し、計数する方法を実行するための以下を含むキット:
- 液体もしくは脱水形態の請求項18または19記載の濃縮培地、約63μmの空隙率を示す全表面フィルターに沿って並べられたプラスチック袋、
- 請求項8において定義した磁気ビーズ、
- 凍結乾燥した形態の、請求項11において定義した1つまたはいくつかの基質、
- 適切な溶媒。
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