MX2007010276A - Determinacion de microorganismos viables utilizando perlas paramagneticas revestidas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para la deteccion de microorganismos. En una modalidad, la presente invencion proporciona metodos para detectar microorganismos vivos en un cultivo al capturar y cultivar los microorganismos en perlas paramagneticas revestidas paratropicas. Esta tecnica es util para cualquier aplicacion en la cual sea necesario monitorear el nivel de contaminacion biologica, por ejemplo, agua para beber, aguas recreacionales, aguas para procesamiento de alimentos y laboratorios medicos. En una modalidad, el metodo para determinar la concentracion de microorganismos viables en una muestra de acuerdo a la invencion comprende ademas un reactivo inductor, en donde el reactivo inductor incluye un compuesto inductor que induce la actividad de una enzima unica para el microorganismo de interes.

Description

DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS VIABLES USAN DO GRAN ULOS PARAMAGN ETICOS REC UBIERTOS Referencia Cruzada a las Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad bajo 35 US C. 1 1 9 de la Solicitud de Patente No. 60/655.204, presentada el 22 de febrero, 2005; cuya descripción completa es incorporada por referencia adj unto. Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a métodos para la detección de microorganismos. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para detectar m icroorganismos vivos en un cultivo. Antecedentes de la Invención Los coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli son uti lizados como indicadores de contaminación fecal de los suministros de ag ua y aguas recreacionales [1 ]. Entre éstos, el E . coli generalmente es considerado el más confiable ya que su presencia se relaciona directamente con la contaminación fecal [2] . E. coli se encuentra en el contenido intestinal de seres humanos, de animales de sangre caliente y pájaros. Aunq ue muchas cepas no son patogénicas, alg unas cepas de E. col i están invol ucradas en el a limento y en las enfermedades a cuosas [3]. Los métodos tradiciona les para enumerar E. coli son consumidores de tiempo, incómodos y en la mayoría de los casos , requieren varias etapas de manejo [4] . Para superar estas dificultades , muchos métodos rápidos, novedosos, han sido desarrollados para sustituir técnicas tradicionales. Además de ser rápidos, son silenciosos , específicos, sensibles, exactos y de trabajo menos intenso. Los inmunoensayos, los cuales son confiables en la reacción antígeno-anticuerpo especifico, son uti l izados comúnmente para detectar patógenos rápidamente. Muchos i nmunoensayos, tales como los ensayos inmunosorbentes ligados a la enzima, disponibles comercialmente (ELISA) , para detectar alg unas bacterias, requieren un m ínimo de 1 05- 1 06 células para la detección, tal etapa de enriquecimiento es usualmente incorporada para alcanzar u na concentración suficiente de célula , la cual aumenta el tiempo de ensayo [5] . Otra opción es inmunocapturar las célu las bacterianas usando inmunogránulos magnéticos. Cuando los granulos son mezclados con una muestra, ellos capturan las bacterias específicas y después son retiradas por un imán para concentrar las bacterias objetivo y quitar las bacterias y otros componentes de la muestra q ue puede interferir con el ensayo [5]. Como otras bacterias, bajo la carencia de nutrientes y de diferentes condiciones de crecimiento, E . coli experimenta modificaciones fisiológicas que invol ucran las actividades enzimáticas y ia s íntesis de la proteína [6]. Entre éstos, la ß-galactosidasa, una enzima catabólica que divide a la lactosa en galactosa y glucosa, es uti lizada con frecuencia como un marcador general para los coliformes totales. Así, la actividad de esta enzima puede utilizarse como un ind icador de contaminación fecal y determinar el número de bacterias usando los sustratos convenientes , en particular, sustratos de la enzima fluorogénica o cromogénica [6]. Los sustratos de la enzima fluorogénica consisten generalmente de un sustrato específico para la enzima específica, tal como un azúcar o un aminoácido, y un fluorogeno, tal como 4-metilumbeliferona. Los sustratos metilumbeliferil son altamente sensibles y muy específicos [7]. La presente invención describe el desarrollo de un inmunoensayo basado en un granulo para la detección de E. coli. El inmunoensayo fue basado en el recubrimiento de la superficie de los microgránulos paramagnéticos con el anticuerpo específico de E. coli y captura de las bacterias. La actividad de la ß-galactosidasa, inducida en E. coli, fue determinada usando el sustrato 4-metilumbeliferil-ß-D-galactosida (MUG) y fue utilizada para enumerar E. coli. El inmunoensayo desarrollado no requirió enriquecimiento o filtración. Además, el sistema de detección no requirió anticuerpos secundarios, debido a que la detección fue basada en la actividad de la enzima intrínseca en E. coli.

Así, la actividad de la enzima fue utilizada para determinar el número de bacterias vivas en la muestra. Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a métodos para la detección de microorganismos. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para detectar microorganismos vivos en un cultivo. En general, la presente invención proporciona un método de medir la presencia de microorganismos vivos de interés en una muestra, que comprende las etapas de: a. capturar el microorganismo de interés con una cantidad apropiada de fracción marcada (m olécula paratrópica) capaz de enlazar específicamente al microorganismo marcado de interés; b. incubar el microorganismo con un sustrato para una enzima presente en el microorganismo por suficiente tiempo para permitir la producción de una ca ntidad detectable de producto por la enzima en los m icroorganismos vivos presentes ; c. detectar el producto ; y d . correlacionar la ca ntidad de producto con un estándar conocido y de tal modo determinar la presencia de microorganismos vivos. La fracción marcada usada es preferiblemente anticuerpos, receptores solubles, moléculas paratópicas, moléculas recombinantes con sitios de enlace para el analito marcado, o fragmentos del m ismo.

La fracción marcada es preferiblemente un anticuerpo y más preferiblemente u n anticuerpo poli clonal que reconoce muchos epitopes en el microorganismo marcado. En otra modalidad, la prese nte invención proporciona un método para medir la presencia de m icroorganismos vivos de interés en una muestra, que comprende las etapas de: a . capturar el m icroorganismo de interés con una cantidad apropiada de fracción marcada (molécu la paratrópica) capaz de enlazar específicamente al microorganismo marcado de interés; b. incubar el microorganismo por un tiem po suficiente para permitir el crecimiento de los microorganismos vivos presentes; c. incubar el microorganismo con un sustrato por una enzima presente en el microorganismo po r un tiem po suficiente para perm itir la producción de una cantidad detect able de producto por la enzima en los microorganismos vivos presentes; d . detectar la cantidad de producto producido en la muestra ; y e . correlacionar la cantidad de producto con un estándar conocido y de tal modo determinar la presencia de microorganismos vivos. En otra modalidad , la presente invención proporciona un método para medir la presencia de microorganismos vivos de interés en una muestra, que comprende las etapas de: a . capturar el m icroorganismo de interés con una cantidad apropiada de fracción marcada (m olécula paratrópica) capaz de enlazar específicamente al microorganismo marcado de interés; b. incubar el microorganismo por un tiempo suficiente para permitir el crecim iento de los microorganismos vivos presentes; c. incubar el microorganismo con un sustrato por una enzima presente en el microorganismo por un tiempo suficiente para permitir la producción de una cantidad detectable de producto por la enzima en los microorganismos vivos presentes ; d . detectar la cantidad de producto producida en la muestra ; y e. correlacionar la cantidad de producto con un estándar conocido y de tal modo determinar la presencia de m icroorganismos vivos , f. en donde el producto es detectado por fluorescencia. Esta técnica es útil para cualquier aplicación en la cual es necesario supervisar el nivel de contaminación biológica , por ejemplo agua potable, aguas recreacionales, aguas de procesamiento de alimentos y laboratorios médicos. En otra modalidad , el métod o para determinar la concentración de coliformes viables o E. coli en u n líquido de acuerdo a la invención , comprende además la etapa de obtener una muestra que se probará de una fuente donde se sospecha la contam inación. En otra modalidad , el métod o para determinar la concentración de microorganismos viables en una muestra de acuerdo a la invención comprende además un reactivo i nductor, en donde el reactivo ind uctor incluye un compuesto inductor q ue induce la actividad de una enzima única al microorganismo de interés. En una modalidad , el inductor es el isopropiltiogalactopiranosida (I PTG) q ue es un inductor de la enzima beta-galactosidasa en coliformes. En otra modalidad, el ind uctor es seleccionado del grupo que consiste de 1 -O-metil-beta-D-glucuronida , ácido isopropil-beta-D-tioglucurónico, isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida, 3-O-metil-. alfa.-D-glucopiranosida y 1 -O-metil-beta-D-glucopiranosida. Los expertos en la técnica reconocerán que un inductor particular puede usarse para promover la producción de u na enzima particu lar. En otra modalidad , el método para determinar la concentración de col iformes vi a bles o E. col i en u n l íq u ido de acuerdo a la invención comprende además un reactivo ind icador, en donde el reactivo indicador incluye un compuesto i ndicador q ue experimenta un cambio detectable por métodos visuales o de espectrofotometría durante la división por una enzima beta galactosidasa encontrada en coliformes o una enzima única beta glucuronidasa a E. coli . En otra modalidad, el reactivo indicador el cual experimenta un cambio visible de color cuando es dividido por las enzimas únicas al grupo de bacterias coniformes, es utilizado en la prueba de coliformes y un reactivo el cual se vuelve flu orescente cuando es d ivid ido por las enzimas únicas en E. coli que es utilizado en la prueba de E . coli, en donde únicamente los microorganismos viables pueden dividir al reactivo. En otra modalidad , el métod o para determinar la concentración de microorganismos viables en una muestra de acuerdo a la invención, comprende además la incubación de la muestra de prueba y de la muestra de control a aproximadamente 35° C, por aproximadamente 24 h o menos. En una modalidad , la invención proporciona un nuevo método para detectar e indicar rápida y exactamente la presencia de col iformes via bles o E. coli en una muestra l íquida. En otra modal idad , la invención proporciona un método semicuantitativo para cuantificar e indicar rápida y exactamente la concentración de coliformes viables o E. coli en u na m uestra l íqu ida. En otra modalidad , la invención proporciona un método en el cual la detección es por medio de espectrofotometría.

En otra modalidad, el métod o para determ inar la concentración de microorganismos viables en una muestra de acuerdo a la invención además comprende disolver por medio de usinas las membranas de la célula del mircroorganismo para l i berar la enzima a la cual el sustrato está dirigido. En otra modalidad, la invención proporciona un kit para determinar e indicar rápida y exactamente la presencia o ausencia de coliformes o E. coli en una muestra l íquida . Los usos del kit pueden ser para detectar los coliformes o E . coli anteriores, sin embargo, otros usos son posibles . Cada componente del kit (s) puede empaquetarse i nd ividualmente en su propio envase conveniente. Los envases ind ividuales pueden también etiquetarse de una manera que se identifique el contenido. Por otra parte, los com ponentes individual mente empaquetados pueden ponerse en un envase más grande capaz de sostener todos los componentes deseados. Asociadas con el kit pueden estar las i nstrucciones que explican cómo utilizar el kit. Estas instrucciones pueden ser escritas o adjuntas al kit. En una modalidad, la invención involucra el enlace de los anticuerpos monoclonales, por ejemplo de origen murino o humano, que reconocen específicamente los a ntígenos presentes en las células del microorganismo en cuestión , o para otros propósitos para subpoblaciones especificas de células, para partículas paramagnéticas, ya sea directamente o a los g ranulos primero recubiertos con anticuerpos que reconocen específicamente los anticuerpos respectivos, o la porción-Fe de a nti cuerpos I gG , q ue en lazan a las cél u las de l microorganismo. En una modalidad , los anticuerpos que enlazan a la célula pueden ser del tipo IgG o IgM o ser un fragmento de ab IgG o Ig M. La presente invención también proporciona kits reactivos útiles en la realización de los métodos descritos, proporcionando: a . un primer reactivo que contiene una fracción marcada etiquetada específica para el microorganismo marcado y capaz de formar un complejo con el microorganismo marcado; b. un segundo reactivo separado del primer reactivo que contiene un sustrato conveniente para el microorganismo q ue es detectado; y c. un tercer reactivo separado del primero y segundo reactivos que contiene un estándar para el producto producido por el sustrato. La presente invención también proporciona kits reactivos útiles en la realización de métodos descritos, que proporcionan : a . un primer reactivo que contiene una fracción marcada etiquetada específicamente para el microorganismo marcado y capaz de formar un complejo con el microorganismo marcado; b. un segundo reactivo separado del primer reactivo que contiene un sustrato conveniente para que el microorganismo sea detectado; y c. un tercer reactivo separado del primer y segundo reactivos, que contiene un estándar del producto producido por el sustrato. d . un cuarto reactivo separado del primer, segundo y tercer reactivos , que contiene una etiqueta de detección para el producto. En una modalidad , la fracción paratrópica es un anticuerpo y la fracción de captura es un anticuerpo. En otra modalidad , estos anticuerpos son policlonales. En otra modalidad, los anticuerpos de captura están inmovilizados en un soporte sól ido. En otra modalidad , el soporte sólido es un microg ránulo. En otra modalidad , el microgránulo es u n microgránulo paramagnético recubierto con un anticuerpo dirigido hacia uno o más microorganismos de interés. La presente invención también proporciona kits reactivos útiles en la realización de los métodos descritos, que comprenden : (a) un primer envase que tiene molécu las paratópicas que immunoreaccionan con los microorgan ismos marcados, y están operativamente ligados a un medio que indica la enzima; (b) un segundo envase que tiene moléculas paratópicas que immunoreaccionan con el producto marcado pero no están en el primer envase; y (c) uno o más de otros envases que comprenden uno o más de lo siguiente: un depósito de muestra, un soporte de fase sól ida, reactivos de lavado, reactivos capaces de detectar la presencia del anticuerpo enlazado desde el segundo envase , o reactivos capaces de ampl ificar los medios de indicación. En una modalidad, las moléculas paratópicas están detectablemente etiquetadas a través del uso de u na etiqueta seleccionada del grupo consistente de radioisótopos, etiq uetas de afinidad, etiquetas enzimáticas , y etiquetas fluorescentes . Más preferiblemente, las moléculas paratópicas, que están etiq uetadas detectablemente a través del uso de agentes de etiq uetado fluorescente, son fluorocromas, por ejemp lo, isocianato fluoresceína (FIC) , isotiocianato fluoresceína ( FITC) , cloruro 5-dimetilamina-1 -naftalenosulfonilo (DANSC) , tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC), lissamina, rodamina 8200 o cloruro de sulfonilo (RB 200 SC) . En otra modalidad , la presente invención está dirigida a un método para monitorear una muestra que comprende medir la concentración de un microorganismo. Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención llegarán a ser aparentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las modalidades descritas y de las reivindicaciones anexas. Breve Descripción de los Dibujos Los dibujos anexos incorporados en y que forman una parte de la especificación , ilustran varios aspectos de la presente invención, y junto con la descripción sirven para explicar los principios de la invención . En los dibujos: Figura 1 . (a) Optimización de la concentración del anticuerpo para recubrir los granulos paramagnéticos. (b) Efecto del tiem po de captura para el granulo en el anticuerpo q ue enlaza para formar el complejo del g ranulo-anticuerpo. Figura 2. Efecto del tiempo de incubación para capturar E . coli por el complejo del granulo-anticuerpo. Figura 3. (a) Estud io de la concentración I PTG para optim izar la activid ad de la ß-ga lactosidasa . ( b) Opti m ización de la tem peratura de incubación para maximizar la actividad de la ß-galactosidasa. Figura 4. (a) Señales de RDE generadas usando los cultivos de E. coli de concentraciones altas y bajas así como componentes individuales y combinados del medio de crecimiento marcado. Estas señales muestran la ausencia de ruido de fondo significante. Intercalación: Cambio de la corriente (?µA) después de agregar las soluciones de la muestra al sistema RDE. (b) Curva de calibración PAP generada trazando las concentraciones PAP (mM) contra la corriente (µA). Fueron utilizadas las concentraciones PAP de 1.35x10"4 a 4.0X10"3 mM. Figura 5. (a) Detección amperimétpca de la producción PAP en diferentes concentraciones de E. coli. Fueron utilizadas las concentraciones bacterianas de 20 cfu/mL a 2x106 cfu/mL. (b) Tiempo de incubación contra la concentración inicial de E. coli. La curva es lineal con por lo menos una línea cuadrada de y = -81.8x + 519.4, R2 = 0.989 entre 20 a 2x106 cfu/mL resultando de la dilución de 5 µL de los microgránulos modificados con 20 µL del sustrato de la enzima. En la siguiente descripción de las modalidades ilustradas, las referencias son hechas a los dibujos anexos, que forman una parte de la misma, y en la cual se muestra a modo de ilustración varias modalidades en las cuales la invención puede ser practicada. Deberá entenderse que otras modalidades pueden utilizarse, y los cambios funcionales y estructurales pueden hacerse sin salirse del alcance de la presente invención. Descripción Detallada de la Invención Antes de que las presentes proteínas, secuencias de nucleótidos, y métodos sean descritos, se enti ende que esta invención no está unida a la metodolog ía particular, protocolos, líneas celulares , vectores, y reactivos descritos ya que éstos pueden variar. Debe tam bién entenderse q ue la terminolog ía usada en la presente es con el propósito de describir modalidades particu l ares únicamente, y no se desea que lim ite el alcance de la presente invención, q ue será limitado únicamente por las reivindicaciones anexas. Deberá observarse que como es utilizado en la presente y en las reivind icaciones anexas, las form as del singular de "un", "una", y "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera . Así, por ejemplo , la referencia a "una célula hospedadora" incluye una pluralidad de tales células hospedadoras. A menos que sea definido de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados como es entendido comúnmente por un experto en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse en l a práctica o prueba de la presente invención , los métodos, dispositivos, y materiales preferidos son descritos ahora . Todas las referencias, pu blicaciones, patentes, solicitudes de patente, y materiales comerciales mencionados en la presente están incorporados por referencia adjunta con el propósito de describir y descubrir las l íneas celulares, vectores, y metodolog ías que son reportadas en las publicaciones que pudieron utilizarse en relación con la i nvención . N ada en la presente es construido com o u na adm isió n que la invención no está autorizada para ante-fechar ta l descripción en virtud de la invención anterior. Para proporcionar un entendimiento claro y consistente de la especificación y de las reivindicaciones , incl uyendo el alcance dado a tales términ os, las siguientes definiciones son proporcionadas: La "actividad biológica" o "bioactividad " o "actividad" o "función biológica", las cuales son utilizadas recíprocamente, para los propósitos en la presente, significa una función que es realizada directa o ind irectamente por un polipéptido (si está en su conformación natural o desnaturalizada) , o por cualq uier s ubsiguiente del m ismo. El término "anticuerpo" se refiere a una molécula que es un m iembro de una familia de prote ínas llamadas inmunoglobulinas que pueden combinarse específicamente con un antígeno. Tal anticuerpo se combina con su antígeno por una interacción de enlace i nmunológico específico entre el antígeno dete rm inante del antígeno y el sitio que combina el anticuerpo del anticuerpo. La frase "molécula del anticuerpo" en sus varias formas gramaticales como es utilizada en la presente contempla una molécula de inm unoglobulina intacta y una porción activa inm unológica de una molécula de inmu noglobulina . Las molécu las de anticuerpos ejemplares son moléculas de inmunog lobuli na intactas, moléculas de inmunoglobulina intactas sustancialmente y porciones de una molécula de inmunoglobul ina que contienen paratope , incl uyendo las porciones conocidas en la técn ica como Fab, Fab' F(ab') . sub.2 y F(v) . Las porciones de anticuerpos Fab y F(ab') .sub.2 son preparadas por la reacción proteol ítica de la papa ína y pepsina , respectivamente, en anticuerpos sustancialmente intactos por los métodos que son bien conocidos. Ver por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4.342.566 de Theofilopolous y Dixon. Las porciones de anticuerpo Fab' son también bien conocidas y son producidas a partir de las porciones F(ab').sub.2 seguidas por la reducción de los enlaces de disulfuro que ligan las dos porciones de la cadena pesada como con un mercaptoetanol, y seguidas por la alquilación de la proteína de mercaptano resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. Las moléculas de anticuerpo intactas que contiene un anticuerpo son preferidas, y son utilizadas como ilustrativas en la presente. La frase "anticuerpo monoclonal" en sus varias formas gramaticales se refiere a una población de una especie de molécula de anticuerpo de determinada especificidad de antígeno (conocida). Un anticuerpo monoclonal contiene únicamente una especie de sitio que combina el anticuerpo capaz de inmunoreaccionar con un antígeno particular y exhibe así normalmente una sola afinidad de enlace para ese antígeno. Un anticuerpo monoclonal puede por lo tanto contener una molécula de anticuerpo biespecífico que tiene dos sitios que combinan anticuerpos, cada uno inmunoespecífico para un diferente antígeno. Un "sitio que combina el anticuerpo" es la porción estructural de una molécula de anticuerpo que comprende regiones variables e hipervariables de cadena pesada y ligera que específicamente enlaza al antígeno. Usando la nomenclatura de Jerne, Ann. Immunol., 125:373-389 (1974), un sitio que combina el anticuerpo es referido generalmente en la presente como un "paratope." Las porciones de anticuerpos de pol ipéptido (que contiene paratope) que contienen el siti o que com bina el anticuerpo, son porciones de moléculas de anticuerpo que contienen paratope y se enlazan a un antígeno, e incluye n, por ejem plo, las porciones de los anticuerpos Fab, Fab' , F(ab')2 y F (v) . En una modalidad , los anticuerpos intactos son utilizados. La palabra "antígeno" ha sido utilizada históricamente para designar una entidad que es unida por un anticuerpo, y también para designar la entidad que induce la producción del anticuerpo. U n uso más actual limita el significado del antígeno a la entidad enlazada por un anticuerpo, mientras que la pala bra "inm unogen" es utilizada para la entidad que induce la producció n de anticuerpo. Donde una entidad discutida en la presente es inm u nogénica y antigénica, generalmente será llamada antígeno. La frase "determinante a ntigénico" se refiere a la porción estructural actual del antígeno q ue está enlazado inmunológicamente por un sitio que combina el anticuerpo. La nomenclatura Jerne redefine un determinante antigénico como "epitope." "E LI SA" se refiere a un ensayo inmunosorbente ligado a una enzima que usa un antígeno o un enlace de anticuerpo a una fase sólida y a una conjugación de antígeno-enzima o anticuerpo-enzima para detectar y cuantificar la cantidad de antígeno o de anticuerpo presente en una muestra . U na descripción de la técnica ELI SA se encuentra en las Patentes Norteamericanas Nos. 3.654.090, presentada el 4 de abri l de 1 972; 3.850.752 , presentad a e l 26 de n oviem bre de 1 974 ; y 4.016.043, presentada el 5 de abril , 1 977, todas de Schuurs, y colaboradores, las cuales son incorporadas por referencia adjunta . La "enzima" se refiere a una proteína capaz de acelerar o producir por acción catalítica, cierto cambi o en un sustrato para el cual es con frecuencia específico. La "actividad enzimática" se refiere a una medida de capacidades catal íticas de una enzima para convertir el sustrato al producto expresado usualmente en unidades por peso de la muestra probada. "Inmunoreactivo" como es utilizado en la presente, se refiere al producto de una reacción inmu nol óg ica ; es decir, la entidad producida cuando un antígeno está enlazado inmunológ icamente por un anticuerpo o una molécula que contiene un pa ratope. Como es usado en la presente , los términos "etiqueta" y "medios de indicación" en sus varias formas gramaticales se refieren a átomos y moléculas solas que están involucradas ya sea directamente o ind irectamente en la producción de una señal detectable para indicar la presencia de un complejo. Cualquier etiqueta o medio de indicación puede ligarse a o incorporarse en una proteína expresada , polipéptido, o molécula de anticuerpo que sea parte de un anticuerpo o de una composición de anticuerpo monoclonal de la presente i nvención , o usado por separado, y los átomos o moléculas pueden utilizarse solos o en conjunto con reactivos adicionales . Tales etiquetas son por ellas mismas bien conocidas en diag nósticos q u ímicos cl ínicos y constituyen una parte de esta invención ún icamente en la medida en q ue sean utilizadas con , de otra manera, métodos y/o sistemas de las prote ínas de novedad. Los medios de etiquetado pueden ser un agente de etiquetado fluorescente que químicamente enlace a los anticuerpos o antígenos sin desnaturalizarlos para formar un fluorocroma (tinte) que sea un trazador inmunofluorescente útil. Los agentes de etiquetado fluorescente convenientes son fluorocromas tales como isocianato de fluoresceína (FIC), isotiocíanato de fluoresceína (FITC), cloruro 5-dimetilamina-1-naftalenesulfonilo (DANSC), tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC), lissamina, rodamina, cloruro de sulfonilo 8200 (RB 200 SC) y similares. En una modalidad, el grupo de indicación es una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), glucosa oxidasa, o similares. En tales casos donde el grupo de indicación principal es una enzima tal como HRP o glucosa oxidasa, los reactivos adicionales son requeridos para visualizar el hecho de que un complejo de ligadura al receptor (inmunoreactivo) ha sido formado. Tales reactivos adicionales para HRP incluyen peróxido de hidrógeno y un precursor de tinte de oxidación tal como diaminobenzidina. Un reactivo adicional útil con la glucosa oxidasa es 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolina-G ácido sulfónico) (ABTS). Las moléculas paratópicas cuando están ligadas a las etiquetas de la enzima también son referidas algunas veces en la presente como moléculas paratópicas ligadas a la enzima. El término "anticuerpo entero" es utilizado en la presente para distinguir una molécula entera, intacta secretada por una célula de otras moléculas, más pequeña, que también contiene el paratope necesario para la actividad biológica en una inmunoreacción con un epitope.

Las moléculas paratópicas de la presente invención pueden ser moléculas paratópicas monoclona l es. U n "anticuerpo monoclonal" (Mab) es un anticuerpo producido por clones de un hibridoma que secreta solo una clase de molécula de ant icuerpo, y una molécula paratópica monoclonal es un anticuerpo monoclonal o una porción de polipéptido que contiene paratope de la m ism a, como es discutido abajo. La célula hibridoma está fusionada de la célula que produce el anticuerpo y un mieloma u otra l ínea celular auto-perpetúa. Tales anticuerpos fueron primero descritos por Kohler y Milstein , Nature, 256, 495-497 ( 1 975) , cuya descripción está incorporada por referencia en la presente. Los términos "molécu la paratópica monoclonal" y "molécula paratópica" únicamente son utilizados recíproca y colectivamente en la presente para referirse al género de las moléculas q ue contienen un sitio de combinación de un anticuerpo monoclonal , e incluyen un anticuerpo monoclonal ente ro, un anticuerpo monoclonal sustancialmente entero y una porción que contiene el sitio de enlace del anticuerpo de un anticuerpo monoclonal . Como es usado en la prese nte el término "condiciones de ensayo biológ ico" es utilizado por las condiciones en donde una molécula útil en esta invención tal como un anticuerpo que se enlaza a otra molécula úti l tal como un epitope antígeno. En una modalidad , esto está en un intervalo de valor pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, en fuerzas iónicas tales como de ag ua destilada a aproximadamente un cloruro de sodio molar, y a temperaturas de aproximadamente 4 grados C a aproxi m ad a mente 45 g rados C .

La palabra "complejo" como es utilizado en la presente se refiere al producto de una reacción específica de ligando-agente de unión . U n complejo ejemplar es un producto de in m unoreacción formado por una reacción de anticuerpo-antígeno. Como es utilizado en la presente "fracción marcada o reactivo" es una molécula que se enlaza a una fracción marcada molecular soluble definida. La fracción marcada puede enlazarse a un receptor, una citocina, hormona, fármaco, u otra molécula soluble. El anticuerpo es utilizado a través de la especificación como un ejemplo prototípico de una fracción marcada . Como se utiliza en la presente un "par de ligando/anti-l igando" es t un grupo de moléculas complementarias/anti-complementarias que muestran el enlace específico, generalmente de afinidad relativamente alta. Los pares ejemplares de ligandos/anti-ligandos incluyen hapteno/anticuerpo, ligando/receptor, y biotina/avidina. La biotina/avidina es utilizada a través de la especificación como un ejemplo prototípíco de un par de l igandos/anti-ligandos. Como se define en la presente, u n "anti-ligando" muestra un enlace de a lta afinidad, divalente o univalente del ligando complementario. Preferiblemente, el anti-ligando es suficientemente grande para evitar la separación renal rápida, y tiene una vida promedio in vivo mayor que el ligando . El anti-ligando no deberá causar la producción de agregados grandes de ligandos/anti-ligandos que podrían q uitarse rápidamente desde la sangre o linfa por el sistema retículo-endotelial .

Como se definió en la presente, "avidina" incl uye avidina, estreptavidina y derivados y análogos de la misma q ue son capaces de un enlace de alta afinidad, multivalente o univalente a la biotina. Como es defin ido en la presente , un "ligando" es una molécula soluble relativamente pequeña , que exh ibe la separación rápida de suero, sangre y/o de cuerpo entero cuando es administrada de forma intravenosa en un animal o human o. Las bacterias coliformes son indicadoras de la calidad sanitaria del agua y del alimento. Los coliformes totales (TC) en ag ua son originarios del suelo o de material vegetal orgánico. Los coliformes fetales (termotolerante) (FC) y E . coli en particular habita n el intestino de humanos y an imales y son indicadores de contam inación fecal . Los procesos tradicionales para detectar col iformes y E . coli por filtración de membrana están basados en la fermentación de lactosa en conjunto con pruebas confirmatorias y requieren de 48 a 96 horas para concluirlos. U n procedimiento es considerado convencionalmente rápido si toma 24 horas o menos en realizarse . Sin embargo, un método de 24 horas no es bastante rápido para ser util izado por el ensayo de agua potable en situaciones de emergencia , por ejemplo después de averías en el abastecimiento de ag ua o trabajos de construcción al sistema de distribución . En estos casos, la detección de por lo menos 1 bacteria coliforme por 100 ml de agua debe ser factible dentro del cambio de trabajo ordi nario de 8 horas y en máximo 7 horas para mostrar la potabilidad del agua y, por lo tanto evitar advertencias i nnecesarias al pú bli co acerca de las contrariedades .

Los métodos de filtración de membrana, rápidos existentes (24 horas) para la detección de las bacterias coliformes, en particular TC y E. coli , se apoyan en la demostración de la actividad de 2 enzimas marcadoras específicas en las colonias bacterianas, es decir -galactosidasa y -glucuronidasa, respectivamente, que las bacterias producen mientras crecen y metabolizan . La presencia de estas enzimas es revelada por la capacidad de las bacterias presentes en el filtro de la mem brana para dividir los sustratos cromogénicos ag regados al medio de crecimiento tal como 5-bromo-4-cloro-3-indolilo— D-galactopiranosida (X-gal) para -galactosidasa y 5-bromo-4-cloro-3-indolil— D-g lucuronida (X-gluc) para -glucuronidasa. Los sustratos cromogén icos por sí mismos no se colorean de modo que la detección de colonias coloreadas en el filtro de la membrana indica la presencia de la enzima y, por lo tanto, de las bacterias. Ver por ejemplo Manafi and Kneifel , Zentralbl . Hyg . 1 89:225-234 (1 989) , Brenner et al. , Appl. Environ . M icrobiol . 59: 3534-3544 (1 993) and Frampton and Restaino, J . Appl. Bacteriol . 74: 223-233 ( 1 993). Sim ilarmente, los sustratos fluorogénicos, por ejem plo 4-metilumbeliferil— D-galactopiranosida (M U-gal) o 4-metilumbeliferil— D-g lucuronida (MUG) agregados al medio de crecimiento pueden dividirse por -galactosidasa y -g lucuronidasa bacteriano , respectivamente, para rendir un producto fluorescente, 4-metilumbeliferona (4-MU) . Los sustratos fluorogén icos por sí m ismos no son fluorescentes de modo que la detección de colonias fluorescentes en el filtro de la membrana indica la presencia de la enzima y, por lo tanto, de las bacterias . Actualmente, el método fluorescente más rápido para detectar el TC en un filtro de la membrana usando MU-gal como sustrato para -galactosidasa, toma 16-24 horas para concluir (Brenner, citado arriba). Para E.coli el tiempo de detección mínimo obtenido usando MUG como un sustrato para -glucuronidasa es 7.5 horas (Sarhan and Foster, J. Appl. Bacterial. 70:394-400 1991)). La Patente Norteamericana y Publicación Científica de Berg y colaboradores describe un método para detectar coliformes fecales (termotolerantes) en un filtro de la membrana usando un medio de crecimiento agar que contiene MU-gal como un sustrato para -galactosidasa y una temperatura de incubación de 41.5°C, en un período de tiempo de 6 horas (Berg y colaboradores., U.S Pat. No. 5.292.644 and Appl. Environ. Microbiol. 54:2118-2122 (1988)). Sin embargo, el tiempo para detectar los coliformes totales que crecen a 35°-37° C. y poseen actividad galactosidasa más baja que los coliformes termotolerantes exceden 8 horas. E. coli no puede detectarse específicamente usando este método. En una modalidad, la presente invención proporciona una técnica para la detección rápida y exacta de la contaminación de microorganismos en un líquido que ha sido descubierto. Esta técnica es útil para cualquier aplicación en la cual sea necesario monitorear el nivel de contaminación biológica, por ejemplo agua potable, aguas recreacionales, aguas de procesamiento para alimentos y laboratorios médicos. La muestra de agua es agregada a una mezcla reactiva que contiene un agente cromogénico que rinde un cromoforo amarillo durante la división por la enzima única beta galactosidasa al grupo de bacterias col iformes o de una mezcla reactiva q ue contiene un agente fluorogénico que rinde un fluoroforo azul brillante en la d ivisión por la enzima única glucuronidasa beta a E. coli . La formulación nutriente incluye un tampón, tal como tampón fosfato, capaz de mantener el pH de la muestra en o aproximadamente pH 7, caldo de soja tríptico (TSB) sin glucosa , succinato, e isopropiltioga lactopiranosida (I PTG) que es un inductor de la enzima beta galactosidasa en coliformes . TSB es una mezcla no definida del componente que proporciona vitaminas , minerales y oligoelementos, pero no de una fuente de carbón significativa con excepción de aminoácidos. TSB sin glucosa puede utilizarse por muchos microbios as í como los microorganismos marcados de la presente invención para el crecim iento. Los antibióticos son exclu idos opcionalmente de la formulación nutriente. El succinato es una fuente de carbohidrato para el crecim iento de organismos y es utilizado para aumentar la biomasa. No inhibe la producción o actividad de la enzima beta galactosidasa en el ensayo de coliformes pero inhibe la producción/actividad de la enzima glucuronidasa en E. coli. Por lo tanto, el succinato no está inclu ido en la mezcla de polvo del reactivo para el ensayo de E. coli . El succinato es utilizado en una cantidad efectiva para mejorar la formación de biomasa en el ensayo del coliforme y es usual mente 0.05-0.2/m l, preferiblemente 0.1 -0. 1 5 mg/ml de la m uestra en la cual la concentración de la biomasa es aumentada rápidamente. La adición de cantidades crecientes de succinato de sodio, por ejem plo, 0.2 mg/ml de la muestra, resulta en biomasa incrementada de microbios no-marcados capaces de utilizar el succinato como una fuente de carbono. La concentración de TSB sin glucosa en la ampolla de prueba después de agregar la muestra directamente sin dilución, deberá ser suficiente para proporcionar nutrientes para sostener la viabilidad y reproducción de microbios marcados, y es usualmente 5-15 mg/ml de la muestra, preferiblemente 8-12 mg/ml, más preferiblemente 9-11 mg/ml y mucho más preferible 10 mg de TSB/ml de la muestra después de la adición directa de la muestra a la ampolla de prueba. La cantidad total del TSB sin glucosa, tampón, IPTG y succinato es suficiente para sostener la viabilidad del microbio marcado (coliforme) y dar lugar a la réplica del microbio marcado para generar la biomasa suficiente para producir un cambio detectable en la muestra debido a la actividad beta-galactosidasa y está usualmente en el intervalo de 10-25 mg/ml, preferiblemente 10-20 mg/ml, más preferiblemente de 13-18 mg/ml, y mucho más preferible de 16.8-17.3 mg/ml. Por ejemplo, una mezcla de TSB/tampón y de succinato en una relación de 10 mg:7 mg:0.1 mg respectivamente es suministrado en un peso de 136.8 mg para una muestra de 8 ml o 171 mg, para una muestra de 10 ml o 342 mg, para una muestra de 20 ml. IPTG es utilizado en una cantidad para inducir la producción de beta-galactosidasa, y está usualmente en el intervalo de 0.01-0.05 mg/ml, preferiblemente 0.015-0.05 mg/ml, y más preferiblemente de 0.02 mg/ml de la muestra. ONPG es utilizado en una cantidad suficiente para producir un cambio detectable visualmente o espectrofotométricamente en respuesta a su división por las enzimas beta-galactosidasa, y está usualmente en el intervalo de 0.5-5 mg/m l, preferiblemente 1 -3 mg/ml, y más preferiblemente de 1 .25 mg/ml de la muestra. M UG es utilizado en una cantidad suficiente para producir un cambio detectable visualmente o espectrofotométricamente en respuesta a la división por la enzima beta-g l ucuronidasa , y está usual mente en el intervalo de 0.005-0.5 mg/ml, preferiblemente aproximadamente de 0.05 mg/ml de la muestra. El tampón puede ser cualq uier tampón que es utilizado en una cantidad suficiente para mantener el pH de la m uestra q ue es probado en aproximadamente 7. Preferiblemente, el tampón es una mezcla de NaH2 PO4 y Na2 HPO4, y está generalmente en el intervalo de 5-9 mg/ml , preferiblemente 6.5-7.6 mg/ml , y más preferiblemente de 7 mg/ml de la m uestra . La muestra es mezclada e incubada a una temperatura que permite el crecimiento rápido del microorganismo (s) q ue es analizado y está generalmente a 32-37°C , preferiblemente en o aproximadamente de 35°C. El espectro de absorbencia de cada muestra de la prueba del col iforme es monitoreada en o aproximadamente del lambda máximo del cromoforo generado (en 405 nm , el lambda máximo del cromoforo de nitrofenol generado por la división del reactivo indicador, ONPG , por la enzima beta galactosidasa en la prueba del coliforme , y en 355 nm , el lambda máximo del fluoroforo producido por la d ivisión del reactivo indicador, M UG , por la enzima beta gl ucuronidasa, en u na prueba del E. co l i) .

El monitoreo espectrofotométrico de la mezcla de reacción resulta en la detección de un criterio de valoración positivo (es decir aumento en la Absorbencia de aproxi madamente 0.05 de unidades de absorbencia) antes que sea posibl e la detección visual del color amarillo brillante o la detección de la fluorescencia azul brillante bajo una onda UV larga . La detección por métodos visuales o espectrofotométricos pueden fácilmente lograrse dent ro de aproximadamente 24 horas o menos. La concentración de coliformes en la muestra puede determ inarse en un intervalo grande de concentración , con la detección espectrofotométrica de 20 coliformes/m l dentro de aproximadamente 1 0 h , y la detección visual dentro de aproximadamente 1 1 .5 h. La concentración de E . coli en la muestra puede determinarse en un intervalo grande de concentració n, con la detección 1 0 de E. coli/m l dentro de aproximadamente 12 h, preferiblemente dentro de 10 h usando el ensayo espectrofotométrico, y dentro de 12 h para la detección visual bajo onda larga . En una modalidad de la presente invención , el inductor es seleccionado del g ru po que comprende isopropil— D-tiogalactopiranosida para -galactosidasa e isopropil--D-tioglucuronída y pnitrofenil — D-alucuronida para -glucuronidasa. En otra modalidad de la presente invención, el uso es hecho como el medio de crecim iento de un medio que contiene nutrientes minerales , un hidrolisado de proteína, en particu lar triptona , y un azúcar, preferiblemente maltosa, o un polialcohol , preferiblemente manitol . El uso de u n med io de crecim iento en l a etapa de prei ncu bación combi na las características de la promoción de crecim iento eficiente, buena recuperación de coliformes/E. coli tensionado por un lado con un fondo luminiscente bajo y por otro lado efectos m ínimos de enfriamiento de emisión de luz. En una modalidad aún más preferida de la presente invención , el uso está hecho de sustratos fluorogénicos diferentes del M U-gal y M UG mencionados anteriormente, en particular de 4-trifluorometilum beliferil--D-galactopiranosida (TFMU-gal) o 4-trifluorometilumbeliferil--D-glucuronida (TFM UG), pero la preferencia se da a los sustratos quimíoluminogénicos. El último no ha sido aplicado hasta ahora para la detección de las colonias bacterianas desarrolladas en un filtro de membrana pero en más sensible q ue los sustratos usados actualmente.

El término "coliformes totales" (TC) se refiere a las bacterias que pertenecen ya sea a cuatro géneros, es decir, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella o C itrobacter, y poseen la enzima -galactosidasa. El término coliformes fecales (FC) se refiere a bacterias (termotolerantes) que pertenecen al grupo de los coliformes y habitan el intestino de seres humanos y animales. Estos coliformes fecales son indicadores de contaminación fecal y poseen también la enzima -galactosidasa, las especies particulares E. coli además poseen la enzim a -glucuronidasa. La detección de los coliformes fecales puede ser hecha por su incubación a una temperatura más alta (41 .5°-44°C. ) q ue la tem peratura usada para detectar los coliformes totales (aproximadamente 35°-37°C). El térm ino preincubación se refiere a una etapa en el método de esta invención en la cual una muestra con una o más bacterias es colocada en un medio de crecimiento y mantiene cierta temperatura por un tiempo dado para propagar la bacteria e inducir la enzima marcadora.

El término "permeabilizadores de membrana" se refiere al compuesto capaz de dividir la membrana citoplásmica y la externa de bacterias para facilitar la absorción de químicos. El término "ensayo de enzima" se refiere a una etapa distinta de la etapa de crecimiento en el método de esta invención en el cual un sustrato es dividido por una enzima marcadora, en particular -galactosidasa o -glucuronidasa, presente en las bacterias, el producto de la división es entonces determinado en virtud de la luz que emite después de la excitación química o fotoquímica. El término "luminiscencia" se refiere a la fluorescencia o quimioluminiscencia. El término fluorescencia se refiere a un proceso fisicoquímico en el cual una molécula emite luz de cierta longitud de onda después de la excitación fotoquímica, es decir, con la luz de una longitud de onda más corta. El término quimioluminiscencia se refiere a un proceso fisicoquímico en el cual una molécula emite luz después de la excitación química con una formulación llamada "acelerador". El término sustrato fluorogénico se refiere a un compuesto el cual por sí mismo no es fluorescente pero que contiene una parte estructural, es decir, el producto fluorescente así llamado, que emite luz cuando es liberado del compuesto asociado y excitado fotoquímicamente. El término sustrato quimioluminogéníco se refiere a un compuesto que por sí mismo no es quimioluminiscente pero contiene una parte estructural, es decir, el producto quimioluminiscente, que es el emisor de luz cuando es liberado del compuesto asociado y excitado químicamente. La muestra que es analizada es líquida o licuada y es sospechosa de contener por lo menos 1 TC, 1 FC o 1 E. coli/100 ml. Las muestras normales a las cuales el método de la invención puede ser aplicado incluyen agua potable, agua de baño o extractos líquidos de alimentos o productos farmacéuticos. En una modalidad, el medio de ensayo contiene en particular un sustrato fluorogéníco para cualquiera de las dos enzimas marcadoras, que es preferiblemente TFMU-gal (.lambda.exe 394, . lambda. em 489 nm) (-galactosidasa) o TFMUG (.lambda.exe 394, . lambda. em 489 nm) (-glucuronidasa). Los sustratos fluorogénicos comunes MU-Gal (-galactosidasa) o MUG (-glucuronidasa) pueden también ser utilizados pero rinde una sensibilidad más baja. Una desventaja de los últimos dos compuestos es que requieren de pulverizar el filtro de la membrana con hidróxido de sodio para rendir una fluorescencia óptima. Otros análogos de MU-gal que podrían también considerarse como sustratos para -galactosidasa, incluyendo 3-acetil-7-(-D-galactopiranosiloxi)couma n (.lambda.exe 420, . lambda. em 459 nm), 3(2-benzoxazolil)-7-(-D-galactopiranosiloxi)coumarin y 1-(-D-galactopiranosiloxi)-1-(-D-galactopiranosiloxi)-pireno-3,6,8-tris-(dimetil-sulfonamida)-3.6.8-tr¡s-(dimetil-sulfonamida) (.lambda.exe. 495 nm, lambda. em. 550 nm en pH 9) (ver Koller y colaboradores., Appl. Fluoresc. Technol. 1.15-16 (1989)) son en principio más sensibles y específicos que MU-gal por sí mismo ya que sus longitudes de onda de excitación y de emisión han cambiado a valores más altos y/o porque han aumentado los coeficientes de absorción molar. Las galactopiranosidas y glucuronidas fluorogénicas sin umbeliferil pueden en principio también utilizarse, por ejemplo fluoresceína di — D-galactopiranosida o fluoresceína di-D-glucuronida y derivados de las mismas tal como C12 -fluoresceína-d¡— D-galactopiranosida o C12 -fluoresceína-di — D-glucuronida (ImaGene, Green, Molecular Probes, Eugene, OR) o resorufin— D-galactopiranosida o resorufin— D-glucuronida (ImaGene Red, Molecular Probes). Aún una sensibilidad intrínseca más alta está asociada con el quimioluminogéníco AMPGD (3-(4-metoxispiro>(1 ,2-dioxetano-3,2'-triciclo>3.3. 1.1.sup.3J!decan!-4-il)fenil) — D-galactopiranosida) o derivados de los mismos, en derivados de cloro particulares (por ejemplo Galacton.RTM. (un mono-cloro derivado de AMPGD), Galacton-Plus.RTM. (un derivado di-cloro de AMPGD) (-galactosidasa) disponible de Tropix, Inc., Bedford, Mass.) y Glucuron. RTM. (3-(4-metoxispiro>1 , 2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)-triciclo>3.3.1.1.sup.3.7!decan!4-il)fenill)-D-glucuronida) o derivados del mismo (-glucuronidasa) (Tropix Inc.), quimioluminiscencia en general es superior en sensibilidad a la fluorescencia por orden de magnitud. AMPGD y Glucuron han sido utilizados como sustratos en ensayos reportadores del gene. Ver por ejemplo Jain y colaboradores, Anal. Biochem. 199:119-124 (1991) y Bronstein y colaboradores., Anal. Biochem. 219:169-181 (1994). En otra modalidad, el medio del ensayo contendrá un permeabilizador de membrana. En una modalidad, el permeabilizador es polimixin B sulfato o colistin metanosulfonato, o una mezcla de uno de éstos con lisozima y sustancias del tampón para ajusta r a un pH 7-7.5, en una modalidad, a un pH 7.3. En otra modalidad de esta invención , es posible incluir un inductor con el que la m uestra líquida comprenda bacterias. El inductor es específico para una o más proteínas tales como una o más enzimas en las bacterias y mejora el nivel de transcripción y por lo tanto la ca ntidad de proteína (por ejemplo, enzima) en las bacterias. Una variedad de inductores es conocida en la técn ica por una variedad de enzimas. Los ind uctores ejemplares incluyen , pero no se lim itan a , 1 -O-metil-beta-D-glucuronida o ácido de isopropil-beta-D-tiog lucorón ico para la actividad enzimática beta-glucuronídasa, isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida para la actividad enzimática beta-galactosidasa, 3-O-metil-alfa-D-glucopiranosida para la actividad enzimática alfa-glucosidasa , y 1 -O-metil-beta-D-glucopiranosida para la actividad enzimática beta-glucosidasa. Después de la incubación de la muestra celular con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos primarios y el anticuerpo recubierto de partículas paramagnéticas como se describió previamente, la suspensión de la célula es incubada con un segundo g rupo de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos contra otros extracelulares o contra determinantes intracelulares de las células del microorgan ismo marcado, con o sin el tratamiento previo con los fijadores celulares tales como formaldeh ído o alcoholes . Estos anticuerpos o sus fragmentos pud ieron haber sido pre-etiquetados por agentes fluorescentes, metalocoloides, radioisótopos, com plejos de biotin o enzimas como peroxidas a y fosfatasa alcalina, permitiendo la visualización por sí mismos de métodos conocidos en el microscopio y/o un dispositivo de conteo convenie nte. Las células del microorganismo marcado serán ambas visualizadas con el último métod o y tendrán enlazadas partículas a su superficie, y pueden así ser enumeradas. Para el uso en el nuevo procedimiento, en una modal idad los kits contendrán por ejemplo partículas paramagnéticas , primero recubiertas preparadas para cada anticuerpo monoclonal. En otra modalidad , los kits contienen partículas paramagnéticas primero recubiertas con el isotipo IgG específico del anticuerpo anti-ratón o anti-humano como una parte de éste, y diferente célula asociada marcada , por ejemplo las células de E. coli , anticuerpos en otra parte. En una tercera modalidad, el kit contiene partículas paramag néticas recubiertas primero con los anticuerpos anti-Fc específicos , tales como anti-ratón policlonal, o antiratón monoclonal de rata , o anti-ratón, o anticuerpos anti-humano, capaces de enlazar a la Fc-porción los anticuerpos que se asocian a la célula marcada, que enlaza a los anticuerpos de la anti-célula marcada especifica. En una modalidad adicional , el kit contiene otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo específicos dirigidos contra antígenos/receptores dentro o en las células marcadas deseadas, donde los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo están conjugados a la peroxidasa, fosfatasa alcalina, o a otras enzimas, junto con los sustratos relevantes a tales enzimas , o donde el anticuerpo o frag mento de anticuerpo es enlazado a las partículas no-paramagnéticas con colores específicos o con enzimas de enlace tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina. El término "soporte de fase sólida" significa cualquier soporte capaz de enlazar al antígeno o anticuerpos . Los soportes bien conocidos, o portadores, i ncluyen, pero no se limitan a , poliestireno, polipropilene, polietileno, vidrio, dextrán , nylon , am ilasas, celulosas naturales y mod ificadas, poliacr ilamidas, agarosas, y mag netita. El material de soporte puede tener virtual y estructuralmente cualquier configuración siempre y cuando e n su superficie, el antígeno sea capaz de unirse a un anticuerpo. Así, la configuración de soporte puede ser esférica, como en u n g ranulo, o ci lindrica, como en la superficie interior de un tubo de prueba, o la superficie externa de una barra. Alternativamente, la superficie pu ede ser plana tal como una hoja, una tira de prueba, etc. U n portador preferido es el fondo y los lados de una placa de pozo de microtitulación de poliestireno. Los expertos en la técnica sabrán de m uchos otros portadores convenientes para enlazar el anticuerpo o antígeno, o podrán ser capaces de determ inar el mismo por el uso de una experimentación ruti naria. La actividad de enlace de u n lote dado de la molécula paratrópica puede determinarse de acuerdo a los métodos bien conocidos . Los expertos en la técnica podrán ser capaces de determinar las condiciones operativas y óptimas del ensayo para cada determinación usando la experimentación rutinaria. Otras etapas tales como lavar, agitar, sacud ir, filtrar y si m ilares pueden agregarse a los ensayo como de costumbre o según ' sea necesario de acuerdo a la situació n particular. La detección del anticuerpo etiquetado o compañero de enlace por el analito etiquetado puede logra rse por un contador de centelleo , por ejemplo, si la etiqueta detectable es un em isor gamma radiactivo, o por un fluorómetro, por ejem plo, si la etiqueta es un material fluorescente. En el caso de una etiqueta de la enzima y de un sustrato cromogénico, la detección puede lograrse por métodos colorimétricos. La detección puede también lograrse por com paración visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados similarmente. Adicionalmente, los inmunoensayos se apoyan en los epitopes para el reconocim iento del agente marcado. Los epitopes, sin embargo, son vulnerables a las modificaciones q ue pueden ocurrir como un resultado de varios componentes presentes en el agua , tales como, agentes de desinfección (es deci r, cloro, cloraminas, dióxido de cloro, hipoclorito, ozono), y residuales de los mismos. Por ejemplo, la oxidación debido al cloro acuoso o cloraminas, usados para la desinfección y mantenidos en niveles residuales de agua acabada pueden causar la alteración del epitope . Como un ejemplo adicional , las cadenas laterales de aminoácido de tirosina , triptofan , cisteina, prolina e histidina pueden también modificarse por la adición de varios agentes de desinfección. Como resultado, las alteraciones pueden rendir epitopes y/o secuencias no reactivas de ácido nucleico hacia los elementos de reconocim iento molecular q ue han sido desarrollados por la versión sin modificar de los agentes marcados.

Como un ejemplo ad icional , l a presencia de iones de metal en una muestra de prueba , tal como calci o, magnesio, así como otros metales conocidos en la técnica puede n reaccionar con el anticuerpo o frag mento (elemento de reconocimiento molecular) y/o el agente marcado. La interferencia puede s uceder, por ejemplo, por los iones de metal presentes coord inando con , por ejemplo, amina , sulfidrilo, histidilo, y/o ligandos de superficies de carboxilo. Esta interferencia, sin embargo, puede evitarse, por ejemplo, agregando a un agente de quelación que lo asocia con los iones de metal y los hace incapaces de interactuar con el elemento de reconocimiento molecular y/o agente marcado. El término "agente de quelación" como es utilizado en la presente se refiere a cualquier compuesto orgánico e inorgánico que unirá a un ¡ón de metal q ue tiene una valencia más grande de una . Un "quelante", "resina de quelación" , "ligante", "agente secuestrador", o "secuestrador de cationes divalentes" se refiere a una composición que enlaza cationes divalentes. El enlace puede ser reversible o irreversible. El enlace de los cationes d ivalentes generalmente los hace sustancialmente incapaces de participar en reacciones químicas con otras fracciones con las cuales ellas entran en contacto. U n "quelante", "resina q uelante", "ligante", "agente secuestrador", o "secuestrador de cationes divalentes" se refiere a una composición que enlaza cationes divalentes . El enlace puede ser reversi ble o irreversible. El enlace de los cationes divalentes genera lmente los hace sustancialmente incapaces de participar en reacciones químicas con otras fracciones con las cuales hacen contacto. Ejemplos de agentes de quelación son , por ejemplo, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido nitriloacético (NTA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA), ácido trans-1,2-diaminociclohexanotetraacético (DCTA), bis-(aminoetil)glicoéter-N,N,N', N'-ácido tetraacético (ECTA), trietileno tetramina dihidrocloruro (TRIEN), etileno glicol-bis (beta.-aminoetil éter)-N,N,NN'-ácido tetracético, (EGTA), trietilenotetramina hexaacético ácido (TTG), deferoxamina, Dimercaprol, edetato de calcio y disodio, citrato de cinc, penicilamina succimero, editronato así como otros conocidos en la técnica. En una modalidad de la presente invención el agente de quelación tiene una concentración en la solución de entre aproximadamente 0.1 mM y aproximadamente 50 mM. En otra modalidad, la concentración del agente de quelación está entre aproximadamente 0.1 mM y aproximadamente 10 mM. En otra modalidad de la presente invención, el quelante es proporcionado en una cantidad de modo que el quelante comprende aproximadamente 0.001 M a aproximadamente 0.05 M, en una modalidad de aproximadamente 0.005 M a aproximadamente de 0.02 M, y en otra modalidad de aproximadamente 0.008 M a aproximadamente 0.012 M de la solución de quelante final / agua acabada / tampón (opcional). El quelante puede combinarse con la muestra de agua acabada antes, durante, o después de la adición de la mezcla tampón o ácido al agua acabada. Así, por ejemplo, el quelante puede proporcionarse en un fluido de preservación y/o almacenaje con un dispositivo de recolección de agua acabada. El quelante es entonces combinado con el agua acabada durante el almacenaje y transporte. Alternativamente, el q uelante puede com binarse con el agua acabada justo antes de la aplicación de la muestra de agua acabada al dispositivo de ensayo. En aún otra modalidad , el quelante puede agregarse al d ispositivo de ensayo después de que la a plicación de agua acabada pueda almacenarse en un recipiente dentro del dispositivo de ensayo. En otra modalidad, el quelante no necesita combinarse , sino únicamente hacer contacto con el agua acabada y/o la mezcla de tampón y/o agua acabada. Así, por ejemplo donde el inmunoensayo implica la prog resión del fluido a través de una matriz porosa , el material de matriz por sí mismo puede hacerse de un material q ue quela o si no secuestra o enlaza a cationes divalentes. Tales materiales de matriz son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los agentes de secuestro más comunes son con frecuencia utilizados como resinas de intercambio de ion e incluyen , pero no se l imitan a, fijar resinas que contienen iones de iminodiacetato, o resinas que contienen poliaminas de base libre, o ácido amino fosfónico. Alternativamente, el agua acabada o la mezcla de tampón/agua acabada pueden tratarse previamente por el pasaje a través de una matriz que q uela o secuestra de otra manera cationes divalentes. Este tratamiento previo puede i ncorporarse en el envase de almacenaje y transporte, provisto como etapa de fi ltración, o provisto como un componente del método de extracción de la muestra de agua acabada del dispositivo de recolección . En esta última modalidad , por ejemplo, la centrifugación de la muestra de agua acabada fuera del dispositivo de recolección puede vincular el pasaje de agua acabada a través de u n a matriz de q uelación o secuestro en ruta a u na cám a ra de recolección q ue pueda o no pueda por s í misma proporcionarse como un componente del dispositivo de inm unoensayo. Adicionalmente, los niveles de pH en la solución de prueba pueden también interferir con el reconocimiento molecular debido a su efecto en el estado de protonaci ón de ácidos y grupos básicos en la superficie o ya sea del elemento de reconocimiento molecular y/o del agente marcado. Tales fracciones qu ím icas que pueden afectarse por el pH incluyen por ejemplo, histidina , ácido carboxílico, aminas, así como otros conocidos en la técnica . Esta interferencia puede evitarse, por ejemplo, agregando un amortiguador. Los amortiguadores son compuestos cuyas soluciones actúan para resistir cambios en el pH de la adición de la base o ácido. El término " amortiguador de pH " como es utilizado en la presente se refiere a cualquier compuesto o combinación orgánica o inorgánica de los compuestos q ue mantendrán el pH de una muestra o solución de agua acabada dentro de aproximadamente 0.5 unidades de pH de un valor de pH seleccionado. U n amortiguador normal consiste de un ácido débil y su base conjugada, y es elegido para operar en un intervalo particular de pH , o por otras propiedades importantes para el sistema amortiguado . Por ejemplo, los tampones de fosfato son uti lizados comúnmente para amortiguar soluciones de las enzimas de fosfatasa porque inhiben las propiedades catal íticas de las enzimas. U n amortiguador de pH puede seleccionarse de, pero no está limitado a , Tris (hidroximetilo) aminometano (trometaprim ; base TRIZMA) , o sales del mismo, sod io y/o fosfato de potasio , ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico, ácido 3-(N-Morfolino)propanosulfónico , ácido N-2-H id roxietilpiperazina-N'-2-etanosulf ónico, Tris(hidroxi metil) aminometano, así como los fosfatos o cualquier otro amortiguador que sea fisiológicamente aceptable en el agua acabada. En una modalidad, el amortiguador de pH es Tris(hidroximetilo) aminometano (Base TRIZMA), tiene una concentración en la solución antimicrobiana de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM, y mantiene el pH en el intervalo de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 9.0. Mientras que un experto en la técnica reconocerá que cualquier concentración aceptable fisiológicamente y el valor pH está dentro del alcance de la presente invención, en otra modalidad el amortiguador es 50 M de Tris y mantiene el valor pH en aproximadamente 7.0 a aproximadamente 8.0. Un agente de reducción puede también ser utilizado. En una modalidad, el agente de reducción es seleccionado del grupo que consiste de ditiotreitol (DTT) tioglicerol, y mercaptoetanol. En una modalidad, la concentración del agente de reducción es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM. En una modalidad, el amortiguador es fosfato de sodio o borato de sodio, en pH 6.5, es de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM. En otra modalidad, el agente de quelación es ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA). Generalmente, la concentración EDTA es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. En otra modalidad, el detergente es sulfato de sodio dodecilo (SDS) o polioxietilenosorbitan monolaurato. En una modalidad, la concentración del detergente es de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 0.5 %.

Los portadores pueden también agregarse a la muestra de prueba . El término "portador" como es utilizado en la presente se refiere a cualquier solvente aceptable farmacéuticamente de químicos, agentes de quelación y amortiguadores de pH q ue permitirán q ue la composición de la presente invención sea ag regada al agua acabada. Un portador como es usado en la presente, por lo tanto, se refiere al solvente tal como, pero no se limita a, agua , sal ina, salina fisiológica, ungüentos , cremas, emulsiones de aceite-agua o cualq u ier otro solvente o combinación de solventes y de compuestos conocidos por un experto en la técnica que es aceptable farmacéuticamente y fisiológicamente en agua acabada. Los diluyentes adicionalm ente pueden agregarse. Donde un diluyente es proporcionado, los diluyentes convenientes son elegidos por ser compatibles con el analito y con los anticuerpos y/o proteínas marcadas en el ensayo sujeto. Los diluyentes son normalmente elegidos para evitar la desnaturalización u otra degradación de las proteínas o anticuerpos y proporcionar un entorno compatible y facilitar el enlace de anticuerpo/marca (epitope). Mientras que cualquier diluyente normalmente usado en inm unoensayos es conveniente (Ver, por ejemplo, Current Protocols in I mm unology Wiley/Greene, NY; Harlow and Lañe ( 1 989) ; Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, NY; Stites y colaboradores (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed . ) Lange Medical Publ icatio ns, Los Altos , Cal if . , y las referencias médicos citadas en los m ismos) , u n diluyente de la modalidad particular comprende 0. 1 M NaHCC pH 8.0. Un preservativo puede también agregarse (por ejemplo, aproximadamente de 0.01 % timerosal). En una modalidad, los diluyentes son tampones que tienen un intervalo de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9, en otra modalidad, aproximadamente de pH 7.5 a aproximadamente pH 8.5, y en otra modalidad aproximadamente de pH 8. Un experto en la técnica apreciará que el diluyente (tampón muestra) pueda incluir adicionalmente una proteína u otra fracción sin relación al analito que participa en reacciones de enlace no específicas con los varios componentes del ensayo (por ejemplo, el sustrato) y de tal modo bloquea y previene el enlace no específico de los anticuerpos. En una modalidad, el agente de bloqueo es la albúmina de suero bovino (BSA) o el alcohol de polivinilo (PVA). En una modalidad, la muestra de agua acabada es diluida en un diluyente:proporción de muestra con un intervalo de aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:20 (v/v), en otra modalidad de aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:15 (v/v) y en aún otra modalidad de aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:10 (v/v). En una modalidad, la muestra es diluida en un diluyente:proporción de muestra de aproximadamente 1:8 (v/v). En ciertas modalidades, la muestra de agua acabada no puede diluirse del todo antes de usar. En otra modalidad, el agente de bloqueo de enlace no específico es gelatina o albúmina de suero bovino. Generalmente, el agente de bloqueo del enlace no específico es gelatina. En una modalidad, la concentración de gelatina es de 0.05 % a aproximadamente 1.0 %. En otra modalidad, el agente caotrópico es tiocianato de sodio o tiocianato de amonio. En otra modalidad, el diluyente o tampón antígeno comprende el fosfato de sodio de 25 mM, pH 6.5, 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.2 % gelatina, tiocianato de amonio de 100 mM, 0.09 % azida de sodio y 0.1% SDS. Las bacterias son organismos unicelulares, pequeños que pueden crecer generalmente en medios de cultivo sólidos o líquidos. La mayoría de las bacterias no causan enfermedad en humanos, pero generalmente causan una enfermedad por invadir el tejido o producir veneno o toxinas. Las bacterias que pueden ser dañinas a humanos son, por ejemplo, Brucella sp., Escherichia coli (O157:H7), Francisella tularensis, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Yersinia pestis, Salmonella typhosa, Bacillus anthrascis, Aerobacter aerogenes, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Campylobacter fetus, C. jejuni, Corynebacterium diphtheriae, C. bovis, Cytophagia, Desulfovibrio desulfurica, Edwardsiella, enteropathogenic E. coli, Enterotoxin-producing E coli, Flavobacterium spp., Flexibacter, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, N. meningitidis, Proteus mirabilis, P. vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus equi, Salmonella choleraesuis, S. enteridis, S. typhimurium, S. typhosa, Shigella sonnet, S. dysenterae, Staphylococcus aureus, Staph, epidermidis, Streptococcus anginosus, S. mutans, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, Actinomycetes spp., Streptomyces reubrireticuli, Streptoverticillium reticulum, y Thermoactinomyces vulgarizas, así como otras conocidas en la técnica.

Bajo circunstancias especia les, algunos tipos de bacterias forman endosporas que son más resistentes al frío, calor, sequedad, químicos, y radiación que la misma bacteria. Ejemplos de tales esporas que pueden ser dañinas a los human os como una fuente de bacterias son , por ejem plo, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum , así como otras conocidas en la técnica. Los virus son el tipo más simple de microorganismo y consisten de una capa de la proteína nucleocá psida que contiene material genético, es decir, ADN o ARN . Porque los virus carecen de un sistema para su propio metabolismo, requieren de hospedadores vivos para la réplica.

La mayoría de los virus no respo nden a los antibióticos. Los virus que pueden ser dañinos a los humanos son , por ejemplo, el virus Marburg , virus Junin , virus Rift Valleuy Fever, virus varióla, virus de la encefalitis eq uina de Venezuela, virus de fiebre amarilla, virus del Dengue (DEN- 1 , DEN-2 , DEN-3 y DEN-4) , virus del Ebola , virus hemorrágico de la fiebre de Congo-Crimean, virus de Lassa, virus de Machupo, virus de Nipah , hantavirus, así como otros virus conocidos en la técnica. Rickettsiae son bacterias i ntracelulares obligadas que son intermedias en tamaño entre la mayoría de las bacterias y virus y poseen ciertas características com unes para las bacterias y los virus.

Igual q ue las bacterias , tienen enzimas metabólicas y membranas cel ulares, utilizan oxígeno, y son susceptibles a los antibióticos de amplio espectro, pero como virus , crecen solamente en célu las vivas . Aunque la mayoría de las rickettsiae pueden extenderse solamente a través de la mordedura de insectos infectados y no se expanden a través de contacto humano, la Coxiella burnetii puede infectar a través de la inhalación . Los ejemplos de rickettsiae que pueden ser dañinos a los humanos son, por ejemplo, R ickettsia prowazkeii , Coxiella burneti i , Ríckettsia rickettsii, así como otro s conocidos en la técn ica. Los hongos son organism os unicelulares y m ulticelulares que pueden ya sea ser patógenos oportunistas que causan infecciones en personas ¡mmunocomprometidas (es decir, pacientes con cáncer, receptores de trasplante, y personas con SI DA) o patógenos que causan infecciones en personas sanas. Los ejemplos de tipos de hongos que pueden ser dañinos a h uman os son, por ejemplo, Blastomyces dermatitidis, Aspergillus , Cand ida albicans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum , Cryptococcus neoformans, Mucorales, Paracoccidioides brasiliensis. Los protozoos son organismos eucarióticos unicelulares que se alimentan injiriendo materiales de partículas o macromoleculares, con frecuencia por fagocitosis. La mayoría de los protozoos son móviles por medio de flagela, cilios o movimiento amoeboide. Los ejemplos de protozoos que pueden dañar a humanos son , por ejemplo, Cryptosporidium parvum , Cyclospora cayatanensis, Giardia lamblia , Entamoeba histolytica , Toxoplasma, Microsporid ia, Trypanosoma brucei gambiense Trypanosoma brucei rhodesiense , Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodiu m ovale, Plasmodium falciparum , así como otros conocidos en la técnica. U n prión es una partícula de la prote ína q ue es capaz de causar una i nfección o u n a enfermedad . Como vi rus , los priones no son capaces de reproducirse por sí mismos, sino que a diferencia de los virus, los priones no contienen material genético (ADN o ARN) . Además, los priones tienen la cap acidad no apta de cambiar su forma y causar una cadena de reacción qu e hace que otras proteínas del mismo tipo cambien su forma también. Los priones son conocidos para hacer que un grupo de enfermedades neurológ icas devastadoras conocidas como encefalopatías espongiform es transmisibles (TSEs) , tales como, por ejemplo, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos, temblor en ovejas, o encefalitis espongiforme de bovinos en ganados domésticos, así como otras conocidas en la técnica. En un inm unoensayo, la frase "en lace específicamente a un analito" o "específicamente inmun oreactivo con" cuando se refiere a un anticuerpo, se refiere a una reacci ón de enlace que es determinativa de la presencia del analito en la presencia de una población heterogénea de moléculas tales como proteínas y otros biológicos (es decir, tal como se pueden encontrar en agua acabada). As í , bajo condiciones de inmunoensayo señaladas, los anticuerpos especificados se enlazan a un analito particular y no enlazan en una cantidad significante a otros analitos presentes en la muestra. Una variedad de formatos de inmunoensayo pueden utilizarse para seleccionar anticuerpos específicamente im munoreactivos con un analito particu lar. Por ejemplo, los inmunoensayos ELI SA de fase sólida son utilizados rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente ¡nm unoreactivos con una proteína . Harlow and Lañe ( 1 988) Antibodies , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayos que pueden utilizarse para determinar la inmunoreactividad específica. Las varias técnicas pueden utilizarse por transducción incluyendo, por ejemplo, electro-quimioluminiscencia, luminiscencia, fluorescencia, resonancia y variantes en un plasmón de superficie, citometría de flujo , electroquímica, y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con esfuerzos que emergen en otros métodos ópticos, electroforesis microcapilar y tecnologías de serie. El método de transducción con frecuencia incluye una etiqueta detectable. La etiqueta puede incluir, pero no está unida a, un cromoforo, un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un compuesto reactivo de la enzima cuyo producto de desdoblamiento es detectable, rodamina o derivado de rodamina, biotin, estreptavidina, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, derivados y/o combinaciones de estos marcadores. El proporcionar una señal con cualquier etiqueta se lleva a cabo bajo ciertas condiciones para obtener la detección óptima del elemento de reconocimiento molecular. Los ensayos, en particular ¡nmunoensayos, que utilizan fracciones de partículas como etiquetas detectables, son bien conocidos para los expertos en la técnica. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, reacciones de fluido o gel de precipitina, ensayos de aglutinación, inmunodifusión (solo o doble), inmunoelectrofóresis, ensayos inmunosorbentes, varios ensayos de fase sólida, inmunocromatografía (por ejemplo, inmunocromatografía de flujo lateral) y similares. El método de realizar tales ensayos es bien conocido por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo , Patente Norteamericana No. 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; 4.837.168; 5.405.784; 5.534.441; 5.500.187; 5.489.537; 5.413.913; 5.209.904; 5.188.968; 4.921.787; y 5.120.643; Patente Británica GB 2204398A; Patente Europea EP 0323605; Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); and Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991)). Los métodos de esta invención son practicables con esencialmente cualquier ensayo que utilice una fracción de partículas como una etiqueta detectable. El término fracción de partículas es utilizado para referirse a cualquier elemento o compuesto que es insoluble en el sistema amortiguador particular del inmunoensayo en el cuál este es utilizado o en el cuál se precipita fuera de la solución para formar una fracción detectable. Las etiquetas de partículas normalmente son detectadas (es decir, reconocidas produciendo una "señal") cuando acrecientan, aglutinan, o se precipitan fuera de la solución para formar una masa detectable (distinguible de la forma no-acrecentada, aglutinada o solubilizada de la "partícula"), y en una modalidad en una región discreta del medio de ensayo. Las micropartículas o las "etiquetas de micropartículas" son partículas o etiquetas que tienen un intervalo de tamaño de aproximadamente 0.1 nm (diámetro promedio) a aproximadamente 1000 nm, en una modalidad de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm, en otra modalidad de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, y en aún otra modalidad de aproximadamente 15 nm a aproximadamente 25 nm. En una modalidad, las etiquetas de partículas incluyen, pero no se limitan a, partículas tales como carbón vegetal , colin ita, bentonita, células de sangre roja (RBCs), oro coloidal , claro o cristal o plástico coloreado (por ejemplo poliestireno, polipropi leno, látex, etc. ) granulos o microesferas. Muchas técnicas de transd ucción implican la amplificación , por cualq uier amplificación directame nte de la seña l , tal como, por ejemplo usando una enzima . Una enzima puede utilizarse para convertir un sustrato inactivo en una señal acti va . Además , el uso de la amplificación de la enzima puede hacerse en un ensayo extremadamente sensible debido a q ue cada molécula de la enzima puede catalizar la producción de miles de productos de molécu l as. Este es generalmente el producto de moléculas que está siendo detectado, y así, la am plificación grande de la señal de salida puede proporcionarse, la cual permite extraordinariamente bajos niveles de detección para ser logrado por el agente marcado. Por las razones anteriores, las enzimas son utilizadas comúnmente como etiquetas catal íticas en la transd ucción de una señal , pero en princi pio cualquier material catal ítico puede util izarse, tal como un compuesto de coordinación inorgánica. Alternativamente, el objetivo puede amplificarse, por ejemplo, usando la cadena de reacción de la polimerasa (PCR) para el ácido n ucleico, el cual reduce la sensibi lidad exigida del ensayo a umentando la concentración eficaz del objetivo. En las técnicas de ensayo descritas en la presente, el elemento de reconocimiento molecular funciona para identificar un componente único de un agente biológico marcado y para capturarlo. El elemento de reconocimiento molecular puede i ntroducirse a u na m uestra sospechada de tener un agente biológ ico m a rcado (m uestra de prueba) usand o cualquier método conocido en la técnica . Por ejem plo, los elementos de reconocimiento moleculares pueden fijarse a una fase sólida q ue no es movible tal como, por ejemplo, los micropozos, tubos capilares, cubetas , granulos, fibras , así como otros conocidos en la técnica. En tal caso , una muestra de prueba puede introduci rse en una fase sólida q ue ha unido elementos de reconocim iento. El agente biológico marcado, si está presente, será capturado y sostenido por los elementos de reconocim iento molecular fijos en la fase sólida no movible. La transduccíón del agente capturado en una señal puede completarse mientras que los elementos de reconocim iento molecu lar todavía están fijos a la fase sól ida no movible. Tal transducción será discutida abajo.

Alternativamente, el elemento (s) de reconocimiento molecular puede unirse a la fase sólida móvil, tal como, por ejemplo, macro-, m icro-, o nanogránulos, varilla de nivel de aceite, o a otra fase sólida movible conocida en la técnica en la cual un inmunoensayo puede realizarse . Por ejem plo, por lo m enos un elemento de reconocimiento molecular unido a una fase sólida movible puede introducirse en una muestra de prueba . Alternativamente, una muestra de prueba puede introducirse en una solución que tiene por lo menos una fase sólida móvil con un elemento de reconocimiento molecu lar un ido. Si está presente, el agente biológico marcado será capturado y sosten ido por los elementos de reconocimiento molecular que están unidos a la fase sólida móvi l . U na vez que los agentes biológ icos marcados son capturados, el aspecto final del i nmunoensayo , la transducción , puede ocurri r.

Usar una fase sólida móvil pequeña, tal como microgránulos es ventajoso porque su tamaño permite que sean dispersados a través de una muestra de prueba pequeña para proporcionar un área de superficie grande para muestrear una relación de volumen que mejore la captura del agente biológico marcado reduciendo al mínimo las distancias disfunsíonales. Adicionalmente, los microgránulos pueden utilizarse en volúmenes pequeños, que reducen la dilución del producto que proporciona la señal en las etapas de transducción y detección, y por lo tanto, maximiza la sensibilidad. El componente de fase sólida móvil puede además ser magnético, tal como, por ejemplo, nano magnético o microgránulos, los cuales permiten que la fase sólida móvil sea sostenida y/o manipulada por imanes durante un ensayo. En particular, el nano magnético o microgránulos permiten el uso de un sistema de ensayo microfluídico donde todas las etapas pueden automatizarse para dar un monitoreo casi continuo. Los granulos pueden transportarse a través de los canales por el flujo de fluido, capturados, y sostenidos en puntos específicos por un imán. Un ejemplo de un microgránulo magnético que puede utilizarse es, por ejemplo, el diámetro 2.8 micrones de diámetro Streptavidin-coated M-280 Dynabeads de Dynal Biotech, Inc. en Great Neck, New York. Como se mencionó previamente, una vez que un elemento de reconocimiento molecular está unido a una fase sólida y un agente biológico marcado ha sido identificado y capturado, ya sea el agente biológico marcada, o su elemento de reconocimiento molecular asociado pueden ser manipulados de modo que una señal visible y/o una señal cuantificable esté presente. Por ejemplo, una señal puede proporcionarse por asociación del agente biológico capturado previamente con un elemento mo lecular de reconocim iento secundario que tiene una etiqueta unida, la cual puede manipu larse para emitir una señal. Una vez que el elemento de reconocimiento molecular secundario capture al agente marcado, cual quier etiqueta puede ser manipulada para emitir una señal cuantificable, o la etiqueta puede actuar para manipular un componente agregado para causar la em isión de la señal . Como se menciono previamente e n la presente , tal manipulación puede ocurrir usando, por ejemplo, una enzima. Una enzima , por ejemplo, puede unirse a un elemento de reconocimiento molecular como una etiqueta y reaccionar con un su strato de la enzima para formar un producto de la enzima que em ita una señal . Alternativamente, un sustrato de la enzima un ida a un elemento de reconocim iento molecular puede ser manipulado por una enzima para formar un producto de la enzima que emita una señal . Alternativamente, las etiq uetas de la no-enzima pueden utilizarse para proporcionar una señal , tal como, por ejemplo, puntos cuánticos, fluoroforos, etiq uetas electroqu ím icas, espín , etiquetas de metal queladas, etiquetas de liposoma, etiquetas radiactivas , así como otros conocidos en la técnica. Además , la captura de un agente marcado puede detectarse sin una etiqueta usando métodos tales como resonancia en un plasmón de superfice, microscopios de exploración , microplumas, as í como otros métodos conocidos en la técnica .

Muchas técnicas pueden ut ilizarse para detectar una señal que indique la presencia de un agente marcado. De éstos, la electroqu ímica es un método de detección eficaz cuando un elemento de reconocimiento es etiquetado con , por ejem plo, una etiqueta de metal electroactiva , un grupo orgánico e lectroactivo, o una enzima que genere un producto electroactivo. Como es usado en la presente, el producto electroactivo, la etiqueta de metal electroactiva , o grupos orgánicos electroactivos , se refieren a los productos, etiquetas de metal, o grupos orgánicos que puedan oxidarse por el retiro de electrones o por ser reducidos por la adición de electrones . La detección electroqu ímica involucra una célula electroqu ímica que consiste en por lo menos dos electrodos: un electrodo de trabaj o hecho de un material conductor, tal como platino, oro, o carbón; y un electrodo de referencia, tal como un alambre de plata recubierto con el cloruro de plata o un electrodo calomel saturado. Un tercer electrodo, un electrodo auxiliar o contraelectrodo, que está hecho de un material conductor (es decir, carbón o acero inoxidable) , puede también utilizarse. Para la detección voltamétrica, un potencial es aplicado al electrodo de trabajo con respecto al electrodo de la referencia, y el resultado corriente es medido. La corriente se eleva de la transferencia d irecta de electrones a través de la interfase de electrodo/solución hasta la oxidación o reducción de una especie electroactiva . La detección electroqu ímica puede además i nclui r el uso de la potenciometría , en la cual el potencial entre un electrodo que indica y la referencia es el electrodo q ue es med id o . As í , la se ñal ind ica el potencia l de l a célu la más q ue la corriente. En tal caso, el producto de etiqueta o enzima no necesita ser electroactivo. Cualquier método conocido en la técnica puede utilizarse para conducir una detección electroquímica. Algunas ventajas de detección electroquímica incluyen, por ejemplo, capacidad de detección en matrices de muestra complicada, instrumentación simple, límites de detección bajos, y células electroquímicas disponibles. Por ejemplo, un elemento de reconocimiento molecular secundario puede tener una etiqueta de la enzima unida. Un sustrato de la enzima puede agregarse a la muestra que contiene el agente biológico capturado y la etiqueta de la enzima. La enzima que es agregada a ya sea una solución de prueba o unida a un elemento de reconocimiento molecular secundario convertirá catalíticamente al sustrato en un producto electroactivo. A modo de ejemplo adicional, una etiqueta de la enzima de, por ejemplo, beta-galactosidasa puede unirse a un elemento de reconocimiento molecular secundario que ha capturado un agente marcado. Un sustrato de la enzima de, por ejemplo, p-aminofenilgalactosidasa (PAPG) puede entonces agregarse a la muestra que convierte el sustrato de la enzima en p-aminofenol (PAP), que puede detectarse electroquímicamente por la oxidación. Otros sistemas de etiqueta de ia enzima que son conocidos en la técnica para producir productos electroactivos pueden también utilizarse, tales como, por ejemplo, el uso de fosfatasa alcalina (ALP) como una etiqueta de la enzima que convierte aminofenilfosfato (PAPP) a PAP, que es detectable electroquímicamente. Los ejemplos de algunos sistemas de la enzima que se han utilizado para la detección electroquímica son mostrados en la tabla 1 . Alternativamente, las etiquetas electroquímicas no enzimáticas pueden utilizarse tales como, por ejem plo, las etiquetas de metal, etiquetas de ferrocen i lo, así como otras conocidas en la técnica. La detección de fluorescenci a es también una técnica comúnmente usada para determinar la presenci a de un agente marcado. La detección de fluorescencia es relativamente fácil cuando el fluoroforo tiene una lumi niscencia fuerte, es decir, cuando el rendim iento cuántico de la fluorescencia está cerca de la u n idad . En casos donde el rendimiento cuántico es relativamente bajo, l as condiciones experimentales de la longitud de onda de excitación de fluorescencia, el rendimiento de fluorescencia, el ángulo sólido de las detecciones ópticas, y la eficacia del detector, juegan todos u n papel im portante en la determinación de la eficacia total de la medición. En general , la metodología de la fluorescencia puede conducirse, por ejemplo, con una etiqueta de la enzima sim ilar a las descritas arriba para la detección electroquímica. Los métodos de detección de fl uorescencia incl uyen , pero no están limitados a, la detección directa de fluorescencia emitida por la etiqueta de la enzima, detección de la polarización de fluorescencia , detección de fluorescencia por transferencia de energ ía de resonancia , detección por q uelación de fluorescencia, as í como otras conocidas en la técnica . Por ejemplo, después de que la ca ptura inicial de un agente marcado, u n elemento de reconocimiento molecular secundario con una etiq ueta de la enzima unida pueda reconocer y capturar un agente capturado previamente. Un sustrato de la enzima puede introducirse en la muestra de agentes biológicos capturado s. La etiqueta de la enzima puede entonces alterar el sustrato en un producto de la enzima que es detectable a través de la fluoresce ncia. En tal caso, varias enzimas , tal como por ejemplo, ALP y beta-galactosidasa pueden ser un a etiqueta en un elemento de reconocimiento molecular. Para estas dos enzimas, hay m últiples sustratos fluorescentes q ue pueden utilizarse para proporcionar la fluorescencia adecuada para la detección . Por ejemplo, el difosfato de fluoresceína (FDP) reacciona con ALP y divide ambas fracciones de fosfato del FDP no fluorescente para producir el tinte de fluoresceína fluorescente, que es fácilmente excitable en la región visible en 490 nm con máxima emisión de fluorescencia en 514 nm . El rendimiento cuántico de fluorescencia de la fl uoresceína es conocido para ser pH dependiente teniendo un alto ren dimiento en niveles altos de pH que hace a FDP un sustrato de fosfatasa alcalina etiquetada deseable. Hay, sin embargo, sustratos de fosfatasa alcalina etiquetados fluorescentemente alternativos que son efectivos incluyendo, por ejemplo, 7-hidroxi-9H-( 1 , 3-d icloro-9 ,9-dimeti lacridin-2-ona)-fosfato (DDAO-fosfato) , 4-metilumbeliferi lfosfato (MU P) , 6, 8-difluoro-4-metílumbeliferilfosfato (DiFMU P) . Alternativamente, la beta-galactosidasa puede , por ejemplo , utilizarse como una etiqueta de la enzima que reacciona con varios sustratos de la enzima , por ejemplo, fluoresceína di-beta-D-piranosida (FDG) , 4-metilumbeliferil-beta-D-piranosida (M U-gal) , Resorufin beta-D-galactopiranosida (Resorufin-gal) , DDAO beta-D-galactopiranosida (DDAO-gal) , así como otros sustratos de la enzima conocidos en la técnica. Ejemplo 1. La detección y enumeración de los coliformes fecales, especialmente Escherichia coli, como indicadores de contaminación fecal, son esenciales para el control de calidad de suministros de aguas recreacionales. Hemos desarrollado un método de detección amperimétrico de pequeño volumen, sensitivo y económico para E. coli ß-galactosidasa por inmunoensayo basado en granulo. La técnica utiliza anticuerpos de captura biotin-etiquetados (Ab) inmovilizados en microgránulos paramagnéticos que han sido funcionalizados con estreptavidina (gránulo~Ab). El conjugado del gránulo~Ab captura el E. coli desde la solución. El E. coli capturado es incubado en un medio caldoso en Luria Bertani (LB) con el inductor agregado de isopropil ß-D-tiogalactopiranosida (PTG). La ß-galactosidasa inducido convierte a p-aminofenil ß-D-galactopiranosida (PAPG) en la forma reducida de p-aminofenol (PAP), que es medido por la amperimetría usando un electrodo de disco giratorio Au de 3 mm. Una buena correlación lineal (R2 = 0.989) fue obtenida entre la diagrafía cfu/ml de E-coli y el tiempo necesario para la producción de una cantidad específica de PAP. La detección Amperométrica permitió la determinación de 2x106 cfu/mL de E. coli dentro de un período de incubación de 30 minutos, y el tiempo de ensayo total fue menos de 1h. Fue también posible determinar solo 20 cfu/mL de E. coli con condiciones optimizadas dentro de 6-7 h. Este proceso puede adaptarse fácilmente como un dispositivo bioanalítico portátil automatizado para la detección rápida de E. coli.

Todos los químicos fueron de grado de reactivo y usados como se recibieron. Las soluciones acuosas fueron preparadas usando agua desionizada orgánica pura (DI) de un sistema de filtración Barnstead (Boston, MA). Los granulos paramagnéticos M280 recubiertos estreptavidina (~2.8 µm) vienen de Dynal Inc. (Great Neck, NY, USA), y fueron proporcionados como una suspensión mono-dispersa de 6.7 x 108 gránulos/mL que fue utilizada sin dilución adicional. El Ab de cabra conjugado con biotin a E. coli fue comprada de Virostat, Portland, ME. La cepa de E. coli W 3011 fue un regalo del profesor Brian Kinkle del Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, OH, USA. El p-Aminofeníl ß-D-galactopiranosida, isopropil ß-D-tiogalactopiranosida, y el p-aminofenol fueron de Sigma Chemicals. La célula electroquímica hidrofóbica fue construida como se describió previamente [7]. Brevemente, las diapositivas de cristal fueron forradas con Parafilm™ (American Can Co., Greenwich, CT, USA) sin estiramiento o tocando la superficie que se expondrá al PAPG y a los microgránulos. La diapositiva de cristal forrada fue montada en Plexiglás (3 pulg. x 5 pulg.) que también soportó los electrodos conductores Pt y conductores Ag. Tres tampones fueron utilizados, a) 0.1 M PBS, pH 7.5 (250 mL DI agua, 1.50 g, KH2PO42.44 g K2HPO4, 1.46 g NaCI; pH ajustado con 6 M HCl o 6M NaOH); b) PBST, pH 7.5 (0.1M PBS, pH 7.5 con 0.05 % v/v Tween 20); c) PBST, pH 7.3 (250 mL DI agua, 1.50 g KH2PO4, K2HPO4 2.44 g, 1.46 g NaCI, 0.25 g MgCI2; pH ajustado con 6 M HCl o 6M NaOH).

Antes de cada experimento , una colonia de E . coli, desarrollada en una placa de agar nutriente a 37 °C por 24 h , fue transferida en un medio caldoso Luria Bertani (LB) y el cultivo fue incubado a 37°C por 24 h . Después de la incubación el cultivo fue guardado a 2-4°C por 1 2 h. En todos los experimentos las célu l as almacenadas, refrigeradas fueron usadas, y cada d ía fue preparado un cultivo nuevo en LB. El Ab policlonal conjugado con biotin contra E . coli fue recubierto en la superficie de granulos paramagnéticos recubiertos con estreptavidina. En este procedimiento la concentración inicial y el tiempo de incubación de Ab, fueron investigados . La concentración de Ab fue probada entre 0.01 y 0.25 mg/mL. Las soluciones de Ab fueron preparadas de una solución mad re (5 mg/mL) y PBS . Los granulos paramagnéticos recubiertos de etreptavidina. ( 1 0 µ L) fueron mezclados con 1 0 µL de solución de Ab en u n tubo de cultivo disponible capsulado e incubado a temperatura ambiente por 30 minutos en un mezclador vórtice fijado a la velocidad m ínima. Después de la i ncubación los granulos fueron retirados magnéticamente y lavados (3 veces) con 50 µL PBS seguido por 50 µ L PBST (3 veces) y finalmente con 50 µ L PBS (3 veces) . Los granulos recubiertos con Ab fueron mezclados con 250 µ L de E. coli ( 106 cfu/ml) e incubados por 1 h a temperatura ambiente en un mezclador vórtice. Después de esto, los granulos fueron separados magnéticamente y lavados con P BS y PBST. I PTG fue mezclado con caldo de LB para preparar el medio de crecimiento. La concentración final de I PTG en LB fue 0.1 mM , y esto fue uti lizada para i nducir la actividad de la ß-galactosidasa . La incubación fue a 37°C por 1 h .

Después de la incubación el medio de crecimiento fue retirado y los granulos fueron lavados con PBS. Cinco µL de granulos fueron entonces utilizados en la medición electroquímica. El efecto del tiempo de incubación en el recubrimiento de Ab fue investigado. La solución de Ab (0.15 mg/mL) fue incubada con 10 µL de granulos paramagnéticos recubiertos de estreptavidina por entre 5 y 30 minutos. Después de la incubación, los granulos fueron retirados, lavados, expuestos en E. coli, y finalmente la actividad ß-galactosidasa en las células fue determinada usando el procedimiento dado arriba. El efecto del tiempo de incubación en capturar E. coli fue investigado con los granulos magnéticos recubiertos con Ab. Los granulos (concentración de Ab: 0.15 mg/mL y tiempo de incubación: 10 minutos) fueron incubados con E. coli (106 cfu/ml) por entre 5 y 40 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los granulos fueron retirados y lavados con PBS y PBST. Los granulos fueron incubados en la solución IPTG y la actividad ß-galactosidasa en las células fue determinada electroquímicamente. Los efectos de otros parámetros de incubación tales como concentración de IPTG y temperatura de incubación fueron también investigados. El efecto de la concentración de IPTG en LB fue probado entre 0 y 0.5 mM usando granulo capturado de E. coli. Los granulos de E. coli fueron mezclados en 30 µL de la solución LB e incubados a 37°C por 1 h. Posteriormente los granulos fueron retirados y lavados con PBS, y la actividad enzimática fue determinada electroquímicamente. El efecto de la temperatura de incubación en el crecimiento de E. coli fue también examinada a 37°C y 44°C, puesto que estas temperaturas fueron utilizadas frecuentemente para incubar E. coli. La concentración de IPTG en LB fue ajustada a 0.5 mM y los granulos capturados de E. coli fueron incubados por 1 h. El resultado de la actividad ß-galactosidasa fue determinada electroquímicamente. Utilizamos seis concentraciones de E. coli entre 2x10 cfu/mL y 2x106 cfu/mL. Una alícuota de 250 µL de la solución de E. coli fue mezclada con 10 µL de los granulos paramagnéticos recubiertos de Ab e incubados a temperatura ambiente por 20 minutos mientras que estuvieron centrifugados. Después de capturar, los granulos fueron separados magnéticamente y lavados con PBS y PBST. Entonces, 30 µL de la solución de crecimiento (preparado por la mezcla de LB con PAPG y IPTG con una concentración final de 4 mM PAPG y 0.5 mM IPTG) fueron agregados e incubados a 37°C. Para cada concentración bacteriana, por lo menos cuatro lotes de granulos de E. coli fueron preparados. Las muestras fueron apartadas en intervalos de 30-60 minutos dependiendo de la concentración de E. coli, y los granulos fueron retirados del medio de crecimiento. Finalmente, 5 µL del medio de crecimiento fueron ensayados electroquímicamente. El número de cfu/mL en cada solución fue estimado por las diluciones seriales dispersas en bandejas Petri de 9 cm de agar de MacConkey. Después de incubar a 37°C por 24 h, el número de cfus rosas fue contado. Por lo menos tres mediciones fueron hechas y el promedio fue tomado. Las mediciones electroquímicas fueron hechas con un potenciostado BAS-100B y un software electroquímico BAS-100W (Byoanalytical Systems, West Lafayette IN, USA), con un electrodo de disco giratorio de oro con un diámetro de 3mm (RDE), un conductor de electrodo Pt, y un conductor de electrodo de referencia AG. Una gota de 20 µL de 4 mM PAPG en PBS fue colocada en la superficie de la plataforma del ensayo y el RDE fue colocado en la gota sin tocar los electrodos Pt y AG. El BAS fue fijado en Single Potential Time Technique a +290 mV, el intervalo de la muestra de 100 ms y el muestreo de 70 s a 2000 rpm. Después de haber transcurrido 40 s, 5 µL de la muestra fueron agregados a la gota PAPG. El PAP generado de la consumición enzimática de PAPG fue detectado por la oxidación electroquímica. En la última parte del estudio, la hidrólisis enzimática de PAPG fue hecha durante el período de incubación. Por esa razón, 20 µL de PBS también fue utilizado con la solución PAPG en la superficie de la plataforma de ensayo. Después de 40 s, 5 µL de la muestra de PAP fueron agregados y la corriente de oxidación en el RDE fue medida sin la reacción enzimática. Los estudios iniciales para evaluar la viabilidad de usar microgránulos paramagnéticos para detectar bacterias utilizaron 30 µL de granulos y 30 µL de Ab. Ambas cantidades fueron reducidas a 10 µL para conservar los reactivos costosos sin afectar los resultados (datos no mostrados), y por lo tanto el ensayo completo para este estudio fue hecho usando 10 µL de cada uno de los granulos y Ab. La concentración óptima de Ab en la superficie de los granulos es la cantidad m ínima q ue rinde la respuesta máxima de la concentración máxima del E. coli q ue es probad a. Para esta determinación expusimos un número fijo de g ranulos a las concentraciones de Ab entre 0.01 y 0.25 mg/mL, seguidos por la incubación con E. coli . Los resultados fueron dados en la figura I (a) , donde el inicio del plato muestra que la concentración óptima de Ab com o definido es 0. 1 5 mg/mL. Elegimos utilizar 0. 1 5 mg/mL para minim izar los efectos de la variabilidad causados por estar tan cerca del i nicio. Como parte del proceso de optimización del ensayo, el tiempo necesario para los granulos y el Ab para formar el conjugado de gránulo~Ab fue estudiado con tiempos de incubación entre 0 minutos y 30. minutos . Las señales de corrie nte generadas más allá de 1 0 minutos fueron esencialmente constantes , y así la (figura l(b)) fue usada 1 0 minutos como tiempo óptimo de la incubación para formar el conjugado de g ránulos~Ab. El tiempo involucrado en capturar E. col i con el conjugado de gránulo~Ab también fue estudiado con resultados como se muestran en la figura 2. El tiempo m ínimo de enlazar E. coli fue determinado tratando a los gránulos-Ab con 250 µ L L en una solución de E. coli en LB con tiempos de captura desde 5 a 40 minutos. Se esperaba que el grado de interacción incrementara con el tiempo y entonces alcanzará la saturación una vez que todos los sitios de enlace de AB estuvieran ocupados. La señal corriente en la detección amperimétrica incremento con el tiem po de captura incrementada hasta 20 m inutos, indicando que los sitios disponibles de Ab casi fueron saturados . Mientras la corriente cambio únicamente por + 15 % de 40 min a 20 min, el tiempo de captura de E. coli fue utilizado en el desarrollo posterior del ensayo. Diferentes concentraciones de IPTG fueron utilizadas para inducir ß-galactosidasa, que fue ensayado para determinar la óptima concentración de IPTG (figura 3(a)). Las concentraciones de IPTG en el caldo LB entre 0 a 0.5 mM fueron utilizadas. En 0.5 mM de IPTG la señal fue estabilizada, y esta concentración fue utilizada para la inducción. El efecto de la temperatura de incubación fue investigado a 37°C y 44°C (figura 3(b)). La pendiente de la señal más alta fue de 37°C, y esto fue utilizado como la temperatura de incubación bacteriana para el estudio completo. Comenzamos incubando una cultivo de célula de E. coli de 106 cfu/mL con 0.5 mM de IPTG en el caldo de LB. La producción de ß-galactosidasa fue medida electroquímicamente siguiendo la actividad enzimática usando PAPG como sustrato. Las muestras de las bacterias, diluidas apropiadamente, fueron colocadas en células electroquímicas. La figura 4 (a) muestra un ejemplo de la respuesta amperimétrica de los cultivos de E. coli de concentración alta (106 cfu/mL) y baja (103 cfu/mL) así como el espacio del medio de crecimiento. El cambio de la corriente se relaciona con la actividad enzimática, que se relaciona directamente con la concentración de E. coli en las soluciones de la muestra. La realización del inmunoensayo microbiano fue evaluada generando una curva de calibración. La corriente de señal medida amperimétricamente por RDE fue trazada contra la concentración de PAP para conseguir la curva de calibración mostrada en la figura 4(b).

Una relación lineal entre la concentración de PAP y de la corriente fue obtenida (n = 6; pendiente: 139 µA (mmol)"1 PAP; intercepción: 0.0026 µ A; R2: 0.999). El límite de detección de este inmunoensayo fue calculado de la figura 4 (b) usando la relación [32]: DL = k S ?Jw donde DL es la corriente DL (nA) en el límite de detección, k es un factor de confianza, usualmente 3 para el 95 % de límite de confianza, Sbk es la desviación estándar de las mediciones de espacio (únicamente el medio de crecimiento) y m es la pendiente de la curva de calibración. El límite de detección fue 1.0 x 10"5 mM PAP, que es mejor que el de un tipo similar de ensayo [33]. Los resultados obtenidos para E. coli son mostrados en la figura 5 (a). Las concentraciones bacterianas de 2x106 a 20 cfu/mL fueron utilizadas. En la región plana inicial, las señales muy bajas fueron observadas (es decir, <0.34 nA que fue tres veces la desviación estándar del espacio). Así, el número y la actividad enzimática de las bacterias fueron insuficientes para producir una concentración de PAP igual o mayor que el límite de detección. Cuando las bacterias alcanzaron una concentración crítica, una señal mayor o igual a 0.34 nA fue obtenida, la cual entonces aumentó rápidamente. El tiempo requerido para obtener una señal de 0.34 nA es reportado como el tiempo de detección [33]. Un diagrama semi logarítmico del tiempo de detección contra la concentración inicial de E. coli tiene una buena correlación lineal con un valor R2 de 0.989 (figura 5(b), e indica que E.coli en 2x106 cfu/mL podría determ inarse con un período de in cubación de 30 m inutos. Debajo de 20 cfu/mL, es necesario incubar la muestra por aproximadamente 7 horas para recibir una señal sensible. Ejem plo 2. Un sistema de ensayo rápid o y conveniente fue desarrollado para detectar Escherichia col i viables en ag ua . Las bacterias marcadas fueron recuperadas de la solución por la separación inmunomagnética e incubadas en el caldo de soya tríptico (TSB) con isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (I PTG) , la cu al induce ß-galactosidasa. La lisozima fue utilizada para lisar las célu las de E. coli y para liberar la ß-galactosidasa. La ß-galactosidasa convirtió el 4-meti lumbeliferil-ß-D-galactosida (MUG) a 4-metil umbel iferona (4-MU), la cual fue medida por el espectrofotómetro de fluorescencia usando la excitación y em isión de las longitudes de onda de 355 y 460 nm , respectivamente. Las actividades de las enzimas liberadas fueron calculadas usando el gráfico de calibración de las intensidades de fluorescencia 4-M U , y una buena correlación lineal (R2 = 0.99) fue obtenida entre la diagrafía cfu m L" 1 y la diagrafía de la actividad de ß-galactosidasa. La detección y enumeración de E . coli fue mostrada con un intervalo de detección de 4X1 01 a 4x1 06 al cfu mL" 1 y un tiempo de incubación de 1 20 minutos. El inm unoensayo desarrollado no requirió de enriquecimiento o filtración y necesito únicamente de un anticuerpo , que hace al ensayo menos costoso. La detección directa de cél ulas viables puede hacerse por el método, ya q ue fue basado en la actividad intrínseca de la enzima en E . coli . Los granulos paramagnéticos M280 recubiertos con estreptavidina de ~2.8 µm en diámetro, fue de Dynal Inc. (Great Neck, NY, USA) como una suspensión mono dispersa de 6J x 108 granulos fueron ml"1. El anticuerpo de la cabra conjugado con biotin en E. coli fue de Virostat, Portland, ME. E. coli K12 la estepa fue de Refik Saydam National Type Culture Collections, Ankara, Turkey. Sorbitol MacConkey agar (SMAC).

El agar de Sorbitol MacConkey (SMAC) y el tríptico caldoso de soja (TSB) fue de Merck KGaA (Alemania).4-metilumbeliferil-ß-D-galactosida (MUG), 4-metilumbeliferona (4- U), dimetilsulfoxido, isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG) fueron de Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO). Na2HPO y KH2PO4 fueron de J.T. Baker (Netherlands), usado como tampón de fosfato salino (PBS). Las medidas de fluorescencia fueron hechas usando un Cary Eclipse Fluorescente Spectrophotometer (Varian Inc., Netherlands) usando la excitación y emisión de las longitudes de onda de 355 y 460 nm, respectivamente, y una célula micro cuarzo (50 µL). La temperatura fue controlada por el software de Cary Eclipse y un sistema de Peltier. Los granulos paramagnéticos recubiertos con estreptavidina (10 µL, 6.7 x 108 granulos mi"1) fueron agregados a un tubo que contiene anticuerpos conjugados con biotin (Ab) (10 µL, 0.15 mg m1"1), y el tubo fue centrifugado (Stuart, UK) a temperatura ambiente por 10 minutos [8 ]. Los granulos recubiertos con Ab fueron retirados magnéticamente de ia solución y lavados 3 veces por resuspensión de ellos en PBS (pH 7.5, 0.1 M). Los granulos fueron entonces mezclados con E. coli (2-4x103 cfu m1"1) e incubados a temperatura ambiente en el mezclador del vórtice por varias horas desde 0-60 minutos para determinar el efecto del tiempo de reacción en capturar E. coli. Similarmente, los efectos en capturar la concentración de PBS y pH, y el volumen de reacción fueron examinados. Los complejos del granulo E. coli fueron manipulados magnéticamente. Una muestra de la solución 100 µL que contiene E. coli, y 100 µL de la solución sobrenadante no capturada de E. coli fue plateada en SMAC e incubada a 37°por 24 h. Las colonias de E. coli fueron contadas para determinar el porcentaje del E. coli capturado. El resto del sobrenadante fue retirado y los granulos fueron lavados 3 veces con PBST (pH 7.5, 0.1 M, 0.05 % (v/v) Tween 20). IPTG (40 µL, 0.5 mM), disuelto en TSB, fue mezclado con E. coli capturado para inducir la actividad de la ß-galactosidasa, e incubado a 37°C por 2 h [8].

La lisozima (10 µL, de 0-20 mg mL'1) fue agregada para capturar E. coli (106 cfu mL"1) para lisar las células para liberar ß-galactosidasa, e incubando a 37°C por 0-45 minutos. La medición fue hecha en 50 µL de volumen final, que consiste de 20 µL PBS (0.1 M, 1 mg mL"1 MgCI2), una solución de 10 µL de MUG y la muestra de 20 µL. La solución MUG fue preparada con el tampón dimetiIsulfoxido-PBS y utilizado como el sustrato para la ß-galactosidasa. Las actividades de las enzimas liberadas fueron calculadas usando gráficos de calibración de las intensidades de fluorescencia 4-MU los cuales fueron derivados por el mismo pH y temperatura. La solución de E. coli (106 cfu mL"1), en la cual la actividad de la ß-galactosidasa ha sido inducida con IPTG (0.5 mM), fue incubada con la lisozima (5 mg mL"1) a 37°C por 30 minutos. Esta solución fue utilizada como solución madre de la enzima. La medición fue hecha en 50 µL volumen final de 20 PBS (0.1 M, 1 mg mL"1 MgCI2), 10 µL de solución MUG y 20 µL de solución de la enzima. El efecto de la temperatura en la actividad enzimática fue investigado entre 22 y 67° C, (en pH 7.3 y 0.5 mM de MUG) y el efecto de pH fue investigado entre 6.5 y 7.7 a 37°C y 0.5 mM de MUG. El efecto de la concentración de MUG en la actividad enzimática fue investigado similarmente, a 37°C y pH 7.3 mientras que varia la concentración de MUG en el medio de reacción entre 0.05 a 2 mM. La actividad de la enzima fue calculada usando gráficos de calibración de intensidades de fluorescencia 4-MU las cuales fueron derivadas por diferentes pH y temperaturas. Las E. coli (101 cfu mL'1 y 106 cfu mL"1) fueron capturadas por granulos magnéticos y usadas después de la inducción de la actividad de la ß-galactosidasa. La muestra (20 µL) fue agregada a una célula micro cuarzo que contiene 20 µL PBS (pH 7.3, 0.1 M, 1 mg mL"1 MgCI2) y 10 µL MUG (1 mM) a 50°C. La cuenta de la célula bacteriana fue detectada midiendo la pendiente del incremento en la intensidad de 4-MU, el producto de la reacción enzimática. El número de cfu mi"1 en cada solución fue estimada plateando en SMAC, incubando a 37°C por 24 h, y contando el número de colonias. El promedio fue tomado por lo menos de tres mediciones. El efecto del tiempo de reacción de 10-60 minutos en capturar E. coli (250 µL 3.0 x 103 cfu mL"1) por anticuerpos de granulos paramagnéticos recubiertos a temperatura ambiente y pH 7.5, 0.1 M PBS. El porcentaje de bacterias capturadas aumentó con el incremento del tiempo de reacción hasta 30 minutos, alcanzó aproximadamente 60 % y fueron aplastados. El efecto de pH de PBS (0. 1 M) en las bacterias de captura (250 µ L, 3.0 x 1 03 cfu m L" 1 ) a temperatura ambiente por 30 m inutos es mostrado en la figura 2. Una eficacia máxima (aproximadamente 60 %) de bacterias de captura fue observada en pH 7.5. El efecto de la concentració n PBS en capturar E. coli (250 µ L, 3.5 x 1 03 cfu mL" 1 ) a temperatura ambiente y pH 7.5 por 30 minutos fue determinado (fig ura no mostrada) . Una eficacia máxima (aproximadamente de 60 %) de bacterias de captura fue observada en la concentración de 0.1 M PBS. Uno de los factores más importantes que afectan la interacción del anticuerpo-antígeno son los enlaces ¡ónicos [9 ]. Así, los cambios en el pH o fuerzas iónicas del medio de reacción pueden afectar fácilmente el enlace del antígeno al anticuerpo. El efecto del volumen de ¡nmunoreacción en bacterias capturadas fue examinado de 50 a 500 µ L (figura no mostrada) . Las mismas cantidades de bacterias (7.5 x 1 02 cfu) y gran ulos magnéticos recubiertos de anticuerpos (gran ulos 6.7 x 1 08) fueron utilizados en diferentes volúmenes y la captura fue realizada a temperatura ambiente y pH 7.5 en 0. 1 M PBS por 30 m inutos. Cuando el volumen de reacción alcanzó 250 µL, el número de bacterias capturadas fue de u n máximo y después disminuyó con el incremento de volumen . Se esperaba que en la segunda parte de este gráfico el incremento del volu men de la inmunoreacción reduzca la densidad de granulos y bacterias; como un resultado, la probabilidad de interacción entre los granulos y las bacterias sería di smi nuida y este ca m bio afectó la captura efi ciente. Por otra parte, la primera parte del gráfico m uestra una tendencia inesperada . Disminuye el volumen de la inm u noreacción , el cual aumentó la concentración de granulo y bacteria , dism inuyendo dramáticamente la captura eficiente (la captura eficiente en 50 µL y 250 µL fue de 30 y 58 % , respectivamente). Estos datos fueron confirmados midiendo la actividad enzimática en las célu las capturadas y fue obtenido un cambio similar (los datos no mostrados) . U n aumento en la densidad del granulo puede causar impedimento estérico en la inmunoreacción y este impedimento afectaría la eficiencia negativamente. La cantidad máxima de enzima li berada fue encontrada en 5 mg m L" 1 de concentración de lisozima. Arriba de esta concentración, la cantidad de enzima l iberada dismi nuyó hasta 21 % con el aumento de la concentración de lisozima . El efecto del tiempo de reacción en liberar la enzima fue determ inado (figura no mostrada). La cantidad de enzima liberada aumentó con el incremento de tiempo de incubación hasta 30 m inutos. Supervisamos la actividad a varias temperaturas desde 22 a 67° C para determ inar la tem peratura óptima por la actividad de la ß-galactosidasa (figura no mostrada) . La actividad máxima de la enzima fue observada a 53°C . La actividad enzimática óptima fue observada a pH 7.25 El efecto de la concentración del sustrato en la actividad ß-galactosidasa fue examinada en presencia de varias concentraciones de M UG (fig ura no mostrada) . La actividad enzimática primero aumentó con el incremento de la concentración de MUG hasta 1.0 mM, y entonces disminuyó con el aumento de la concentración de sustrato debido a la inhibición del sustrato de la ß-galactosidasa [10]. Los parámetros optimizados del ensayo desarrollado fueron aplicados para detectar E. coli. El sistema fue utilizado con las soluciones madre que contienen concentraciones de E. coli entre 4 x 101 y 4 x 106 cfu mL'1. Una buena correlación lineal (R2 = 0.99) fue obtenida entre la diagrafía de E. coli cfu mL"1 y la actividad de la diagrafía ß-galactosidasa. El intervalo de trabajo fue 4x101 4x106 al cfu ml/1 con un tiempo de la incubación de 120 minutos. La medición total del tiempo del análisis, el cual incluye la captura de bacteria (30 minutos), la incubación con IPTG (120 minutos), el lisis de las células (30 minutos) y medición y fluorescencia y otros (20 minutos), fue menos de 200 minutos. Usando tres horas de ruido, el límite de detección del método propuesto es de 40 cfu mi"1 y si este valor es multiplicado con la eficiencia de captura y el volumen de la muestra, se obtiene el número de bacterias capturadas en los granulos. Este es 6 cfu, que fue capturado por los granulos y podrían detectarse por el método. Si el período de incubación es incrementado no tendría el efecto de reducir el límite de detección, ya que el número de bacterias en el medio de reacción es limitado. Es posible incrementar el número de bacterias capturadas incrementando el volumen de la muestra. Sin embargo, si el volumen de la muestra aumenta, entonces la cantidad de los granulos recubiertos con anticuerpos debe ser incrementada. De otra manera, debido a la reducción de la densidad del granulo en el volumen de captura, la eficiencia de la captura disminuirá y este cambio afecta negativamente la realización de la medición. Incrementado el número de granulos también aumentará el costo de medición. Si la concentración de E. coli en la muestra es más alta de 103 el cfu mL"1, una incubación de 60 minutos con 120 minutos de tiempo de análisis global será suficiente para detectar E. coli. El sistema de análisis es adaptable a un sistema fluido automatizado, que será investigado en estudios adicionales. Referencias [1] B. Swaminathan, P. Feng, Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria, Ann. Rev. of Microbiol.48 (1994) 401-406. [2]D.L. Archer, J.E. Kvenberg, Incidence and cost of foodborne diarrheal disease in United States, J. of Food Protect 48 (1985) 887-894. [3]T.E. Ford, Microbiological safety of drínking water: United States and global perspectives, Envirop. Health Perspect. 107 (1999) 191-206. [4] W.R. MacKenzie, NJ. Hoxie, M.E. Proctor, M.S. Gradus, KA. Blair, D.E. Peterson, JJ. Addiss, K.R. Fox, J.B. Rose, J.P. Davis, A massive outbreak in Milwaukee of Cryptosporidium infection transmitted through the public water supply, N. Eng. J. Med.331 (1994) 161-167. [5]Centers for Disease Control and Prevention, Morb. Mortal. Wkly. Rep.

Outbreak of Escherichia coli O157:H7 and Campylobacter among attendees of the Washington Country Fair-New York 48 (1999) 803-805. [6]W. Kondro, E. coli outbreak deaths spark judicial inquiry in Canadá, Lancet 355 (2000) 2058. [7]J.H. Thomas, NJ. Ronkainen-Matsuno, S. Farrell, H.B. Halsall, W.R.

Heineman, Microdrop analysis of a bead-based immunoassay, Microchemical J.74 (2003) 267-276. [8] S. F. Altekruse, MX. Cohén, D.L. Sherdlow, Emerging foodborne disease, Emerg. Infec. Dis.3 (1997) 285-293. [9]P.M. Griffín, R.V. Tauxe, The epidemiology of infections caused by Escherichia coli 0157:H7, other enterohemorrhagic E. coli, and the associated hemolytic uremic syndrome, Tauxe, Epidemiol. Rev. 13 (1991) 60-98. [10] D.L. Jones, Potential health risks associated with the persistence of Escherichia coli 0157 in agricultural environments, Soil Use and Management 15 (1999) 76-83. [11] JG.A. Willshaw, J. Thirlwell, A.P. Jones, S. Parry, R.L. Salmón, M.

Hickey, Vero cytotoxin-producing Escherichia coli 0157 in beefburgers linked to an outbreak of diarrhea, haemorrhagic colitis and haemolytic uraemic syndrome in Britain, Lett. Appl. Microbiol. 19 (1994) 304-307. [12] JE.W. Rice, MJ. Alien, DJ. Brender, S.C. Edberg, Assay for beta-glucuronidase in species of the genus Escherichia and its applications for drinking-water analysis, Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 592-593. [13] American Public Health Association, Standard methods for the examination of water and wastewater, edición 19th, American Public Health Association, Washington DC, (1995) Partes 921 IB, 9211C, 9221B and 9222. [14] AJ. Madonna, S.V. Cuyk, KJ. Voorhees, Detection of Escherichia coli using immunomagnetic separation and bacteriophage amplification coupled with matrix láser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 17 (2003) 257-263. [15] K. Geissler, M. Manafi, I. Amoros, J.L. Alonso, Quantitative determination of total coliforms and Escherichia coli in marine waters with chromogenic and fluorogenic media, J. Appl. Microbiol. 88 (2000) 280-285. [16] M. Hattenberger, F. Mascher, K. Kalcher, E. Marth, Improved method for the fluorimetric detection of ß-D-galactosidase ¡n water, Int. J. Hyg. Environ. Health.203 (2001) 281-287. [17]G.R. Campbell, J. Prosser, A. Glover, K. Killham, Detection of Escherichia coli O157:H7 in soil and water using multiplex PCR, J. Appl.

Microbiol.91 (2001) 1004-1010. [18] W. Sun, F. Khosravi, H. Albrechtsen, L.Y. Brovko, M.W. Griffiths, Comparison of ATP and in vivo bioluminescence for assessing the efficiency of immunomagnetic sorbents for live Escherichia coli O157:H7 cells, J. Appl. Microbiol.92 (2002) 1021-1027. [19]A.M. Prescott, CR. Fricker, Use of PNA oligonucleotides for the in situ detection of Escherichia coli in water, Mol. Cell. Probes 13 (1999) 261-268. [20] T. Hurt, R.D. Craven, K.G. Harvey, P. Zhang, E. Price, N.C. Fawcett, J.A. Evans, Detection of E. coli O157:H7 with a quartz crystal biosensor and asymmetric PCR, Presented at INABIS'98 - 5th Internet World Congress on Biomedical Sciences at McMaster University, Canadá, (1998) Dic.7-16th. [21] H. Stender, AJ. Broomer, K. Oliveira, H. Perry-O'Keefe, JJ. Hyldig-Nielsen, A. Sage, J. Coull, Rapid detection, identification, and enumeration of Escherichia coli cells in municipal water by chemiluminescent in situ hybridization, Appl. Environ. Microbiol. 67 (2001) 142-147. [22] W.C. Yam, MX. Lung, M.H. Ng, Evaluation and optimization of a látex agglutination assay for detection of cholera toxin and Escherichia coli heat- labile toxin, J. Clin. MicrobioL 30 (1992) 2518-2520. [23] P. Arbault, V. Buecher, S. Poumerol, M.L. Sorin, Study of ELISA method for detection of E. coli 0157 in food, Progress in Biotechnol. 17 (2000) 359-368. [24] H.Yu, J.G. Bruno, Iramunoniagnetic-electrochemiluminescent detection of Escherichia coli 0157 and Salmonella typhimurium in foods and environmental water samples, Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996) 587-592. [25] J.A. Ho, H. Hsiu-Wen, Procedures for preparíng Escherichia coli O157:H7 immunoliposome and its application in liposome immunoassay, Anal. Chem.75 (2003) 4330-4334. [26] P. Bouvrette, J.H.T. Luong, Development of a flow injection analysis (FIA) immunosensor for the detection of Escherichia coli, Int. J. Food Microbiol.27 (1995) 129-137. [27] C. Rúan, H. Wang, Y. Li, A bienzyme electrochemical biosensor coupled with immunomagnetic separation for rapid detection of Escherichia coli O157:H7 in food samples, Transactions of the ASAE, 45 (2002) 249-255. [28] T. Neufeld, A. Schwartz-Mittelmann, D. Biran, E.Z. Ron, J. Rishpon, Combined phage typing and amperometric detection of released enzymatic activity for the specific identification and quantification of bacteria, Anal. Chem.75 (2003) 580-585. [29] C.A. Wijayawardhana, H.B. Halsall, W.R. Heineman, Micro volume rotating disk electrode (RDE) amperometric detection for a bead-based immunoassay, Anal. Chim. Acta 399 (1999) 3-11. [30] CA. Wijayawardhana, G. Wittstock, H.B. Halsall, W.R. Heineman, Electrochemícal immunoassay with microscopic immunomagnetic bead domains and scanning electrochemical microscopy, Electroanalysis 12 (2000) 640-644. [31] S. Purushothama, S. Kradtap, CA. Wijayawardhana, H.B. Halsall, W.R.Heineman, Small volume bead assay for ovalbumin with electrochemical detection, Analyst 126 (2001) 337-341. [32] J.D. Jr. Ingle, S.R. Crouch, Spectrochemical Analysis, Prentice Hall, 1988, p 173. [33]F. Pérez, I. Tryland, M. Mascini, L. Fiksdal, Rapid detection of Escherichia coli in water by a culture-based amperometric method, Anal. Chim. Acta 427 (2001) 149-154. [34] A.S. Mittelmann, E.Z. Ron, J. Rishpon, Amperometric quantification of total coliforms and specific detection of Escherichia coli, Anal. Chem. 74 (2002) 903-907

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1 . Método para medir la presencia de un microorganismo vivo de interés en una muestra , que co mprende las etapas de: a. capturar el m icroorganismo de interés con una cantidad apropiada de fracción marcada capaz de enlazar específicamente al microorganismo marcado de interé s; b. incubar el microo rganismo con un sustrato para una enzima presente en el microorga nismo por un tiempo suficiente para permitir la producción de una ca ntidad detectable de producto por la enzima en microorganismos vivos presentes; c. detectar el producto ; y d. correlacionar la ca ntidad de producto con un estándar conocido y de tal modo determinar la presencia de m icroorganismos vivos .

2. Método de conformidad con la reivindicación 1 , q ue además comprende la etapa de obtener u na m uestra que es probada de una fuente donde se sospecha de contaminación.

3. Método de conformidad con la reivindicación 1 , que además comprende la etapa de incubar el microorganismo por un tiempo suficiente para permitir el crecim iento de los microorganismos vivos presentes.

4. Método de conform idad con la reivindicación 1 , en donde la muestra es utilizada para supervisar el nivel de contam inación biológica en ag ua potable.

5. Método de conformida d con la reivindicación 1 , que además comprende la etapa de incubar el microorganismo con un reactivo inductor.

6. Método de conformida d con la reivindicación 5, en donde el reactivo inductor incluye un compuesto inductor q ue induce la actividad de una enzima única al microorgan ismo de interés.

7. Método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el inductor es isopropiltiogalactopiran osida (I PTG) .

8. Método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el inductor es seleccionado del grupo que consiste de 1 -O-metil-beta-D-glucuronida, ácido isopropil-beta-D-tioglucuronico, isopropil-beta-D-tiogalactopiranosída, 3-O-metil-alfa-D-glucopiranosida y 1 -O-metil-beta-D-glucopiranosida.

9. Método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el sustrato comprende un reactivo ind icador. 1 0. Método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el reactivo indicador incluye un com puesto indicador que experimenta un cambio detectable por métodos es pectrofotométricos o visuales durante la división por una enzima beta galactosidasa encontrada en coliformes o una enzima única beta glucuronidasa en E. col i . 1 1 . Método de conformidad con la reivindicación 1 , que además comprende la etapa de incubar la muestra de la prueba y la muestra de control a aproximadamente 35° C, por aproximadamente 24 h o menos. 1 2. Método de conform idad con la reivindicación 1 , que además comprende la etapa de l isa r las membranas celulares del mircroorganismo para liberar la enzima a la cual está dirig ido el sustrato. 1 3. Kit para determinar e indicar rápida y exactamente la presencia o ausencia de microorg anismos viables en una muestra que comprende: a. un primer reactivo q ue contiene un granulo paramag nético recubierto con un agente paratróp ico específico por el microorganismo marcado y capaz de formar un com plejo con el m icroorganismo marcado; b. un segundo reactivo separado del primer reactivo que contiene un sustrato conveniente para el m icroorganismo que es detectado; y c. un tercer reactivo separado del primer y seg undo reactivos q ue contiene un estándar para el producto producido por el sustrato. 14. Kit de conformidad con la reivindicación 1 3, en donde el sustrato es capaz de producir un producto detectable por la enzima de interés en los m icroorganismos vivos. 1 5. Kit de conformidad con la reivindicación 1 3, que además comprende un reactivo inductor para la enzima de interés en el microorgan ismo . RESUM EN La presente invención se refiere a métodos para la detección de microorganismos. En una modalid ad , la presente invención proporciona métodos para detectar microorgan i smos vivos en un cultivo capturando y cultivando los microorganismos en granulos paramagnéticos recubiertos paratrópicos. Esta técnica es útil para cualquier aplicación en la cual sea necesario supervisar el nivel de contaminación biológica, por ejemplo ag ua potable, aguas recreacionales, aguas de procesam iento de alimentos y laboratorios médicos . En una modalidad, el método para determinar la concentración de microorganismos viables en una m uestra de acuerdo a la invención además comprende un reactivo i nductor, en donde el reactivo inductor incluye un compuesto inductor que induce la actividad de una enzima única al m icroorganismo de interés.