KR20150093544A - 양자점 층을 포함한 비드 입자를 포함하는 복합체 및 이를 이용한 심근경색 관련 질환의 진단 방법 - Google Patents

양자점 층을 포함한 비드 입자를 포함하는 복합체 및 이를 이용한 심근경색 관련 질환의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

양자점 층을 포함한 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체, 이를 포함하는 표적 물질 검출용 또는 심근경색 질환 진단용 조성물, 및 이를 이용한 심근경색 관련 질환을 진단하는 방법이 제공된다.

Description

양자점 층을 포함한 비드 입자를 포함하는 복합체 및 이를 이용한 심근경색 관련 질환의 진단 방법 {Complex comprising bead including quantum dot-layer and method for diagnosing myocardial infarction-related disease using the same}
양자점 층을 포함하는 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체, 이를 포함하는 표적 단백질 분석용 조성물, 이를 이용한 심근경색 관련 질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 심근경색 관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
현재 급성 심근경색은 가슴의 통증, 심전도 검사, 혈액검사를 통한 호르몬 (CK-MB, 미오글로빈(Myoglobin), 심장성 트로포닌(Cardiac Troponin))의 농도 변화 관찰로 진단하고 있으며, 확진은 심혈관 조영술을 통해야 가능한 수준이다. 환자들은 대부분 심근경색 발병 후에 병원에 내진하게 되므로, 그 진단비용이나 치료비용이 매우 높다. 심장성 트로포닌은 급성 심근경색 진단의 골드 스탠다드(gold standard)임에도 불구하고 그 특이성이 80% 미만이고, 심장발작이 있은 후에 혈중에 방출되기 때문에 조기진단의 어려움이 있다. 따라서 실제로는 급성 심근경색이더라도 음성으로 나올 가능성도 꽤 높아, 아직까지는 심전도 검사, MRI 및 X-ray등의 물리적 진단검사를 주로 시행하고 있는 실정이다. 또한 일단 급성 심근경색이 발병하면 그 예후가 치명적이므로, 조기 진단의 중요성이 점점 더 높아지고 있다. 이에 따라 펩티드성 진단 마커의 발굴이 가속화되었는데, 그 중 심혈관 질환과 관련성이 잘 알려진 마커는 NT-proBNP (N-terminal proBNP)이다. 급성 심근 경색증 환자에게서도 시간이 경과함에 따라 증가하는 것으로 알려져 있지만, 혈장의 NT-proBNP 농도는 만성 심부전증 (congestive heart failure, CHF)의 마커로 더 많이 알려져 있다. NT-ProBNP 또한, Troponin 처럼 심장세포의 사멸로 인해 혈중으로 방출되므로, 조기진단에 활용하기 어렵다. 가슴통증, 심전도, 심혈관 조영술은 조기 진단에는 적합하지 않아, 조기진단용 혈중 바이오 마커를 발굴하고, 더욱 높은 특이도 및 민감도를 갖는 급성 심근경색 진단 검사법 및 심근경색 관련 질환 진단법의 발굴이 필요한 상황이다.
일 양상은 양자점 층을 포함한 비드 입자, 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체를 포함하는 표적 물질 분석용 조성물, 표적 물질 면역 분석용 키트, 및 심근경색 관련 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 이용하여 심근경색 관련 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체를 제공한다.
상기 비드 입자는 양자점 층을 포함하는 구형 형상의 입자로, 예를 들면 상기 양자점 층은 비드 입자의 내부에 위치할 수 있다. 용어 "양자점(Quantum Dot)"은 독특한 광학적 및 전자적 성질을 지닌 0차원 구조의 나노미터 크기의 입자를 의미할 수 있으며, 예를 들면 나노미터 크기의 반도체 결정체를 포함할 수 있다. 상기 양자점은 중심체, 상기 중심체를 둘러싸고 있는 셀부 및 상기 셀부를 코팅하고 있는 고분자 코팅층의 구조로 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 양자점의 구체적인 종류는 특별히 제한되는 것은 아니고, 생체 이미징에 사용 가능하도록 생체 적합성을 가지고 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 양자점의 중심체를 구성하는 성분은 예를 들면 CdSe(카드뮴-세슘), CdTe(카드뮴-텔루라이드), CdS(황화 카드뮴), ZnSe(아연-세슘), ZnO(산화 아연) 또는 ZnS(황화 아연) 등이 사용될 수 있다. 상기 성분들은 일반적인 형광물질보다 훨씬 강한 형광을 좁은 파장대에서 발생하는 특징을 가질 수 있다. 용어 "양자점 층"은 다수개의 양자점들이 서로 전기력, 자기력, 화학 결합, 또는 외부 또는 내부의 힘에 의해 시트 또는 막 형태를 형성한 것을 의미한다. 이때 완전한 막을 형성하는 경우뿐만 아니라, 동심구 상에 위치하되 완전한 막을 형성하지 못하고 존재하는 경우도 포함할 수 있다.
상기 비드 입자는, 비드 입자의 표면에 가까운 내부의 동심구 상에 방사상으로 정전기적 인력에 의해 결합되어 있는 양자점들을 포함하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 양자점들 각각이 상기 비드 입자의 중심으로부터 같은 거리에 방사상으로 위치하여 단일 층으로 이루어진 구 껍질(sphere shell) 형상을 이루면서 상기 비드 입자 내부에 도핑될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 양자점들의 단일 층은 유기물 폴리머 사용을 배제한 상태에서 정전기적 인력에 의한 양자점의 도핑을 통해 양자점의 산화반응이 없는 균일한 밀도의 도핑층을 제공한다. 상기 양자점들이 동심구 형태의 단일 층으로 존재하므로, 자체 소광 현상이 최소화되고, 상기 비드 입자의 동공 (cavity)과의 공명 현상에 의해 증폭된 형광을 방출할 수 있다.
상기 동심구는 상기 비드 입자의 중심으로부터 표면에 이르는 거리(반지름; R)의 0.5배 이상 1배 미만, 0.7배 이상 1배 미만, 0.9배 이상 1배 미만의 반지름(r)을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면 비드 입자의 표면에 가까운 내부일 수 있다. 상기 동심구가 상기 반지름(R)의 0.5배 미만의 반지름(r)을 갖는다면, 상기 양자점 층이 상기 비드 입자 내부의 너무 깊숙한 곳에 형성되므로 상기 비드 입자 외부로 방출되는 형광이 너무 약해지기 때문이다. 상기 반지름(R)의 1배 미만은 상기 양자점들이 비드 입자의 외부에 노출되지 않음을 의미한다. 따라서 상기 양자점 들이 비드 입자의 내부에 위치함에 따라 상기 비드 입자는 기공체층을 형성할 수 있다(도 2 참조). 상기 기공체 층은 비드 입자의 내부와 동종 물질일 수 있으며, 이종 물질일 수 있다. 상기 양자점들이 상기 기공체 층에 의해 감싸져 상기 비드 입자의 내부에 가두어짐으로써, 상기 기공체층 없이 상기 양자점들이 단독으로 있을 때보다 광 안정성 및 내구성이 향상됨과 동시에, 상기 양자점들과 상기 기공체층의 동공 간의 공명 짝지움 (resonance coupling) 현상에 의해 발광 세기가 더욱 증폭된다.
상기 비드 입자의 직경은 예를 들면, 10 내지 1000nm, 50 내지 500nm, 또는 100 내지 300nm인 것일 수 있다. 비드 입자의 직경이 10nm 이하일 경우, 양자점들이 균일하게 구 형상의 단일층을 형성하기 어렵고, 1000nm 이상일 경우 비드 입자의 합성이 어렵다. 비드 입자의 직경이 100 내지 300nm 일 때 양자점들의 적절한 발광 특성을 나타낸다. 상기 비드는 실리카, 티타니아, 지르코니아 및 지올라이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하여 이루어질 수 있으며, 예를 들면 실리카로 이루어질 수 있다. 또한 굴절률이 높은 무기 물질로 이루어진 비드 입자라면 특별한 제한을 두지 않는다.
상기 복합체에 있어서 상기 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제는 상기 비드 입자와 결합하며, 예를 들면 비드 입자의 표면에 결합할 수 있다. 용어 "표적 물질"은 본 발명의 복합체가 검출, 탐지 또는 분석 등을 목적으로 하는 단백질, 핵산, 펩티드, 세포, 세포 내 소기관 또는 기타 생리활성물질일 수 있다. 용어 "표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제"는 표적 물질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있으며, 또한 표적 물질 자체 또는 이의 단편일 수 있다. 용어 "단편"은 표적 물질의 일부를 의미하는 것으로, 물리적, 효소 또는 화학적으로 절단한 것을 포함한다., 예를 들면 단백질의 경우, 프로테이즈로 절단한 것이나, 화학적으로 절단한 것을 모두 포함한다. 용어 "표적 물질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합"은 본 발명의 복합체에 포함되는 제제가 표적 물질 또는 표적물질의 단편에 선택적으로 결합하고, 표적 물질 이외의 다른 물질에는 실질적으로 결합하지 않음을 의미한다. 용어 "표적 물질에 특이적으로 결합하는 물질"은 표적 물질에 특이적으로 결합하는 단백질, 핵산, 펩티드 또는 이들의 유도체일 수 있으며, 예를 들면 표적 물질에 특이적인 항체, 또는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함하는 펩티드일 수 있다. 용어 "항체"란 당해 기술 분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린이다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 및 재조합 항체 모두를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미할 수 있다. 또한, 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다. 용어 "특이적인 결합 도메인을 갖는 부분 펩티드"란 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위, 즉 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 부분 펩티드는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체가 아닌 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다. 상기 펩티드는 최소한 7개 이상의 아미노산, 예를 들면 9 개 이상의 아미노산, 또는 예를 들면 12개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제는 비드 입자의 표면에 공유결합, 수소결합, 이온결합, 또는 반데르발스 결합 등의 화학적 결합에 의해 결합할 수 있으며, 예를 들면 공유결합에 의해 결합할 수 있다. 상기 공유결합은 아미드 결합, 이황화결합, 인산화결합, 옥심 형성 또는 에스테르 결합일 수 있으며, 예를 들면 아미드 결합일 수 있다.
상기 비드 입자와 상기 제제를 결합시키기 위해 상기 비드 입자의 표면이 반응성기를 함유하거나, 반응성기가 도입될 수 있도록 비드 입자의 표면을 활성화시킬 수 있다. 용어 "비드 입자 표면의 활성화"란 비드 입자의 표면에 다른 물질을 결합할 수 있도록 공유결합을 비롯한 화학 결합을 형성할 수 있는 반응성 작용기를 도입하는 것을 의미하며, '표면 개질'을 포함한다. 용어 "표면 개질"이란 개질 대상이 되는 물질의 기본적 물성에 변화를 주지 않으면서 다른 물질과의 결합을 용이하게 위해 표면을 변형 또는 변경시키는 것을 의미한다. 상기 비드 입자의 표면을 활성화시킴에 따라 비드입자의 표면은 반응성 작용기 예를 들면, 하이드록실기, 카르복실기, 티올기, 설폰기 또는 아미노기를 포함할 수 있다. 일 구체예로는 실리카로 이루어진 비드 입자의 표면에 아미노기를 가질 수 있다(도 2 참조).
상기 비드 입자는 상기 제제와 직접적인 공유 결합에 의해 결합하거나, 적절한 링커를 매개로 한 공유결합에 의해 결합할 수 있다. 용어 "링커"는 비드 입자와 표적 물질에 특이적으로 결합하는 제제를 연결시켜 주는 물질을 의미하는 것으로, 반응성 작용기를 포함하는 화합물, 당, 펩티드 또는 핵산일 수 있다. 일 구체예로 글루타랄데히드가 링커의 역할을 수행할 수 있다.
상기 표적 물질은 예를 들면 P 물질 (Substance P, Sub P) 또는 신경펩티드 Y (Neuropeptide Y, NpY)일 수 있다. 용어 "P 물질 (Substance P, Sub P)"은 포유류의 타키키닌인 신경펩티드를 나타낸다. 또한, 그 단백질 서열은 서열번호 1을 포함할 수 있다. 용어 "신경펩티드 Y (Neuropeptide Y, NpY)"는 중추신경계에 광범위하게 분포되어 있는 펩티드를 나타낸다. 그 단백질 서열은 서열번호 2를 포함할 수 있다. 일 구체예로 본 발명의 복합체는 상기 P 물질 또는 상기 신경 펩티드 Y 또는 이의 단편을 포함하거나, 또는 이들에 특이적으로 결합하는 항체, 핵산, 펩티드 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있으며, 이들은 비드 입자의 표면에 결합되어 있을 수 있다.
펩티드 서열 정보 서열번호
P 물질 RPKPQQFFGLM 서열번호 1
신경펩티드 Y YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY 서열번호 2
다른 양상은 양자점 층을 포함하는 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체를 포함하는 표적 물질 분석용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 포함되는 복합체에 대해서는 상기한 바와 같다. 용어 "표적 물질 분석"은 표적 물질을 검출, 탐지, 정량 등의 표적 물질에 대한 연구를 수행하는 데 필요한 모든 행위를 포함한다. 상기 조성물은 표적 물질을 검출, 정량 등의 분석을 수행하는데 필요한 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 필요한 물질은 항체 또는 항원 결합 단편, 세포 염색 시약, 버퍼 등일 수 있다.
다른 양상은 양자점 층을 포함하는 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체를 포함하는 표적 물질 면역분석용 키트를 제공한다.
상기 표적 물질 면역분석용 키트에 포함되는 복합체에 대해서는 상기한 바와 같다. 용어 "면역 분석용 키트"란 표적 물질을 검출, 탐지, 정량등의 분석을 면역학적 방법, 즉 표적 물질에 대한 항체를 이용하여 특이적인 결합능을 이용하여 표적물질을 분석할 수 있는 도구를 의미한다. 상기 키트는, 예를 들면 복합체에 포함되는 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제로, 표적물질 또는 표적물질의 항체에 특이적인 항체를 이용할 수 있다. 상기 키트는 추가적으로 표적 물질의 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 상기 일 양상에 따른 키트는 예를 들면, 표적물질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 복합체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 또는 2차 항체가 결합된 복합체를 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있다.
상기 표적 물질 분석용 조성물 및 상기 표적 물질 면역 분석용 키트는 검출 수단으로 양자점을 사용하는 것을 특징으로 하기 때문에 양자점으로부터의 형광 이미지를 통해 표적 물질의 존재 확인, 정량 분석 및 분리 등을 더욱 우수하게 수행할 수 있으며, 특히 민감도가 높아 소량의 표적 물질의 분석에 탁월하다.
다른 양상은 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 표적 물질에 특이적으로 결합하는 제제를 포함하고, 상기 표적 물질이 P 물질 또는 신경펩티드 Y인 복합체를 포함하는 심근경색 관련 질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 심근경색 질환 진단용 조성물에 포함되는 양자점 층을 포함하는 비드 입자에 대해서는 상기한 바와 같다. 용어 "심근경색 관련 질환"이란 심장혈관이 급성 또는 만성으로 협착이 일어나서 심장 근육의 조직이나 세포가 괴사하거나 심장으로의 혈류공급이 감소하여 심장근육에 이상이 생겨 통증을 일으키는 모든 질환을 의미하는 것으로, 예를 들면 심근경색, 안정성 협심증, 불안정성 협심증을 포함한다. 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에 있어서 급성 심근경색, 안정협심증, 협심증 등을 포함하는 심근경색 질환 여부를 확인하는 것이다. 상기 P 물질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 신경펩티드 Y는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 심근경색 관련 질환 조성물은 복합체에 P 물질 또는 신경펩티드 Y 단백질에 특이적인 항체, 또는 P 물질 또는 신경펩티드 Y 단백질 자체, 또는 이들의 단편을 포함함으로써 심근경색 관련 질환을 진단할 수 있다. 본 발명의 심근 경색 관련 질환 진단용 조성물은 양자점 층을 포함하는 복합체를 사용함으로써 현재 시판되고 있는 상업적 키트의 정량한계를 극복하고 더욱 민감도를 가지고 있어, 심근경색 관련 질환의 경우 혈액 내에 미량으로 존재하는 마커, 예를 들면 P물질의 정확하고 민감한 검출 및 수준 측정이 가능하여 심근 경색 관련 질환을 진단하는데 더욱 바람직하다.
다른 양상은 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 표적물질에 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 복합체의 제조방법을 제공한다.
먼저 상기 복합체의 제조방법을 설명하면 다음과 같다. 먼저, 양자점 층을 포함하는 비드 입자의 표면을 활성화시키는 단계를 포함할 수 있다. 용어 "활성화"는 상기한 바와 같다. 상기 활성화를 위해, 화학물질의 사용, 플라즈마의 처리, 이온화 처리 등의 당업계에 공지되어 있는 통상의 방법을 사용할 수 있다. 활성화 이후 최종적으로 아미노기, 카르복시기, 또는 하이드록시기 등의 반응성 작용기가 비드 입자의 표면에 도입될 수 있다. 일 구체예에서 실리카로 구성된 비드 입자에 실란 커플링제를 사용하여 활성화시켜 표면에 아미노기를 도입하였다. 도입된 반응성 작용기는 상기 제제와 비드입자를 결합시키기 위해 사용된다.
다음으로, 상기 활성화된 비드 입자의 표면과 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 링커를 통해 공유 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 링커는 적어도 비드 입자와 상기 제제를 연결하는 일반적인 구조를 의미한다. 상기 링커는 예를 들면 공유적으로 연결하는 구조일 수 있으며, 예를 들면 아미드 결합일 수 있다. 상기 링커는 교차연결 제제일 수 있으며, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 알데히드, 이소시아네이트, 말레이미드, 글루타르알데히드를 포함할 수 있다. 일구체예에서 글루타랄데하이드를 링커로 사용하여 아미드 결합에 의해 상기 제제와 상기 비드를 연결할 수 있다.
다른 양상은 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 표적 물질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하고, 표적 물질이 P 물질 (Substance P, Sub P) 또는 신경펩티드 Y (Neuropeptide Y, NpY)인 복합체를 이용하는 심근경색 관련 질환의 진단방법을 제공한다.
상기 심근경색 관련 질환의 진단방법을 설명하면 다음과 같다. 먼저, 상기 심근 경색 질환의 진단방법은 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석할 수 있는 제제, 예를 들면 표적물질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하고, 상기 표적 물질이 P 물질 (Substance P, Sub P) 또는 신경펩티드 Y (Neuropeptide Y, NpY)인, 복합체를 이용하여 환자의 시료 중에서 P 물질 또는 신경펩티드 Y의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 표적 물질이 P 물질 또는 신경펩티드 Y인 복합체에 대해서는 상기한 바와 같다. 용어 "환자"는 급성 심근 경색이 의심되는 개체를 의미하고, 급성 심근 경색에 의하여 P 물질 또는 신경 펩티드 Y의 발현이 변화하는 임의의 개체를 포함한다. 용어 "시료"는 상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질을 나타내는 것으로, 개체로부터 유래된 혈액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 일 양상의 "단백질의 발현 수준 측정"은 급성 심근 경색 여부를 진단하기 위하여 시료에서 P 물질 또는 신경펩티드 Y 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 단백질의 발현 수준 측정은, 예를 들면, 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS , 단백질 칩(protein chip) 또는 이들의 조합에 의하여 수행될 수 있다. 다만 상기 방법 또는 장치에 있어서, 형광 특성을 나타내기 위해서는 통상적으로 사용하는 물질 대신 본 발명의 복합체를 사용한다. 예를 들면 ELISA의 경우, 효소를 이용한 형광신호 대신 본 발명의 복합체를 사용하여 복합체로부터의 형광신호를 이용하여 단백질의 발현 수준을 측정한다.
상기 단백질 발현 수준 측정은 예를 들면, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)법에 의할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다(도 1). 즉, 상기에서 언급한 바와 같이, 단백질 발현 수준 측정 방법은 종래 ELISA 방법에 의해 수행될 수 있으나, 효소에 의한 형광신호 대신 본 발명의 복합체로부터 유래된 형광신호의 분석에 의해 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 것이다.
예를 들면, 샌드위치 ELISA 방법을 이용하는 경우, 일차항체로서의 P 물질 또는 신경펩티드 Y 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; 정상인 개체와 급성 심근 경색이 의심되는 개체의 혈액 시료를 상기 항체에 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도시키는 단계; 상기 항원-항체 반응 유도 단계의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 상기 효소의 활성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다(도 1(다)). 상기 고체 기질로 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 겔이 이용될 수 있으며, 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 단백질 발현수준 측정이 직접적 ELISA 방법에 의하는 경우, 일차항체로서의 SubP 또는 NpY 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; 정상인 개체와 급성 심근 경색이 의심되는 개체의 혈액 시료를 일정한 양의 표지화 (효소, 형광유기물질 또는 나노형광무기물질이 결합된 펩타이드 스탠다드)된 표준물질과 경쟁적으로 상기 항체에 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도시키는 단계; 상기 항원-항체 반응 유도 단계의 결과물을 자외선 리더기 (microplate reader) 또는 형광 리더기 (fluorescence reader)로 측정하여, 농도를 직접적으로 (direct)검출하는 단계를 포함할 수 있다 (도 1 (나)).
또한 상기 단백질 발현수준 측정은 예를 들면, 상기 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 샘플에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동을 하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로오즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 상기 단백질의 양을 확인하여, 심근경색 관련 질환을 확인할 수 있다.
다음으로, 상기 심근경색 관련 질환 진단 방법은 상기 측정된 단백질의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기의 비교는 정상 대조군에서의 상기 단백질의 발현양과 환자의 시료에서의 상기 단백질의 발현양을 조사하는 방법으로 이루어질 수 있고, 단백질 수준은 상기한 마커의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한 상기 심근경색 관련 질환의 진단 방법은 상기 환자의 시료에서 정상 대조군보다 P 물질 또는 신경펩티드 Y 단백질의 발현 수준이 높을 경우 심근경색 관련 질환으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 P 물질의 발현 수준이 제1 소정의 값 이상 및 신경펩티드 Y의 발현 수준이 제2 소정의 값 이상인 경우 급성심근경색으로 판단할 수 있다. 상기 방법은 P 물질의 발현 수준이 제1 소정의 값 이상 또는 신경펩티드 Y의 발현 수준이 제3 소정의 값 이상인 경우 급성심근경색, 안정협심증, 또는 협심증으로 판단할 수 있다. 상기 방법은 P 물질의 발현이 제1 소정의 값 미만 및 신경펩티드 Y의 발현수준의 양이 제3 소정의 값 미만인 경우 급성 심근경색, 불안정협심증, 안정협심증, 또는 협심증이 아닌 것으로 판단할 수 있다. 상기 제1 소정의 값은 3594 ± 1 pg/ml 이고, 상기 제2 소정의 값은 59 ± 0.85 pg/ml이며, 상기 제3 소정의 값은 40 ± 0.85 pg/ml일 수 있다. 일 실시예에서 본 발명의 복합체를 이용하여 정상인과 급성심근경색을 가진 환자의 P 물질 및 신경펩티드 Y의 혈중 농도를 비교 분석하였을 때, 그 결과는 정상인에 비해 유의미하게 높았다(P<0.0001).
일 양상에 따른 양자점 층을 포함한 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하는 제제를 포함하는 복합체, 이를 포함한 조성물에 의하면 표적 물질에 대한 검출, 또는 분석에 있어서, 빠르고 정확도가 높은 분석 결과를 제공할 수 있다.
또한 일 양상에 따른 심근경색 관련 질환 조성물, 및 급성 심근 경색 진단 방법에 의하면, 심혈관 질환이 의심되는 환자로부터 급성 심근경색을 비롯한 심근경색 관련 질환의 진단에 높은 특이도 및 민감도를 가져 조기진단, 및 질환의 판단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 표적 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 이용한 ELISA 어세이 방법을 나타낸 개략도를 나타낸 도면이다. (가)는 경쟁적(competitive) ELISA Assay, (나)는 직접적(direct) ELISA Assay, (다)는 샌드위치(sandwich) ELISA Assay, 및 (라)는 응용된(applied) 경쟁적 ELISA Assay 방법을 나타낸다.
도 2는 양자점 층이 내부에 포함된 실도 1은 표적 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 이용한 ELISA 어세이 방법을 나타낸 개략도를 나타낸 도면이다. (가)는 경쟁적(competitive) ELISA Assay, (나)는 직접적(direct) ELISA Assay, (다)는 샌드위치(sandwich) ELISA Assay, 및 (라)는 응용된(applied) 경쟁적 ELISA Assay 방법을 나타낸다.
도 2는 양자점 층이 내부에 포함된 실리카 비드 입자의 표면에, 프로필아민을 모디피케이션시켜, 활성화(기능화)된 SQS-NH2 의 구조를 보여준다.
도 3은 NH2로 활성화된 비드 입자에 P 물질의 항체를 결합시키는 방법에 관한 모식도이다.
도 4는 양자점 층을 포함한 비드입자에 결합한 항체의 양을 단백질 정량법(Bradford Assay)으로 정량 분석한 결과를 나타낸다. SQS-NH2 100 nmole/L에 결합한 항체의 양이 약 210 nmole/L로 한 개의 SQS-NH2에 2개의 항체가 결합된 것을 확인 할 수 있었다.
도 5은 양자점을 포함한 실리카 비드 입자(SQS)에 P 물질에 대한 항체를 결합하여, 직접적 ELISA Assay를 한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 100 nm SQS-NH2, 및 (b)는 300 nm SQS-NH2 에 대한 것이다. LOD는 1 pg/ml이며, 다이내믹 레인지(dynamic range)는 (a): 1-300 pg/ml, (b): 1-10000 pg/ml이다.
도 6a, 6b는 100, 300 nm의 SQS에 P 물질의 항체를 붙여서 경쟁적 ELISA Assay를 한 결과의 정량곡선이다. 직선성은 0.957, 0.999로 매우 우수하였다. 도 6c는 6b 상기 정량 곡선을 log scale로 변경한 그래프이다.
도 7의 경우, 상업적인 키트를 사용하여, 신경펩티드 Y의 혈중농도를 분석한 결과이다.
도 8의 경우, 상업적인 키트를 사용하여, 물질 P의 혈중농도를 분석한 결과이다.
도 9의 경우, SQS를 사용하여, 물질 P의 혈중농도를 분석한 결과이다.
도 10의 경우, 상업적인 키트로 분석한 물질 P의 결과와 SQS를 사용한 키트로 분석한 결과를 비교한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 양자점 층을 포함하는 비드입자 및 항체 또는 P 물질 또는 신경펩티드 Y의 단편을 포함하는 복합체의 제조
1.1 양자점 층을 포함하는 실리카 비드 입자의 제조 및 활성화
내부에 양자점층을 포함하는 실리카 비드 입자를 하기에 기재된 방법에 의해 준비하였다(이하, 본 명세서의 실시예 및 도면에서 양자점 층을 포함하는 실리카 비드 입자를 'SQS'(quantum dot-layered silica sphere)라 칭한다).
구체적으로 먼저, 표면이 옥타데실아민 (ODA)으로 보호되어 있는 코아/쉘 구조의 CdSe/CdS-ODA 양자점 용액 (2×10-5M) 5 ㎖를 취하여 진공에 연결시켜 헥산 용매를 제거한 후 클로로폼 10 ㎖에 분산시키고, 0.05 M의 메캅토프로피온산 (MPA)과 0.06 M의 수산화나트륨을 함께 녹인 메탄올 용액을 과량 가하고 30분간 세게 교반하였다. 이 용액에 증류수를 2 내지 3 mL 추가하니 양자점이 물층으로 올라왔고, 물층을 분리하여 메탄올과 에틸아세테이트를 가하고 원심 분리해서 양자점을 회수했다. 이 양자점을 물에 분산하고 묽은 수산화나트륨 용액을 사용하여 용액의 pH를 10 근처로 조절해서 양자점 표면의 카복시산이 ―CO2-상태인 폴리음이온성 단분산 양자점 CdSe/CdS(―SCH2CH2CO2 -)ex 수용액 100 mL (1× 10-6M)를 제조하였다. 다음으로 폴리사이언스사로부터 구입한 실리카 비드 용액 (DLS size 1.0± 0.05 ㎛, 10 wt%) 5 mL를 취하여 원심 분리한 후에 메탄올 20 mL에 분산하였다. 여기에, 아미노프로필트리메톡시실란을 0.025 mL 가하고 10시간 동안 환류하였다. 이 용액을 냉각한 후, 원심 분리를 이용해서 메탄올로 3-4회 수세하였다. 최종적으로 에탄올 10 mL에 분산하고 묽은 염산을 몇 방울 가하여 용액의 pH를 4 근처로 조절해서 실리카 비드 표면의 아민이 ―NH3+ 상태인 폴리양이온성 단분산 실리카 비드 용액을 제조하였다. 제조항 폴리야이온성 실리카 비드 용액을 제조한 폴리음이온성 양자점 용액에 천천히 가하면서 균일하게 혼합되도록 흔들어 주었다. 침전이 형성되는 시점에서 멈추고, 이 용액을 1분간 vortex 처리한 후 원심 분리하였다. 여액에서는 형광이 검출되지 않아서 폐기하였고, 침전물은 400 mL 에탄올에 분산하여 표면에 양자점 층이 도핑된 실리카 비드 용액을 제조하였다. 제조한 표면에 양자점 층이 도핑된 실리카 비드 용액에 12ml의 증류수와 4ml의 진한 암모니아 용액을 넣고 저어주었다.이어서, 테트라에톡시실란 (TEOS) 2 mL를 넣고 3 시간 동안 저어주었고, 이 과정을 두 번 더 반복하여, 총 6 mL의 테트라에톡시실란을 표면에 양자점 층이 도핑된 실리카 비드 위에 실리카 층으로 성장시킴으로써, 표면에 가까운 내부에 양자점 층이 도핑된 실리카 비드를 제조하였다. 이 용액을 원심 분리하고 침전물을 에탄올로 수세한 후, 다시 원심 분리하여 에탄올 20 mL에 분산하여 최종적으로 SQS를 제조하였다.
SQS를 활성화시키기 위해, 상기의 SQS 용액 2 mL를 취하여 20 mL로 묽히고 0.4 mL의 진한 암모니아수를 넣고 저어주었다. 이어서 아미노프로필트리메톡시실란을 0.93 mL를 가하고 20°C에서 14시간 동안 저어주었다. 원심분리를 이용하여 에탄올로 2회 수세하고 최종적으로 에탄올 10 mL에 분산 농도하였다. 이 때 내포된 양자점의 농도는 1 mM이 되게 하였다.
1.2 링커를 통한 항체와 SQS 의 결합
NH2가 활성화된 SQS와 항체의 아민기를 연결시켜주는 cross-linker로 글루타랄데하이드 (glutaraldehyde)를 이용하여, 표적 펩티드(P 물질 또는 신경펩티드 Y의 단편)(100 nM, monoclonal, biorbyt) 또는 항체(50 nM, monoclonal, PHOENIX PHARMACEUTICALS, INC.)를 연결하였다. 글루타랄데하이드(2.5%)가 용해된 탄산염 버퍼(50 mM, pH 9.6)에 에탄올에서 분리한 100 nm 및 300nm의 SQS-NH2(내포된 양자점 농도 25 nM) 각각을 용해시켜 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 원심분리(10000g, 15 분, 4°C)를 통해 결합하지 않은 글루타랄데하이드를 제거하였다.
하기 표 2는 100 nm의 SQS-NH2와 항체가 결합된 복합체를 Zeta PAL (Brookhaven Instrument Co., USA)을 사용하여 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 항체의 크기가 약 15 - 20 nm이므로, 1:2 또는 1:4의 결합비율 모두 2개 이상의 항체가 결합된 것으로 판단된다.
결합 비율(coupling ratio) (SQS:Ab) SQS only 1:2 1:4
평균 직경(mean diameter) (nm) 167.8 ± 26.5 211.4 ± 27 243.1 ± 18.5
상대분산(relative variance) 1.107 1.315 0.659
하기 표 3은 300 nm의 SQS-NH2 와 항체가 결합된 복합체의 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 1:1 또는 1:2의 결합비율 모두 2개 이상의 항체가 결합된 것으로 보인다.
결합비율(coupling ratio) (SQS:Ab) SQS only 1:1 1:2
평균 직경(mean diameter) (nm) 207 ± 25 219.7 ± 27 236.3 ± 18.5
상대분산(relative variance) 1.107 1.315 0.659
실시예 2. 복합체를 이용한 혈액 시료에 대한 면역학적 어세이
2.1 시료의 준비 및 어세이 방법
혈액 시료 중 P 물질 또는 신경펩티드 Y의 농도를 측정하기 위해 상업적인 키트(PHOENIX PHARMACEUTICALS, INC.) 및 실시예 1에서 제조한 SQS-항체 복합체를 이용하여 샌드위치 ELISA 어세이에 의해 실험을 진행하였다.
상업적인 키트를 이용한 샌드위치 ELISA 어세이 실험은 총 세 개 그룹의 시료에 대해 수행하였다. 구체적으로 심근경색 및 불안정 협심증 (40명), 안정 협심증 (40명), 정상인 대조군 (80명)의 혈청 시료를 준비하였다.
SQS-항체 복합체를 이용한 샌드위치 ELISA 어세이 실험은 총 4 개 그룹에 대해 수행하였으며, 정상인(29명), 급성 심근경색 환자(30명), 불안정 협심증 환자(28명), 협심증 환자(30명)의 혈청 시료를 테스트하였다.
고려대 의대로부터 얻은 정상인의 혈액 시료 및 심혈관질환 환자의 혈액 시료 500 ㎕를 10 % 포름산 버퍼로 2배 희석한 다음, Oasis HLB 1cc (30mg) Extraction Cartridges Solid phase Extraction Kit로 펩티드를 추출하였다 (Waters, Ireland). 다른 한편으로는 30 kDa Molecular cut-off filter (Millipore, USA)를 사용하여, 혈청 및 플라즈마 내의 내인성 펩티드를 단백질로부터 분리하여 추출하였다. 상기 추출된 펩티드가 포함된 용액은 N2 Evaporator, Freeze-Dryer를 사용하여 말린 후, 면역학적 분석을 위해서는 50 ㎕의 어세이 버퍼(각 ELISA kit회사에서 제공하는)에 용해하여 분석하거나, 또는 25 ㎕의 혈청 및 플라즈마를 PBS 버퍼에 2배 희석하여 직접 분석하였고, LC-MS/MS 분석을 위하여서는 100 ㎕의 50 % 메탄올 중 0.2 % 포름산에 용해하여 분석하였다.
2.2 상업적 키트를 이용한 신경펩티드 Y ( Neuropeptide Y, NpY )의 농도 측정
조정곡선을 그리기 위한 표준용액은 1000 ng/㎖ 스톡을 1x 어세이 버퍼로 단계 희석하여, 그 농도는 각각 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/㎖ 로 조정하였으며, 비교군으로 양성 대조군 50 ㎕를 준비하였다. 이차 항체가 코팅된 마이크로 플레이트의 각 웰에 대조군과 표준용액은 2 중(duplicate)으로, 2배 희석시킨 샘플은 3 중(triplet)으로 분주하였다. 뒤이어 토끼에 인공 신경펩티드 Y를 주입하여 수득한 일차 항체 (토끼 항-펩티드 IgG) (PHOENIX PHARMACEUTICALS, INC.) 25 ㎕와 비오틴화된 펩티드 25 ㎕를 분주한 후, 실온에서 300-400 rpm 속도 하에 2시간 인큐베이션시켰다. 이후 세척 버퍼로 네 번 세척 후, 스트렙타비딘-호스래디쉬 페록시다아제 (Streptavidin-horseradish peroxidase) 100 ㎕를 분주하여 한 시간 동안 실온에서 교반 (300-400 rpm) 하였다. 이후, 상기 세척과 동일하게 세척 버퍼로 네 번 세척한 다음, TMB 기질 용액 100 ㎕를 분주하여 한 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 마지막으로 정지액 (2N HCl) 100 ㎕로 반응을 종료시킨 후, 450 nm의 파장에서 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 O.D.값을 측정하였다.
2.3 상업적 키트를 이용한 P 물질 ( Substance P, SubP )의 농도 측정
ELISA 실험을 위해 R&D system의 상업적 키트을 이용하였고, 경쟁적 결합 (competitive binding) 원리에 근거한 ELISA 어세이로 실험을 진행하였다. 교정 곡선 (Calibration curve)을 그리기 위한 표준 용액(Standard solution)은 50 ng/ml의 P 물질 표준 용액 50㎕를 1㎖ Calibrator Diluent RD5-45에 희석시킨 후, 300㎕를 1㎖ Calibrator Diluent RD5-45에 단계 희석(serial dilution)하여 2500, 1250, 625, 312, 156, 78, 39, 0 pg/㎖ 농도를 준비하였다. 비교군으로 213-540, 517-982, 1224-2217 pg/㎖의 대조군(control)과 zero standard well을 설정했으며, 표준 용액과 대조군, zero standard well은 모두 이중반복(duplicate)으로 실험하였다. 혈청 시료는 두 배 희석시켜 삼중반복(triplet)으로 실험하였다. 키트에 포함되어있는 goat anti-mouse polyclonal antibody가 코팅된 ELISA 마이크로플레이트에 표준 및 대조군 용액, 희석된 혈청시료 50㎕를 분주 후, 각 웰에 일차 항체 용액 (물질 P 에 대한mouse monoclonal antibody) 50㎕, Substance P Conjugated HRP 50㎕를 순서대로 분주 후 접착 스트립(adhesive strip)으로 덮은 뒤, 마이크로플레이트 교반기(microplate shaker)에서 500 ± 50 rpm의 속도로 3시간 인큐베이션(incubation)시켰다. 이후 세척 버퍼를 이용해 각 웰을 4번 세척 후, Substrate Solution(TMB) 200㎕ 분주 후 30분 인큐베이션시켰다. 마지막으로 Stop Solution (2N sulfuric acid) 50㎕ 분주 후 푸른색의 용액이 노란색으로 변화되는 것을 확인한 후 450 nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)기를 이용하여 O.D.값을 측정하였다.
2.4 SQS -항체 복합체를 이용한 P 물질의 농도 측정
파랄린 A가 코팅된 96웰 마이크로플레이트에 10% 글루타랄데하이드가 용해된 에탄올로 파랄린 A를 활성화시킨 후, P 물질을 2시간 동안 인큐베이션시켜 코팅시킨 뒤, BSA로 블로킹 시킨 마이크로플레이트를 제작했다. SQS와 P 물질 항체를 결합시킨 분자가 용해된 PBS와 PBS에 희석시킨 환자 혈청 샘플을 인큐베이션시켜 혈청에 존재하는 P 물질 또는 스탠다드 P 물질이 SQS-P 물질의 항체에 결합하도록 반응시켰다. 원심 분리하여 SQS-P 물질 항체와 SQS-P 물질 항체와 P물질의 결합체를 분리한 후 미리 제작한 마이크로플레이트 웰에 함께 넣어 3시간 동안 인큐베이션 시켰다. 혈청 내의 P 물질의 농도가 높으면 SQS-P 물질 결합체의 항체가 이미 P 물질과 포화로 결합하여, 플레이트의 P 물질에 결합하지 않게 되기 때문에, 혈중 농도가 높을수록 ELISA 어세이의 형광 세기는 낮은 결과로 도출된다.
이후, Tween이 0.1 % 첨가된 PBS로 가볍게 세척한 후, 멀티라벨 플레이트 리더기로 여기(excitation) 486 nm, 방출(emission) 630 nm의 파장에서 형광을 측정하였다. 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.
복합체를 이용한 면역학적 어세이의 정량성 및 재현성이 매우 높은 것으로 나타났다. 100 nm SQS를 사용하였을 때, 하기 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 정확도가 120 %, 정밀도가 10 % 미만으로 그 정량성, 재현성이 매우 높고, dynamic range도 다른 상업적인 면역학적 어세이법에 비해 넓었다 (~105).
Intraday assay Interday assay
Parameter 정확도
(Accuracy) (%)		 정밀도
(Reproducibility) (%)		 정확도
(Accuracy) (%)		 정밀도
(Reproducibility) (%)
QC conc.
(0.1 ng/ml)		 120 ± 86 9.9 ± 4.2 100 ± 11.7 10.1 ± 5.7
실시예 3. P 물질 및 신경펩티드 Y를 이용한 심근경색 관련 환자의 진단
3.1 상업적인 키트를 이용한 시료에서의 신경펩티드 Y 단백질의 농도 분석
먼저 상업적인 키트를 이용하여 상기의 ELISA 방법을 통해 정상인과 심혈관 환자의 혈액 시료로부터 P 물질 및 신경펩티드 Y의 농도를 분석하였다.
도 7 a, b, c, d는 정상인과 심혈관 질환 환자의 혈액 시료로부터 신경펩티드 Y의 농도를 비교한 도면이다. 도 7의 a는 신경 펩티드 Y에 대한 급성 심근경색 (Acute Myocardial Infarction, AMI)환자와 정상인을 비교한 경우이며, *P value < 0.0001, Cut-off value > 40 pg/ml이다. b는 정상인과 심혈관 질환 환자 (불안정 협심증(Unstable Angina, UA), 안정 협심증(Stable Angina, SA), 급성 심근 경색)를 비교한 경우이며 *P value < 0.0001, Cut-off value > 59 pg/ml이다. c는 AMI와 nonAMI를 d는 각각의 질환(AMI, UA, SA)을 비교한 것이다.
이 결과를 바탕으로 Receiver operating characteristic(ROC) 곡선을 계산하여 얻은 AUC (area under curve)와 통계적으로 t-test를 통하여 계산된 유의성 (p, %), 그리고 positive prediction rate (PPR, %), negative prediction rate (NPR, %)를 하기 표 5에 나타내었다.
Sensitivity (%) Specificity (%) cut-off (pg/mL) p value PPR (%) NPR (%)
control vs. disease 100 59 ＞40 ＜0.0001 70 100
control vs. AMI 100 64 ＞59 ＜0.0001 71 88
AMI vs. non AMI 100 41 59 0.0036 20 100
3.2 상업적인 키트를 이용한 P 물질의 농도 분석
상업적 키트를 사용하여 분석한 P 물질 농도에 대한 결과는 도 8에 나타내었다. 도 8에서, a는 정상인과 급성 심근 경색의 비교이며, Cut-off value > 364 pg/ml이지만, 통계적으로 유의미하지 않았다. b는 정상인과 심혈관 질환 환자 (불안정 협심증, 안정 협심증, 급성 심근 경색)을 비교한 경우이며 *P value < 0.0001, Cut-off value > 400 pg/ml이다. c는 AMI와 nonAMI를 d는 각각의 질환을 비교한 것이다. 여기서 특이한 점은 안정 협심증 환자의 신경펩티드 Y의 농도가 정상인, 그리고 다른 심혈관 질환에 비해 매우 높게 나왔다는 것이다 (p<0.0001). ROC 곡선을 계산하여 얻은 AUC와 통계적으로 t-test를 통하여 계산된 유의성, 그리고 PPR, NPR을 표 6에 나타내었다.
Sensitivity
(%)		 Specificity
(%)		 cut-off
(pg/mL)		 p value PPR (%) NPR (%)
control vs. disease 40 94 >547 <0.0001 76 69
control vs. AMI 40 97 >524 <0.0001 29 88
AMI vs. non AMI 40 63 ≤240 0.7387 87 8
3.3 복합체를 이용한 P 물질의 농도 분석
SQS를 사용한 P물질의 혈중농도 분석 결과는 도 10에 나타내었으며, 급성 심근경색 환자의 경우, 정상인 (control)에 비해 유의미하게 높았다(p<0.0001). ROC 곡선을 계산하여 얻은 AUC와 통계적으로 t-test를 통하여 계산된 유의성, 및 PPR, NPR을 하기 표 7에 나타내었다.
Sensitivity
(%)		 Specificity
(%)		 cut-off
(pg/mL)		 p value PPR (%) NPR (%)
control vs. disease 87.5 100 >3594 <0.0001 100 79
control vs. AMI 100 100 >3594 <0.0001 100 100
AMI vs. non AMI 100 57.7 >2887 0.0005 100 61.5
P물질과 신경펩티드 Y의 ROC가 0.8 이상, 민감도가 100 %, 특이도가 64 % 이상이었다 (표 8 참조). 상기 결과로 볼 때, SubP와 NpY 두 마커가 매우 민감하고, 급성 심근 경색 진단 마커로 아주 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
파라미터
P 물질 ( SubP )
복합체 이용
P 물질 ( SubP ) 상업적키트이용 신경펩티드 Y ( NpY )
Cut-off 값
 3594 pg/ml
 524 pg/ml 59 pg/ml
AUC
 1.00±0.000a,b
0.681±0.045a,b 0.799±0.047a,b
특이도
 100 %
 97 % 64 %
민감도
 100 %
 40 % 100 %
AUC, area under the curve
aAUC ± standard error
SubP 및 NpY의 AUC를 비교하는 때 bAll p < 0.05
각 어세이의 민감도 및 특이도는 cut-off 값을 이용하여 계산하였다.
<110> KIST <120> Complex comprising bead including quantum dot-layer and method for diagnosing myocardial infarction-related disease using the same <130> PN103532 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Substance P <400> 1 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met 1 5 10 <210> 2 <211> 36 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Neuropeptide Y <400> 2 Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp 1 5 10 15 Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35

Claims (18)

  1. 양자점 층을 포함하는 비드 입자 및 표적 물질을 검출 또는 분석하기 위한 제제를 포함하는 복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 물질을 검출 또는 분석하기 위한 제제는 상기 비드 입자의 표면에 결합된 것인 복합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 양자점 층은 상기 비드 입자의 내부에 위치한 것인 복합체.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 양자점 층은 비드 입자의 중심으로부터 표면에 이르는 거리의 0.5배 이상 1배 미만의 반지름을 갖는 동심구상의 형태를 이루는 것인 복합체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 비드 입자의 직경은 100 내지 300 nm인 것인 복합체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 비드는 실리카, 티타니아, 지르코니아 및 지올라이트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로 이루어지는 것인 복합체.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 표적 물질 또는 이의 단편이거나, 표적 물질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 핵산 또는 이의 유도체인 것인 복합체.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 물질은 P 물질 (Substance P, Sub P) 또는 신경펩티드 Y (Neuropeptide Y, NpY)인 것인 복합체.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 P 물질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 상기 신경펩티드 Y는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 표적 물질 분석용 조성물.
  11. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 표적 물질 면역분석용 키트.
  12. 청구항 8의 복합체를 포함하는 심근경색 관련 질환 진단용 조성물.
  13. 청구항 8의 복합체를 이용하여 환자의 시료 중에서 P 물질 또는 신경펩티드 Y의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    상기 측정된 단백질의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계: 및
    상기 환자의 시료에서 정상 대조군보다 상기 단백질의 발현 수준이 높을 경우 급성 심근경색으로 판정하는 단계를 포함하는, 심근경색 관련 질환을 진단하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 P 물질 단백질의 발현 수준 측정은 청구항 8의 복합체를 이용하여 측정하는 것이고, 상기 신경펩티드 Y의 발현 수준 측정은 Phoenix Pharmaceuticals Inc.의 실험용 면역학 어세이 키트를 사용하여 측정하는 것인 상기 복합체의 형광을 검출하여 측정하는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 P 물질의 발현이 제1 소정의 값 이상 및 상기 신경펩티드 Y의 발현이 제2 소정의 값 이상인 경우, 급성심근경색으로 판단하는 것인 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 P 물질의 발현이 제1 소정의 값 이상 또는 상기 신경펩티드 Y의 발현수준의 양이 제3 소정의 값 이상인 경우 급성심근경색, 안정협심증, 또는 협심증을 포함하는 심혈관 질환인 것으로 판단하는 것인 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 P 물질의 발현이 제1 소정의 값 미만 및 상기 신경펩티드 Y의 발현수준의 양이 제3 소정의 값 미만인 경우 심혈관질환이 아닌 것으로 판단하는 것인 방법.
  18. 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 제1 소정의 값은 3594±1 pg/ml, 제 2 소정의 값은 59 ± 0.85 pg/ml, 및 제 3 소정의 값은 40 ± 0.85 pg/ml인 것인 방법.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210020204A (ko) * 2019-08-13 2021-02-24 울산과학기술원 양자점-폴리머 복합체 및 이를 이용한 진단 키트
WO2021187951A1 (ko) * 2020-03-20 2021-09-23 주식회사 마라나노텍코리아 혈중 심혈관 질환 물질 진단을 위한 나노웰 진단키트
KR20210117872A (ko) * 2020-03-20 2021-09-29 주식회사 마라나노텍코리아 혈중 심혈관 질환 물질 진단을 위한 나노웰 진단키트
WO2022173238A3 (ko) * 2021-02-10 2022-10-06 울산과학기술원 생적합성 양자점-폴리머 복합체 및 이를 이용한 진단 키트

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
US6809186B1 (en) * 1999-01-22 2004-10-26 Martek Biosciences Corporation Simple method for labeled conjugate production
EP1410031A2 (en) * 2001-06-28 2004-04-21 ADVANCED RESEARCH AND TECHNOLOGY INSTITUTE, Inc. Methods of preparing multicolor quantum dot tagged beads and conjugates thereof
WO2006091630A2 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 University Of Cincinnati Determination of viable microorganisms using coated paramagnetic beads
WO2007062060A2 (en) * 2005-11-22 2007-05-31 Ted Reid Methods and compositions using substance p to promote wound healing
US20090181410A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-16 Florida State University Research Foundation Immunoglobulin peptides against asian pangasius catfish
JP5948673B2 (ja) * 2011-03-10 2016-07-06 ジーンフロンティア株式会社 リポ多糖混入量を低減した蛋白質合成用組成物、該組成物を用いた蛋白質製造方法
US8691500B2 (en) * 2011-07-29 2014-04-08 Korea Institute Of Science And Technology Device and method for detecting biomolecule

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210020204A (ko) * 2019-08-13 2021-02-24 울산과학기술원 양자점-폴리머 복합체 및 이를 이용한 진단 키트
WO2021187951A1 (ko) * 2020-03-20 2021-09-23 주식회사 마라나노텍코리아 혈중 심혈관 질환 물질 진단을 위한 나노웰 진단키트
KR20210117872A (ko) * 2020-03-20 2021-09-29 주식회사 마라나노텍코리아 혈중 심혈관 질환 물질 진단을 위한 나노웰 진단키트
WO2022173238A3 (ko) * 2021-02-10 2022-10-06 울산과학기술원 생적합성 양자점-폴리머 복합체 및 이를 이용한 진단 키트

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