JP2024030655A - リンパ球性下垂体前葉炎及び副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査のための試薬及び検査方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】リンパ球性下垂体前葉炎及び副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査のための試薬及び検査方法等に関する。【解決手段】本開示は、抗ＧＡＴＡ２抗体と免疫学的に結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、抗ＧＡＴＡ２抗体を検出するための試薬を提供する。【選択図】なし
Description
本明細書は、リンパ球性下垂体前葉炎及び副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査のための試薬及び検査方法等に関する。
病因が明らかでない下垂体機能障害の一つに自己免疫性視床下部下垂体炎があり、その代表的疾患としてリンパ球性下垂体炎がある。リンパ球性下垂体炎は、その病変部位によって、リンパ球性下垂体前葉炎（lymphocytic adenohypophysitics、ＬＡＨ）、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎(lymphocytic infundibulo-neurohypophysitics、ＬＩＮＨ)及びリンパ球性汎下垂体炎（lymphocytic panhypophysitis、ＬＰＨ）がある。
ＬＡＨは、下垂体前葉に炎症病変が限局し、副腎皮質刺激ホルモン（adrenocortictropic hormone、ＡＣＴＨ）などの下垂体前葉ホルモンの分泌が低下又は喪失する疾患である。ＬＩＮＨは、漏斗部および後葉に炎症が限局し、中枢性尿崩症を呈する疾患である。さらに、ＬＰＨは、下垂体全体に炎症をきたし、ＬＡＨとＬＩＮＨの両者の臨床的特徴を呈する疾患である。
ＬＡＨなどのリンパ球性下垂体炎は、臨床症状が下垂体腫瘍ほか、全身性疾患による下垂体病変と類似しているという特徴がある。そこで、リンパ球性下垂体炎の確定診断には、ＭＲＩ画像の取得、下垂体組織の生検、さらには、ステロイドを投与した上での経過観察などが行われている。
リンパ球性下垂体炎のうち、ＬＩＮＨについては、特定の自己抗体が疾患のマーカーとなることを本発明者らが既に報告している（特許文献１）。また、ＬＡＨの類縁疾患である副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)単独欠損症（isolated ACTH deficiency、ＩＡＤ）を判別するマーカーを既に報告している（特許文献２）。
しかしながら、こうしたマーカー、すなわち、自己抗体を検出するのにあたって、これまで、自己抗体と結合する抗原であるタンパク質自体を検出用試薬として用いていた。タンパク質自体を試薬として取り扱うため、製造コスト等が課題となっていた。
本明細書は、リンパ球性下垂体前葉炎(ＬＡＨ)及びその類縁疾患である副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症（ＩＡＤ）のより低侵襲的かつ実用的な検査に貢献できる技術を提供する。
本発明者らは、ＬＡＨ罹患ヒト個体からの試料につき、プロテオミクス解析を行った結果、６００個を超えるタンパク質を同定するとともに、５０個の自己抗原となるタンパク質候補を同定した。さらに、ＩＡＤ罹患ヒト個体についても同様の解析を行って１３１個の自己抗原となるタンパク質候補を同定した。本発明者らは、これらのタンパク質候補につき、詳細な解析を行ったところ、ＩＡＤ罹患可能性に関連付けられるマーカーとなる自己抗体を同定することができた。さらに、当該自己抗体のエピトープを同定することができた。本明細書は、かかる知見に基づき以下の手段を提供する。
［１］抗ＧＡＴＡ２抗体と免疫学的に結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、抗ＧＡＴＡ２抗体を検出するための試薬。
［２］前記アミノ酸配列は、ＱＮＲＰＬＩＫである、［１］に記載の試薬。
［３］前記アミノ酸配列は、ＱＮＲＰＬＩＫＰＫである、［１］に記載の試薬。
［４］前記ペプチドは標識を備える、［１］～［３］のいずれかに記載の試薬。
［５］ＥＬＩＳＡ用である、［１］～［４］のいずれかに記載の試薬。
［６］リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症を検査するための試薬である、［１］～［５］のいずれかに記載の試薬。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の試薬を含む、抗ＧＡＴＡ２抗体の検出キット。
［８］リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査用である、［７］記載のキット。
［９］［１］～［６］のいずれかに記載の試薬が固定化された固相担体を備える、抗ＧＡＴＡ２抗体の検出キット。
［１０］リンパ球性下垂体前葉炎又は下副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査用である、［９］記載の検出キット。
［１１］抗ＧＡＴＡ２抗体を含む可能性のある被験試料と、［１］～［６］のいずれかに記載の試薬と、を接触させて、抗原抗体反応を生じさせることと、
前記抗原抗体反応による複合体を検出することと、
を含む、リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症を検査するための方法。
［１２］抗ＧＡＴＡ２抗体と免疫学的に結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、抗ＧＡＴＡ２抗体の回収剤。
［２］前記アミノ酸配列は、ＱＮＲＰＬＩＫである、［１］に記載の試薬。
［３］前記アミノ酸配列は、ＱＮＲＰＬＩＫＰＫである、［１］に記載の試薬。
［４］前記ペプチドは標識を備える、［１］～［３］のいずれかに記載の試薬。
［５］ＥＬＩＳＡ用である、［１］～［４］のいずれかに記載の試薬。
［６］リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症を検査するための試薬である、［１］～［５］のいずれかに記載の試薬。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の試薬を含む、抗ＧＡＴＡ２抗体の検出キット。
［８］リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査用である、［７］記載のキット。
［９］［１］～［６］のいずれかに記載の試薬が固定化された固相担体を備える、抗ＧＡＴＡ２抗体の検出キット。
［１０］リンパ球性下垂体前葉炎又は下副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査用である、［９］記載の検出キット。
［１１］抗ＧＡＴＡ２抗体を含む可能性のある被験試料と、［１］～［６］のいずれかに記載の試薬と、を接触させて、抗原抗体反応を生じさせることと、
前記抗原抗体反応による複合体を検出することと、
を含む、リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症を検査するための方法。
［１２］抗ＧＡＴＡ２抗体と免疫学的に結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、抗ＧＡＴＡ２抗体の回収剤。
本明細書の開示は、抗ＧＡＴＡ２抗体と免疫学的に結合するペプチドを含む、抗ＧＡＴＡ２抗体を検出するための試薬とその利用に関する。抗ＧＡＴＡ２抗体は、ＬＡＨ及びＩＡＤのマーカーとなる自己抗体である。
本明細書に開示の一実施形態である試薬は、抗ＧＡＴＡ２抗体の存在を指標として、ＬＡＨの罹患可能性又はＩＡＤの罹患可能性の有無について評価する試薬である。この試薬により、抗ＧＡＴＡ２抗体の存在又は抗ＧＡＴＡ２抗体が所定量以上であることが肯定できるとき、被験試料が由来する患者について、少なくともこれらのいずれかの疾患の罹患可能性を肯定することができる。この試薬により、抗ＧＡＴＡ２抗体の存在又は抗ＧＡＴＡ２抗体が所定量以上であることが否定できるとき、被験試料が由来する患者について、これらのいずれの疾患の罹患可能性を否定することができる。
本明細書に開示される試薬は、特定のエピトープ配列と抗ＧＡＴＡ２抗体との抗原抗体反応によって生じる免疫学的な結合に基づいている。このため、抗ＧＡＴＡ２抗体や、抗ＧＡＴＡ２抗体の検出に関連付けられるＬＡＨ又はＩＡＤを従来に比して容易にかつ確実に診断する診断に貢献できる。
なお、本明細書に開示される技術は、単独で、ＬＡＨ又はＩＡＤを診断するものではなく、診断のために有用な情報を提供するものである。本明細書に開示される技術が、ＬＡＨ及びＩＡＤの診断に関する医学上の知見に基づく観察や検査に組み合わされることにより、これらの疾患について診断がなされるというものである。
また、本明細書において、ＬＡＨの罹患可能性とは、個体からの試料採取時点におけるＬＡＨに罹患している可能性を意味しており、将来的にＬＡＨに罹患する可能性や罹患の予兆を意味するものではない。ＩＡＤ罹患可能性についても同様である。
また、本明細書に開示される技術は、典型的にはヒトを対象としている。また、被験試料としては、ヒトから採取される試料であって、抗ＧＡＴＡ２抗体の存否等を検出することができるものであればよい。被験試料の採取にあたっての侵襲性は特に限定するものではないが、非侵襲的又は低侵襲的に採取される試料であることが好ましい。被験試料は、典型的には、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、涙液、唾液等が挙げられる。被験試料は、また、ヒトなどから採取される細胞、組織等が挙げられる。こうした細胞又は組織は、例えば、個体の視床下部、下垂体全体、又はその一部であって、例えば、下垂体前葉、下垂体後葉及び視床下部漏斗部などが挙げられる。
以下、本明細書に開示される種々の実施形態について説明する。
＜抗ＧＡＴＡ２抗体を検出するための試薬＞
本明細書に開示される抗ＧＡＴＡ２抗体を検出するための試薬（以下、単に、試薬ともいう。）は、ＧＡＴＡ２抗体と結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチドを備えている。以下の説明においては、抗ＧＡＴＡ２抗体の存在に関連付けられるＬＡＨ及びＩＡＤを検査するための試薬を例示して説明する。
本明細書に開示される抗ＧＡＴＡ２抗体を検出するための試薬（以下、単に、試薬ともいう。）は、ＧＡＴＡ２抗体と結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチドを備えている。以下の説明においては、抗ＧＡＴＡ２抗体の存在に関連付けられるＬＡＨ及びＩＡＤを検査するための試薬を例示して説明する。
＜リンパ球性下垂体前葉炎（ＬＡＨ）又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症（ＩＡＤ）を検査するための試薬＞
ＧＡＴＡ２（Endothelial transcription factor GATA-2）タンパク質は、ジンクフィンガー転写因子のＧＡＴＡファミリーのメンバーであり、このタンパク質は、造血および内分泌細胞系統の発達と増殖に関与する遺伝子の転写を調節する上で重要な役割を果たしているとされている。このタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１で表され、アミノ酸４８０個（４８０ＡＡ）からなる。
ＧＡＴＡ２（Endothelial transcription factor GATA-2）タンパク質は、ジンクフィンガー転写因子のＧＡＴＡファミリーのメンバーであり、このタンパク質は、造血および内分泌細胞系統の発達と増殖に関与する遺伝子の転写を調節する上で重要な役割を果たしているとされている。このタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１で表され、アミノ酸４８０個（４８０ＡＡ）からなる。
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
配列番号１：MEVAPEQPRWMAHPAVLNAQHPDSHHPGLAHNYMEPAQLLPPDEVDVFFNHLDSQGNPYYANPAHARARVSYSPAHARLTGGQMCRPHLLHSPGLPWLDGGKAALSAAAAHHHNPWTVSPFSKTPLHPSAAGGPGGPLSVYPGAGGGSGGGSGSSVASLTPTAAHSGSHLFGFPPTPPKEVSPDPSTTGAASPASSSAGGSAARGEDKDGVKYQVSLTESMKMESGSPLRPGLATMGTQPATHHPIPTYPSYVPAAAHDYSSGLFHPGGFLGGPASSFTPKQRSKARSCSEGRECVNCGATATPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGQNRPLIKPKRRLSAARRAGTCCANCQTTTTTLWRRNANGDPVCNACGLYYKLHNVNRPLTMKKEGIQTRNRKMSNKSKKSKKGAECFEELSKCMQEKSSPFSAAALAGHMAPVGHLPPFSHSGHILPTPTPIHPSSSLSFGHPHPSSMVTAMG
配列番号１：MEVAPEQPRWMAHPAVLNAQHPDSHHPGLAHNYMEPAQLLPPDEVDVFFNHLDSQGNPYYANPAHARARVSYSPAHARLTGGQMCRPHLLHSPGLPWLDGGKAALSAAAAHHHNPWTVSPFSKTPLHPSAAGGPGGPLSVYPGAGGGSGGGSGSSVASLTPTAAHSGSHLFGFPPTPPKEVSPDPSTTGAASPASSSAGGSAARGEDKDGVKYQVSLTESMKMESGSPLRPGLATMGTQPATHHPIPTYPSYVPAAAHDYSSGLFHPGGFLGGPASSFTPKQRSKARSCSEGRECVNCGATATPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGQNRPLIKPKRRLSAARRAGTCCANCQTTTTTLWRRNANGDPVCNACGLYYKLHNVNRPLTMKKEGIQTRNRKMSNKSKKSKKGAECFEELSKCMQEKSSPFSAAALAGHMAPVGHLPPFSHSGHILPTPTPIHPSSSLSFGHPHPSSMVTAMG
エピトープ配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目（ＱＮＲＰＬＩＫＰＫ）のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなる。エピトープ配列は、また例えば、少なくとも連続する７アミノ酸残基からなり、また例えば、少なくとも連続する８アミノ酸残基からなり、また例えば、少なくとも連続する８アミノ酸残基からなり、また例えば、連続する９アミノ酸残基からなる。エピトープ配列は、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３２８番目～第３３３番目のアミノ酸（６ＡＡ）に相当するＱＮＲＰＬＩであり、同第３２９番目～第３３４番目のアミノ酸（６ＡＡ）に相当するＮＲＰＬＩＫであり、同第３２８番目～第３３４番目のアミノ酸（７ＡＡ）に相当するＱＮＲＰＬＩＫであり、同３３０番目～３３５番目のアミノ酸に相当するＲＰＬＩＫＰＫであり、同第３２８番目～第３３５番目のアミノ酸残基（８ＡＡ）に相当するＱＮＲＰＬＩＫＰ（８ＡＡ）であり、同第３２８番目～第３３６番目のアミノ酸（９ＡＡ）に相当するＱＮＲＰＬＩＫＰＫ（９ＡＡ）である。
エピトープ配列は、後述する実施例に開示するように、ＧＡＴＡ２タンパク質のN末端から順に全長ＧＡＴＡ２について、１５ＡＡのペプチドに変換し、このペプチドを固相担体に固定化したペプチドマイクロアレイを用いて、ＬＡＨ2症例、ＩＡＤ１症例、および健常者２例の血清との抗原抗体反応による解析によって取得した。
ペプチドが有するエピトープ配列は、抗ＧＡＴＡ２抗体によって特異的に認識され、抗原抗体反応により複合体を形成する。ペプチド－抗ＧＡＴＡ２複合体を検出することにより、抗ＧＡＴＡ２抗体の存在を検出することができる。抗ＧＡＴＡ２抗体の存在は、ＬＡＨ罹患可能性及びＩＡＤ罹患可能性を肯定する指標となる。このため、ペプチドを検出剤（プローブ）として用いることで、ＬＡＨ罹患可能性を肯定し、同時にＩＡＤ罹患可能性を肯定することができる。ＩＡＤはＬＡＨの類縁疾患であり、このエピトープ配列を有するペプチドを用いることにより、ＬＡＨ又はＩＡＤの罹患可能性を肯定又は否定することができるようになる。また、この結果、リンパ球性下垂体炎に包含される他の疾患であるＬＩＮＨやＬＰＨの罹患可能性を把握することができる。
試薬が備えるペプチドは、かかるエピトープ配列を有していればよく、その長さ及び他のペプチド又はタンパク質、さらには、各種標識などと複合化されていてもよい。
ペプチドは、線状ペプチドであっても、環状ペプチドであってもよいが、好ましくは、線状ペプチドである。また、ペプチドは、エピトープ配列のみから構成されていてよいが、また、エピトープ配列のＮ末端及び／又はＣ末端に追加のアミノ酸又はペプチドを備えていてもよい。かかるアミノ酸又はペプチドとしては、例えば、Ｎ末端側に付加されるアミノ酸又はペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列においてエピトープ配列のＮ末端側に存在する１～２０個であってもよい。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列においてエピトープ配列のＣ末端側に相当するの１～２０個であってもよい。こうしたペプチドのアミノ酸残基数は、例えば７Ａ以上５０ＡＡ以下であり、また例えば、９ＡＡ以上４０ＡＡ以下であり、また例えば、１０ＡＡ以上３０ＡＡ以下であり、また例えば、１０ＡＡ以上２０ＡＡ以下である。
ペプチドは、また、ＧＡＴＡ２タンパク質以外の他のペプチドまた例えばタンパク質を備えていてもよい。他のペプチド又はタンパク質は、例えば、ＧＦＰやＲＦＰなどの蛍光標識、のほか、他の標識された抗体によって識別される別の公知のタグ、ペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素標識、放射線標識等が挙げられる。
このようなペプチド及び標識されたペプチドは、従来公知の化学的又は遺伝子工学的手法により得ることができる。エピトープ配列が取得されたことにより、短鎖ペプチドによって試薬を構成できるため、無細胞タンパク質合成系などを用いて迅速かつ容易に試薬を取得することができるようになる。
エピトープ配列を有するペプチドを用いることで、エピトープ配列と免疫学的に特異的に結合する自己抗体である抗ＧＡＴＡ２抗体との間で、抗原抗体反応によりペプチド－抗ＧＡＴＡ２抗体複合体を形成することができる。この複合体を、ペプチドに複合化した標識や抗ＧＡＴＡ２抗体に対する標識された抗ヒト抗体の当該標識などを用いた免疫学的手法により、抗ＧＡＴＡ２抗体を検出することができる。
免疫学的手法としては、特に限定するものではないが、ラテックス凝集法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、ウェスタンブロット法及び免疫沈降法（ＩＰ）を例示することができる。好ましい測定法としては、ＦＩＡ法及びＥＩＡ法（ＥＬＩＳＡ法を含む）を挙げることができる。また、細胞や組織を試料とする場合には、免疫細胞化学的方法、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリーなどを採用することができる。
例えば、ＥＬＩＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法を用いる場合、ペプチドをマイクロプレートなどの固相に固定した固相体を準備する。この固相体に対して、例えば、患者から採取した血清の希釈液を供給して、抗原抗体反応により、抗原－抗体複合体を生成させる。予め自己抗体に結合する、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体にホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）などの標識要素を備える二次抗体を供給し、自己抗体－二次抗体複合体を形成させる。その後、標識要素であるＨＲＰの所定の基質を供給して、ＨＲＰによる酵素反応により生成する反応物の特定吸収波長を観察することにより、自己抗体を検出ないし定量をすることができる。
＜リンパ球性下垂体前葉炎（ＬＡＨ）を検査するためデバイス＞
試薬は、また、固相担体に固定化されていてもよい。本明細書によれば、以上説明した試薬が固定化された固相担体を備える、リンパ球性下垂体前葉炎を検査するためデバイスも提供される。固相担体は特に限定されないで、公知の樹脂材料やガラス質材料などの各種材料で構成された任意の形態のものを適宜用いることができる。典型的には、チップ又はアレイなどの平板状体、多数個のウェルをマイクロプレートなどのウェルプレート状体、ビーズなどの球状体、又はファイバーないしフィルター状体又はストリップ状体などとすることができる。これらによれば、試薬を固定化した固相担体表面において抗原抗体反応により、抗ＧＡＴＡ２抗体とペプチドとの複合体を形成可能である。キャピラリー現象により液体が移動可能なファイバー、フィルター又はストリップにおいては、イムノクロマトグラフィーが可能である。また、ペプチドを固定化したビーズ等が充填したカラムによっても、イムノクロマトグラフィーが可能である。
試薬は、また、固相担体に固定化されていてもよい。本明細書によれば、以上説明した試薬が固定化された固相担体を備える、リンパ球性下垂体前葉炎を検査するためデバイスも提供される。固相担体は特に限定されないで、公知の樹脂材料やガラス質材料などの各種材料で構成された任意の形態のものを適宜用いることができる。典型的には、チップ又はアレイなどの平板状体、多数個のウェルをマイクロプレートなどのウェルプレート状体、ビーズなどの球状体、又はファイバーないしフィルター状体又はストリップ状体などとすることができる。これらによれば、試薬を固定化した固相担体表面において抗原抗体反応により、抗ＧＡＴＡ２抗体とペプチドとの複合体を形成可能である。キャピラリー現象により液体が移動可能なファイバー、フィルター又はストリップにおいては、イムノクロマトグラフィーが可能である。また、ペプチドを固定化したビーズ等が充填したカラムによっても、イムノクロマトグラフィーが可能である。
このようなマイクロプレート、アレイ、ストリップ、カラム、ビーズ等は、当業者であれば、周知の技術を用いて適宜作製することができる。ペプチドの固相担体への固定化についても疎水性相互作用又は共有結合などの公知の方法を適宜採用することができる。
＜リンパ球性下垂体前葉炎を検査するためのキット＞
本明細書によれば、以上説明した試薬を備える、ＬＡＨを検査するためのキットが提供される。このキットにおいて、試薬は、上記した各種の態様を採ることができる。試薬は、試薬自体のほか、固相担体に固定化したデバイスの態様を採ることができる。また、キットには、その他、抗原抗体反応及び複合体の検出に必要な公知の要素を適宜備えることができる。
本明細書によれば、以上説明した試薬を備える、ＬＡＨを検査するためのキットが提供される。このキットにおいて、試薬は、上記した各種の態様を採ることができる。試薬は、試薬自体のほか、固相担体に固定化したデバイスの態様を採ることができる。また、キットには、その他、抗原抗体反応及び複合体の検出に必要な公知の要素を適宜備えることができる。
例えば、キットには、試薬と抗ＧＡＴＡ２抗体とが結合した複合体の抗ＧＡＴＡ２抗体に結合する抗ヒト抗体（標識されていてもよい）などの二次抗体や、当該二次抗体を固定化したストリップなどの固相担体などが含まれていてもよい。
＜リンパ球性下垂体前葉炎（ＬＡＨ）又は副腎皮質刺激ホルモン欠損症（ＩＡＤ）を検査するための方法＞
本明細書に開示されるＬＡＨを検査するための方法は、抗ＧＡＴＡ２抗体を含む可能性のある被験試料と、試薬と、を接触させて、抗原抗体反応を生じさせることと、及び抗原抗体反応による複合体を検出することと、を含むことができる。
本明細書に開示されるＬＡＨを検査するための方法は、抗ＧＡＴＡ２抗体を含む可能性のある被験試料と、試薬と、を接触させて、抗原抗体反応を生じさせることと、及び抗原抗体反応による複合体を検出することと、を含むことができる。
ＬＡＨ検査方法において、試料中の自己抗体を指標として、ＬＡＨ罹患可能性を評価する態様は特に限定するものではなく、種々の態様を採ることができる。例えば、抗ＧＡＴＡ２抗体の存否を指標とすることができる。すなわち、試料中の抗ＧＡＴＡ２抗体の存否を定性的に検出してもよい。抗ＧＡＴＡ２抗体の存在を定性的に検出するとは、採用した自己抗体の検出方法において検出限界以上の濃度（含有量）であることを検出することを意味するが、検出限界は、一般的な自己抗体の存否の基準値や検査方法の目的や自己抗体の種類等によって適宜設定される。また、抗ＧＡＴＡ２抗体の不存在を検出するとは、採用した自己抗体の検出方法において、既述の検出限界未満の濃度（含有量）であることを意味する。
また例えば、抗ＧＡＴＡ２抗体の濃度を指標としてもよい。この場合、抗ＧＡＴＡ２抗体の濃度に基づくシグナルの強度から半定量的に又は定量的に抗ＧＡＴＡ２抗体濃度を検出してもよい。なお、適宜、濃度指標や標準曲線を準備する。
また例えば、自己抗体の濃度と予め定めた基準値との対比を指標としてもよい。この場合、自己抗体予め定めた基準値以上（超）であるか未満（以下）であるかなどを検出してもよい。なお、基準値は、ＬＡＨ患者群など疾患の確定診断がついている患者群と健常者群とについての血中自己抗体濃度の測定値に基づいて適宜設定することができる。
この検査方法においては、既に説明した種々の態様の試薬を、抗原抗体反応に基づく種々の手法で用いて、抗ＧＡＴＡ２抗体を検出し、ひいては、ＬＡＨ又はＡＩＤの罹患可能性について検査することができる。
本明細書によれば、抗ＧＡＴＡ２抗体と免疫学的に結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、抗ＧＡＴＡ２抗体の回収剤が提供される。この回収剤によれば、抗ＧＡＴＡ２抗体が含まれる可能性のある試料中の抗ＧＡＴＡ２抗体を捕捉し、分離し、回収することができる。回収剤は、既述の試薬について各種態様で使用することができる。
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
まず、ＧＡＴＡ２の組換え完全長ヒトタンパク質を合成し、完全長ヒトタンパク質を７．５～１０．００％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に移し、それを各血清試料（１：５０希釈）を用いた免疫ブロット法に供した。患者（ＬＡＨ患者及びＩＡＤ患者それぞれ３名）及び健常者（２名）の血清を一次抗体、ＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を二次抗体として、ウェスタンブロット法で抗原抗体反応を解析した。その結果、ＬＡＨ及びＩＡＤの罹患可能性に関連付けられる自己抗体として、抗ＧＡＴＡ２抗体が見出された。
（全長ＧＡＴＡ２タンパク質の１５ＡＡペプチドアレイの作製）
ＧＡＴＡ２遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端に対してＧＳＧＳＧＳＧリンカーをそれぞれ付与した配列のＮ末端から１５ＡＡづつ、１４ＡＡのＡＡが重複するオーバーラップペプチドをそれぞれ作製した。これらの合計４８０個のペプチドを、各２つ反復して、計９６０個のスポットからなるアレイを作製した。さらに、これらのペプチドアレイの周囲に、コントロールペプチドとしてのＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ）を４２スポット及びポリオタグ（ＫＥＶＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ）の４２個のスポットを追加した。
ＧＡＴＡ２遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端に対してＧＳＧＳＧＳＧリンカーをそれぞれ付与した配列のＮ末端から１５ＡＡづつ、１４ＡＡのＡＡが重複するオーバーラップペプチドをそれぞれ作製した。これらの合計４８０個のペプチドを、各２つ反復して、計９６０個のスポットからなるアレイを作製した。さらに、これらのペプチドアレイの周囲に、コントロールペプチドとしてのＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ）を４２スポット及びポリオタグ（ＫＥＶＰＡＬＴＡＶＥＴＧＡＴ）の４２個のスポットを追加した。
＜被験試料＞
被験試料は、ヒト血清サンプル（患者No.１６３３、１０３８，１６１０及び健常人Ｎｏ．１１９３、１２８９）とした。患者No.１６３３、１０３８及び１６１０のうち、Ｎｏ. １６３３及び１０３８が、ＬＡＨであり、Ｎｏ．１６１０がＩＡＤであると確定診断されている。
被験試料は、ヒト血清サンプル（患者No.１６３３、１０３８，１６１０及び健常人Ｎｏ．１１９３、１２８９）とした。患者No.１６３３、１０３８及び１６１０のうち、Ｎｏ. １６３３及び１０３８が、ＬＡＨであり、Ｎｏ．１６１０がＩＡＤであると確定診断されている。
（使用バッファ＞
洗浄バッファ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、0.05% Tween 20 を含む
（洗浄バッファによる洗浄は、各インキュベーション後に、１０秒間の洗浄を３回行った）
ブロッキングバッファ：ロックランドブロッキングバッファMB-070
インキュベーションバッファ：10% ブロッキングバッファを含む洗浄バッファ
洗浄バッファ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、0.05% Tween 20 を含む
（洗浄バッファによる洗浄は、各インキュベーション後に、１０秒間の洗浄を３回行った）
ブロッキングバッファ：ロックランドブロッキングバッファMB-070
インキュベーションバッファ：10% ブロッキングバッファを含む洗浄バッファ
＜アッセイ＞
アレイをブロッキングバッファで３０分間インキュベーション後、ブロッキングバッファを除去し洗浄バッファで洗浄した。ブロッキング処理後のアレイに対して、インキュベーションバッファで５００倍に希釈した被験試料（血清）を供給して、４℃で１６時間インキュベーションしつつ、１４０ｒｐｍで水平回転で振とうした。
アレイをブロッキングバッファで３０分間インキュベーション後、ブロッキングバッファを除去し洗浄バッファで洗浄した。ブロッキング処理後のアレイに対して、インキュベーションバッファで５００倍に希釈した被験試料（血清）を供給して、４℃で１６時間インキュベーションしつつ、１４０ｒｐｍで水平回転で振とうした。
インキュベーション後のアレイを、洗浄バッファで洗浄後、インキュベーションバッファ中でアレイに、二次抗体としてヤギ抗ヒト抗体であるＩｇＧ（Ｆｃ）抗体ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（０．１μｇ／ｍｌ）を用いて室温で４５分間染色した。同時に、コントロールとして、マウスモノクローナル抗体である抗－ＨＡ（１２ＣＡ５）Ｄｙｌｉｇｈｔ８００（０．２μｇ／ｍｌ）を用いて室温で４５分間染色した。
＜検出＞
患者由来の血清で処理したアレイ及び健常者由来の血清で処理したアレイのそれぞれにつきInnopsys InnoScan 710-IR マイクロアレイ スキャナーを用い、スキャン解像度は２０μｍとし、低レーザー出力（６８０ｎｍ、赤）時はゲイン５０、高レーザー出力（８００ｎｍ、緑）時はゲイン１０でスキャンした。
患者由来の血清で処理したアレイ及び健常者由来の血清で処理したアレイのそれぞれにつきInnopsys InnoScan 710-IR マイクロアレイ スキャナーを用い、スキャン解像度は２０μｍとし、低レーザー出力（６８０ｎｍ、赤）時はゲイン５０、高レーザー出力（８００ｎｍ、緑）時はゲイン１０でスキャンした。
ＧＡＴＡ２全長についてのオーバーラップペプチドに対する５名の血清の蛍光強度を対比した結果を図１に示す。
図１に示すように、患者３名と健常者２名の応答性との対比から、患者３名においては、共通して、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第３２８番目～第３３６番目のアミノ酸残基（９ＡＡ）に相当するＱＮＲＰＬＩＫＰＫのうち、少なくとも連続する６ＡＡがエピトープ配列として認定できることがわかった。例えば、詳細には、ＱＮＲＰＬＩ、ＱＮＲＰＬＩＫ、ＲＰＬＩＫＰＫ、ＮＲＰＬＩＫＰＫ、ＱＮＲＰＬＩＫＰＫ等がエピトープ配列となりうることがわかった。
Claims (12)
- 抗ＧＡＴＡ２抗体と免疫学的に結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、抗ＧＡＴＡ２抗体を検出するための試薬。
- 前記アミノ酸配列は、ＱＮＲＰＬＩＫである、請求項１に記載の試薬。
- 前記アミノ酸配列は、ＱＮＲＰＬＩＫＰＫである、請求項１に記載の試薬。
- 前記ペプチドは標識を備える、請求項１に記載の試薬。
- ＥＬＩＳＡ用である、請求項１～４のいずれかに記載の試薬。
- リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症を検査するための試薬である、請求項１～４のいずれかに記載の試薬。
- 請求項１に記載の試薬を含む、抗ＧＡＴＡ２抗体の検出キット。
- リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査用である、請求項７に記載のキット。
- 請求項１～４のいずれかに記載の試薬が固定化された固相担体を備える、抗ＧＡＴＡ２抗体の検出キット
- リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症の検査用である、請求項９記載の検出キット。
- 抗ＧＡＴＡ２抗体を含む可能性のある被験試料と、請求項１～４のいずれかに記載の試薬と、を接触させて、抗原抗体反応を生じさせることと、
前記抗原抗体反応による複合体を検出することと、
を含む、リンパ球性下垂体前葉炎又は副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症を検査するための方法。 - 抗ＧＡＴＡ２抗体と免疫学的に結合するペプチドであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３２８番目から３３６番目のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、抗ＧＡＴＡ２抗体の回収剤。
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