CN117280214A - SARS-CoV-2的免疫测定方法及免疫测定试剂盒、以及单克隆抗体或其抗体片段 - Google Patents

SARS-CoV-2的免疫测定方法及免疫测定试剂盒、以及单克隆抗体或其抗体片段 Download PDF

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Abstract

根据本发明，提供一种免疫测定方法，其为SARS‑CoV‑2的免疫测定方法，其包含使生物样品和与SARS‑CoV‑2的核衣壳蛋白结合的单克隆抗体或其抗体片段进行接触的步骤，所述单克隆抗体或其抗体片段与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS‑CoV‑2结合。

Description

SARS-CoV-2的免疫测定方法及免疫测定试剂盒、以及单克隆 抗体或其抗体片段
技术领域
本发明涉及SARS-CoV-2的免疫测定方法和免疫测定试剂盒。本发明还涉及单克隆抗体或其抗体片段。
本申请基于在2021年6月16日于日本申请的日本特愿2021-100117号而主张优先权，并将其内容引用于此。
背景技术
SARS-CoV-2是引起coronavirus disease 2019(COVID-19)的病毒。SARS-CoV-2属于具有单链正链RNA作为基因组的冠状病毒科。目前，coronavirus disease 2019在世界上流行，产生了很多感染者。
为了检测SARS-CoV-2，使用PCR检查、抗原检查。抗原检查能够从检体采集起十几分钟左右进行结果的确认，因此能够比PCR检查更简便地进行检查。另一方面，为了SARS-CoV-2的迅速检测，要求高灵敏度且特异性的检查。但是，抗原检查一般比PCR检查灵敏度低。因此，要求更高灵敏度的抗原检查。
还进行了从人体采集的SARS-CoV-2样品的分析(非专利文献1)。但是，还不清楚以SARS-CoV-2的哪种序列或哪种样品为目标进行分析时能够进行高灵敏度的抗原检查。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Journal of proteome research 2020,19,4389-4392MassSpectrometric Identification of SARS-CoV-2Proteins from Gargle SolutionSamples of COVID-19Patients
非专利文献2：“ESPLINE(注册商标)SARS-CoV-2”(FUJIREBIO公司)体外诊断用医药品的包装说明书
非专利文献3：“QUICKNAVI(注册商标)-COVID19 Ag”(DENKA公司)体外诊断用医药品的包装说明书
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的技术问题在于，提供能够以高灵敏度进行迅速的免疫测定的SA RS-CoV-2免疫测定试剂盒和SARS-CoV-2的免疫测定方法。此外，本发明的另一技术问题在于，提供能够用于所述免疫测定试剂盒和免疫测定方法的单克隆抗体或其抗体片段。
解决技术问题的手段
本发明人等为了解决所述技术问题而进行了深入研究。并且发现，通过使用与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-CoV-2结合的单克隆抗体或其抗体片段，能够解决所述技术问题，从而完成了本发明。
本发明人等在实施例中比较了本发明的免疫测定方法的一个实施方式与市售的SARS-CoV-2抗原检测用试剂即ESPLINE(注册商标)SARS-CoV-2(FU JIREBIO公司)(非专利文献2)和QUICKNAVI(注册商标)-COVID19 Ag(DENK A公司)(非专利文献3)的灵敏度。本发明的免疫测定方法的一个实施方式相对于这2种试剂，在更短的测定时间内显示同等以上的灵敏度。
具体地，本发明如下：
[1]一种SARS-CoV-2的免疫测定方法，其包含：使生物样品和与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合的单克隆抗体或其抗体片段进行接触的步骤，
所述单克隆抗体或其抗体片段与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-Co V-2结合。
[2]根据[1]所述的免疫测定方法，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段与SEQ ID NO.21的氨基酸序列的第388～第414氨基酸的序列反应。
[3]根据[1]或[2]所述的免疫测定方法，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段识别KQQTVTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位、或AADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的免疫测定方法，其中，
所述生物样品进行了丝氨酸蛋白酶处理。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的免疫测定方法，其中，
所述生物样品为呼吸器官分泌液。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的免疫测定方法，其中，
使用2种与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的肽片段结合的单克隆抗体或其抗体片段，
所述2种单克隆抗体或其抗体片段分别为第一单克隆抗体或其抗体片段和第二单克隆抗体或其抗体片段，第一单克隆抗体或其抗体片段间接或直接与标记物质结合，第二单克隆抗体或其抗体片段间接或直接与固相结合，
第一单克隆抗体或其抗体片段与第二单克隆抗体或其抗体片段所识别的表位不同。
[7]根据[6]所述的免疫测定方法，其中，
所述进行接触的步骤为(1)使生物样品和与标记物质进行了结合的第一单克隆抗体或其抗体片段进行接触而形成第一复合体的步骤，并且进一步包含(2)使所述第一复合体和第二单克隆抗体或其抗体片段进行接触而形成第二复合体的步骤；和(3)测定源自标记物质的信号的步骤。
[8]根据[6]或[7]所述的免疫测定方法，其中，
所述第一单克隆抗体或其抗体片段是识别KQQTVTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段，
所述第二单克隆抗体或其抗体片段是识别AADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的免疫测定方法，其为免疫层析法或ELIS A。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的免疫测定方法，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段为选自以下的(1)～(4)中的1种或2种：
(1)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的CDR3；
(2)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的CDR3；
(3)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的CD R2和具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的CDR3；
(4)抗体或其抗体片段，其包含：与所述(1)～(3)中任一项的抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区分别具有80％以上的氨基酸序列的同一性的重链可变区和轻链可变区。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的免疫测定方法，其中，
与测定胰蛋白酶处理前的SARS-CoV-2抗原时的灵敏度相比，测定使用1μg/mL浓度的胰蛋白酶在37℃下处理30分钟的SARS-CoV-2抗原时的测定灵敏度为60％以上，优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上。
[12]一种生物样品中的SARS-CoV-2的免疫测定试剂盒，其包含：
与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合的单克隆抗体或其抗体片段，
所述单克隆抗体或其抗体片段与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-Co V-2结合。
[13]根据[12]所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段与SEQ ID NO.21的氨基酸序列的第388～第414氨基酸的序列反应。
[14]根据[12]或[13]所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段识别KQQTVTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位、或AADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位。
[15]根据[12]～[14]中任一项所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述生物样品进行了丝氨酸蛋白酶处理。
[16]根据[12]～[15]中任一项所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述生物样品为呼吸器官分泌液。
[17]根据[12]～[16]中任一项所述的免疫测定试剂盒，其包含2种与SAR S-CoV-2的核衣壳蛋白的肽片段结合的单克隆抗体或其抗体片段，
所述2种单克隆抗体或其抗体片段分别为第一单克隆抗体或其抗体片段和第二单克隆抗体或其抗体片段，第一单克隆抗体或其抗体片段间接或直接与标记物质结合，第二单克隆抗体或其抗体片段间接或直接与固相结合，
第一单克隆抗体或其抗体片段与第二单克隆抗体或其抗体片段所识别的表位不同。
[18]根据[17]所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述第一单克隆抗体或其抗体片段为识别KQQTVTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段，
所述第二单克隆抗体或其抗体片段为识别AADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段。
[19]根据[12]～[18]中任一项所述的免疫测定试剂盒，其为用于免疫层析法或ELISA的试剂盒。
[20]根据[12]～[19]中任一项所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段为选自以下的(1)～(4)中的1种或2种：
(1)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的CDR3；
(2)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的CDR3；
(3)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的CD R2和具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的CDR3；
(4)抗体或其抗体片段，其包含：与所述(1)～(3)中任一项的抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区分别具有80％以上的氨基酸序列的同一性的重链可变区和轻链可变区。
[21]根据[12]～[20]中任一项所述的免疫测定试剂盒，其中，
与测定胰蛋白酶处理前的SARS-CoV-2抗原时的灵敏度相比，测定使用1μg/mL浓度的胰蛋白酶在37℃下处理30分钟的SARS-CoV-2抗原时的测定灵敏度为60％以上，优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上。
[22]一种与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合的单克隆抗体或其抗体片段，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-Co V-2结合。
[23]根据[22]所述的单克隆抗体或其抗体片段，其识别KQQTVTLLPAA DLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位、或AADLDDFSKQL Q(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位。
[24]根据[22]或[23]所述的单克隆抗体或其抗体片段，其选自以下的(1)～(4)：
(1)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的CDR3；
(2)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的CDR3；
(3)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的CD R2和具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的CDR3；
(4)抗体或其抗体片段，其包含：与所述(1)～(3)中任一项的抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区分别具有80％以上的氨基酸序列的同一性的重链可变区和轻链可变区。
[25]一种由第一抗体或其抗体片段、第二抗体或其抗体片段和SARS-Co V-2的核衣壳蛋白组成的复合体，其中，
所述第一抗体或其抗体片段和所述第二抗体或其抗体片段为[22]～[24]中任一项所述的抗体或抗体片段。
此外，本发明也包含以下的实施方式。
(A)根据[5]～[11]中任一项所述的免疫测定方法，其中，
所述第一单克隆抗体或其抗体片段为将LLPAA(SEQ ID NO.25)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体或其抗体片段，
所述第二单克隆抗体或其抗体片段为识别LDDFSKQLQ(SEQ ID NO.26)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段。
(B)根据[17]～[21]中任一项所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述第一单克隆抗体或其抗体片段为将LLPAA(SEQ ID NO.25)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体或其抗体片段，
所述第二单克隆抗体或其抗体片段为识别LDDFSKQLQ(SEQ ID NO.26)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段。
(C)根据[19]所述的单克隆抗体或其抗体片段，其LLPAA(SEQ ID NO.25)所示的氨基酸序列作为表位进行识别，或者识别LDDFSKQLQ(SEQ ID NO.26)所示的氨基酸序列中的表位。
发明效果
根据本发明，能够提供高灵敏度且可迅速分析的SARS-CoV-2免疫测定试剂盒和SARS-CoV-2的免疫测定方法、以及可用于它们的单克隆抗体或其抗体片段。
附图说明
图1是显示核衣壳蛋白的氨基酸序列的图。
图2是显示用于抗体的表位分析的合成肽的氨基酸序列与核衣壳蛋白上的氨基酸序列之间的对应关系的图。
图3是显示SARS-CoV-2抗原的胰蛋白酶处理时间与测定灵敏度的关系的图。
图4是显示SARS-CoV-2核衣壳蛋白的鼻腔擦拭处理时间与测定灵敏度的关系的图。
具体实施方式
1.SARS-CoV-2免疫测定方法
(生物样品)
作为本说明书中的“生物样品”，主要可举出源自生物体的固体组织和体液。
作为生物样品，可举出：血液、血清、血浆、尿、泪液、耳漏、前列腺液或呼吸器官分泌液。优选呼吸器官分泌液。在本说明书中，“呼吸器官分泌液”是指在呼吸器官的组织内或表面分泌的体液。作为呼吸器官分泌液，可举出在鼻孔、鼻腔、咽头、鼻咽、口腔、气管、支气管或肺等中分泌的体液，特别优选鼻咽擦拭液、鼻腔擦拭液、唾液或痰。需要说明的是，在本说明书中，“呼吸器官”是与呼吸相关的器官的总称，是指从鼻前庭经过鼻腔、咽头、喉头、气管、支气管、细支气管直至肺泡(肺)的器官。
采集生物样品的对象包含人或动物(例如猴、狗或猫)，优选为人。生物样品可以是源自对象的生物样品本身，也可以是对采集的生物样品进行通常进行的稀释、浓缩等处理后的生物样品。需要说明的是，进行本发明中使用的生物样品的采集、制备的人，可以是与进行本发明的免疫测定方法的人相同的人，也可以是不同的人。此外，本发明的免疫测定方法中使用的生物样品可以是在实施本发明的免疫测定方法时采集或制备的生物样品，也可以是预先采集或制备并保存的生物样品。
生物样品优选使用从编码丝氨酸蛋白酶的基因表达的部位采集的生物样品、例如生物样品的表面的擦拭液等。也可以从生物体采集生物样品后，用丝氨酸蛋白酶处理生物样品。在本说明书中，“对生物样品进行了丝氨酸蛋白酶处理”包含：生物样品是从编码丝氨酸蛋白酶的基因表达的部位采集的生物样品、以及从生物体采集后利用丝氨酸蛋白酶对生物样品进行处理这两者。
“丝氨酸蛋白酶”是具有进行亲核攻击的丝氨酸残基作为催化剂残基的蛋白酶，是水解L-精氨酸和L-赖氨酸的羧基侧的肽键的酶。
已知在气管上皮等器官中表达有TMPRSS2、TMPRSS4、TMPRSS11D等丝氨酸蛋白酶。认为从气管上皮等器官采集的生物样品中还存在被丝氨酸蛋白酶分解的源自SARS-CoV-2的蛋白质。本发明中，能够检测被丝氨酸蛋白酶分解的源自SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。具体而言，能够检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白被丝氨酸蛋白酶分解而产生的肽片段。因此，根据本发明，能够避免生物体内的丝氨酸蛋白酶对SARS-CoV-2抗原的分解导致的测定灵敏度降低，因此能够高灵敏度地检测SARS-CoV-2。作为本发明中的SARS-Co V-2抗原的测定灵敏度，与利用胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶进行酶处理前相比，酶处理后的测定灵敏度为60％以上即可。例如，与测定胰蛋白酶处理前的SARS-CoV-2抗原时的灵敏度相比，测定使用1μg/mL浓度的胰蛋白酶在37℃下处理30分钟的SARS-CoV-2抗原时的测定灵敏度优选为60％以上，70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上。
源自SARS-CoV-2的蛋白质中所含的特定抗体的表位有可能被丝氨酸蛋白酶分解。在表位的氨基酸序列被丝氨酸蛋白酶切断的情况下，该特定的抗体失去对源自SARS-CoV-2的蛋白质的反应性。即，无法通过特定的抗体检测SARS-CoV-2，或者特定的抗体对SARS-CoV-2的检测灵敏度发生降低。此外，在使用表位分别不同的2种抗体通过夹心系统检测源自SARS-CoV-2的蛋白质的情况下，即使在表位的氨基酸序列未被切断的情况下，存在于两个表位之间的部分也有可能被丝氨酸蛋白酶切断。在该情况下，由于无法用2种抗体对源自SARS-CoV-2的蛋白质进行夹心检测，因此在使用了这些抗体的检测系统中无法检测SARS-CoV-2，或者该检测系统对SARS-CoV-2的检测灵敏度发生降低。在本发明中，通过使用能够对被丝氨酸蛋白酶分解的由SA RS-CoV-2产生的肽片段进行夹心检测的2种抗体，能够检测被丝氨酸蛋白酶分解的SARS-CoV-2。因此，能够降低由所述原因引起的SARS-CoV-2检测中的假阴性风险。
本说明书中，“表位”是指由抗体识别的抗原(本发明的情况下为SARS-Co V-2)的一部分。
(SARS-CoV-2)
SARS-CoV-2是引起coronavirus disease 2019(COVID-19)的病毒。SARS-CoV-2的病毒粒子由作为尖峰蛋白、核衣壳蛋白、膜蛋白和包膜蛋白已知的4种蛋白质和RNA构成。
SARS-CoV-2的核衣壳蛋白是由419个氨基酸构成的蛋白质(SEQ ID NO.21)。核衣壳蛋白可能发生突变，因此，核衣壳蛋白包含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列具有至少90％，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列所表示的肽片段。
核衣壳蛋白包含NTD抗原(包含N末端的RNA结合结构域)、CTD抗原(包含C末端的二聚化结构域)和位于中央部的富含Ser/Arg(SR)的接头区域。
NTD抗原是核衣壳蛋白的第1～第174氨基酸的区域。其中第1～第49氨基酸的区域为N末端区域，第50～第174氨基酸的区域为RNA结合结构域。
NTD抗原的氨基酸序列如下所示。
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAE(SEQ ID NO.22)
接头区域是核衣壳蛋白的第175～第247氨基酸的区域。
接头区域的氨基酸序列如下所示。
GSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVT(SEQ ID NO.23)
CTD抗原是核衣壳蛋白的第248～第419氨基酸的区域。其中第248～第364氨基酸的区域为二聚化结构域，第365～第419氨基酸的区域为C末端区域。
CTD抗原的氨基酸序列如下所示。
KKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA(SEQ ID NO.24)
(单克隆抗体)
本说明书中，“单克隆抗体”是指由源自单一的抗体产生细胞的克隆得到的抗体或抗体分子。在本发明的免疫测定方法中，只要能够得到本发明的效果，也可以使用具有该单克隆抗体的功能的抗体片段。作为具有单克隆抗体的功能的抗体片段，例如可举出包含通过单克隆抗体的酶消化而得到的该单克隆抗体的Fab部分的功能性片段、包含通过基因重组而制备的该单克隆抗体的Fab部分的功能性片段、以及包含利用噬菌体展示法制备的scFv的功能性片段等。
(SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的肽片段)
本发明的免疫测定方法中使用的单克隆抗体或其抗体片段与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-CoV-2结合。以下，有时将与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-CoV-2结合的单克隆抗体或其抗体片段称为本发明的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体的第一实施方式能够识别核衣壳蛋白中的CTD抗原的第365～第419氨基酸的区域中的表位，优选能够识别存在于C末端区域的、SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的表位，更优选将LLPAA(SEQ ID NO.25)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
本发明的单克隆抗体的第二实施方式能够识别核衣壳蛋白中的CTD抗原的第365～第419氨基酸的区域中的表位，优选能够识别存在于C末端区域的、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的表位，更优选识别LDDFSKQLQ(SEQ ID NO.26)所示的氨基酸序列中的表位。
本发明的单克隆抗体可以是分离得到的单克隆抗体或其抗体片段。
本发明的单克隆抗体优选特异性识别基于丝氨酸蛋白酶的分解而产生的SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的肽片段中的表位。“特异性地识别表位”是指，单克隆抗体或其抗体片段实质上不与特定的肽片段或表位以外的结合。
本发明的单克隆抗体的第一实施方式更优选将NTD抗原中的氨基酸序列、接头区域中的氨基酸序列、以及CTD抗原中的二聚化结构域即第248～第364氨基酸的区域的氨基酸序列均不作为表位进行识别。
本发明的单克隆抗体的第二实施方式更优选将NTD抗原中的氨基酸序列、接头区域中的氨基酸序列、以及CTD抗原中的二聚化结构域即第248～第364氨基酸的区域的氨基酸序列均不作为表位进行识别。
为了确认本发明的单克隆抗体与具有某种氨基酸序列的肽片段是否“实质上不结合”，例如可以基于SPR法，使用Biacore(注册商标)T100、T200，将本发明的单克隆抗体固定化而进行测定。也可以通过所述SPR法以外的本领域技术人员公知的方法或手段来确认“实质上不结合”。
认为在核衣壳蛋白的C末端侧的区域中，在位于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的末端的K(赖氨酸)与位于QLQQSMSSA(SEQ ID NO.27)所示的氨基酸序列的开头的Q(谷氨酰胺)之间，丝氨酸蛋白酶切断核衣壳蛋白。其结果，认为产生由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列构成的肽片段。认为本发明的单克隆抗体能够与该肽片段结合。
此外，若考虑后述的S32217抗体的表位分析的结果，则与由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列构成的肽片段的末端相比进一步包含C末端侧的肽片段(具体而言，包含由LDDFSKQLQ(SEQ ID NO.26)构成的氨基酸序列的肽片段)也有可能包含在由丝氨酸蛋白酶处理过的样品中。
通过采用例如后述的竞争法，仅使用一种本发明的单克隆抗体，可以进行SARS-CoV-2的免疫测定。其中，优选使用2种本发明的单克隆抗体进行SARS-CoV-2的免疫测定。此时，2种单克隆抗体优选识别不同的表位。“识别不同的表位”是指，作为表位进行识别的氨基酸序列不重复。需要说明的是，就使用“2种”本发明的单克隆抗体而言，只要使用“至少2种”本发明的单克隆抗体即可，使用多于2种的本发明的单克隆抗体的实施方式不排除在本发明的范围之外。
使用2种本发明的单克隆抗体时，2种单克隆抗体优选分别识别KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.28)所示的氨基酸序列中的不同的表位，更优选一个单克隆抗体识别SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的表位，另一个单克隆抗体识别SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列中的表位，进一步优选一个单克隆抗体将LLPAA(SEQ ID NO.25)所示的氨基酸序列作为表位进行识别，另一个单克隆抗体识别LDDFSKQLQ(SEQ ID NO.29)所示的氨基酸序列中的表位。
本发明的单克隆抗体优选为选自以下的(1)～(4)中的任1种或2种。
(1)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的CDR3；
(2)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的CDR3；
(3)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的CD R2和具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的CDR3；
(4)抗体或其抗体片段，其包含：与所述(1)～(3)中任一项的抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区分别具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选98％以上的氨基酸序列的同一性的重链可变区和轻链可变区。
所述氨基酸序列的同一性优选为与构成重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列(HCCDR1+HC CDR2+HCCDR3+LCCDR1+LCCDR2+LCCDR3)的序列同一性。
需要说明的是，“具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1”是指CDR1由SEQ ID NO.3的氨基酸序列构成。关于其他CDR(互补决定区，Compleme ntarity-determining region)也同样。
本发明的单克隆抗体中，除了重链可变区和轻链可变区以外，还可以包含恒定区(C区)。作为恒定区，可以在轻链中包含CL区，可以在重链中包含CH区(CH1、CH2和CH3)。
本发明的单克隆抗体更优选分别为选自以下的(1)、(2)和(4)中的任1种或2种。
(1)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的CDR3；
(2)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的CDR3；
(4)抗体或其抗体片段，其包含：与所述(1)～(2)中任一项的抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区分别具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选98％以上的氨基酸序列的同一性的重链可变区和轻链可变区。
使用2种本发明的单克隆抗体时，2种单克隆抗体优选为(1)的抗体和(2)的抗体。最优选使用(1)的抗体作为标记抗体，使用(2)的抗体作为固相抗体。
作为与所述抗体(1)类似的抗体，可举出识别SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的表位的抗体、例如S32213抗体和S32212抗体。此外，作为所述抗体(1)，可举出将LLPAA(SEQID NO.25)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的抗体、例如S32213抗体。
作为与所述抗体(2)类似的抗体，可举出识别AADLDDFSKQLQQSMSSA(SEQ IDNO.30)的氨基酸序列中的表位的抗体，例如S32217抗体和S32209抗体。此外，作为所述抗体(2)，可举出识别LDDFSKQLQ(SEQ ID NO.29)所示的氨基酸序列中的表位的抗体、例如S32217抗体。
作为所述抗体(3)，可举出识别CTD抗原中的C末端区域中的表位的抗体、例如S32223抗体。认为S32223抗体具有与S32217抗体同样的反应性。
本说明书中，单克隆抗体或其抗体片段与特定的物质或氨基酸序列“反应”、“识别”和“结合”以相同含义使用。单克隆抗体是否与抗原(化合物)“反应”的确认，可以通过抗原固相化ELISA、竞争ELISA或夹心ELISA等进行。此外，能够通过利用了表面等离子体共振(surface plasmon resonance)的原理的方法(SPR法)等来进行。SPR法可以使用以Biacore(注册商标)的名称市售的装置、传感器或试剂类来进行。
例如，进行与后述的实施例1的表位分析(抗体的表位分析1)同样的操作时，可以评价为将吸光度最高的肽片段中所含的氨基酸序列作为表位进行识别。
(单克隆抗体的制备方法)
本发明的单克隆抗体可以通过将全长的核衣壳蛋白作为抗原(免疫原)溶解于磷酸缓冲生理盐水等溶剂中，将该溶液给药非人动物进行免疫来制备。根据需要在所述溶液中添加适当的佐剂后，可以使用乳液进行免疫。作为佐剂，除了油包水型乳剂、水包油包水型乳剂、水包油型乳剂、脂质体、氢氧化铝凝胶等通用的佐剂以外，还可以使用源自生物体成分的蛋白质或肽性物质等。例如，可以优选使用弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂等。佐剂的给药途径、给药量、给药时期没有特别限定，优选以能够增强免疫抗原的动物所期望的免疫应答的方式适当选择。
用于免疫的动物的种类也没有特别限定，可以优选使用哺乳动物，例如小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊、羊驼、小鼠或大鼠，更优选使用小鼠或大鼠。动物的免疫按照一般的方法进行即可，例如可以通过将抗原的溶液，优选与佐剂的混合物注射到动物的皮下、皮内、静脉或腹腔内来进行。免疫应答通常根据被免疫的动物的种类和系统而不同，因此免疫时间表优选根据所使用的动物适当设定。抗原施用优选在最初的免疫后反复进行几次。
为了得到本发明的单克隆抗体，可以继续进行以下操作，但不限于此。单克隆抗体本身的制备方法是本领域公知的，并且是通用的，因此本领域技术人员可以使用所述抗原制备本发明的单克隆抗体(参见例如Antibodies，ALaboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1988)第六章等)。
最终免疫后，从免疫的动物摘出作为抗体产生细胞的脾脏细胞或淋巴结细胞，与具有高增殖能力的骨髓瘤来源的细胞株进行细胞融合，由此可以制备杂交瘤。细胞融合优选使用抗体产生能力(质·量)高的细胞，此外，更优选骨髓瘤来源的细胞株与融合的抗体产生细胞来源的动物具有适合性。细胞融合可以按照该领域中公知的方法进行。例如，可以采用聚乙二醇法、使用了仙台病毒的方法、或利用电流的方法等。得到的杂交瘤可以按照本领域通用的条件进行增殖。可以在确认所产生的抗体的性质的同时选择所期望的杂交瘤。杂交瘤的克隆可以通过例如极限稀释法、软琼脂法等公知的方法进行。
克隆步骤后，可以使用ELISA、RIA法或荧光抗体法等方法测定所产生的单克隆抗体与全长的核衣壳蛋白的结合能力。通过这些操作，可以确认所选择的杂交瘤是否产生具有所期望性质的单克隆抗体。
通过大量培养如上所述筛选的杂交瘤，可以制造具有所需特性的单克隆抗体。大量培养的方法没有特别限定，例如可举出：将杂交瘤在适当的培养基中培养而使单克隆抗体在培养基中产生的方法；以及向哺乳动物的腹腔内注射杂交瘤而使其增殖、在腹水中产生单克隆抗体的方法等。
作为本发明的单克隆抗体，除了抗体分子整体以外，还可以使用具有抗原抗体反应活性的单克隆抗体的抗体片段。除了如上所述经过对动物的免疫步骤而得到的抗体以外，还可以使用利用基因重组技术得到的单克隆抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等。单克隆抗体的片段的实例包含F(ab’)2、Fab’和scFv。这些片段可以通过将如上所述得到的单克隆抗体用蛋白质分解酶(例如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)处理、或者克隆该抗体的DNA并在使用大肠杆菌、酵母的培养体系中使其表达来制备。
通过使用2种与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的肽片段结合的单克隆抗体，也可以在本发明的免疫测定方法中构建夹心系统。夹心系统是指通过用识别不同表位的2种抗体夹持被检测物质而得到高特异性和灵敏度的方法。
构建夹心系统时，优选2种单克隆抗体中的至少一种为固相抗体，至少一种为标记抗体。本说明书中，固相抗体是指直接或间接地固相化在固相上的单克隆抗体。本说明书中，标记抗体是指在测定源自标记物质的信号时，用后述的本领域技术人员公知惯用的标记物质直接或间接地进行了标记的单克隆抗体。
例如，可以通过使单克隆抗体物理吸附于固相、或化学键合于固相(可以介由适当的间隔物)来制造固相抗体。作为固相，可以使用由聚苯乙烯树脂等高分子基材、玻璃等无机基材、或纤维素、琼脂糖等多糖类基材等构成的固相。固相的形状没有特别限定，可以选择板状(例如微孔板、膜)、珠或粒子状(例如胶乳粒子、磁性粒子)、或筒状(例如试管)等任意的形状。
通过使用能够与本发明的免疫测定方法中使用的单克隆抗体直接结合的标记抗体(二次抗体)，也可以测定与SARS-CoV-2或其肽片段结合的抗体的量。本说明书中，将与本发明的单克隆抗体结合且结合有标记物质的抗体称为二次抗体。也可以使用该二次抗体，使标记物质与本发明的单克隆抗体间接结合。
可以测定标记物质发出的信号的强度，测定生物样品中的SARS-CoV-2或其肽片段的量。作为用于制备标记抗体的标记物质，例如可举出：金属络合物、酶、不溶性粒子、荧光物质、化学发光物质、生物素、亲和素、放射性同位素、胶体金粒子或着色胶乳。作为标记物质与单克隆抗体的键合法，可以使用本领域技术人员可利用的物理吸附法、戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法、或高碘酸法。使用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)等酶作为标记物质时，可以使用该酶的特异性基质测定酶活性。例如，酶为HRP时，可以使用O-苯二胺(OPD)或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，酶为ALP时，可以使用对硝基苯基磷酸酯测定酶活性。使用生物素作为标记物质时，也可以用生物素标记单克隆抗体，使用酶、色素或荧光标记(优选HRP)标记的亲和素或链霉亲和素进行反应。在本发明的免疫测定方法中，优选使用胶体金粒子作为标记物质。
在本说明书中，有时将使抗原或抗体物理性或化学性地进行担载、或担载于固相的状态表述为“固定化”或“固相化”。术语“分析”、“检测”或“测定”包含证明SARS-CoV-2或其肽片段的存在以及SARS-CoV-2或其肽片段的定量。
作为本发明的免疫测定方法，可举出包含以下那样的步骤(1)～(4)的竞争法即竞争ELISA。使用竞争ELISA时，可以使用一种本发明的单克隆抗体进行免疫测定方法。
(1)在微孔板等固相固定SARS-CoV-2或其肽片段的步骤。
(2)将待分析的生物样品加入微孔板的步骤。
(3)将酶标记了的本发明的单克隆抗体加入微孔板的步骤。
(4)添加所述酶的基质，测定源自酶反应的信号的步骤。
生物样品中的SARS-CoV-2或其肽片段与固定于固相的SARS-CoV-2或其肽片段之间发生竞争时，信号的强度降低。此外，也可以用生物素标记抗体。可以使该生物素与用HRP等标记了的链霉亲和素结合。然后，可以测定通过添加OPD作为基质而产生的显色信号。
本发明的免疫测定方法中，优选使用识别不同表位的2种单克隆抗体。需要说明的是，为了方便，有时将一个单克隆抗体称为第一单克隆抗体，将另一个单克隆抗体称为第二单克隆抗体。
当第一单克隆抗体为标记抗体、第二单克隆抗体为固相抗体时，本发明的免疫测定方法可以包含以下的步骤(1)～(3)。
(1)使生物样品和与标记物质进行了结合的第一单克隆抗体接触，形成第一复合体(包含SARS-CoV-2或其肽片段、标记物质、以及第一单克隆抗体)的步骤。
(2)将所述第一复合体与第二单克隆抗体接触，形成第二复合体(包含SA RS-CoV-2或其肽片段、标记物质、第一单克隆抗体和第二单克隆抗体)的步骤。
(3)测定源自标记物质的信号的步骤。
第二复合体中包含标记物质。信号的测定可以根据标记物质采用本领域技术人员公知的测定方法。信号的测定可以使用测定机器进行，也可以通过目视进行。
在使用所述1种或2种单克隆抗体的情况下，在本发明的免疫测定方法中，根据需要，可以包含对生物样品进行预处理的步骤、和/或将得到的信号的强度与第一阈值进行比较的步骤。作为预处理，可举出生物样品的过滤、以及利用检体稀释液的生物样品的稀释等。第一阈值可考虑灵敏度以及生物样品等的种类而适当设定。
第一阈值也可以是范围。“第一阈值为范围”是指在所示的范围之间存在具体的阈值，通过判定测定值是大于还是小于该具体的阈值来判断有无疾病。
第一阈值例如可以是1.1×102TCID50/mL。
在第一阈值为范围的情况下，第一阈值可存在于1.1×102TCID50/mL～2.0×102TCID50/mL之间、1.1×102TCID50/mL～1.8×102TCID50/mL之间、或者1.1×102TCID50/mL～1.5×102TCID50/mL之间。
在本发明的免疫测定方法中，可以包含在信号强度低于(高于)第一阈值的情况下判定为感染了SARS-CoV-2的步骤，或者可以包含在信号强度高于(低于)第一阈值的情况下判定为未感染SARS-CoV-2的步骤。
本发明的免疫测定方法可基于信号的测定值来判定感染了SARS-CoV-2的对象中的特定药物的治疗效果。此时，本发明的免疫测定方法除了所述步骤以外，还可以包含以下步骤。
对对象施用特定药物和/或将信号强度与第二阈值进行比较的步骤。
该情况下，第二阈值可以考虑灵敏度和生物样品的种类等而适当设定，也可以是对对象施用特定的药物前的所述对象中的SARS-CoV-2或其肽片段的测定值。
在本发明的免疫测定方法中，可以包含：在信号的强度低于(高于)第二阈值的情况下，判定为特定的药物具有治疗效果的步骤；或者在信号的强度高于(低于)第二阈值的情况下，判定为特定的药物没有治疗效果的步骤。
在所述的治疗效果的判定中，也可以每几天进行测定，监视治疗效果。
(免疫测定方法)
“免疫测定方法”是指利用抗原与抗体的反应来测定生物样品中所含的物质的水平的方法。“水平”包含物质的量、浓度、或者存在或不存在的确认等。
作为本发明的免疫测定方法，可举出：电化学发光免疫测定法(ECL法)、酶免疫测定法(ELISA)、胶乳免疫比浊法(LTIA法)、化学发光免疫测定法、免疫层析法和荧光抗体法，但不限于这些。本发明的免疫测定方法优选为ELIS A或免疫层析法，更优选为免疫层析法。
本发明的免疫测定方法可以是体内或体外的免疫测定方法。此外，为了增强灵敏度，也可以使用敏化剂。
本发明的免疫测定方法可以分析以相当于1.1×102TCID50/mL以上的量包含在生物样品中的SARS-CoV-2或其肽片段。
在本发明的免疫测定方法中，将本发明的单克隆抗体和生物样品添加到测定系统中的顺序只要能够得到本发明的效果就没有限定。即，可以将本发明的单克隆抗体在添加生物样品前、添加生物样品的同时、或添加生物样品后添加到测定系统中。
以下，对采用的每个免疫测定方法说明测定的步骤和原理。下述仅例示本发明的一个实施方式中的测定的步骤及原理，并不对本发明的范围进行任何限定。
本发明的免疫测定方法中，优选使用本发明的单克隆抗体的第一实施方式作为标记抗体，使用本发明的单克隆抗体的第二实施方式作为固相抗体。
在下述的各个免疫测定方法中，单克隆抗体固定化于固相的方法、单克隆抗体与标记物质的结合方法、标记物质的种类等具体方法包含上述的方法，可以没有限制地使用本领域技术人员公知的方法。
(免疫层析法)
免疫层析法是指利用与被检测物质结合的标记抗体或标记抗体在膜上流动的性质的免疫测定方法。测定免疫层析法中的被检测物质的一般原理如下。
将针对作为被检测物质的抗原的抗体固定在作为层析介质的不溶性膜载体上，制备作为固定相的检测部。并且，将偶联物(conjugate)(通过能够与所述被检测物质结合的抗体而致敏的标记物质)用作流动相。使被检测物质与作为流动相的偶联物特异性反应，并且在作为固定相的检测部中，使与偶联物结合的被检测物质与固定于检测部的抗体特异性反应。
作为本发明的免疫测定方法，采用免疫层析法时的测定步骤和原理如下所述。
(1)使用于供给生物样品的样品供给部与生物样品接触。
(2)生物样品中的SARS-CoV-2或其肽片段与偶联物接触，形成第一复合体(包含SARS-CoV-2或其肽片段、标记物质和第一单克隆抗体)。偶联物是在标记物质上结合有第一单克隆抗体的物质。
(3)所述第一复合体与固定于检测部的第二单克隆抗体接触，形成第二复合体(包含SARS-CoV-2或其肽片段、标记物质、第一单克隆抗体及第二单克隆抗体)。
(4)通过测定源自偶联物中所含的标记物质的信号的强度，确认所述第二复合体的形成。
作为标记物质，可举出：胶体金粒子、胶体铂粒子、彩色胶乳粒子和磁性粒子等。优选胶体金粒子。对于这些标记物质的种类和粒径，本领域技术人员可以根据所期望的灵敏度适当调节。
(ELISA)
免疫测定方法中，使用酶标记的ELISA也能够简便且迅速地测定靶标，因此优选。在本说明书中，ELISA是指利用针对所述被检测物质的抗体或抗原捕捉样品中所含的作为被检测物质的抗原或抗体后，利用酶反应进行检测的方法。固相优选板(免疫板)。作为标记，可以使用HRP或ALP。
作为本发明的免疫测定方法，使用夹心ELISA时的测定步骤和原理如下所述。
(1)在固定化有固相抗体的固相上添加生物样品使其反应时，生物样品中的SARS-CoV-2或其肽片段与固相抗体结合，在固相上形成固相抗体与SAR S-CoV-2或其肽片段的复合体。
(2)将识别标记了的其他表位的标记抗体添加到固相并使其反应时，标记抗体与所述捕获的SARS-CoV-2或其肽片段结合，与所述固相抗体-SARS-Co V-2或其肽片段复合体形成夹心。
(3)清洗后，与酶的基质反应而显色，测定吸光度。
根据测定的标记物质的量，可以测定生物样品中的SARS-CoV-2或其肽片段的量。
夹心ELISA法中，也可以使用二次抗体。通过使用二次抗体，反应被扩增，能够提高检测灵敏度。在下述实例的情况下，二次抗体是特异性识别一次抗体(第二单克隆抗体)的抗体。
在使用二次抗体的情况下，可以采用以下的步骤(1)～(5)。
(1)在固定化有第一单克隆抗体的固相上添加适当处理并稀释了的生物样品后进行孵育，除去生物样品并进行清洗。
(2)加入一次抗体(第二单克隆抗体)进行孵育和清洗。
(3)进一步添加进行了酶标记的二次抗体进行孵育。
(4)加入基质使其显色。
(5)通过使用酶标仪等测定显色来测定SARS-CoV-2或其肽片段的量。
(电化学发光免疫测定法)
电化学发光免疫测定法是指通过通电使标记物质发光，通过检测其发光量来测定被检测物质的量的方法。电化学发光免疫测定法中，作为标记物质，可以使用钌络合物。在固相(微孔板等)上设置电极，在该电极上产生自由基，由此使钌络合物成为激发状态而发光。并且，能够检测该钌络合物的发光量。
使用磁性粒子作为固相并且使用钌络合物作为标记物质时的测定步骤和原理如下所述。
(1)使固定化有固相抗体的磁性粒子与生物样品接触时，生物样品中的SARS-CoV-2或其肽片段与固相抗体结合。
(2)清洗磁性粒子后使其与标记抗体接触时，标记抗体与结合于磁性粒子的SARS-CoV-2或其肽片段结合。
(3)清洗磁性粒子后，通电时，根据与SARS-CoV-2或其肽片段结合的标记抗体的量而发光。通过测定该发光量，能够准确地测定生物样品中的被检测物质的量。
(胶乳免疫比浊法)
胶乳免疫比浊法是利用了与胶乳表面结合的抗体和被检测物质(抗原)的凝集的免疫测定方法。作为胶乳粒子，只要是体外诊断药中通常使用的胶乳粒子就没有特别限制。凝集反应测定时的胶乳粒子的浓度、胶乳粒子的平均粒径等可以根据灵敏度或性能适当设定。
作为本发明的免疫测定方法，使用胶乳免疫比浊法时的测定步骤和原理如下所述。
(1)使第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与胶乳粒子结合而与生物样品接触。
(2)生物样品中的SARS-CoV-2或其肽片段与第一单克隆抗体和第二单克隆抗体结合，抗体结合胶乳粒子发生凝集。
(3)对生物样品照射近红外光，进行吸光度的测定或散射光的测定。基于测定值，能够求出抗原的浓度。
作为本发明的免疫测定方法而使用胶乳免疫比浊法时，胶乳为固相，并且作为标记物质发挥作用。即，第一单克隆抗体和第二单克隆抗体均与固相和标记物质各自结合。
2.生物样品中的SARS-CoV-2的免疫测定试剂盒
本发明的生物样品中的SARS-CoV-2的免疫测定试剂盒(以下，有时简称为本发明的免疫测定试剂盒)包含本发明的单克隆抗体。
本发明的免疫测定试剂盒可以是包含一种本发明的单克隆抗体的用于竞争法，优选竞争ELISA的免疫测定试剂盒。
本发明的免疫测定试剂盒中，优选使用2种与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的肽片段结合的单克隆抗体来分析SARS-CoV-2。此时，2种单克隆抗体优选识别不同的表位。2种单克隆抗体可以放入各自的容器中。
作为本发明的免疫测定试剂盒，可举出用于实施免疫层析法、ELISA、电化学发光免疫测定法、胶乳免疫比浊法、化学发光免疫测定法和荧光抗体法的免疫测定试剂盒，但不限于这些。本发明的免疫测定试剂盒优选为用于实施ELISA或免疫层析法的免疫测定试剂盒，更优选为用于实施免疫层析法的免疫测定试剂盒。
本发明的免疫测定试剂盒可以是用于分析体内或体外的样品的免疫测定试剂盒。
本发明的免疫测定试剂盒中，还可以包含标准抗原物质、精度管理用抗原样品等其他检查试剂、检体稀释液和/或使用说明书等。本领域技术人员可适当调节包含抗体的试剂等的浓度。
以下，按所采用的免疫测定方法说明试剂盒中所含的试剂。本发明的免疫测定试剂盒中，优选使用本发明的单克隆抗体的第一实施方式作为标记抗体，使用本发明的单克隆抗体的第二实施方式作为固相抗体。
在使用免疫层析法的情况下，本发明的免疫测定试剂盒可以是将免疫层析法用测试条收纳、搭载于适当的容器(壳体)的形态。
免疫层析法用测试条可以由具有样品供给部的样品垫、作为层析介质的不溶性膜载体和配置于所述不溶性膜载体的下游侧端部的吸收垫构成。
可以在不溶性膜载体上配置固定化有第一单克隆抗体的检测部，在样品垫与不溶性膜载体之间配置配置有偶联物的偶联物垫。
可以在样品垫或不溶性膜载体上包含偶联物。
此外，作为免疫层析法的构成，可以适当采用例如国际公开第2018/012517或国际公开第2016/031892中记载的构成。
作为标记物质，可举出胶体金粒子、胶体铂粒子、彩色胶乳粒子和磁性粒子等。优选胶体金粒子。这些标记物质的种类和粒径只要是本领域技术人员就可以适当调节。
使用夹心ELISA时，本发明的免疫测定试剂盒可以包含以下(A)和(B)。(A)包含第二单克隆抗体与酶(HRP或ALP等)的结合体的标记试剂(B)固定化有第一单克隆抗体的固相。
在这样的试剂盒中，首先，在固定化有第一单克隆抗体的固相中添加生物样品后进行孵育，除去生物样品并进行清洗。接着，添加标记试剂后进行培养，加入基质使其显色。通过使用酶标仪等测定显色，能够分析SARS-Co V-2或其肽片段。
在竞争ELISA的情况下，本发明的免疫测定试剂盒可以包含以下(A)和(B)。(A)固定化有SARS-CoV-2或其肽片段的固相(B)酶标记了的本发明的单克隆抗体。固相和SARS-CoV-2或其肽片段可以在免疫测定试剂盒中分开被包含。此时，进行分析的人将包含SARS-CoV-2或其肽片段的肽片段固定化于固相。
也可以使用生物素。生物素可以与用HRP等标记了的链霉亲和素结合。作为基质，还可以包含OPD。
使用电化学发光免疫测定法时，本发明的免疫测定试剂盒可以包含以下(A)和(B)。
(A)标记试剂，其包含第二单克隆抗体与电化学发光物质(例如钌络合物等)的偶联物。
(B)固定化有与SARS-CoV-2或其肽片段结合的第一单克隆抗体的固相。
例如，在使用磁性粒子作为固相的试剂盒中，在固定化有与SARS-CoV-2或其肽片段结合的第一单克隆抗体的磁性粒子中添加生物样品使其反应后，除去生物样品进行清洗。然后，添加偶联物使其反应。清洗磁性粒子后，施加电能使其发光。然后，通过测定标记物质的发光量，可以分析SARS-CoV-2或其肽片段。
使用胶乳免疫比浊法时，本发明的免疫测定试剂盒可以包含以下的(1)和(2)。
(1)结合有第一单克隆抗体的胶乳粒子。
(2)结合有第二单克隆抗体的胶乳粒子。
作为本发明的免疫测定试剂盒而使用胶乳免疫比浊法用的试剂盒时，胶乳为固相，并且为标记物质。因此，第一单克隆抗体和第二单克隆抗体均与固相和标记物质各自结合。
以上，分为发明的方面(aspect)进行了说明，但各个方面所记载的事项、语句的定义以及实施方式也能够应用于其他方面。
接着举出实施例对本发明进行具体说明，但这些并不限定本发明的范围。需要说明的是，只要没有特别说明，则％是指质量％。
实施例
[制备例1单克隆抗体的制备]
将SARS-CoV-2(COVID-19)核衣壳蛋白(Nuculeocapsid protein)，His-tag1-419aa(以下称为Nu抗原，acrobiosystems公司制，NUN-C5227)作为免疫原。对于Nu抗原，初次免疫与弗氏完全佐剂(Freund's Complete Adjuvant)(Difco Laboratories)以1:1混合使用，第二次免疫以后与弗氏不完全佐剂(Freund's In complete Adjuvant)(DifcoLaboratories)以1:1混合使用。对于Balb/c，初次免疫使用20μg的免疫原量，第二次免疫以后使用10μg(用PBS稀释)的免疫原量，每隔一周继续皮下免疫。实施3次免疫后，通过抗原固相化ELISA评价血中抗体效价。对于能够确认充分的效价上升的个体，在解剖的1～3天前以用PB S稀释的免疫原进行腹腔免疫。之后，回收脾脏细胞、肠骨淋巴结细胞及鼠颈部淋巴结细胞，通过电融合法与骨髓瘤细胞SP2/0融合。融合细胞在96孔板中培养，从融合开始7或8天后回收培养上清。然后，实施基于后述的抗原固相化ELISA的筛选，选择对Nu抗原显示反应性且对NHis-cBSA不显示反应性的株。需要说明的是，在筛选前一天进行培养基更换。
[制备例2抗Nu抗原抗体的筛选(抗原固相化ELISA)]
在ELISA用96孔板(NUNC442404)中分注Nu抗原及NHis-cBSA(将His-tag抗原与BSA进行了conjugate的(本公司制备品)，100ng/mL in PBS)(50μL/孔)，在室温下静置2小时。用PBST清洗3次后(400μL/孔)，分注封闭液(1％BSA-PBST)(100μL/孔)，在室温下静置1小时或在4℃下静置整夜。除去封闭液后，分注细胞培养上清液(2倍稀释)、抗血清(1000及10000倍稀释)(50μL/孔)，在室温下静置1小时。用PBST清洗3次后，分注Goat anti-Mouse IgG(H+L)PAb-HRP(Southern Biotech公司制，1031-05，9500倍稀释)(50μL/孔)，在室温下静置1小时。用PBST清洗3次后，分注OPD显色液(50μL/孔)，在室温下静置10分钟。分注停止液(50μL/孔)，反应停止后，用酶标仪测定(Abs.492nm)。筛选与Nu抗原显示反应性且与NHis-cBSA不显示反应性的抗体。基于反应性等，将筛选得到的抗体分类为组A(3种)、组B(15种)、组C1(8种)、组C2(3种)、组C3(3种)、组C4(1种)和组D(1种)。
[分析例1基于夹心ELISA的抗体分类]
从得到的抗体组中选择2种而实施夹心ELISA时，通过下述步骤确认是否能够检测Nu抗原。
在ELISA用96孔板(NUNC442404)中分注1种抗体，在室温下静置2小时。用PBST清洗3次后，分注封闭液(1％BSA-PBST)(100μL/孔)，在4℃静置整夜。除去封闭液后，分注Nu抗原，在室温下静置30分钟。用PBST清洗3次后，添加生物素标记了的另1种抗体，在室温下静置1小时。用PBS T清洗3次后，将5000倍稀释的链霉亲和素-HRP以50μL/孔进行分注，在室温下静置30分钟。用PBST清洗3次后，分注OPD显色液，在室温下静置10分钟。分注反应停止液，用酶标仪测定吸光度(波长492nm)。
在通过夹心ELISA无法检测Nu抗原的情况下，判断为该2种抗体的抗原识别位点接近，将该2种分类为同一组。能否基于各组的抗体对进行夹心，如表1所示。
[表1]
+：可夹心，-：不可夹心
[分析例2基于免疫层析法的抗体分类]
按照下述步骤制备免疫层析法用测试条。
1)胶体金标记抗体溶液的制备
在1OD/mL的胶体金溶液20mL中添加包含25μg/mL的抗SARS-CoV-2的磷酸缓冲液1mL，在室温下搅拌10分钟。接着，在胶体金溶液中添加10％BSA溶液2mL，在室温下搅拌5分钟。将得到的溶液在10℃、10000rpm下离心45分钟，除去上清。将残渣用ConjugateDilution Buffer(Scripps公司)悬浮，得到胶体金标记抗体溶液。
2)偶联物垫的制备
将1)制备的胶体金标记抗体溶液用1.33％酪蛋白、4％蔗糖溶液(pH7.5)稀释至4OD/mL，制备偶联物液。将偶联物液以线状涂布于玻璃纤维垫，使其干燥，得到偶联物垫。
3)抗体固相化膜的制备
制备包含0.75mg/mL的抗SARS-CoV-2抗体和2.5％蔗糖的PBS，作为测试线(Testline)涂布液。制备包含1.0mg/mL的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体和2.5％蔗糖的PBS，作为对照线(Control line)涂布液。使用免疫层析法用分配器“XYZ3050”(BIO DOT公司制)，在硝基纤维素膜上分别以1.0μL/cm涂布测试线涂布液及对照线涂布液，使其干燥，由此得到抗体固相化膜。
4)测试设备的制备
在塑料制粘合片上粘贴抗体固相化膜、偶联物垫、吸收垫，裁切成5mm宽，由此得到免疫层析法用测试条。
试验方法
1)样品
将SARS-CoV-2(Isolate：USA-WA1/2020)Culture Fluid(Heat Inactivated)(Zepto Metrix公司)用Universal Transport Medium(BD公司)稀释至5.0×105TCID50/mL。用快速测试器(Rapid Tester)FLU·NEXT用检体稀释液(积水医疗公司)进一步稀释11倍作为样品。
2)试验步骤
将样品120μL滴加至测试条，10分钟后，目视判定抗体固相化膜上的测试线是否显色。
使用通过各种抗体组合而制备的测试条的SARS-CoV-2灭活抗原的检测试验结果如下述表2所示。可知在能够用ELISA夹心的一部分抗体群对中，能够用免疫层析法检测SARS-CoV-2灭活抗原。
[表2]
++：可夹心且高灵敏，+：可夹心，-：不可夹心
[实施例1抗体表位分析1]
从各抗体组中分别选择1种抗体，确认这些抗体与Nu抗原的N末端侧和C末端侧中的哪一侧反应。
将制备为5μg/mL的抗His-tag抗体以50μL/孔分注到96孔ELISA用微孔板中，在4℃下静置一夜。用PBST清洗3次后，以100μL/孔分注包含1％BSA的PBST(封闭液)，在4℃静置一夜。除去封闭液后，以50μL/ml分注制备成100ng/ml的Nu抗原、SARS-CoV-2(COVID-19)NPNTD domain V2 Recombinant Protein His-tag，44-180aa(以下称为NTD侧区域抗原，ProSci，92-749)或Recombinant nucleoprotein(C-term)antigen for COVID-19(NP-CTD)，His-tag 212-417aa(以下称为CTD侧区域抗原，rekom biotech，RAG0071)，在室温下静置1小时。用PBST清洗3次后，将制备为1μg/ml的生物素标记的各抗体以50μL/孔进行分注，在室温下静置1小时。用PBST清洗3次后，将5000倍稀释的链霉亲和素-HRP以50μL/孔进行分注，在室温下静置30分钟。用PBST清洗3次后，分注OPD显色液，在室温下静置10分钟。分注反应停止液，用酶标仪测定吸光度(波长492nm)。
将结果示于以下的表3。
[表3]
组 抗体 Nu抗原 NTD侧区域抗原 CTD侧区域抗原
A S32201 0.680 4.177 0.012
B S32202 0.585 0.019 4.236
C1 S32212 1.949 0.006 4.281
C2 S32213 0.679 0.006 4.209
C3 S32217 1.935 0.003 4.379
C4 S32209 0.609 0.003 4.298
D S32205 0.357 4.177 0.014
属于组A和D的抗体与NTD侧区域抗原反应，识别Nu抗原的N末端侧。属于组B和C的抗体与CTD侧区域抗原反应，识别Nu抗原的C末端侧。在表1和2的任一者中，能够夹心的组合是组B和C的组合、以及组C彼此的组合，因此认为在使用2种识别Nu抗原的C末端侧的抗体的情况下，能够高灵敏度地检测Nu抗原。
[实施例2抗体的表位分析2]
对于与Nu抗原的C末端侧反应的抗体，为了更详细地分析表位，实施抗原固相ELISA。
将与Nu抗原的特定氨基酸序列对应的合成肽(10μg/mL)(参照图2)分别分注到96孔ELISA用微孔板中(50μL/孔)，在室温下静置2小时或在4℃下静置一晚。用PBST清洗3次后，分注封闭液(1％BSA-PBST)(100μL/孔)，在室温下静置1小时或在4℃下静置一夜。除去封闭液后，分注生物素标记的S32202、S32213、S32212、S32217或S32209抗体(1μg/mL)(50μL/孔)，在室温下静置1小时。用PBST清洗3次后(400μL/孔)，分注链霉亲和素-HRP(×5000)(50μL/孔)，在室温下静置1小时。用PBST清洗3次后(400μL/孔)，分注OPD显色液(2mg/mL)(50μL/孔)，在室温下静置10分钟。分注反应停止液(50μL/孔)，用酶标仪测定吸光度(波长492nm)。
将代表各组的抗体与合成肽的反应性示于表4。反应的用“+”表示，未反应的用“-”表示。任一抗体均与核衣壳蛋白(SEQ ID NO.21)的第388-第414氨基酸的序列反应。属于组C1和C2的抗体与核衣壳蛋白的第388-第405氨基酸的序列(SEQ ID NO.51)反应。属于组B、C3和C4的抗体与第397-第414氨基酸的序列(SEQ ID NO.52)反应。
[表4]
B C1 C2 C3 C4
位置 氨基酸序列 SEQ ID NO. S32202 S32212 S32213 S32217 S32209
208-225 ARMAGNGGDAALALLLLD SEQ ID NO.31 - - - - -
217-234 AALALLLLDRLNQLESKM SEQ ID NO.32 - - - - -
226-243 RLNQLESKMSGKGQQQQG SEQ ID NO.33 - - - - -
235-252 SGKGQQQQGQTVTKKSAA SEQ ID NO.34 - - - - -
244-261 QTVTKKSAAEASKKPRQK SEQ ID NO.35 - - - - -
253-270 EASKKPRQKRTATKAYNV SEQ ID NO.36 - - - - -
262-279 RTATKAYNVTQAFGRRGP SEQ ID NO.37 - - - - -
271-288 TQAFGRRGPEQTQGNFGD SEQ ID NO.38 - - - - -
280-297 EQTQGNFGDQELIRQGTD SEQ ID NO.39 - - - - -
289-306 QELIRQGTDYKHWPQIAQ SEQ ID NO.40 - - - - -
298-315 YKHWPQIAQFAPSASAFF SEQ ID NO.41 - - - - -
307-324 FAPSASAFFGMSRIGMEV SEQ ID NO.42 - - - - -
316-333 GMSRIGMEVTPSGTWLTY SEQ ID NO.43 - - - - -
325-342 TPSGTWLTYTGAIKLDDK SEQ ID NO.44 - - - - -
334-351 TGAIKLDDKDPNFKDQVI SEQ ID NO.45 - - - - -
343-360 DPNFKDQVILLNKHIDAY SEQ ID NO.46 - - - - -
352-369 LLNKHIDAYKTFPPTEPK SEQ ID NO.47 - - - - -
361-378 KTFPPTEPKKDKKKKADE SEQ ID NO.48 - - - - -
370-387 KDKKKKADETQALPQRQK SEQ ID NO.49 - - - - -
379-396 TQALPQRQKKQQTVTLLP SEQ ID NO.50 - - - - -
388-405 KQQTVTLLPAADLDDFSK SEQ ID NO.51 - + + - -
397-414 AADLDDFSKQLQQSMSSA SEQ ID NO.52 + - - + +
406-419 QLQQSMSSADSTQA SEQ ID NO.53 - - - - -
[实施例3抗体的表位分析3]
利用PEPperPRINT公司的PEPperMAP(注册商标)Peptide Microarray保藏分析服务，实施S32213和S32217抗体的详细表位分析。线性表位映射(15个氨基酸残基的肽链长度，由14个氨基酸残基重叠肽分析)和立体构象表位映射(7个氨基酸残基、10个氨基酸残基、13个氨基酸残基的肽链长度，分别由6个氨基酸残基、9个氨基酸残基、12个氨基酸残基重叠肽分析)的分析结果的部分摘录示于表5和6中。结果显示，S32213抗体识别作为SARS-CoV-2核衣壳蛋白的第394-398位的氨基酸序列的LLPAA(SEQ ID NO.25)，S32217抗体识别作为该蛋白质的第400-408位的氨基酸序列的LDDFSKQLQ(SEQ ID NO.29)中存在的表位。
[表5]
+++：反应且高灵敏，+：反应，-：未反应[表6]
+++：反应且特别高灵敏，++：反应且高灵敏，
+：反应，-：未反应
[实施例4抗体对胰蛋白酶消化Nu抗原的反应性]
将源自猪胰脏的胰蛋白酶用PBS稀释，制备胰蛋白酶溶液(0或2000ng/mL)。将各胰蛋白酶溶液与用PBS稀释而制备的Nu抗原(2000ng/mL)以1∶1的比例混合，在37℃下反应10分钟。反应后，添加100分之1量的蛋白酶抑制剂使酶反应停止，将其作为胰蛋白酶消化Nu抗原。
将5种试验用抗体(5μg/mL)分注到96孔ELISA用微孔板中(50μL/孔)，在室温下静置2小时。用PBST清洗3次后，分注封闭液(1％BSA-PBST)(100μL/孔)，在室温下静置1小时。除去封闭液后，分注胰蛋白酶消化Nu抗原(1000ng/ml)(50μL/ml)，在室温下静置30分钟。用PBST清洗3次后(400μL/孔)，分注合成肽(2μg/mL，25μL/孔)、生物素标记的试验用抗体5种(1μg/ml)(50μL/孔)，在室温下静置1小时。用PBST清洗3次后(400μL/孔)，分注链霉亲和素-HRP(×5000)(50μL/孔)，在室温下静置1小时。用PBST清洗3次后(400μL/孔)，分注OPD显色液(2mg/mL)(50μL/孔)，在室温下静置10分钟。分注反应停止液(50μL/孔)，用酶标仪测定吸光度(波长492nm)。将结果示于表7。
[表7]
液相抗体 S32213(C2) S32217(C3) S32212(C1) S32209(C4) S32231(B)
固相抗体 S32217(C3) S32213(C2) S32217(C3) S32213(C2) S32217(C3)
未胰蛋白酶消化 4.245 4.369 4.634 4.229 4.409
有胰蛋白酶消化 4.595 4.284 4.456 4.511 0.122
在属于组C的抗体彼此的组合中，即使在进行了胰蛋白酶消化的情况下也能够检测Nu抗原。然而，在组B与组C3的组合中，抗原与抗体的反应因胰蛋白酶消化而大幅降低。认为属于组B的抗体将QLQQSMSSA(SEQ ID NO.27)中的任意的氨基酸序列作为表位进行识别。
[实施例5基于免疫层析法的SARS-CoV-2检测]
与分析例2同样地制备免疫层析法用测试条。标记抗体使用S32213抗体，固相抗体使用S32217抗体。
5)试验方法将快速测试器FLU·NEXT用检体稀释液(积水医疗)每次500μL地分注到稀释液管中。在SARS-CoV-2 PCR positive swab(Trina公司)中添加UniversalTransport Medium(BD公司)作为样品。在样品中插入检体采集用棉棒，采集检体后，用稀释液管内的稀释液提取检体。在稀释液管上安装检体过滤器，进行全量过滤。将所述样品每次120μL地滴加至测试设备，10分钟后通过目视判定有无测试线。
使用QIAmp Viral RNA mini Kit(QIAGEN公司)从该样品中提取RNA。基于国立感染症研究所的“病原体检测手册2019-nCoV Ver.2.9.1”，实施RT-PCR。将结果示于表8。需要说明的是，在RT-PCR的结果中，29个检体为阳性，26个检体为阴性。购入检体采集时为阳性的检体，用于试验，但认为由于输送、冷冻融解和检体稀释的影响，一部分检体阴性化。
[表8]
免疫层析法中的与RT-PCR的阳性一致率为100％(29/29×100)。免疫层析法中的与RT-PCR的阴性一致率为92.3％(24/26×100)。对于所使用的检体，确认每1次测试的SARS-CoV-2的拷贝数。阳性检体29例全部在每1次测试中包含1600拷贝以上的SARS-CoV-2。
此处，市售的SARS-CoV-2抗原检测用试剂的包装说明书中记载了测定1600拷贝/测试的样品时的阳性一致率。
ESPLINE(注册商标)SARS-CoV-2(FUJIREBIO公司)在测定时间为30分钟时的阳性一致率为92％(12/13×100)。
QUICKNAVI(注册商标)-COVID19 Ag(DENKA公司)在测定时间15分钟时阳性一致率为96.3％(26/27×100)。
因此，本实施例的免疫层析法与市售的SARS-CoV-2抗原检测用试剂相比，在更短的测定时间内显示同等以上的灵敏度。因此，可以说通过使用本实施例的免疫层析法，能够迅速且高灵敏度地检测SARS-CoV-2。
[实施例6免疫层析法的特异性评价]
使用与实施例5同样的测试设备。将快速测试器FLU·NEXT用检体稀释液每次500μL地分注到稀释液管中，对于1根稀释液管，从同一健康人的2根鼻咽擦拭棉棒中提取检体。在稀释液管上安装检体过滤器，进行全量过滤。将所述样品向与实施例5同样的测试设备中各滴下120μL，在10分钟后和30分钟后通过目视和装置进行判定。此外，也用与实施例5同样的方法实施RT-PCR。将供体各不相同的30例样品的判定结果示于表9。
[表9]
检体1～30在RT-PCR中均为阴性。在实施例的基于免疫层析法的10分钟后的判定中，均判定为阴性。此外，在超过实施例的免疫层析法的给定测定时间的30分钟后的判定中，全部检体也判定为阴性。因此，本实施例的免疫层析法表现出良好的特异性。
[实施例7单克隆抗体的氨基酸序列的分析]
利用公益财团法人KAZUSA DNA研究所的抗体可变区分析，分别分析S32213抗体、S32217抗体和S32223抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。其结果，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如下表10所示。
[表10]
S32223抗体是在分析例1的基于夹心ELISA的抗体分类中与S32217抗体属于相同的组C3的抗体。S32223抗体的重链可变区和轻链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别与S32217抗体的重链可变区和轻链可变区的CDR1～CDR3的氨基酸序列具有高同一性。因此，认为S32223抗体对SARS-CoV-2抗原具有与S32217抗体同样的反应性。
[实施例8由丝氨酸蛋白酶分解带来的影响]
<实验1>胰蛋白酶处理时间与测定灵敏度的关系
向检体输送培养基中以256ng/mL的浓度添加灭活抗原(Vero细胞SARS-CoV-2感染细胞溶解液MOI＝3；国立感染症研究所)，制备样品。在样品中以使最终浓度为1μg/mL的方式添加溶解于PBS的胰蛋白酶，在37℃下加热。在反应2分钟、5分钟、15分钟、30分钟后，按照包装说明书而添加蛋白酶抑制剂混合物套装I、无动物来源物(Protease InhibitorCocktail Set I，Animal-derived-free)(通用)(×100)(富士胶片和光纯药株式会社)，使反应停止，用快速测试器FLU·NEXT用检体稀释液(积水医疗)、ESPLINE(注册商标)SARS-CoV-2检体处理液(FUJIREBIO公司)、或QUICKNAVI(注册商标)检体悬浮液(COVID19 Ag用)(DENKA公司)每次50μL地添加反应液，得到测定用样品。
将测定用样品用实施例5中使用的免疫层析法用测试条、作为现有的SA RS-CoV-2测定试剂的ESPLINE(注册商标)SARS-CoV-2(FUJIREBIO公司)和QUICKNAVI(注册商标)-COVID19 Ag(DENKA公司)进行测定。
将结果示于图3。
如图3所示，现有的测定试剂随着胰蛋白酶处理时间变长而测定灵敏度降低，进行了30分钟胰蛋白酶处理的样品的测定灵敏度相对于胰蛋白酶处理前的样品的测定灵敏度为20％以下，与之相对，本发明的测定试剂(实施例5)随着胰蛋白酶处理时间变长而测定灵敏度增加。
<实验2>鼻腔擦拭液处理时间与测定灵敏度的关系
将用棉棒从3位健康人采集得到的鼻腔擦拭液以每3根棉棒用500μL的PBS悬浮并储备(プール)。在鼻腔擦拭液悬浮液池中以1μg/mL的浓度添加重组抗原(SARS-CoV-2(COVID-19)Nucleocapsid protein，His Tag；ACROBiosy stems公司制)，制备样品。将样品在37℃下加热，反应30、60分钟后，按照包装说明书而添加蛋白酶抑制剂混合物套装I、无动物来源物(Protease Inhibi tor Cocktail Set I，Animal-derived-free)(通用)(×100)(富士胶片和光纯药株式会社)，停止反应，向快速测试器FLU·NEXT用检体稀释液(积水医疗)或QUI CKNAVI(注册商标)检体悬浮液(COVID19 Ag用)(DENKA公司)中每次10μL地添加反应液，得到测定用样品。
用实施例5中使用的免疫层析法用测试条及作为现有的SARS-CoV-2测定试剂的QUICKNAVI(注册商标)-COVID19 Ag(DENKA公司)测定测定用样品。
将结果示于图4。
如图4所示，现有的SARS-CoV-2测定试剂的测定灵敏度根据鼻腔擦拭液处理时间而降低，另一方面，本发明的测定试剂(实施例5)的测定灵敏度没有变化。
<结果的说明>
实验1的结果表明，本发明的免疫测定方法能够检测被丝氨酸蛋白酶分解了的SARS-CoV-2。
此外，实验2的结果表明，本发明的免疫测定方法能够检测利用在气管上皮等器官中表达的丝氨酸蛋白酶进行分解后的核衣壳蛋白。
因此，实验1和2的结果表明，本发明的免疫测定方法通过使用与由被胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶分解了的SARS-CoV-2生成的肽片段结合的2个单克隆抗体，而能够实施SARS-CoV-2的高灵敏度的免疫测定。
[序列一览]
[表11]
SEQ ID NO. 氨基酸序列(N末端→C末端)
1 KQQTVTLLPAADLDDFSK
2 AADLDDFSKQLQ
3 GFSLSTSGMG
4 IYWDDDK
5 ARRDYGYNFDY
6 SSVSSTY
7 STS
8 HQWSSYPPT
9 GFTFSDYY
10 ITDGDNYT
11 ARDGNYYASSPFTY
12 TGAVTTSNY
13 GTN
14 ALWYSNHWV
15 GFTFSDYY
16 ISDGYSYT
17 ARDQDYFGSSLAY
18 TGAVTTSNY
19 GTN
20 ALWYSNRWV
[表12]
[表13]
SEQ ID NO. 氨基酸序列(N末端→C末端)
25 LLPAA
26 LDDFSKQLQ
27 QLQQSMSSA
28 KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQ
29 LDDFSKQLQ
30 AADLDDFSKQLQQSMSSA
31 ARMAGNGGDAALALLLLD
32 TAALALLLLDRLNQLESKM
33 RLNQLESKMSGKGQQQQG
34 SGKGQQQQGQTVTKKSAA
35 QTVTKKSAAEASKKPRQK
36 EASKKPRQKRTATKAYNV
37 RTATKAYNVTQAFGRRGP
38 TQAFGRRGPEQTQGNFGD
39 EQTQGNFGDQELIRQGTD
40 QELIRQGTDYKHWPQIAQ
41 YKHWPQIAQFAPSASAFF
42 FAPSASAFFGMSRIGMEV
43 GMSRIGMEVTPSGTWLTY
44 TPSGTWLTYTGAIKLDDK
45 TGAIKLDDKDPNFKDQVI
46 DPNFKDQVILLNKHIDAY
47 LLNKHIDAYKITFPPTEPK
48 KTFPPTEPKKDKKKKADE
49 KDKKKKADETQALPQRQK
50 TQALPQRQKKQQTVTLLP
51 KQQTVTLLPAADLDDFSK
52 AADLDDFSKQLQQSMSSA
53 QLQQSMSSADSTQA
[表14]
SEQ ID NO. 氨基酸序列(N末端→C末端)
54 RQKKQQT
55 QKKQQTV
56 KKQQTVT
57 KQQTVTL
58 QQTVTLL
59 QTVTLLP
60 TVTLLPA
61 VTLLPAA
62 TLLPAAD
63 LLPAADL
64 LPAADLD
65 PAADLDD
66 AADIDDF
67 ADLDDFS
68 DLDDESK
69 LDDFSKQ
[表15]
SEQ ID NO. 氨基酸序列(N末端→C末端)
70 QQTVTLLPAADLDDF
71 QTVTLLPAADLDDFS
72 TVTLLPAADLDDFSK
73 VTLLPAADLDDESKQ
74 TLLPAADLDDFSKQL
75 LLPAADLDDESKQLQ
76 LPAADLDDFSKQLQQ
77 PAADLDDFSKQLQQS
78 AADLDDFSKQLQQSM
79 ADLDDFSKQLQQSMS
80 DLDDFSKQLQQSMSS
81 LDDFSKQLQQSMSSA
82 DDFSKQLQQSMSSAD
83 DFSKQLQQSMSSADS
84 FSKQLQQSMSSADST
85 SKQLQQSMSSADSTQ
工业实用性
根据本发明，能够提供高灵敏度且可迅速分析的SARS-CoV-2免疫测定试剂盒和SARS-CoV-2的免疫测定方法、以及可用于它们的单克隆抗体或其抗体片段。
序列表
<110> 积水医疗株式会社
<120> SARS-CoV-2的免疫测定方法及免疫测定试剂盒
<130> 22P00297
<150> JP2021-100117
<151> 2021-06-16
<160> 85
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
<400> 1
Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
<400> 2
Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32213HCCDR1
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Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32213HCCDR2
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Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys
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<213> 未知
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<220>
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Ser Ser Val Ser Ser Thr Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32213LCCDR2
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1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32213LCCDR3
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His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32217HCCDR1
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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32217HCCDR2
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Ile Thr Asp Gly Asp Asn Tyr Thr
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<223> S32217HCCDR3
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Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Ala Ser Ser Pro Phe Thr Tyr
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<223> S32217LCCDR1
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Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 未知
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Gly Thr Asn
1
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32217LCCDR3
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Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
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<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32223HCCDR1
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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
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Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Tyr Thr
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<212> PRT
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<220>
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Ala Arg Asp Gln Asp Tyr Phe Gly Ser Ser Leu Ala Tyr
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Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr
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Gly Thr Asn
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> S32223LCCDR3
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Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
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<211> 419
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
<400> 21
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 22
<211> 174
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
<400> 22
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu
165 170
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<211> 73
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
<400> 23
Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser
1 5 10 15
Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser
20 25 30
Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu
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Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly
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Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr
65 70
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
<400> 24
Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr
1 5 10 15
Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro
20 25 30
Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly
35 40 45
Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala
50 55 60
Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser
65 70 75 80
Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp
85 90 95
Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala
100 105 110
Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys
115 120 125
Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr
130 135 140
Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu
145 150 155 160
Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
165 170
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
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Leu Leu Pro Ala Ala
1 5
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
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Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
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Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala
1 5
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<211> 21
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
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Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe
1 5 10 15
Ser Lys Gln Leu Gln
20
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
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Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln
1 5
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<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2
<400> 30
Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser
1 5 10 15
Ser Ala
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 1
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Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Asp
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<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 2
<400> 32
Thr Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu
1 5 10 15
Ser Lys Met
<210> 33
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 3
<400> 33
Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln
1 5 10 15
Gln Gly
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 4
<400> 34
Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 5
<400> 35
Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg
1 5 10 15
Gln Lys
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<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 6
<400> 36
Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr
1 5 10 15
Asn Val
<210> 37
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 7
<400> 37
Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg
1 5 10 15
Gly Pro
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 8
<400> 38
Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe
1 5 10 15
Gly Asp
<210> 39
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 9
<400> 39
Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly
1 5 10 15
Thr Asp
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 10
<400> 40
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
1 5 10 15
Ala Gln
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 11
<400> 41
Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala
1 5 10 15
Phe Phe
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 12
<400> 42
Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met
1 5 10 15
Glu Val
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 13
<400> 43
Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu
1 5 10 15
Thr Tyr
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 14
<400> 44
Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp
1 5 10 15
Asp Lys
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 15
<400> 45
Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln
1 5 10 15
Val Ile
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 16
<400> 46
Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp
1 5 10 15
Ala Tyr
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 17
<400> 47
Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Ile Thr Phe Pro Pro Thr
1 5 10 15
Glu Pro Lys
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 18
<400> 48
Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala
1 5 10 15
Asp Glu
<210> 49
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 19
<400> 49
Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg
1 5 10 15
Gln Lys
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 20
<400> 50
Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu
1 5 10 15
Leu Pro
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 21
<400> 51
Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 52
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 22
<400> 52
Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser
1 5 10 15
Ser Ala
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 23
<400> 53
Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 24
<400> 54
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 25
<400> 55
Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 26
<400> 56
Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 27
<400> 57
Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 28
<400> 58
Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 29
<400> 59
Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 30
<400> 60
Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 31
<400> 61
Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 32
<400> 62
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 33
<400> 63
Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
1 5
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 34
<400> 64
Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 35
<400> 65
Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 36
<400> 66
Ala Ala Asp Ile Asp Asp Phe
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 37
<400> 67
Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 38
<400> 68
Asp Leu Asp Asp Glu Ser Lys
1 5
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 39
<400> 69
Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln
1 5
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 40
<400> 70
Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> ptide 41
<400> 71
Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> eptide 42
<400> 72
Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 43
<400> 73
Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Glu Ser Lys Gln
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 44
<400> 74
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 45
<400> 75
Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Glu Ser Lys Gln Leu Gln
1 5 10 15
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 46
<400> 76
Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln
1 5 10 15
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 47
<400> 77
Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 48
<400> 78
Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 49
<400> 79
Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 50
<400> 80
Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 51
<400> 81
Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 52
<400> 82
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 53
<400> 83
Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
1 5 10 15
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 54
<400> 84
Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr
1 5 10 15
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽 55
<400> 85
Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln
1 5 10 15

Claims (20)

1.一种SARS-CoV-2的免疫测定方法，其包含：
使生物样品和与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合的单克隆抗体或其抗体片段进行接触的步骤，
在所述免疫测定方法中，所述单克隆抗体或其抗体片段与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-CoV-2结合。
2.根据权利要求1所述的免疫测定方法，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段识别KQQTVTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位、或AADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位。
3.根据权利要求1或2所述的免疫测定方法，其中，
所述生物样品进行了丝氨酸蛋白酶处理。
4.根据权利要求1或2所述的免疫测定方法，其中，
所述生物样品为呼吸器官分泌液。
5.根据权利要求1或2所述的免疫测定方法，其中，
使用2种与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的肽片段结合的单克隆抗体或其抗体片段，
所述2种单克隆抗体或其抗体片段分别为第一单克隆抗体或其抗体片段和第二单克隆抗体或其抗体片段，第一单克隆抗体或其抗体片段间接或直接与标记物质结合，第二单克隆抗体或其抗体片段间接或直接与固相结合，
第一单克隆抗体或其抗体片段与第二单克隆抗体或其抗体片段所识别的表位不同。
6.根据权利要求5所述的免疫测定方法，其中，
所述进行接触的步骤为(1)使生物样品和与标记物质进行了结合的第一单克隆抗体或其抗体片段进行接触而形成第一复合体的步骤，并且进一步包含(2)使所述第一复合体和第二单克隆抗体或其抗体片段进行接触而形成第二复合体的步骤；和(3)测定源自标记物质的信号的步骤。
7.根据权利要求5所述的免疫测定方法，其中，
所述第一单克隆抗体或其抗体片段是识别KQQTVTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段，
所述第二单克隆抗体或其抗体片段是识别AADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段。
8.根据权利要求1或2所述的免疫测定方法，其为免疫层析法或ELIS A。
9.根据权利要求1或2所述的免疫测定方法，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段为选自以下的(1)～(4)中的1种或2种：
(1)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的CDR3；
(2)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQID NO.12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的CDR3；
(3)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQID NO.18的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的CDR3；
(4)抗体或其抗体片段，其包含：与所述(1)～(3)中任一项的抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区分别具有80％以上的氨基酸序列的同一性的重链可变区和轻链可变区。
10.一种生物样品中的SARS-CoV-2的免疫测定试剂盒，其包含：
与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合的单克隆抗体或其抗体片段，
所述单克隆抗体或其抗体片段与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-CoV-2结合。
11.根据权利要求10所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段识别KQQTVTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位、或AADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位。
12.根据权利要求10或11所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述生物样品进行了丝氨酸蛋白酶处理。
13.根据权利要求10或11所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述生物样品为呼吸器官分泌液。
14.根据权利要求10或11所述的免疫测定试剂盒，其包含2种与SAR S-CoV-2的核衣壳蛋白的肽片段结合的单克隆抗体或其抗体片段，
所述2种单克隆抗体或其抗体片段分别为第一单克隆抗体或其抗体片段和第二单克隆抗体或其抗体片段，第一单克隆抗体或其抗体片段间接或直接与标记物质结合，第二单克隆抗体或其抗体片段间接或直接与固相结合，
第一单克隆抗体或其抗体片段与第二单克隆抗体或其抗体片段所识别的表位不同。
15.根据权利要求14所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述第一单克隆抗体或其抗体片段为识别KQQTVTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段，
所述第二单克隆抗体或其抗体片段为识别AADLDDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位的单克隆抗体或其抗体片段。
16.根据权利要求10或11所述的免疫测定试剂盒，其为用于免疫层析法或ELISA的试剂盒。
17.根据权利要求10或11所述的免疫测定试剂盒，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段为选自以下的(1)～(4)中的1种或2种：
(1)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的CDR3；
(2)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQID NO.12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的CDR3；
(3)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的CDR3；
(4)抗体或其抗体片段，其包含：与所述(1)～(3)中任一项的抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区分别具有80％以上的氨基酸序列的同一性的重链可变区和轻链可变区。
18.一种与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白结合的单克隆抗体或其抗体片段，其中，
所述单克隆抗体或其抗体片段与用丝氨酸蛋白酶进行了处理的SARS-CoV-2结合。
19.根据权利要求18所述的单克隆抗体或其抗体片段，其识别KQQT VTLLPAADLDDFSK(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列中的表位、或AADL DDFSKQLQ(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列中的表位。
20.根据权利要求18或19所述的单克隆抗体或其抗体片段，其选自以下的(1)～(4)：
(1)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的CDR3；
(2)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的CDR3；
(3)抗体或其抗体片段，其包含：重链可变区，其包含具有SEQ ID NO.15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的CDR3；和轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的CDR3；
(4)抗体或其抗体片段，其包含：与所述(1)～(3)中任一项的抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区分别具有80％以上的氨基酸序列的同一性的重链可变区和轻链可变区。
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