JP2022022607A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法および該抗体を含むキット - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための手段を提供することを課題とする。【解決手段】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片、該抗体またはその断片を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する方法、および該抗体またはその断片を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット等を提供することにより、上記課題が達成された。【選択図】なし
Description
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法および該抗体を含むキット等に関する。
２０１９新型コロナウイルス（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」と記す場合がある）は、中国武漢市付近で２０１９年に発生が初めて確認された、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスに属するコロナウイルスである。ヒトに対して病原性があり、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。
現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大について、ＷＨＯがパンデミック（世界的流行）相当との認識を示している。他方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者の治療法は確立されていない。したがって、適切な感染拡大防止策を講じるために、迅速な検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者を発見するとともに、免疫学検査を用いて血清中の抗体保有率を調べることで、感染率や感染経路を調査することは極めて重要である。
現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大について、ＷＨＯがパンデミック（世界的流行）相当との認識を示している。他方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者の治療法は確立されていない。したがって、適切な感染拡大防止策を講じるために、迅速な検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者を発見するとともに、免疫学検査を用いて血清中の抗体保有率を調べることで、感染率や感染経路を調査することは極めて重要である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法としては、採取した鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰等を検体とするリアルタイム逆転写ＰＣＲ法等の遺伝子検査が主に使用されている（非特許文献１および２）。これによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の有無を判断することが可能である。他方、前記遺伝子検査では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているにも関わらず検体の採取場所、採取時期、保管方法等の影響で前記検体からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が検出されない事例（偽陰性）が多発しており、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が感染拡大する一因となっている。また、遺伝子検査にはＰＣＲ中リアルタイムで蛍光を検出する特殊な装置が必要となり、結果を得るためには数時間を要することから、感染現場、防疫現場および臨床現場等の設備が十分とはいえない場所における早期発見という観点から実用性に課題が残る。そこで、正確性、迅速性および簡便性を兼ね備えた検査として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来タンパク質に対する抗原抗体反応を利用した免疫学検査が求められている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープ表面に存在し、宿主細胞への感染に関与するスパイク（以下、「Ｓ」と記す場合がある）タンパク質が知られている（非特許文献３）。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク質は多数の糖鎖が結合した糖タンパク質であり（非特許文献３）、その構造を正確に再現したタンパク質を化学合成や遺伝子組換え微生物等を用いて人工的に作製することは極めて困難であると考えられる。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と遺伝学的に近縁関係にあるＳＡＲＳコロナウイルスに由来するＳタンパク質はＳＡＲＳコロナウイルスの増殖に伴ってアミノ酸配列に変異が生じ易いことが知られているが（非特許文献４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク質も同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖に伴ってアミノ酸配列に変異が生じ易いと考えられる。このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク質に対して作製した抗体は、該Ｓタンパク質の変異体に対しては抗原抗体反応を示さない可能性があり、よって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク質に対する抗体を用いる免疫学検査では、検体によっては検査結果に偽陰性が生じてしまうおそれがある。
他方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質（以下、「ＮＰ」と記す場合がある）も知られている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と遺伝学的に近縁関係にあるＳＡＲＳコロナウイルスに由来するＮＰは種々存在するＳＡＲＳコロナウイルス由来タンパク質の中でも感染により産生される量が最も多いことが知られているが（非特許文献５）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰも同様に、種々存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来タンパク質の中でも感染により産生される量が最も多いと考えられる。このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは、検体から比較的容易に検出できるものと期待される。実際に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの部分ペプチドに対する抗体を作製した事例は既に報告されている（非特許文献６）。しかし、該事例において作製された抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と遺伝学的に近縁関係にあるＭＥＲＳコロナウイルスに由来するＮＰやＳＡＲＳコロナウイルスに由来するＮＰに対しても抗原抗体反応を示し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに対する特異性を有していない（非特許文献６）。よって、該抗体を用いる免疫学検査では、検体によっては検査結果に偽陽性が生じてしまうおそれがある。
２０１９－ｎＣｏＶ（新型コロナウイルス）感染を疑う患者の検体採取・輸送マニュアル（国立感染症研究所、２０２０年４月１６日）
病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１（国立感染症研究所、２０２０年３月１９日）
Chen X., et al., Cell. Mol. Immunol., (2020) doi: https://doi.org/10.1038/s41423-020-0426-7
Qin E., et al., Geno., Prot. Bioinfo., 1(2), 101-107 (2003)
Wang J., et al., Geno., Prot. Bioinfo., 1(2), 145-154 (2003)
Li M., et al., medRxiv, (2020) doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025999
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための手段を提供することを課題とする。
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰと他のコロナウイルス由来ＮＰとを分析した結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域を見出した。そして上記課題に鑑み、該領域に対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を作製し、これを免疫原として常法に従って抗体を作製することによって、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目にある、前記抗体またはその断片。
［２］エピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目にある、［１］の抗体またはその断片。
［３］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する、［１］または［２］の抗体またはその断片。
［４］抗体が、モノクローナル抗体である、［１］～［３］のいずれかの抗体またはその断片。
［５］その断片が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、［１］～［４］のいずれかの抗体またはその断片。
［６］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法であって、試料を、［１］～［５］のいずれかの抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法。
［７］試料が、生体試料である、［６］の方法。
［８］ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む、［６］または［７］の方法。
［９］［１］～［５］のいずれかの抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット。
［１０］イムノクロマトストリップの形態である、［９］のキット。
［１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目にある、前記抗体またはその断片。
［２］エピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目にある、［１］の抗体またはその断片。
［３］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する、［１］または［２］の抗体またはその断片。
［４］抗体が、モノクローナル抗体である、［１］～［３］のいずれかの抗体またはその断片。
［５］その断片が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、［１］～［４］のいずれかの抗体またはその断片。
［６］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法であって、試料を、［１］～［５］のいずれかの抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法。
［７］試料が、生体試料である、［６］の方法。
［８］ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む、［６］または［７］の方法。
［９］［１］～［５］のいずれかの抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット。
［１０］イムノクロマトストリップの形態である、［９］のキット。
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに特異的に結合する抗体またはその断片、該抗体またはその断片を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する方法、および該抗体またはその断片を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット等により、正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の有無、あるいは既往歴を検出することが可能である。すなわち、本発明により、感染現場、防疫現場および臨床現場等の設備が十分とはいえない場所における早期発見において高い実用性を備えた免疫学検査を提供することができる。これは、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに特異的に結合する抗体またはその断片の認識するエピトープが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域から構成されることから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検体から特異的に検出することが可能であるためである。
また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに特異的に結合する抗体またはその断片によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する方法を用いることで偽陽性および偽陰性が生じる事例を減少させることが可能である。
また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに特異的に結合する抗体またはその断片によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する方法を用いることで偽陽性および偽陰性が生じる事例を減少させることが可能である。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片］
本発明の一側面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目にある、前記抗体またはその断片（以下、「本発明の抗体またはその断片」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の抗体またはその断片の認識するエピトープは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目にある。一態様において、本発明の抗体またはその断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する。
本発明の一側面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目にある、前記抗体またはその断片（以下、「本発明の抗体またはその断片」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の抗体またはその断片の認識するエピトープは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目にある。一態様において、本発明の抗体またはその断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する。
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、中国武漢市付近で２０１９年に発生が初めて確認された、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスに属するコロナウイルスを指し、「２０１９新型コロナウイルス」と互換的に用いられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトに対して病原性があり、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、他のコロナウイルスと同様に、スパイク、ヌクレオカプシド、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質、およびＲＮＡより構成されている。このうちヌクレオカプシドがＲＮＡと結合してＮＰを形成し、脂質と結合したスパイク、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム配列はGenBankアクセッション番号MN908947.3で公開されている。
本発明において、「ヌクレオカプシドを構成するタンパク質」は、ヌクレオカプシドおよびＲＮＡからなる複合体を構成するタンパク質を指し、「ＮＰ」と互換的に用いられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列は配列番号１で表される。
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列（配列番号１）における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域）からなるタンパク質の断片を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有する。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、９５％以上の配列同一性を有することが好ましく、９８％以上の配列同一性を有することが特に好ましく、１００％の配列同一性を有することがさらに好ましい。一態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域に対応することから、該断片を作製し、これを免疫原として常法に従って本発明の抗体またはその断片を得ることができる。
本発明の抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン分子、好ましくはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。また、本発明の抗体は、キメラのおよびヒト化した抗体等の、修飾および／または変化した抗体で有り得る。また、本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、修飾または変化したモノクローナルまたはポリクローナル抗体、または組換えもしくは合成的に産生したまたは合成した抗体であり得る。本発明の抗体は、正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明の抗体の断片は、ＦａｂフラグメントまたはＶＬ－、ＶＨ－またはＣＤＲ－領域等の、かかる免疫グロブリン分子の部分であり得るが、本発明の抗体の断片も、本発明の抗体と同程度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを特異的に認識し結合し得るものである。本発明の抗体の断片は、抗体フラグメント、ならびに、分離した軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の、それらの部分であり得る。一態様において、本発明の抗体の断片は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
また、本発明の抗体またはその断片は、二機能性抗体等の抗体派生物、または、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖまたは抗体融合タンパク質等の抗体構築物であり得る。
また、本発明の抗体またはその断片は、二機能性抗体等の抗体派生物、または、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖまたは抗体融合タンパク質等の抗体構築物であり得る。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法］
本発明の別の側面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法であって、試料を、本発明の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法（以下、「本発明の方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の方法において、試料は生体試料である。一態様において、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む。
本発明の別の側面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法であって、試料を、本発明の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法（以下、「本発明の方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の方法において、試料は生体試料である。一態様において、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む。
一態様において、本発明の方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を含む。一態様において、本発明の方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を複数回含む。一態様において、該工程の各回毎に本発明の抗体またはその断片はエピトープが異なる。一態様において、本発明の抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。例えば、本発明の方法は、無標識の本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程、および標識物質により標識されている本発明の抗体またはその断片（前記無標識の本発明の抗体またはその断片とはエピトープが異なる）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を含む。
一態様において、本発明の方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程、および／または、本発明の抗体またはその断片と該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の抗体またはその断片、および／または該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
本発明において、「試料」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰが含まれ得る任意の試料であり、特に限定されないが、例えば生体試料が挙げられる。本発明において、「試料」は「検体」と互換的に用いられる。
本発明において、「生体試料」は、ヒトまたは動物の血液、血漿、血清、尿、精液、髄液、唾液、口腔粘膜、鼻水、汗、涙、腹水、羊水、糞便、血管もしくは肝臓等の臓器、組織、細胞、またはそれらの抽出物等、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰが含まれ得る任意の試料であり、好ましくは、採取が容易である、口腔、扁桃腺、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支および肺等からの細胞および分泌液や、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、うがい液、喀痰、気管吸引液、気管支肺胞洗浄液等である。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いた方法が多用される。動物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し得るものであれば特に限定されず、例えば、イヌ、ネコ等が挙げられる。
本発明において、「生体試料」は、ヒトまたは動物の血液、血漿、血清、尿、精液、髄液、唾液、口腔粘膜、鼻水、汗、涙、腹水、羊水、糞便、血管もしくは肝臓等の臓器、組織、細胞、またはそれらの抽出物等、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰが含まれ得る任意の試料であり、好ましくは、採取が容易である、口腔、扁桃腺、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支および肺等からの細胞および分泌液や、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、うがい液、喀痰、気管吸引液、気管支肺胞洗浄液等である。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いた方法が多用される。動物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し得るものであれば特に限定されず、例えば、イヌ、ネコ等が挙げられる。
生体試料は常法に従い採取することができる。
例えば、血清は、非特許文献１に記載のとおり、分離後の血清を密栓できるプラスティックチューブに１～２ｍｌ入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。凝固剤が入っていてもよく、血清分離剤入りの採血管を用いた場合は、遠心後の血清１～２ｍｌをプラスチックチューブ（滅菌チューブが望ましい）に移し蓋をした後、パラフィルムでシールする。
例えば、全血は、非特許文献１に記載のとおり、血液凝固阻止剤（ＥＤＴＡ－ＮａまたＫ）入りの採血管に採取し、１～２ｍｌを密栓できるプラスティックチューブに分注し、蓋をした後、パラフィルムでシールする。可能であれば、血球分離し、末梢血単核球を細胞保存液に懸濁して凍結保存する。末梢血単核球の分離はＢＤバキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）単核球分離用採血管を使うと簡便である。また、採血後の分注や血球分離ができない場合は、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ採血管を用いて採血し、そのまま凍結保存しておいてもよい。
例えば、血清は、非特許文献１に記載のとおり、分離後の血清を密栓できるプラスティックチューブに１～２ｍｌ入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。凝固剤が入っていてもよく、血清分離剤入りの採血管を用いた場合は、遠心後の血清１～２ｍｌをプラスチックチューブ（滅菌チューブが望ましい）に移し蓋をした後、パラフィルムでシールする。
例えば、全血は、非特許文献１に記載のとおり、血液凝固阻止剤（ＥＤＴＡ－ＮａまたＫ）入りの採血管に採取し、１～２ｍｌを密栓できるプラスティックチューブに分注し、蓋をした後、パラフィルムでシールする。可能であれば、血球分離し、末梢血単核球を細胞保存液に懸濁して凍結保存する。末梢血単核球の分離はＢＤバキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）単核球分離用採血管を使うと簡便である。また、採血後の分注や血球分離ができない場合は、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ採血管を用いて採血し、そのまま凍結保存しておいてもよい。
例えば、下気道由来液は、非特許文献１に記載のとおり、喀痰が出る場合喀痰を採取する。人工呼吸器管理下にある場合には、無菌的な操作のもとに、滅菌されたカテーテルを使って気管吸引液を採取する。臨床的に禁忌とならない場合は気管支肺胞洗浄液の採取も検討する。採取した喀痰または吸引液はスクリューキャップ付きプラスティックチューブに入れ蓋をし、パラフィルムでシールする。
例えば、鼻咽頭ぬぐい液は、非特許文献１に記載のとおり、滅菌綿棒（フロックスワブや材質にレーヨンやポリエステルを含む綿棒等。鼻腔用の細いもの）を鼻孔から挿入し、上咽頭を十分にぬぐい、綿棒を１～３ｍｌのウイルス輸送液（ＶＴＭ／ＵＴＭ）が入った滅菌スピッツ管に入れ蓋をし、パラフィルムでシールする。ウイルス輸送液が無い場合はＰＢＳや生理食塩水等を用いる。
例えば、尿は、非特許文献１に記載のとおり、１～２ｍｌを試験管（ファルコンチューブ等）に入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。
例えば、便は、非特許文献１に記載のとおり、０．１ｇ程度（小豆大）を密栓できるプラスティックチューブに採取して蓋をした後、パラフィルムでシールする。
例えば、鼻咽頭ぬぐい液は、非特許文献１に記載のとおり、滅菌綿棒（フロックスワブや材質にレーヨンやポリエステルを含む綿棒等。鼻腔用の細いもの）を鼻孔から挿入し、上咽頭を十分にぬぐい、綿棒を１～３ｍｌのウイルス輸送液（ＶＴＭ／ＵＴＭ）が入った滅菌スピッツ管に入れ蓋をし、パラフィルムでシールする。ウイルス輸送液が無い場合はＰＢＳや生理食塩水等を用いる。
例えば、尿は、非特許文献１に記載のとおり、１～２ｍｌを試験管（ファルコンチューブ等）に入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。
例えば、便は、非特許文献１に記載のとおり、０．１ｇ程度（小豆大）を密栓できるプラスティックチューブに採取して蓋をした後、パラフィルムでシールする。
本発明において、「標識物質」は、本発明の抗体またはその断片、および／または該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片を標識する任意の物質を指し、抗原抗体反応を検出できるものであれば特に限定されない。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、標識物質は、酵素、色素、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子等から選択される１以上のものであることが好ましい。
本発明において、「本発明の抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片」は、本発明の抗体またはその断片に特異的に結合し得る抗体またはその断片を指す。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥからなる群から選択される１以上のものであることが好ましく、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭであることが特に好ましく、ＩｇＧであることがさらに好ましい。また、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体は、キメラのおよびヒト化した抗体等の、修飾および／または変化した抗体で有り得る。また、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、修飾または変化したモノクローナルまたはポリクローナル抗体、または組換えもしくは合成的に産生したまたは合成した抗体であり得る。
本発明の抗体またはその断片を認識する抗体の断片は、ＦａｂフラグメントまたはＶＬ－、ＶＨ－またはＣＤＲ－領域等の、かかる免疫グロブリン分子の部分であり得るが、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体の断片も、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体と同程度に本発明の抗体またはその断片を特異的に認識し結合し得るものである。本発明の抗体またはその断片を認識する抗体の断片は、抗体フラグメント、ならびに、分離した軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の、それらの部分であり得る。一態様において、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体の断片は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
また、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片は、二機能性抗体等の抗体派生物、または、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖまたは抗体融合タンパク質等の抗体構築物であり得る。
また、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片は、二機能性抗体等の抗体派生物、または、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖまたは抗体融合タンパク質等の抗体構築物であり得る。
本発明において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの抗原抗体反応を検出できる任意の免疫学検査によって検出される。免疫学検査は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法（イムノクロマト法）、フィルター抗原アッセイ法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、または粒子凝集反応法等を含む。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは、ＥＬＩＳＡ法および／またはイムノクロマト法によって検出されることが好ましい。また、所定量の本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの抗原抗体反応から検量線を作成し、測定値を検量線に内挿することによって試料中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを定量することもできる。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット］
本発明の別の側面は、本発明の抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット（以下、「本発明のキット」と記す場合がある）に関する。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点、医療従事者が感染現場、防疫現場および臨床現場等の設備が十分とはいえない場所でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点、疫学調査をする観点等から、本発明のキットは、イムノクロマトストリップの形態であることが好ましい。
本発明の別の側面は、本発明の抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット（以下、「本発明のキット」と記す場合がある）に関する。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点、医療従事者が感染現場、防疫現場および臨床現場等の設備が十分とはいえない場所でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点、疫学調査をする観点等から、本発明のキットは、イムノクロマトストリップの形態であることが好ましい。
例えば、イムノクロマトストリップは、本発明の抗体またはその断片および抗マウス免疫グロブリン抗体をそれぞれ別の部位、すなわちテストラインおよびコントロールラインに固定化したものである。イムノクロマトストリップのサンプルパットには、金コロイド粒子、ラテックス粒子、蛍光粒子、磁気粒子等で標識された本発明の抗体またはその断片を予め含浸させておく。サンプルパットに滴下された試料は、毛細管現象により展開され、テストラインに到達すると試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのみが反応し、コントロールラインに到達すると金コロイド等で標識された本発明の抗体またはその断片のみが反応する。その他の試料中の成分は反応せずに吸水パッドまで移動する。テストラインおよびコントロールラインの色の濃さ、反射強度、吸光度、蛍光強度、または磁気強度等をイムノクロマトリーダーで測定することにより、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出できるだけでなく、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを定量できる。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための組成物］
本発明の別の側面は、本発明の抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための組成物（以下、「本発明の組成物」と記す場合がある）に関する。
本発明の別の側面は、本発明の抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための組成物（以下、「本発明の組成物」と記す場合がある）に関する。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法］
本発明の別の側面は、試料を本発明の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法（以下、「本発明の診断方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の診断方法は、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む。
本発明の別の側面は、試料を本発明の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法（以下、「本発明の診断方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の診断方法は、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む。
一態様において、本発明の診断方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を含む。一態様において、本発明の診断方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を複数回含む。一態様において、該工程の各回毎に本発明の抗体またはその断片はエピトープが異なる。一態様において、本発明の抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。例えば、本発明の診断方法は、無標識の本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程、および標識物質により標識されている本発明の抗体またはその断片（前記無標識の本発明の抗体またはその断片とはエピトープが異なる）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を含む。
一態様において、本発明の診断方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程、および／または、本発明の抗体またはその断片と該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の抗体またはその断片、および／または該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
例１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の調製
［免疫原の設計］
データベース上に公開された配列に基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ）由来ＮＰのアミノ酸配列との間の同一性について解析を行った（図１）。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列は、ＳＡＲＳコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約９０％のアミノ酸配列の同一性を有し、ＭＥＲＳコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約４７％のアミノ酸配列の同一性を有し、その他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約３０％以下のアミノ酸配列の同一性を有することがわかった。
そこで、コロナウイルス間で共通して保存されているモチーフ（ＦＹＹＬＧＴＧＰ）を除いた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰ中のアミノ酸１２１～４１９の領域を免疫原とすることにした。
［免疫原の設計］
データベース上に公開された配列に基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ）由来ＮＰのアミノ酸配列との間の同一性について解析を行った（図１）。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列は、ＳＡＲＳコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約９０％のアミノ酸配列の同一性を有し、ＭＥＲＳコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約４７％のアミノ酸配列の同一性を有し、その他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約３０％以下のアミノ酸配列の同一性を有することがわかった。
そこで、コロナウイルス間で共通して保存されているモチーフ（ＦＹＹＬＧＴＧＰ）を除いた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰ中のアミノ酸１２１～４１９の領域を免疫原とすることにした。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の無細胞タンパク質合成］
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を以下の方法により調製した。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列に対応するＲＮＡ配列は配列番号３で表され、該ＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列は配列番号４で表される。なお、該ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を以下の方法により調製した。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列に対応するＲＮＡ配列は配列番号３で表され、該ＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列は配列番号４で表される。なお、該ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
まず、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を人工合成し、該ＤＮＡ配列を鋳型とするＰＣＲ法により、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１）に対応する配列番号４で表されるＤＮＡ配列の３６１～１２６０番目の領域を増幅した。１μＭ フォワードプライマー（配列番号５）５μＬ、１μＭ リバースプライマー（配列番号６）５μＬ、配列番号４で表されるＤＮＡ配列が挿入された１０ｎｇ／μＬ ＤＮＡベクター（ｐＵＣ５７（ジーンウィズ社））１μＬ、PrimeSTAR（登録商標）Max DNA Polymerase(タカラバイオ社)２５μＬ、および超純水１４μＬを混合して全量５０μＬの反応液を調製した。ＰＣＲ法を表１に示すサーマルサイクラーの設定で行った。これにより、配列番号４で表されるＤＮＡ配列の３６１～１２６０番目の領域を含むＤＮＡ配列を得た。そして、pEU-E01-His-TEV-MCS-N2ベクター（セルフリーサイエンス社）を鋳型とするＰＣＲ法により、配列番号７および８に示したプライマーを用いて同様な手法でＤＮＡベクターを増幅した。
次に、前記ＰＣＲ法から得られたＤＮＡ配列およびＤＮＡベクターをアガロースゲル電気泳動により精製した後、In-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit（タカラバイオ社）を用いることで、ＤＮＡを連結させてＤＮＡベクターを調製した。得られたＤＮＡベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換後の大腸菌をアンピシリン含有ＬＢ培地に播種した。増殖後の大腸菌からプラスミド精製キット（プロメガ社）を使用してＤＮＡベクターを調製した。
次に、得られたＤＮＡベクターからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを転写し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用説明書に従って、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１））を小麦胚芽抽出液により無細胞タンパク質合成した。
次に、得られたＤＮＡベクターからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを転写し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用説明書に従って、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１））を小麦胚芽抽出液により無細胞タンパク質合成した。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現の確認］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を、ウエスタンブロット法によって確認した。まず、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識された抗Ｈｉｓタグ抗体と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
その結果、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の分子量は３３．７ｋＤａであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから（図２Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を確認することができた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を、ウエスタンブロット法によって確認した。まず、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識された抗Ｈｉｓタグ抗体と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
その結果、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の分子量は３３．７ｋＤａであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから（図２Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を確認することができた。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の精製］
無細胞タンパク質合成の反応液からＮｉカラムを用いてＨｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を精製した。転写、無細胞タンパク質合成、および精製の一連の工程は、自動合成装置（セルフリーサイエンス社）を用いて行った。Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を３回にわたって精製し、１～３回目の精製画分をそれぞれＥ１～Ｅ３とした。Ｅ１～Ｅ３を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動し、Ｒａｐｉｄ ＣＢＢ ＫＡＮＴＯ ３Ｓ（関東化学株式会社）によって染色した。
その結果、精製前の溶液（Ｓ：可溶性画分）と比較してＥ１～Ｅ３では夾雑タンパク質の存在量が低減されたことから（図２Ｂ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が精製されたことを確認することができた。
無細胞タンパク質合成の反応液からＮｉカラムを用いてＨｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を精製した。転写、無細胞タンパク質合成、および精製の一連の工程は、自動合成装置（セルフリーサイエンス社）を用いて行った。Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を３回にわたって精製し、１～３回目の精製画分をそれぞれＥ１～Ｅ３とした。Ｅ１～Ｅ３を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動し、Ｒａｐｉｄ ＣＢＢ ＫＡＮＴＯ ３Ｓ（関東化学株式会社）によって染色した。
その結果、精製前の溶液（Ｓ：可溶性画分）と比較してＥ１～Ｅ３では夾雑タンパク質の存在量が低減されたことから（図２Ｂ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が精製されたことを確認することができた。
例２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に対する抗体の作製
［マウスの免疫、ハイブリドーマ細胞の作製］
精製した３００μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をフロイントアジュバントと混合して乳化させ、ＢＡＬＢ／ｃマウスに複数回皮下注射して免疫した。免疫したマウスから１か月後にＢ細胞を回収し、ポリエチレングリコール溶液を用いてＳＰ２/０ミエローマ細胞と融合した。融合したハイブリドーマ細胞を選択培地と共に９６ウェルマイクロプレートに播種した。
［マウスの免疫、ハイブリドーマ細胞の作製］
精製した３００μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をフロイントアジュバントと混合して乳化させ、ＢＡＬＢ／ｃマウスに複数回皮下注射して免疫した。免疫したマウスから１か月後にＢ細胞を回収し、ポリエチレングリコール溶液を用いてＳＰ２/０ミエローマ細胞と融合した。融合したハイブリドーマ細胞を選択培地と共に９６ウェルマイクロプレートに播種した。
［ハイブリドーマ細胞のスクリーニングとクローニング］
次に、各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に対する反応性をＥＬＩＳＡ法およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ法により調べた。
ＥＬＩＳＡ法では、まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をＥＬＩＳＡプレート上に固定化した。プレートをブロッキングした後、プレートにハイブリドーマの培養上清を加えて反応させた後、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を加えて反応させた。その後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発色させ、その吸光度を測定した（図３Ａ）。
次に、各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に対する反応性をＥＬＩＳＡ法およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ法により調べた。
ＥＬＩＳＡ法では、まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をＥＬＩＳＡプレート上に固定化した。プレートをブロッキングした後、プレートにハイブリドーマの培養上清を加えて反応させた後、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を加えて反応させた。その後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発色させ、その吸光度を測定した（図３Ａ）。
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ法はメーカー推奨法に従って実施した。まずＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片について、ビオチン標識したタンパク質を例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。その後、合成したビオチン標識タンパク質とハイブリドーマの培養上清をプレートに添加して混合した後、室温で３０分間インキュベートした。そして、アクセプタービーズ（Protein Gコーティング）１０μｌおよびドナービーズ（ストレプトアビジンコーティング）を加えた。さらに３０分間、室温でインキュベートした後、EnVision（PerkinElmer）にて測定を行った（図３Ｂ）。
以上のスクリーニングで特定したハイブリドーマをクローニングすることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞２７種を得た。
以上のスクリーニングで特定したハイブリドーマをクローニングすることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞２７種を得た。
例３ 各モノクローナル抗体が認識するエピトープの解析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片のアミノ酸配列の各領域をそれぞれ欠損させた３種の組換えタンパク質（欠損変異体）を作製し、それらとの反応性を比較することで、各モノクローナル抗体が認識するエピトープを調べた。
各組換えタンパク質を調製するため、まず例１で作製した配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目のアミノ酸配列をコードするコムギ無細胞系発現用ベクターpEU-E01-His-TEV-SARS-CoV-2-NP(121-419)（配列番号９）を鋳型として、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～２３１番目（ｄ１）、２３２～３４０番目（ｄ２）、および３４１～４１９番目（ｄ３）のアミノ酸配列領域をそれぞれコードするｃＤＮＡ断片を欠損させた発現ベクターをそれぞれPrimeSTAR（登録商標）Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ社）の方法に従って作製した。作製したＤＮＡのベクターからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合成し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用方法に従って、各組換えタンパク質を例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片のアミノ酸配列の各領域をそれぞれ欠損させた３種の組換えタンパク質（欠損変異体）を作製し、それらとの反応性を比較することで、各モノクローナル抗体が認識するエピトープを調べた。
各組換えタンパク質を調製するため、まず例１で作製した配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目のアミノ酸配列をコードするコムギ無細胞系発現用ベクターpEU-E01-His-TEV-SARS-CoV-2-NP(121-419)（配列番号９）を鋳型として、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～２３１番目（ｄ１）、２３２～３４０番目（ｄ２）、および３４１～４１９番目（ｄ３）のアミノ酸配列領域をそれぞれコードするｃＤＮＡ断片を欠損させた発現ベクターをそれぞれPrimeSTAR（登録商標）Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ社）の方法に従って作製した。作製したＤＮＡのベクターからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合成し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用方法に従って、各組換えタンパク質を例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。
得られた各タンパク質を用いて、ウエスタンブロット法によって各モノクローナル抗体のエピトープを解析した。まず、得られた各タンパク質を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、例２で作製した各モノクローナル抗体と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
その結果、＃７は、作製した３種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの欠損変異体のうち、ｄ１とのみ反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～２３１番目の領域を認識することがわかった。＃２、＃４、＃９、＃１３、＃４０、＃４５、＃５５、＃９７、＃１０４、＃１１１、および＃１２８の１１クローンは、作製した３種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの欠損変異体のうち、ｄ２およびｄ３と反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２３２～４１９番目の領域を認識することがわかった。＃２８、＃３５、＃４７、＃６０、＃６５、＃６７、＃８６、＃９６、＃９８、＃１０２、＃１０３、＃１１２、＃１３１、＃１３５、および＃１４４の１５クローンは、作製した３種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの欠損変異体のうち、ｄ３とのみ反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４１～４１９番目の領域を認識することがわかった。
以上から、作製した抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～２３１番目、２３２～３４０番目、または３４１～４１９番目の領域中にエピトープを有する抗体に分類された（図４Ａ）。
以上から、作製した抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～２３１番目、２３２～３４０番目、または３４１～４１９番目の領域中にエピトープを有する抗体に分類された（図４Ａ）。
次に、より詳細な認識領域を調べるため、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目（ｄ４）、２０３～２２２番目（ｄ５）、１９８～２２２番目（ｄ６）、１９０～２２２番目（ｄ７）、１４７～１６２番目（ｄ８）、３９８～４１９番目（ｄ９）、３７４～４１９番目（ｄ１０）、および３３２～３５１番目（ｄ１１）のアミノ酸配列領域をそれぞれコードするｃＤＮＡ断片を欠損させた発現ベクターを作製し、上記と同様な方法で試験した。
その結果、＃７は５種の欠損変異体（ｄ４、ｄ５、ｄ６、ｄ７、およびｄ８）のうち、ｄ４、ｄ５、ｄ６およびｄ７と反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目の領域を認識することがわかった。＃２、＃４、＃９、＃１３、＃４０、＃４５、＃５５、＃９７、＃１０４、＃１１１、および＃１２８の１１クローンは、３種の欠損変異体（ｄ９、ｄ１０、およびｄ１１）のうち、ｄ１１と反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３３２～３５１番目の領域を認識することがわかった。＃３５、＃４７、＃６５、＃６７、＃８６、＃９６、＃９８、＃１０３、＃１１２、および＃１３１の１０ローンは、３種の欠損変異体（ｄ９、ｄ１０、およびｄ１１）のうち、ｄ１０とのみ反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３７４～３９７番目の領域を認識することがわかった。＃２８、＃６０、＃１０２、＃１３５、および＃１４４の５クローンは、３種の欠損変異体（ｄ９、ｄ１０、およびｄ１１）のうち、ｄ９およびｄ１０と反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３９８～４１９番目の領域を認識することがわかった。
以上から、作製した抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目の領域中にエピトープを有する抗体に分類された（図４Ｂ）。
以上から、作製した抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目の領域中にエピトープを有する抗体に分類された（図４Ｂ）。
例４ 各モノクローナル抗体の特異性の確認
各モノクローナル抗体が他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰとは反応せず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを特異的に認識するかについて、各ＮＰの組換えタンパク質を合成して調べた。
まず、他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰをコードする各ＤＮＡ配列を合成した（ジーンウィズ社に委託）（それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、および１５で表される）。なお、各ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
次に、他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰを、それぞれ例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。
各モノクローナル抗体が他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰとは反応せず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを特異的に認識するかについて、各ＮＰの組換えタンパク質を合成して調べた。
まず、他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰをコードする各ＤＮＡ配列を合成した（ジーンウィズ社に委託）（それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、および１５で表される）。なお、各ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
次に、他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰを、それぞれ例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。
得られた各タンパク質を用いて、例３に記載したウエスタンブロット法と同様に各モノクローナル抗体の特異性を解析した。結果を図５に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを認識し、他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰとは反応しない抗体が計８種（２０８～２２２領域認識抗体１種、３３２～３５１領域認識抗体３種、３７４～３９７領域認識抗体３種、３９８～４１９領域認識抗体１種）得られた。例えば、＃７、＃９、および＃９８はいずれも他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰとは反応せず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのみを特異的に認識した。他方、＃１２８および＃１４４はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよびＳＡＲＳコロナウイルス由来ＮＰと反応し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよびＳＡＲＳコロナウイルス由来ＮＰを特異的に認識した。
例５ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞の免疫染色
例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に対して反応性を示すかについて検討を行った。
まず、アフリカミドリザル腎由来細胞VeroE6/TMPRSS2（JCRB1819）に対し、国立感染症研究所から供与されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、２４時間、３７℃で感染させた。
例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に対して反応性を示すかについて検討を行った。
まず、アフリカミドリザル腎由来細胞VeroE6/TMPRSS2（JCRB1819）に対し、国立感染症研究所から供与されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、２４時間、３７℃で感染させた。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現の確認］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現を、例１に記載したウエスタンブロット法と同様に確認した。まず、前記感染細胞のライセートを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識されたモノクローナル抗体（＃７、＃９８）と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの分子量は４５．６ｋＤａであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現を確認することができた（図６Ａ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現を、例１に記載したウエスタンブロット法と同様に確認した。まず、前記感染細胞のライセートを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識されたモノクローナル抗体（＃７、＃９８）と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの分子量は４５．６ｋＤａであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現を確認することができた（図６Ａ）。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞の免疫染色］
例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）を前記感染細胞の培養液に加えて反応させた後、蛍光標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を加えて前記感染細胞を免疫染色した。その後、蛍光顕微鏡を用いて免疫染色した前記感染細胞をイメージングした。なお、非感染細胞をネガティブコントロールとした。
その結果、前記感染細胞のみについて、例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）の結合に由来する蛍光反応が認められた（図６Ｂ）。
例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）を前記感染細胞の培養液に加えて反応させた後、蛍光標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を加えて前記感染細胞を免疫染色した。その後、蛍光顕微鏡を用いて免疫染色した前記感染細胞をイメージングした。なお、非感染細胞をネガティブコントロールとした。
その結果、前記感染細胞のみについて、例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）の結合に由来する蛍光反応が認められた（図６Ｂ）。
例６ ＥＬＩＳＡ法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの検出
本発明で得られたモノクローナル抗体のうち、エピトープが異なる＃９および＃９８を用いてＥＬＩＳＡ法を実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰ（全長）を、配列番号１に基づき、例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。＃９をＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡプレートに固定化し、２％のスキムミルク溶液でブロッキングした。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄後、０、１．２５、５、２０ｎｇ／ｍＬに段階希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰをウェルに分注して反応させた。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後に、ペルオキシダーゼ標識した＃９８と反応させた。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液（ＫＰＬ社）を加えて発色させ、その吸光度を測定した。
その結果、各濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出することができた（図７）。
本発明で得られたモノクローナル抗体のうち、エピトープが異なる＃９および＃９８を用いてＥＬＩＳＡ法を実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰ（全長）を、配列番号１に基づき、例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。＃９をＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡプレートに固定化し、２％のスキムミルク溶液でブロッキングした。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄後、０、１．２５、５、２０ｎｇ／ｍＬに段階希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰをウェルに分注して反応させた。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後に、ペルオキシダーゼ標識した＃９８と反応させた。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液（ＫＰＬ社）を加えて発色させ、その吸光度を測定した。
その結果、各濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出することができた（図７）。
本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組み合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組み合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
Claims (10)
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目にある、前記抗体またはその断片。
- エピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目にある、請求項１に記載の抗体またはその断片。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
- 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- その断片が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法であって、試料を、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法。
- 試料が、生体試料である、請求項６に記載の方法。
- ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット。
- イムノクロマトストリップの形態である、請求項９に記載のキット。
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