WO2022004622A1 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法および該抗体を含むキット - Google Patents

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法および該抗体を含むキット Download PDF

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cov
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明秀 梁
悠太郎 山岡
沙也香 菊池
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公立大学法人横浜市立大学
関東化学株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody against SARS-CoV-2, a method for detecting SARS-CoV-2 using the antibody, a kit containing the antibody, and the like.
  • SARS-CoV-2 The 2019 new coronavirus (hereinafter sometimes referred to as "SARS-CoV-2”) is a coronavirus belonging to the SARS-related coronavirus, which was first confirmed to occur in 2019 near Wuhan City, China. It is pathogenic to humans and causes a new coronavirus infection (COVID-19).
  • WHO has indicated that the spread of SARS-CoV-2 infection is equivalent to a pandemic (global epidemic).
  • no cure has been established for patients infected with SARS-CoV-2. Therefore, in order to take appropriate measures to prevent the spread of infection, it is possible to detect SARS-CoV-2 infected patients by rapid testing and to examine the antibody prevalence in serum using immunological tests to determine the infection rate and infection. Investigating the route is extremely important.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Genetic tests such as real-time reverse transcription PCR using collected nasal swabs, pharyngeal swabs, sputum, etc. as samples are mainly used (Non-Patent Documents 1 and 2). ). This makes it possible to determine the presence or absence of SARS-CoV-2 infection. On the other hand, in the genetic test, SARS-CoV-2 is not detected in the sample due to the influence of the sample collection location, collection time, storage method, etc. despite being infected with SARS-CoV-2 (false negative). ) Is frequent, which is one of the causes of the spread of SARS-CoV-2.
  • SARS-CoV-2-derived protein As a SARS-CoV-2-derived protein, a spike (hereinafter, may be referred to as "S") protein that exists on the envelope surface of SARS-CoV-2 and is involved in infection to host cells is known (non-). Patent Document 3).
  • SARS-CoV-2-derived S protein is a glycoprotein in which a large number of sugar chains are bound (Non-Patent Document 3), and a protein that accurately reproduces its structure is artificially synthesized using chemical synthesis or genetically modified microorganisms. It is considered to be extremely difficult to produce the protein.
  • SARS-CoV-2-derived S protein is also considered to be prone to mutation in the amino acid sequence with the proliferation of SARS-CoV-2. Therefore, the antibody prepared against the SARS-CoV-2-derived S protein may not show an antigen-antibody reaction to the variant of the S protein, and thus the SARS-CoV-2-derived S protein. In immunological tests using antibodies against the disease, false negatives may occur in the test results depending on the sample.
  • NP protein constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid
  • SARS-CoV-2-derived NP a protein constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid
  • SARS-CoV-2-derived NP is considered to be produced in the largest amount by infection among various SARS-CoV-2-derived proteins. Therefore, it is expected that the SARS-CoV-2 derived NP can be detected relatively easily from the sample.
  • Non-Patent Document 6 an example of producing an antibody against a partial peptide of SARS-CoV-2-derived NP has already been reported (Non-Patent Document 6).
  • the antibody produced in this case also showed an antigen-antibody reaction against NP derived from MERS coronavirus and NP derived from SARS coronavirus, which are genetically closely related to SARS-CoV-2.
  • SARS-CoV-2 -derived NP does not have specificity (Non-Patent Document 6). Therefore, in an immunological test using the antibody, a false positive may occur in the test result depending on the sample.
  • An object of the present invention is to provide a means for detecting a protein constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid.
  • the present inventors As a result of analyzing SARS-CoV-2-derived NP and other coronavirus-derived NP, the present inventors have found that between the amino acid sequence of SARS-CoV-2-derived NP and the amino acid sequence of other coronavirus-derived NP. We found areas with low identity. Then, in view of the above-mentioned problems, the present invention was completed by preparing a fragment of SARS-CoV-2-derived NP corresponding to the region and using this as an immunogen to prepare an antibody according to a conventional method.
  • the present invention relates to the following.
  • An antibody or fragment thereof that binds to a protein constituting SARS-CoV-2-derived nucleocapsid, and the epitope recognized by the antibody or fragment thereof is positions 121 to 419 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the antibody or fragment thereof in.
  • the antibody or fragment thereof of [1] or [2] that specifically binds to the protein constituting the SARS-CoV-2 derived nucleocapsid are examples of the epitope recognized by the antibody or fragment thereof.
  • [4] The antibody or fragment thereof according to any one of [1] to [3], wherein the antibody is a monoclonal antibody.
  • [5] The antibody or fragment thereof according to any one of [1] to [4], wherein the fragment is a Fab fragment, a Fab / c fragment, an Fv fragment, a Fab'fragment or an F (ab') 2 fragment.
  • [6] A method for detecting a protein constituting SARS-CoV-2-derived nucleocapsid from a sample, which comprises a step of contacting the sample with the antibody or fragment thereof according to any one of [1] to [5]. Method.
  • [7] The method of [6], wherein the sample is a biological sample.
  • a kit for detecting a protein constituting a SARS-CoV-2-derived nucleocapsid which comprises the antibody of any one of [1] to [5] or a fragment thereof.
  • An antibody or fragment thereof that specifically binds to SARS-CoV-2-derived NP of the present invention a method for detecting SARS-CoV-2-derived NP using the antibody or fragment thereof, and SARS containing the antibody or fragment thereof.
  • the presence or absence of SARS-CoV-2 infection or the history of SARS-CoV-2 infection can be detected accurately, easily, and quickly by using a kit or the like for detecting proteins constituting CoV-2-derived nucleocapsid. That is, according to the present invention, it is possible to provide an immunological test having high practicality in early detection in a place where facilities such as an infection site, an epidemic prevention site and a clinical site are not sufficient.
  • the epitope recognized by the antibody or fragment thereof that specifically binds to the SARS-CoV-2-derived NP of the present invention is the amino acid sequence of the SARS-CoV-2-derived NP and the amino acid sequence of another coronavirus-derived NP. This is because the SARS-CoV-2-derived NP can be specifically detected from the sample because it is composed of regions having low identity between the two.
  • a method for detecting SARS-CoV-2 -derived NP by an antibody or a fragment thereof that specifically binds to SARS-CoV-2-derived NP of the present invention it is possible to reduce cases where false positives and false negatives occur. Is possible.
  • FIG. 1 shows the identity of the amino acid sequence between SARS-CoV-2 derived NPs and other coronavirus (SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, and 229E) derived NPs.
  • Fragment of SARS-CoV-2-derived NP (121 to amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1), which has high antigenicity among SARS-CoV-2-derived NPs and excludes motifs common to other coronavirus-derived NPs. The 419th region) is used as an immunogen for antibody production.
  • FIG. 2 shows the results of preparation of fragments of SARS-CoV-2 derived NP.
  • FIG. 2A shows the results of confirming the expression of the fragment of SARS-CoV-2-derived NP.
  • FIG. 2B shows the result of purifying a fragment of SARS-CoV-2 derived NP.
  • FIG. 3 shows the screening results of hybridoma cells producing a monoclonal antibody showing high reactivity with a fragment of SARS-CoV-2 derived NP.
  • FIG. 3A shows the screening results by the ELISA method in which a fragment of SARS-CoV-2-derived NP is immobilized.
  • FIG. 3B shows the screening results by the AlphaScreen method using a fragment of NP derived from SARS-CoV-2.
  • FIG. 4 shows the results of epitope analysis of each monoclonal antibody prepared in Example 2.
  • three types of recombinant proteins (defective variants) d1 to d3 in which each region of the amino acid sequence of the fragment of SARS-CoV-2-derived NP was deleted were prepared (schematic diagram in the upper row), and the same.
  • the results of examining the epitopes recognized by each monoclonal antibody are shown (Western blot results in the lower row).
  • FIG. 4B shows eight types of recombinant proteins (defective variants) d4 to d11 in which each region of the amino acid sequence of the fragment of SARS-CoV-2-derived NP is deleted (schematic diagram in the upper row).
  • the results of examining the epitopes recognized by each monoclonal antibody are shown (Western blot results in the lower row).
  • FIG. 5 shows the results of specificity analysis of each monoclonal antibody prepared in Example 2. The specificity of each monoclonal antibody was analyzed by Western blot using each NP derived from other human coronaviruses (SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, and 229E).
  • FIG. 6 shows the results of immunostaining of SARS-CoV-2 infected cells.
  • FIG. 6A shows the expression of SARS-CoV-2 derived NP in the infected cells.
  • FIG. 6B shows the results of immunostaining of the infected cells with the monoclonal antibody (# 7, # 98) prepared in Example 2.
  • FIG. 7 shows the results of SARS-CoV-2-derived NP detection by the ELISA method using the monoclonal antibody (# 9, # 98) prepared in Example 2.
  • One aspect of the present invention is an antibody or fragment thereof that binds to a protein constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid, and the epitope recognized by the antibody or fragment thereof is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to the antibody or a fragment thereof (hereinafter, may be referred to as "antibody of the present invention or a fragment thereof") at positions 121 to 419.
  • the epitope recognized by the antibody or fragment thereof of the present invention is at positions 208-222, 332-351, 374-397, or 398-419 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention specifically binds to the protein constituting the SARS-CoV-2 derived nucleocapsid.
  • SARS-CoV-2 refers to a coronavirus belonging to the SARS-related coronavirus, which was first confirmed to occur in 2019 near Wuhan City, China, and is used interchangeably with the "2019 new coronavirus”. Be done. SARS-CoV-2 is pathogenic to humans and causes acute respiratory disease (COVID-19). SARS-CoV-2, like other coronaviruses, is composed of spikes, nucleocapsids, integral membrane proteins, envelope proteins, and RNA. Of these, nucleocapsid binds to RNA to form NP, and spikes bound to lipids, integral membrane proteins, and envelope proteins surround it to form an envelope. The genome sequence of SARS-CoV-2 is published in GenBank accession number MN908947.3.
  • protein constituting nucleocapsid refers to a protein constituting a complex consisting of nucleocapsid and RNA, and is used interchangeably with "NP".
  • the amino acid sequence of SARS-CoV-2 derived NP is represented by SEQ ID NO: 1.
  • the "fragment of NP derived from SARS-CoV-2” is derived from the amino acid sequence of NP derived from SARS-CoV-2 and other coronaviruses in the amino acid sequence of NP derived from SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1). It refers to a fragment of a protein consisting of a region having low identity with the amino acid sequence of NP (regions 121 to 419 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1). The fragment of SARS-CoV-2-derived NP has 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the fragment of SARS-CoV-2-derived NP has 95% or more of the same sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is preferably having sex, particularly preferably 98% or more of sequence identity, and even more preferably 100% sequence identity.
  • the fragment of SARS-CoV-2 derived NP consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Since the fragment of SARS-CoV-2-derived NP corresponds to a region having low identity between the amino acid sequence of SARS-CoV-2-derived NP and the amino acid sequence of other coronavirus-derived NP, the fragment was prepared. Then, using this as an immunogen, the antibody of the present invention or a fragment thereof can be obtained according to a conventional method.
  • the antibody of the present invention is, for example, a complete immunoglobulin molecule, preferably IgM, IgD, IgE, IgA or IgG, more preferably IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 or IgG4.
  • the antibodies of the invention can be modified and / or altered antibodies, such as chimeric and humanized antibodies.
  • the antibody of the present invention may be a monoclonal or polyclonal antibody, a modified or modified monoclonal or polyclonal antibody, or a recombinantly or synthetically produced or synthesized antibody.
  • the antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody from the viewpoint of accurately, easily and rapidly detecting SARS-CoV-2 derived NP.
  • Fragments of antibodies of the invention can be parts of such immunoglobulin molecules, such as Fab fragments or VL-, VH- or CDR-regions, but fragments of antibodies of the invention are to the same extent as antibodies of the invention. It is capable of specifically recognizing and binding SARS-CoV-2 -derived NPs.
  • the antibody fragment of the present invention can be an antibody fragment and parts thereof such as separated light and heavy chains, Fab, Fab / c, Fv, Fab', F (ab') 2, and the like.
  • the fragment of the antibody of the invention is a Fab fragment, a Fab / c fragment, an Fv fragment, a Fab'fragment or an F (ab') 2 fragment.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof may be an antibody derivative such as a bifunctional antibody, or an antibody construct such as a single chain Fv (scFv), bispecific scFv or an antibody fusion protein.
  • Another aspect of the present invention is a method for detecting a protein constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid from a sample, which comprises contacting the sample with the antibody of the present invention or a fragment thereof (hereinafter referred to as the above method). , May be referred to as "the method of the present invention").
  • the sample is a biological sample.
  • the method of the invention comprises the step of detecting proteins constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsids by at least one immunological test selected from the group consisting of an ELISA method, an immunochromatography method and a filter antigen assay method. Further included.
  • the method of the present invention comprises the step of conducting an antigen-antibody reaction between the antibody of the present invention or a fragment thereof and the SARS-CoV-2 derived NP. In one aspect, the method of the invention comprises multiple steps of performing an antigen-antibody reaction between an antibody or fragment thereof of the invention and a SARS-CoV-2 derived NP. In one embodiment, the epitope of the antibody or fragment thereof of the present invention is different for each step. In one embodiment, the antibody or fragment thereof of the present invention is labeled with a labeling substance.
  • the method of the present invention is a step of conducting an antigen-antibody reaction between an unlabeled antibody of the present invention or a fragment thereof and an NP derived from SARS-CoV-2, and an antibody of the present invention labeled with a labeling substance or It comprises a step of carrying out an antigen-antibody reaction between the fragment (the epitope is different from the unlabeled antibody of the present invention or a fragment thereof) and the SARS-CoV-2 derived NP.
  • the method of the invention is a step of performing an antigen-antibody reaction between an antibody of the invention or a fragment thereof and an NP derived from SARS-CoV-2, and / or an antibody of the present invention or a fragment thereof and the antibody.
  • the step of performing an antigen-antibody reaction with an antibody that recognizes the fragment or the fragment thereof is further included.
  • the antibody or fragment thereof of the invention and / or the antibody or fragment thereof that recognizes the antibody or fragment thereof is labeled with a labeling substance.
  • the "sample” is any sample that may contain SARS-CoV-2 derived NP, and is not particularly limited, and examples thereof include biological samples.
  • the “sample” is used interchangeably with the “sample”.
  • the "biological sample” is an organ such as human or animal blood, plasma, serum, urine, semen, spinal fluid, saliva, oral mucosa, nasal passage, sweat, tears, ascites, sheep's water, feces, blood vessels or liver. , Tissues, cells, or extracts thereof, any sample that may contain SARS-CoV-2 derived NPs, preferably easy to collect, oral, tonsillar, nasal, pharyngeal, laryngeal, trachea.
  • the method for collecting these samples is not particularly limited, and a known method can be adopted. Specifically, a method using a cotton swab is often used.
  • the animal is not particularly limited as long as it can infect SARS-CoV-2, and examples thereof include dogs and cats.
  • Biological samples can be collected according to conventional methods.
  • 1 to 2 ml of the separated serum is placed in a plastic tube that can be sealed, covered, and then sealed with a parafilm.
  • a coagulant may be contained, and when a blood collection tube containing a serum separating agent is used, 1 to 2 ml of serum after centrifugation is transferred to a plastic tube (preferably a sterile tube), covered, and then sealed with parafilm. .
  • whole blood was collected in a blood collection tube containing an anticoagulant (EDTA-Na or K), and 1 to 2 ml was dispensed into a plastic tube that can be sealed and covered.
  • an anticoagulant EDTA-Na or K
  • BD Vacutainer registered trademark
  • CPT trademark
  • mononuclear cell separation blood collection tube If dispensing or blood cell separation after blood collection is not possible, blood may be collected using a PAXgene (registered trademark) RNA blood collection tube and stored frozen as it is.
  • Non-Patent Document 1 For example, for the liquid derived from the lower respiratory tract, as described in Non-Patent Document 1, sputum is collected when sputum is produced. If under ventilator control, collect tracheal aspirate using a sterile catheter under sterile operation. If it is not clinically contraindicated, consider collecting bronchoalveolar lavage fluid. Place the collected sputum or suction liquid in a plastic tube with a screw cap, cover it, and seal it with parafilm.
  • a sterile cotton swab (a flocked swab, a cotton swab containing rayon or polyester in the material, etc., a thin one for the nasal cavity) is inserted through the nose and the nasopharynx is sufficiently inserted.
  • VTM / UTM virus transport solution
  • Non-Patent Document 1 1 to 2 ml of urine is placed in a test tube (falcon tube or the like), covered, and then sealed with parafilm.
  • a test tube for example, as described in Non-Patent Document 1, about 0.1 g (red bean size) of stool is collected in a plastic tube that can be sealed, covered, and then sealed with a parafilm.
  • the labeling substance refers to an antibody or fragment thereof of the present invention and / or any substance that labels an antibody or fragment thereof that recognizes the antibody or fragment thereof, and can detect an antigen-antibody reaction. If there is, there is no particular limitation. From the viewpoint of accurately, easily and quickly detecting SARS-CoV-2 derived NP, the labeling substance may be one or more selected from enzymes, dyes, metal colloidal particles, latex particles, cellulose particles and the like. preferable.
  • an antibody or fragment thereof that recognizes an antibody or fragment thereof of the present invention refers to an antibody or fragment thereof that can specifically bind to the antibody or fragment thereof of the present invention.
  • the antibody that recognizes the antibody of the present invention or a fragment thereof is selected from the group consisting of IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE. It is preferably 1 or more, particularly preferably IgG and / or IgM, and even more preferably IgG.
  • the antibody that recognizes the antibody of the present invention or a fragment thereof can be a modified and / or altered antibody such as a chimeric and humanized antibody.
  • the antibody that recognizes the antibody of the present invention or a fragment thereof can be a monoclonal or polyclonal antibody, a modified or modified monoclonal or polyclonal antibody, or a recombinantly or synthetically produced or synthesized antibody.
  • An antibody fragment that recognizes an antibody or fragment thereof can be a portion of such immunoglobulin molecule, such as a Fab fragment or VL-, VH- or CDR-region.
  • the fragment of the antibody to be used can also specifically recognize and bind to the antibody of the present invention or a fragment thereof to the same extent as the antibody that recognizes the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • the antibody fragment that recognizes the antibody of the present invention or a fragment thereof is the antibody fragment, and the separated light chain and heavy chain, Fab, Fab / c, Fv, Fab', F (ab') 2, etc. Can be a part.
  • the antibody of the invention or a fragment of an antibody that recognizes a fragment thereof is a Fab fragment, a Fab / c fragment, an Fv fragment, a Fab'fragment or an F (ab') 2 fragment.
  • the antibody or fragment thereof that recognizes the antibody of the present invention or a fragment thereof is an antibody derivative such as a bifunctional antibody, or an antibody construct such as a single chain Fv (scFv), a bispecific scFv or an antibody fusion protein.
  • scFv single chain Fv
  • scFv bispecific scFv
  • an antibody fusion protein can be.
  • the SARS-CoV-2 derived NP is detected by any immunological test capable of detecting an antigen-antibody reaction between the antibody of the present invention or a fragment thereof and the SARS-CoV-2 derived NP.
  • Immunological tests include, for example, enzyme immunoassays (ELISA, EIA), fluorescent immunoassays (FIA), radioimmunoassays (RIA), luminescence immunoassays (LIA), enzyme antibody methods, fluorescent antibody methods, immunochromatography.
  • the SARS-CoV-2 derived NP includes a imaging method (immunoassay method), a filter antigen assay method, an immunoturbidiassay method, a latex turbidimetric method, a latex aggregation reaction measurement method, an hemagglutination reaction method, a particle aggregation reaction method, and the like.
  • the SARS-CoV-2 derived NP is preferably detected by the ELISA method and / or the immunochromatography method.
  • a calibration curve is prepared from an antigen-antibody reaction between a predetermined amount of the antibody of the present invention or a fragment thereof and an NP derived from SARS-CoV-2, and the measured value is interpolated into the calibration curve to contain SARS- CoV-2 derived NP can also be quantified.
  • kits for detecting proteins constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid Another aspect of the present invention is a kit for detecting a protein constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid, which comprises an antibody of the present invention or a fragment thereof (hereinafter, may be referred to as "kit of the present invention").
  • kit of the present invention From the viewpoint of accurately, easily and quickly detecting SARS-CoV-2 derived NP, medical staff can detect SARS-CoV-2 derived NP in places where facilities such as infection sites, epidemiological prevention sites and clinical sites are not sufficient. From the viewpoint of detection, epidemiological investigation, etc., the kit of the present invention is preferably in the form of an immunochromatographic strip.
  • an immunochromatographic strip is an antibody of the present invention or a fragment thereof and an anti-mouse immunoglobulin antibody immobilized on different sites, that is, a test line and a control line.
  • the sample pad of the immunochromatographic strip is pre-impregnated with the antibody of the present invention or a fragment thereof labeled with gold colloidal particles, latex particles, fluorescent particles, magnetic particles and the like.
  • the sample dropped on the sample pad is developed by capillarity, and when it reaches the test line, only the SARS-CoV-2 derived NP in the sample reacts, and when it reaches the control line, it is labeled with colloidal gold or the like. Only the antibody or fragment thereof reacts. The components in the other samples do not react and move to the water absorption pad.
  • composition for detecting proteins constituting SARS-CoV-2-derived nucleocapsids Another aspect of the present invention is a composition for detecting a protein constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid, which comprises the antibody of the present invention or a fragment thereof (hereinafter, may be referred to as "the composition of the present invention”). There is).
  • diagnosis method of the present invention Another aspect of the invention relates to a method for diagnosing SARS-CoV-2 infection (hereinafter, may be referred to as "diagnosis method of the present invention"), which comprises contacting a sample with an antibody or fragment thereof of the present invention. ..
  • the diagnostic method of the present invention is a step of detecting a protein constituting SARS-CoV-2 derived nucleocapsid by at least one immunological test selected from the group consisting of an ELISA method, an immunochromatography method and a filter antigen assay method. Including further.
  • the diagnostic method of the present invention comprises the step of conducting an antigen-antibody reaction between the antibody of the present invention or a fragment thereof and the SARS-CoV-2 derived NP. In one aspect, the diagnostic method of the present invention comprises a plurality of steps of conducting an antigen-antibody reaction between the antibody or fragment thereof of the present invention and SARS-CoV-2 derived NP. In one embodiment, the epitope of the antibody or fragment thereof of the present invention is different for each step. In one embodiment, the antibody or fragment thereof of the present invention is labeled with a labeling substance.
  • the diagnostic method of the present invention comprises an antigen-antibody reaction between an unlabeled antibody of the present invention or a fragment thereof and an NP derived from SARS-CoV-2, and an antibody of the present invention labeled with a labeling substance.
  • it comprises a step of carrying out an antigen-antibody reaction between the fragment thereof (the epitope is different from the unlabeled antibody of the present invention or a fragment thereof) and the SARS-CoV-2 derived NP.
  • the diagnostic method of the present invention is a step of conducting an antigen-antibody reaction between an antibody of the present invention or a fragment thereof and an NP derived from SARS-CoV-2, and / or an antibody of the present invention or a fragment thereof and the same. Further comprising performing an antigen-antibody reaction with an antibody or fragment thereof that recognizes the antibody or fragment thereof.
  • the antibody or fragment thereof of the invention and / or the antibody or fragment thereof that recognizes the antibody or fragment thereof is labeled with a labeling substance.
  • Example 1 Preparation of fragments of SARS-CoV-2-derived NP [design of immunogen] About the identity between the amino acid sequence of NP derived from SARS-CoV-2 and the amino acid sequence of NP derived from other coronaviruses (SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, 229E) based on the sequence published on the database. Analysis was performed (Fig. 1). As a result, the amino acid sequence of the SARS-CoV-2-derived NP has about 90% of the amino acid sequence identity of the amino acid sequence of the SARS coronavirus-derived NP, and the amino acid sequence of the MERS coronavirus-derived NP has the same.
  • a fragment of SARS-CoV-2-derived NP consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was prepared by the following method.
  • the SARS-CoV-2-derived NP consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the RNA sequence corresponding to the amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 3, and the DNA sequence corresponding to the RNA sequence is SEQ ID NO: 4. It is represented by.
  • the DNA sequence is codon-optimized for protein synthesis in eukaryotic cells based on the amino acid sequence.
  • the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 4 is artificially synthesized, and the DNA sequence is used as a template for PCR to correspond to the 121st to 419th regions (FIG. 1) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the 361 to 1260th region of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 4 was amplified.
  • the DNA vector was amplified by the same method using the primers shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 by the PCR method using the pEU-E01-His-TEV-MCS-N2 vector (CellFree Sciences, Inc.) as a template.
  • DNA sequence and DNA vector obtained from the PCR method were purified by agarose gel electrophoresis, and then the DNA was ligated by using In-Fusion® HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.).
  • a DNA vector was prepared.
  • the obtained DNA vector was transformed into Escherichia coli JM109 strain, and the transformed Escherichia coli was inoculated on an ampicillin-containing LB medium.
  • a DNA vector was prepared from the grown E. coli using a plasmid purification kit (Promega).
  • mRNA was transcribed from the obtained DNA vector using SP6 RNA polymerase, and a fragment (SEQ ID NO:) of SARS-CoV-2-derived NP with a His tag added according to the instruction manual of the WEPRO7240 kit manufactured by CellFree Sciences.
  • the 121st to 419th regions (FIG. 1) of the amino acid sequence represented by 1 were synthesized from cell-free proteins using a wheat germ extract.
  • the membrane was blocked with a 2% skim milk solution and then reacted with a peroxidase-labeled anti-His tag antibody. Then, after reacting with the HRP-labeled secondary antibody, a peroxidase substrate solution was added to cause light emission, and detection was performed using a chemiluminescence imaging device. As a result, the molecular weight of the fragment of SARS-CoV-2-derived NP to which the His tag was added was 33.7 kDa, and a band was confirmed at the position corresponding to the molecular weight (FIG. 2A). It was possible to confirm the expression of the fragment of NP derived from -2.
  • E1 to E3 are mixed with 2 ⁇ SDS sample buffer (125 mM Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue, and 10% 2-mercaptoethanol) and heat-treated to form a polyacrylamide gel. It was electrophoresed and stained with Rapid CBB KANTO 3S (Kanto Chemical Co., Ltd.). As a result, the abundance of contaminating proteins was reduced in E1 to E3 as compared with the solution before purification (S: soluble fraction) (FIG. 2B), and thus the fragment of SARS-CoV-2-derived NP was purified. I was able to confirm that.
  • SDS sample buffer 125 mM Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue, and 10% 2-mercaptoethanol
  • Example 2 Preparation of antibody against fragment of SARS-CoV-2 derived NP [immunity of mouse, preparation of hybridoma cell]
  • a 300 ⁇ g purified fragment of SARS-CoV-2 derived NP was mixed with Freund's adjuvant and emulsified, and BALB / c mice were subcutaneously injected multiple times for immunization.
  • B cells were harvested from immunized mice one month later and fused with SP2 / 0 myeloma cells using polyethylene glycol solution. The fused hybridoma cells were seeded in 96-well microplates with selective medium.
  • the AlphaScreen method was carried out according to the manufacturer's recommended method.
  • a biotin-labeled protein was synthesized as a cell-free protein by the same procedure as that described in Example 1. Then, the synthesized biotin-labeled protein and the culture supernatant of the hybridoma were added to the plate and mixed, and then incubated at room temperature for 30 minutes. Then, 10 ⁇ l of acceptor beads (Protein G coating) and donor beads (streptavidin coating) were added. After further incubating for 30 minutes at room temperature, measurement was performed with EnVision (PerkinElmer) (FIG. 3B). By cloning the hybridoma identified in the above screening, 27 hybridoma cells producing a monoclonal antibody showing high reactivity to the fragment of SARS-CoV-2 derived NP were obtained.
  • Example 3 Analysis of epitopes recognized by each monoclonal antibody Three types of recombinant proteins (defective variants) in which each region of the amino acid sequence of the fragment of SARS-CoV-2-derived NP is deleted are prepared and reacted with them. By comparing the sexes, the epitopes recognized by each monoclonal antibody were investigated.
  • each recombinant protein In order to prepare each recombinant protein, first, a wheat cell-free expression vector pEU-E01-His-TEV- encoding the amino acid sequence 121 to 419 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 prepared in Example 1 Using SARS-CoV-2-NP (121-419) (SEQ ID NO: 9) as a template, the amino acid sequences 121 to 231 (d1), 232 to 340 (d2), and 341 to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are used.
  • Expression vectors lacking the cDNA fragments encoding the amino acid sequence regions at position 419 (d3) were prepared according to the method of PrimeSTAR® Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio).
  • MRNA was synthesized from the prepared DNA vector using SP6 RNA polymerase, and each recombinant protein was synthesized cell-free protein by the same procedure as the method described in Example 1 according to the method of using the WEPRO7240 kit of CellFree Sciences.
  • each of the obtained proteins is mixed with 2 ⁇ SDS sample buffer (125 mM Tris-HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue, and 10% 2-mercaptoethanol) and heat-treated.
  • Polyacrylamide gel was subjected to electrophoresis.
  • the gel after electrophoresis was transferred to the PVDF membrane.
  • the membrane was blocked with a 2% skim milk solution and then reacted with each monoclonal antibody prepared in Example 2.
  • a peroxidase substrate solution was added to cause light emission, and detection was performed using a chemiluminescence imaging device.
  • # 7 did not react only with d1 among the three SARS-CoV-2-derived NP-deficient mutants produced, and thus # 7 was the 121st to 231st amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1. It turned out to recognize the area of.
  • the 11 clones of # 2, # 4, # 9, # 13, # 40, # 45, # 55, # 97, # 104, # 111, and # 128 were prepared from the three SARS-CoV-2-derived NPs. Since it did not react with d2 and d3 among the defective mutants of, it was found that the region 232 to 419 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was recognized.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 are 208 to 222 (d4), 203 to 222 (d5), 198 to 222 (d6), and 190 to 222.
  • D7 the cDNA fragments encoding the amino acid sequence regions of positions 147 to 162 (d8), 398 to 419 (d9), 374 to 419 (d10), and 332 to 351 (d11), respectively, were deleted.
  • An expression vector was prepared and tested in the same manner as above.
  • # 7 did not react with d4, d5, d6 and d7 among the five defective variants (d4, d5, d6, d7, and d8), and therefore, the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 It was found to recognize the 208th to 222nd regions of the sequence. Eleven clones of # 2, # 4, # 9, # 13, # 40, # 45, # 55, # 97, # 104, # 111, and # 128 are three defective variants (d9, d10, and). Of d11), since it did not react with d11, it was found that the region 332 to 351 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was recognized.
  • the 10 loans of # 35, # 47, # 65, # 67, # 86, # 96, # 98, # 103, # 112, and # 131 are of three defective variants (d9, d10, and d11). Of these, since it did not react only with d10, it was found that the region 374 to 397 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was recognized. The five clones # 28, # 60, # 102, # 135, and # 144 did not react with d9 and d10 among the three defective mutants (d9, d10, and d11), so the SEQ ID NOs: It was found to recognize the 398th to 419th region of the amino acid sequence represented by 1.
  • the prepared antibody was classified into an antibody having an epitope in the region of positions 208 to 222, 332 to 351, 374 to 397, or 398 to 419 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. (FIG. 4B).
  • Example 4 Confirmation of specificity of each monoclonal antibody
  • Each monoclonal antibody does not react with each NP derived from other human coronaviruses (SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, and 229E), and is derived from SARS-CoV-2. Whether or not NPs were specifically recognized was examined by synthesizing recombinant proteins of each NP.
  • each DNA sequence encoding each NP derived from other human coronaviruses SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, and 229E was synthesized (consigned to Genewith) (SEQ ID NOS: 10, 11, respectively. Represented by 12, 13, 14, and 15).
  • Each DNA sequence is codon-optimized for protein synthesis in eukaryotic cells based on the amino acid sequence.
  • each NP derived from other human coronaviruses SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, and 229E was synthesized as a cell-free protein by the same procedure as that described in Example 1.
  • each monoclonal antibody was analyzed in the same manner as in the Western blotting method described in Example 3. The results are shown in FIG. A total of 8 types of antibodies (208-222 region recognition) that recognize NPs derived from SARS-CoV-2 and do not react with each NP derived from other human coronaviruses (SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, and 229E) 1 type of antibody, 3 types of 332 to 351 region recognition antibody, 3 types of 374 to 397 region recognition antibody, and 1 type of 398 to 419 region recognition antibody) were obtained.
  • SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, and 229E human coronaviruses
  • # 7, # 9, and # 98 all do not react with each NP derived from other human coronaviruses (SARS, MERS, OC43, NL63, HKU1, and 229E) and are derived from SARS-CoV-2. Only NP was specifically recognized. On the other hand, both # 128 and # 144 reacted with SARS-CoV-2-derived NP and SARS coronavirus-derived NP, and specifically recognized SARS-CoV-2-derived NP and SARS coronavirus-derived NP.
  • Example 5 SARS-CoV-2 monoclonal antibody produced by immunostaining
  • Example 2 of infected cells was investigated whether reactive toward SARS-CoV-2 infected cells.
  • African green monkey kidney-derived cells VeroE6 / TMPRSS2 JCRB1819 were infected with SARS-CoV-2 donated by the National Institute of Infectious Diseases for 24 hours at 37 ° C.
  • the membrane was blocked with a 2% skim milk solution and then reacted with a peroxidase-labeled monoclonal antibody (# 7, # 98). Then, after reacting with the HRP-labeled secondary antibody, a peroxidase substrate solution was added to cause light emission, and detection was performed using a chemiluminescence imaging device.
  • the molecular weight of the SARS-CoV-2-derived NP was 45.6 kDa, and a band was confirmed at the position corresponding to the molecular weight, so that the expression of the SARS-CoV-2-derived NP could be confirmed. (Fig. 6A).
  • Example 6 Detection of SARS-CoV-2-derived NP by ELISA method Among the monoclonal antibodies obtained in the present invention, # 9 and # 98 having different epitopes were used to carry out the ELISA method.
  • SARS-CoV-2 derived NP (overall length) was synthesized as a cell-free protein based on SEQ ID NO: 1 by the same procedure as the method described in Example 1. # 9 was diluted with PBS to 2.5 ⁇ g / mL, immobilized on an ELISA plate, and blocked with 2% skim milk solution.
  • SARS-CoV-2-derived NP serially diluted to 0, 1.25, 5, 20 ng / mL was dispensed into wells for reaction.
  • the plates were washed with PBS-T and then reacted with peroxidase-labeled # 98.
  • a peroxidase substrate solution KPL was added to develop a color, and the absorbance thereof was measured.
  • KPL peroxidase substrate solution

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Abstract

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための手段を提供することを課題とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片、該抗体またはその断片を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する方法、および該抗体またはその断片を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット等を提供することにより、上記課題が達成された。

Description

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法および該抗体を含むキット
　本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法および該抗体を含むキット等に関する。
　２０１９新型コロナウイルス（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」と記す場合がある）は、中国武漢市付近で２０１９年に発生が初めて確認された、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスに属するコロナウイルスである。ヒトに対して病原性があり、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。
　現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大について、ＷＨＯがパンデミック（世界的流行）相当との認識を示している。他方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者の治療法は確立されていない。したがって、適切な感染拡大防止策を講じるために、迅速な検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者を発見するとともに、免疫学検査を用いて血清中の抗体保有率を調べることで、感染率や感染経路を調査することは極めて重要である。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法としては、採取した鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰等を検体とするリアルタイム逆転写ＰＣＲ法等の遺伝子検査が主に使用されている（非特許文献１および２）。これによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の有無を判断することが可能である。他方、前記遺伝子検査では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているにも関わらず検体の採取場所、採取時期、保管方法等の影響で前記検体からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が検出されない事例（偽陰性）が多発しており、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が感染拡大する一因となっている。また、遺伝子検査にはＰＣＲ中リアルタイムで蛍光を検出する特殊な装置が必要となり、結果を得るためには数時間を要することから、感染現場、防疫現場および臨床現場等の設備が十分とはいえない場所における早期発見という観点から実用性に課題が残る。そこで、正確性、迅速性および簡便性を兼ね備えた検査として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来タンパク質に対する抗原抗体反応を利用した免疫学検査が求められている。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープ表面に存在し、宿主細胞への感染に関与するスパイク（以下、「Ｓ」と記す場合がある）タンパク質が知られている（非特許文献３）。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク質は多数の糖鎖が結合した糖タンパク質であり（非特許文献３）、その構造を正確に再現したタンパク質を化学合成や遺伝子組換え微生物等を用いて人工的に作製することは極めて困難であると考えられる。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と遺伝学的に近縁関係にあるＳＡＲＳコロナウイルスに由来するＳタンパク質はＳＡＲＳコロナウイルスの増殖に伴ってアミノ酸配列に変異が生じ易いことが知られているが（非特許文献４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク質も同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖に伴ってアミノ酸配列に変異が生じ易いと考えられる。このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク質に対して作製した抗体は、該Ｓタンパク質の変異体に対しては抗原抗体反応を示さない可能性があり、よって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｓタンパク質に対する抗体を用いる免疫学検査では、検体によっては検査結果に偽陰性が生じてしまうおそれがある。
　他方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質（以下、「ＮＰ」と記す場合がある）も知られている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と遺伝学的に近縁関係にあるＳＡＲＳコロナウイルスに由来するＮＰは種々存在するＳＡＲＳコロナウイルス由来タンパク質の中でも感染により産生される量が最も多いことが知られているが（非特許文献５）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰも同様に、種々存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来タンパク質の中でも感染により産生される量が最も多いと考えられる。このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは、検体から比較的容易に検出できるものと期待される。実際に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの部分ペプチドに対する抗体を作製した事例は既に報告されている（非特許文献６）。しかし、該事例において作製された抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と遺伝学的に近縁関係にあるＭＥＲＳコロナウイルスに由来するＮＰやＳＡＲＳコロナウイルスに由来するＮＰに対しても抗原抗体反応を示し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに対する特異性を有していない（非特許文献６）。よって、該抗体を用いる免疫学検査では、検体によっては検査結果に偽陽性が生じてしまうおそれがある。
２０１９－ｎＣｏＶ（新型コロナウイルス）感染を疑う患者の検体採取・輸送マニュアル（国立感染症研究所、２０２０年４月１６日） 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１（国立感染症研究所、２０２０年３月１９日） Chen X., et al., Cell. Mol. Immunol., (2020) doi: https://doi.org/10.1038/s41423-020-0426-7 Qin E., et al., Geno., Prot. Bioinfo., 1(2), 101-107 (2003) Wang J., et al., Geno., Prot. Bioinfo., 1(2), 145-154 (2003) Li M., et al., medRxiv, (2020) doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025999
　本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰと他のコロナウイルス由来ＮＰとを分析した結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域を見出した。そして上記課題に鑑み、該領域に対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を作製し、これを免疫原として常法に従って抗体を作製することによって、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下に関する。
［１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目にある、前記抗体またはその断片。
［２］エピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目にある、［１］の抗体またはその断片。
［３］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する、［１］または［２］の抗体またはその断片。
［４］抗体が、モノクローナル抗体である、［１］～［３］のいずれかの抗体またはその断片。
［５］その断片が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、［１］～［４］のいずれかの抗体またはその断片。
［６］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法であって、試料を、［１］～［５］のいずれかの抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法。
［７］試料が、生体試料である、［６］の方法。
［８］ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む、［６］または［７］の方法。
［９］［１］～［５］のいずれかの抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット。
［１０］イムノクロマトストリップの形態である、［９］のキット。
　本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに特異的に結合する抗体またはその断片、該抗体またはその断片を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する方法、および該抗体またはその断片を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット等により、正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の有無、あるいは既往歴を検出することが可能である。すなわち、本発明により、感染現場、防疫現場および臨床現場等の設備が十分とはいえない場所における早期発見において高い実用性を備えた免疫学検査を提供することができる。これは、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに特異的に結合する抗体またはその断片の認識するエピトープが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域から構成されることから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検体から特異的に検出することが可能であるためである。
　また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰに特異的に結合する抗体またはその断片によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する方法を用いることで偽陽性および偽陰性が生じる事例を減少させることが可能である。
図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰと他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）由来ＮＰとの間のアミノ酸配列の同一性を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの中で抗原性が高く、他のコロナウイルス由来ＮＰと共通するモチーフを除いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域）を抗体作製のための免疫原とする。 図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の調製の結果を示す。図２Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を確認した結果を示す。図２ＢはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を精製した結果を示す。 図３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニング結果を示す。図３Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を固相化したＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング結果を示す。図３Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を用いたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ法によるスクリーニング結果を示す。
図４は、例２で作製した各モノクローナル抗体のエピトープ解析の結果を示す。図４Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片のアミノ酸配列の各領域をそれぞれ欠損させた３種の組換えタンパク質（欠損変異体）ｄ１～ｄ３を作製し（上段の模式図）、それらとの反応性を比較することで、各モノクローナル抗体が認識するエピトープを調べた結果を示す（下段のウエスタンブロット結果）。図４Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片のアミノ酸配列の各領域をそれぞれ欠損させた８種の組換えタンパク質（欠損変異体）ｄ４～ｄ１１を作製し（上段の模式図）、それらとの反応性を比較することで、各モノクローナル抗体が認識するエピトープを調べた結果を示す（下段のウエスタンブロット結果）。 図５は、例２で作製した各モノクローナル抗体の特異性解析の結果を示す。他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰを用いて、各モノクローナル抗体の特異性をウエスタンブロットで解析した。 図６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞の免疫染色の結果を示す。図６Ａは、前記感染細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現を示す。図６Ｂは、前記感染細胞を例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）で免疫染色した結果を示す。 図７は、例２で作製したモノクローナル抗体（＃９、＃９８）を用いたＥＬＩＳＡ法による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰ検出結果を示す。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片］
　本発明の一側面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目にある、前記抗体またはその断片（以下、「本発明の抗体またはその断片」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の抗体またはその断片の認識するエピトープは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目にある。一態様において、本発明の抗体またはその断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する。
　本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、中国武漢市付近で２０１９年に発生が初めて確認された、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスに属するコロナウイルスを指し、「２０１９新型コロナウイルス」と互換的に用いられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトに対して病原性があり、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、他のコロナウイルスと同様に、スパイク、ヌクレオカプシド、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質、およびＲＮＡより構成されている。このうちヌクレオカプシドがＲＮＡと結合してＮＰを形成し、脂質と結合したスパイク、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム配列はGenBankアクセッション番号MN908947.3で公開されている。
　本発明において、「ヌクレオカプシドを構成するタンパク質」は、ヌクレオカプシドおよびＲＮＡからなる複合体を構成するタンパク質を指し、「ＮＰ」と互換的に用いられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列は配列番号１で表される。
　本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列（配列番号１）における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域）からなるタンパク質の断片を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有する。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、９５％以上の配列同一性を有することが好ましく、９８％以上の配列同一性を有することが特に好ましく、１００％の配列同一性を有することがさらに好ましい。一態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域に対応することから、該断片を作製し、これを免疫原として常法に従って本発明の抗体またはその断片を得ることができる。
　本発明の抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン分子、好ましくはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。また、本発明の抗体は、キメラのおよびヒト化した抗体等の、修飾および／または変化した抗体で有り得る。また、本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、修飾または変化したモノクローナルまたはポリクローナル抗体、または組換えもしくは合成的に産生したまたは合成した抗体であり得る。本発明の抗体は、正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
　本発明の抗体の断片は、ＦａｂフラグメントまたはＶＬ－、ＶＨ－またはＣＤＲ－領域等の、かかる免疫グロブリン分子の部分であり得るが、本発明の抗体の断片も、本発明の抗体と同程度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを特異的に認識し結合し得るものである。本発明の抗体の断片は、抗体フラグメント、ならびに、分離した軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の、それらの部分であり得る。一態様において、本発明の抗体の断片は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
　また、本発明の抗体またはその断片は、二機能性抗体等の抗体派生物、または、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖまたは抗体融合タンパク質等の抗体構築物であり得る。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法］
　本発明の別の側面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法であって、試料を、本発明の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法（以下、「本発明の方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の方法において、試料は生体試料である。一態様において、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む。
　一態様において、本発明の方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を含む。一態様において、本発明の方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を複数回含む。一態様において、該工程の各回毎に本発明の抗体またはその断片はエピトープが異なる。一態様において、本発明の抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。例えば、本発明の方法は、無標識の本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程、および標識物質により標識されている本発明の抗体またはその断片（前記無標識の本発明の抗体またはその断片とはエピトープが異なる）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を含む。
　一態様において、本発明の方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程、および／または、本発明の抗体またはその断片と該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の抗体またはその断片、および／または該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
　本発明において、「試料」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰが含まれ得る任意の試料であり、特に限定されないが、例えば生体試料が挙げられる。本発明において、「試料」は「検体」と互換的に用いられる。
　本発明において、「生体試料」は、ヒトまたは動物の血液、血漿、血清、尿、精液、髄液、唾液、口腔粘膜、鼻水、汗、涙、腹水、羊水、糞便、血管もしくは肝臓等の臓器、組織、細胞、またはそれらの抽出物等、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰが含まれ得る任意の試料であり、好ましくは、採取が容易である、口腔、扁桃腺、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支および肺等からの細胞および分泌液や、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、うがい液、喀痰、気管吸引液、気管支肺胞洗浄液等である。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いた方法が多用される。動物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し得るものであれば特に限定されず、例えば、イヌ、ネコ等が挙げられる。
　生体試料は常法に従い採取することができる。
　例えば、血清は、非特許文献１に記載のとおり、分離後の血清を密栓できるプラスティックチューブに１～２ｍｌ入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。凝固剤が入っていてもよく、血清分離剤入りの採血管を用いた場合は、遠心後の血清１～２ｍｌをプラスチックチューブ（滅菌チューブが望ましい）に移し蓋をした後、パラフィルムでシールする。
　例えば、全血は、非特許文献１に記載のとおり、血液凝固阻止剤（ＥＤＴＡ－ＮａまたＫ）入りの採血管に採取し、１～２ｍｌを密栓できるプラスティックチューブに分注し、蓋をした後、パラフィルムでシールする。可能であれば、血球分離し、末梢血単核球を細胞保存液に懸濁して凍結保存する。末梢血単核球の分離はＢＤバキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）単核球分離用採血管を使うと簡便である。また、採血後の分注や血球分離ができない場合は、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ採血管を用いて採血し、そのまま凍結保存しておいてもよい。
　例えば、下気道由来液は、非特許文献１に記載のとおり、喀痰が出る場合喀痰を採取する。人工呼吸器管理下にある場合には、無菌的な操作のもとに、滅菌されたカテーテルを使って気管吸引液を採取する。臨床的に禁忌とならない場合は気管支肺胞洗浄液の採取も検討する。採取した喀痰または吸引液はスクリューキャップ付きプラスティックチューブに入れ蓋をし、パラフィルムでシールする。
　例えば、鼻咽頭ぬぐい液は、非特許文献１に記載のとおり、滅菌綿棒（フロックスワブや材質にレーヨンやポリエステルを含む綿棒等。鼻腔用の細いもの）を鼻孔から挿入し、上咽頭を十分にぬぐい、綿棒を１～３ｍｌのウイルス輸送液（ＶＴＭ／ＵＴＭ）が入った滅菌スピッツ管に入れ蓋をし、パラフィルムでシールする。ウイルス輸送液が無い場合はＰＢＳや生理食塩水等を用いる。
　例えば、尿は、非特許文献１に記載のとおり、１～２ｍｌを試験管（ファルコンチューブ等）に入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。
　例えば、便は、非特許文献１に記載のとおり、０．１ｇ程度（小豆大）を密栓できるプラスティックチューブに採取して蓋をした後、パラフィルムでシールする。
　本発明において、「標識物質」は、本発明の抗体またはその断片、および／または該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片を標識する任意の物質を指し、抗原抗体反応を検出できるものであれば特に限定されない。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、標識物質は、酵素、色素、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子等から選択される１以上のものであることが好ましい。
　本発明において、「本発明の抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片」は、本発明の抗体またはその断片に特異的に結合し得る抗体またはその断片を指す。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥからなる群から選択される１以上のものであることが好ましく、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭであることが特に好ましく、ＩｇＧであることがさらに好ましい。また、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体は、キメラのおよびヒト化した抗体等の、修飾および／または変化した抗体で有り得る。また、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、修飾または変化したモノクローナルまたはポリクローナル抗体、または組換えもしくは合成的に産生したまたは合成した抗体であり得る。
　本発明の抗体またはその断片を認識する抗体の断片は、ＦａｂフラグメントまたはＶＬ－、ＶＨ－またはＣＤＲ－領域等の、かかる免疫グロブリン分子の部分であり得るが、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体の断片も、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体と同程度に本発明の抗体またはその断片を特異的に認識し結合し得るものである。本発明の抗体またはその断片を認識する抗体の断片は、抗体フラグメント、ならびに、分離した軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の、それらの部分であり得る。一態様において、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体の断片は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
　また、本発明の抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片は、二機能性抗体等の抗体派生物、または、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖまたは抗体融合タンパク質等の抗体構築物であり得る。
　本発明において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの抗原抗体反応を検出できる任意の免疫学検査によって検出される。免疫学検査は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法（イムノクロマト法）、フィルター抗原アッセイ法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、または粒子凝集反応法等を含む。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは、ＥＬＩＳＡ法および／またはイムノクロマト法によって検出されることが好ましい。また、所定量の本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの抗原抗体反応から検量線を作成し、測定値を検量線に内挿することによって試料中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを定量することもできる。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット］
　本発明の別の側面は、本発明の抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット（以下、「本発明のキット」と記す場合がある）に関する。正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点、医療従事者が感染現場、防疫現場および臨床現場等の設備が十分とはいえない場所でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出する観点、疫学調査をする観点等から、本発明のキットは、イムノクロマトストリップの形態であることが好ましい。
　例えば、イムノクロマトストリップは、本発明の抗体またはその断片および抗マウス免疫グロブリン抗体をそれぞれ別の部位、すなわちテストラインおよびコントロールラインに固定化したものである。イムノクロマトストリップのサンプルパットには、金コロイド粒子、ラテックス粒子、蛍光粒子、磁気粒子等で標識された本発明の抗体またはその断片を予め含浸させておく。サンプルパットに滴下された試料は、毛細管現象により展開され、テストラインに到達すると試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのみが反応し、コントロールラインに到達すると金コロイド等で標識された本発明の抗体またはその断片のみが反応する。その他の試料中の成分は反応せずに吸水パッドまで移動する。テストラインおよびコントロールラインの色の濃さ、反射強度、吸光度、蛍光強度、または磁気強度等をイムノクロマトリーダーで測定することにより、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出できるだけでなく、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを定量できる。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための組成物］
　本発明の別の側面は、本発明の抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するための組成物（以下、「本発明の組成物」と記す場合がある）に関する。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法］
　本発明の別の側面は、試料を本発明の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法（以下、「本発明の診断方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の診断方法は、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む。
　一態様において、本発明の診断方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を含む。一態様において、本発明の診断方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を複数回含む。一態様において、該工程の各回毎に本発明の抗体またはその断片はエピトープが異なる。一態様において、本発明の抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。例えば、本発明の診断方法は、無標識の本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程、および標識物質により標識されている本発明の抗体またはその断片（前記無標識の本発明の抗体またはその断片とはエピトープが異なる）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程を含む。
　一態様において、本発明の診断方法は、本発明の抗体またはその断片とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰとの間で抗原抗体反応を行う工程、および／または、本発明の抗体またはその断片と該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の抗体またはその断片、および／または該抗体またはその断片を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
例１　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の調製
［免疫原の設計］
　データベース上に公開された配列に基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ）由来ＮＰのアミノ酸配列との間の同一性について解析を行った（図１）。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列は、ＳＡＲＳコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約９０％のアミノ酸配列の同一性を有し、ＭＥＲＳコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約４７％のアミノ酸配列の同一性を有し、その他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列に対して約３０％以下のアミノ酸配列の同一性を有することがわかった。
　そこで、コロナウイルス間で共通して保存されているモチーフ（ＦＹＹＬＧＴＧＰ）を除いた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰ中のアミノ酸１２１～４１９の領域を免疫原とすることにした。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の無細胞タンパク質合成］
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を以下の方法により調製した。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列に対応するＲＮＡ配列は配列番号３で表され、該ＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列は配列番号４で表される。なお、該ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
　まず、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を人工合成し、該ＤＮＡ配列を鋳型とするＰＣＲ法により、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１）に対応する配列番号４で表されるＤＮＡ配列の３６１～１２６０番目の領域を増幅した。１μＭ フォワードプライマー（配列番号５）５μＬ、１μＭ リバースプライマー（配列番号６）５μＬ、配列番号４で表されるＤＮＡ配列が挿入された１０ｎｇ／μＬ ＤＮＡベクター（ｐＵＣ５７（ジーンウィズ社））１μＬ、PrimeSTAR（登録商標）Max DNA Polymerase(タカラバイオ社)２５μＬ、および超純水１４μＬを混合して全量５０μＬの反応液を調製した。ＰＣＲ法を表１に示すサーマルサイクラーの設定で行った。これにより、配列番号４で表されるＤＮＡ配列の３６１～１２６０番目の領域を含むＤＮＡ配列を得た。そして、pEU-E01-His-TEV-MCS-N2ベクター（セルフリーサイエンス社）を鋳型とするＰＣＲ法により、配列番号７および８に示したプライマーを用いて同様な手法でＤＮＡベクターを増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、前記ＰＣＲ法から得られたＤＮＡ配列およびＤＮＡベクターをアガロースゲル電気泳動により精製した後、In-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit（タカラバイオ社）を用いることで、ＤＮＡを連結させてＤＮＡベクターを調製した。得られたＤＮＡベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換後の大腸菌をアンピシリン含有ＬＢ培地に播種した。増殖後の大腸菌からプラスミド精製キット（プロメガ社）を使用してＤＮＡベクターを調製した。
　次に、得られたＤＮＡベクターからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを転写し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用説明書に従って、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１））を小麦胚芽抽出液により無細胞タンパク質合成した。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現の確認］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を、ウエスタンブロット法によって確認した。まず、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識された抗Ｈｉｓタグ抗体と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
　その結果、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の分子量は３３．７ｋＤａであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから（図２Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を確認することができた。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の精製］
　無細胞タンパク質合成の反応液からＮｉカラムを用いてＨｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を精製した。転写、無細胞タンパク質合成、および精製の一連の工程は、自動合成装置（セルフリーサイエンス社）を用いて行った。Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を３回にわたって精製し、１～３回目の精製画分をそれぞれＥ１～Ｅ３とした。Ｅ１～Ｅ３を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動し、Ｒａｐｉｄ ＣＢＢ ＫＡＮＴＯ ３Ｓ（関東化学株式会社）によって染色した。
　その結果、精製前の溶液（Ｓ：可溶性画分）と比較してＥ１～Ｅ３では夾雑タンパク質の存在量が低減されたことから（図２Ｂ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が精製されたことを確認することができた。
例２　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に対する抗体の作製
［マウスの免疫、ハイブリドーマ細胞の作製］
　精製した３００μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をフロイントアジュバントと混合して乳化させ、ＢＡＬＢ／ｃマウスに複数回皮下注射して免疫した。免疫したマウスから１か月後にＢ細胞を回収し、ポリエチレングリコール溶液を用いてＳＰ２/０ミエローマ細胞と融合した。融合したハイブリドーマ細胞を選択培地と共に９６ウェルマイクロプレートに播種した。
［ハイブリドーマ細胞のスクリーニングとクローニング］
　次に、各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に対する反応性をＥＬＩＳＡ法およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ法により調べた。
　ＥＬＩＳＡ法では、まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をＥＬＩＳＡプレート上に固定化した。プレートをブロッキングした後、プレートにハイブリドーマの培養上清を加えて反応させた後、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を加えて反応させた。その後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発色させ、その吸光度を測定した（図３Ａ）。
　ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ法はメーカー推奨法に従って実施した。まずＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片について、ビオチン標識したタンパク質を例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。その後、合成したビオチン標識タンパク質とハイブリドーマの培養上清をプレートに添加して混合した後、室温で３０分間インキュベートした。そして、アクセプタービーズ（Protein Gコーティング）１０μｌおよびドナービーズ（ストレプトアビジンコーティング）を加えた。さらに３０分間、室温でインキュベートした後、EnVision（PerkinElmer）にて測定を行った（図３Ｂ）。
　以上のスクリーニングで特定したハイブリドーマをクローニングすることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片に高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞２７種を得た。
例３　各モノクローナル抗体が認識するエピトープの解析
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片のアミノ酸配列の各領域をそれぞれ欠損させた３種の組換えタンパク質（欠損変異体）を作製し、それらとの反応性を比較することで、各モノクローナル抗体が認識するエピトープを調べた。
　各組換えタンパク質を調製するため、まず例１で作製した配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目のアミノ酸配列をコードするコムギ無細胞系発現用ベクターpEU-E01-His-TEV-SARS-CoV-2-NP(121-419)（配列番号９）を鋳型として、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～２３１番目（ｄ１）、２３２～３４０番目（ｄ２）、および３４１～４１９番目（ｄ３）のアミノ酸配列領域をそれぞれコードするｃＤＮＡ断片を欠損させた発現ベクターをそれぞれPrimeSTAR（登録商標）Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ社）の方法に従って作製した。作製したＤＮＡのベクターからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合成し、セルフリーサイエンス社のWEPRO7240キットの使用方法に従って、各組換えタンパク質を例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。
　得られた各タンパク質を用いて、ウエスタンブロット法によって各モノクローナル抗体のエピトープを解析した。まず、得られた各タンパク質を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、例２で作製した各モノクローナル抗体と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
　その結果、＃７は、作製した３種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの欠損変異体のうち、ｄ１とのみ反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～２３１番目の領域を認識することがわかった。＃２、＃４、＃９、＃１３、＃４０、＃４５、＃５５、＃９７、＃１０４、＃１１１、および＃１２８の１１クローンは、作製した３種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの欠損変異体のうち、ｄ２およびｄ３と反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２３２～４１９番目の領域を認識することがわかった。＃２８、＃３５、＃４７、＃６０、＃６５、＃６７、＃８６、＃９６、＃９８、＃１０２、＃１０３、＃１１２、＃１３１、＃１３５、および＃１４４の１５クローンは、作製した３種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの欠損変異体のうち、ｄ３とのみ反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４１～４１９番目の領域を認識することがわかった。
　以上から、作製した抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～２３１番目、２３２～３４０番目、または３４１～４１９番目の領域中にエピトープを有する抗体に分類された（図４Ａ）。
　次に、より詳細な認識領域を調べるため、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目（ｄ４）、２０３～２２２番目（ｄ５）、１９８～２２２番目（ｄ６）、１９０～２２２番目（ｄ７）、１４７～１６２番目（ｄ８）、３９８～４１９番目（ｄ９）、３７４～４１９番目（ｄ１０）、および３３２～３５１番目（ｄ１１）のアミノ酸配列領域をそれぞれコードするｃＤＮＡ断片を欠損させた発現ベクターを作製し、上記と同様な方法で試験した。
　その結果、＃７は５種の欠損変異体（ｄ４、ｄ５、ｄ６、ｄ７、およびｄ８）のうち、ｄ４、ｄ５、ｄ６およびｄ７と反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目の領域を認識することがわかった。＃２、＃４、＃９、＃１３、＃４０、＃４５、＃５５、＃９７、＃１０４、＃１１１、および＃１２８の１１クローンは、３種の欠損変異体（ｄ９、ｄ１０、およびｄ１１）のうち、ｄ１１と反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３３２～３５１番目の領域を認識することがわかった。＃３５、＃４７、＃６５、＃６７、＃８６、＃９６、＃９８、＃１０３、＃１１２、および＃１３１の１０ローンは、３種の欠損変異体（ｄ９、ｄ１０、およびｄ１１）のうち、ｄ１０とのみ反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３７４～３９７番目の領域を認識することがわかった。＃２８、＃６０、＃１０２、＃１３５、および＃１４４の５クローンは、３種の欠損変異体（ｄ９、ｄ１０、およびｄ１１）のうち、ｄ９およびｄ１０と反応しなかったことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３９８～４１９番目の領域を認識することがわかった。
　以上から、作製した抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目の領域中にエピトープを有する抗体に分類された（図４Ｂ）。
例４　各モノクローナル抗体の特異性の確認
　各モノクローナル抗体が他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰとは反応せず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを特異的に認識するかについて、各ＮＰの組換えタンパク質を合成して調べた。
　まず、他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰをコードする各ＤＮＡ配列を合成した（ジーンウィズ社に委託）（それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、および１５で表される）。なお、各ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
　次に、他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰを、それぞれ例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。
　得られた各タンパク質を用いて、例３に記載したウエスタンブロット法と同様に各モノクローナル抗体の特異性を解析した。結果を図５に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを認識し、他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰとは反応しない抗体が計８種（２０８～２２２領域認識抗体１種、３３２～３５１領域認識抗体３種、３７４～３９７領域認識抗体３種、３９８～４１９領域認識抗体１種）得られた。例えば、＃７、＃９、および＃９８はいずれも他のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）に由来する各ＮＰとは反応せず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのみを特異的に認識した。他方、＃１２８および＃１４４はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよびＳＡＲＳコロナウイルス由来ＮＰと反応し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよびＳＡＲＳコロナウイルス由来ＮＰを特異的に認識した。
例５　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞の免疫染色
　例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に対して反応性を示すかについて検討を行った。
　まず、アフリカミドリザル腎由来細胞VeroE6/TMPRSS2（JCRB1819）に対し、国立感染症研究所から供与されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、２４時間、３７℃で感染させた。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現の確認］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現を、例１に記載したウエスタンブロット法と同様に確認した。まず、前記感染細胞のライセートを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識されたモノクローナル抗体（＃７、＃９８）と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
　その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの分子量は４５．６ｋＤａであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの発現を確認することができた（図６Ａ）。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞の免疫染色］
　例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）を前記感染細胞の培養液に加えて反応させた後、蛍光標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を加えて前記感染細胞を免疫染色した。その後、蛍光顕微鏡を用いて免疫染色した前記感染細胞をイメージングした。なお、非感染細胞をネガティブコントロールとした。
　その結果、前記感染細胞のみについて、例２で作製したモノクローナル抗体（＃７、＃９８）の結合に由来する蛍光反応が認められた（図６Ｂ）。
例６　ＥＬＩＳＡ法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの検出
　本発明で得られたモノクローナル抗体のうち、エピトープが異なる＃９および＃９８を用いてＥＬＩＳＡ法を実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰ（全長）を、配列番号１に基づき、例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成した。＃９をＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡプレートに固定化し、２％のスキムミルク溶液でブロッキングした。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄後、０、１．２５、５、２０ｎｇ／ｍＬに段階希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰをウェルに分注して反応させた。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後に、ペルオキシダーゼ標識した＃９８と反応させた。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液（ＫＰＬ社）を加えて発色させ、その吸光度を測定した。
　その結果、各濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰを検出することができた（図７）。
　本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組み合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組み合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。

Claims (10)

  1. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に結合する抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片の認識するエピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目にある、前記抗体またはその断片。
  2. 　エピトープが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２０８～２２２番目、３３２～３５１番目、３７４～３９７番目、または３９８～４１９番目にある、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  3. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質に特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
  4. 　抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  5. 　その断片が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  6. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を試料から検出する方法であって、試料を、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法。
  7. 　試料が、生体試料である、請求項６に記載の方法。
  8. 　ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法およびフィルター抗原アッセイ法からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出する工程をさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
  9. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドを構成するタンパク質を検出するためのキット。
  10. 　イムノクロマトストリップの形態である、請求項９に記載のキット。
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