CN116194584A

CN116194584A - 抗SARS-CoV-2抗体、使用其检测SARS-CoV-2的方法及包含其的试剂盒

Info

Publication number: CN116194584A
Application number: CN202180046743.0A
Authority: CN
Inventors: 梁明秀; 山冈悠太郎; 菊池纱也香
Original assignee: Kanto Chemical Co Inc; Yokohama City University
Current assignee: Kanto Chemical Co Inc; Yokohama City University
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2023-05-30
Also published as: US20230235028A1; JP2022022607A; EP4174085A1; KR20230028482A; WO2022004622A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种用于检测构成SARS‑CoV‑2衍生核壳体的蛋白的手段。通过提供与构成SARS‑CoV‑2衍生核壳体的蛋白结合的抗体或其片段、使用该抗体或其片段检测构成SARS‑CoV‑2衍生核壳体的蛋白的方法及包含该抗体或其片段的用于检测SARS‑CoV‑2衍生核壳体的蛋白的试剂盒等实现上述课题。

Description

抗SARS-CoV-2抗体、使用其检测SARS-CoV-2的方法及包含其的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种针对SARS-CoV-2的抗体、使用该抗体检测SARS-CoV-2的方法及包含该抗体的试剂盒等。

背景技术

2019新型冠状病毒(以下，有时记作“SARS-CoV-2”)是于2019年首次确认产生的属于SARS相关冠状病毒的冠状病毒。对人类具有致病性，会引发新型冠状病毒感染(COVID-19)。

目前，WHO认为SARS-CoV-2的传播相当于世界性大流行(pandemic)。另一方面，尚未建立治疗SARS-CoV-2感染患者的方法。因此，通过快速检查发现SARS-CoV-2感染患者，并通过免疫学检查调查血清中的抗体携带率来调查感染率和传染途径，以采取适当的疫情预防措施至关重要。

SARS-CoV-2的检测方法主要使用基因检测，如以采集的鼻腔拭液、咽拭液、咳痰等为样本的实时逆转录PCR方法等(非专利文献1和非专利文献2)。这使得判断是否存在SARS-CoV-2感染成为可能。另一方面，在基因检测中，尽管感染了SARS-CoV-2，但由于样本的采集地点、采集时间和储存方法等的影响，样本中没有检测到SARS-CoV-2(假阴性)的情况时有发生，这是SARS-CoV-2传播的原因之一。另外，基因检测需要PCR中实时检测荧光的特殊装置，为了得到结果需要数小时，因此，从在感染现场、防疫现场及临床现场等设备不足的场所进行早期发现的观点来看，实用性上还存在着课题。因此，作为一种兼具准确性、快速性和简便性的检查，需要利用抗原抗体反应对SARS-CoV-2衍生蛋白进行免疫学检查。

作为一种SARS-CoV-2衍生蛋白，已知有存在于SARS-CoV-2包膜表面并参与感染宿主细胞的刺突(以下，有时记作“S”)蛋白(非专利文献3)。然而，SARS-CoV-2衍生S蛋白是由许多糖链结合而成的糖蛋白(非专利文献3)，因此，使用化学合成或基因重组微生物等人工制备精确再现其结构的蛋白极其困难。另外，已知与SARS-CoV-2有遗传学亲缘关系的SARS冠状病毒衍生的S蛋白随着SARS冠状病毒的增殖而氨基酸序列更容易产生变异(非专利文献4)，而SARS-CoV-2衍生S蛋白同样也被认为随着SARS-CoV-2的增殖而氨基酸序列更容易发生变异。因此，针对SARS-CoV-2衍生S蛋白制备的抗体可能不会对S蛋白的突变体产生抗原抗体反应，因此，在使用针对SARS-CoV-2衍生S蛋白的抗体进行免疫学检查时，某些样本的检测结果可能出现假阴性。

另一方面，作为SARS-CoV-2衍生蛋白，还已知有构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白(以下，有时记作“NP”)。已知来自与SARS-CoV-2有遗传学亲缘关系的SARS-冠状病毒的NP在各种SARS-冠状病毒衍生蛋白中由感染产生的量最大(非专利文献5)，而SARS-CoV-2衍生NP也同样被认为是在各种SARS-CoV-2衍生蛋白中由感染产生的量最大的NP。因此，SARS-CoV-2衍生NP有望相对容易地从样本中检测到。事实上，制备针对SARS-CoV-2衍生NP部分肽的抗体的案例已经有报道(非专利文献6)。然而，该案例中制备的抗体对来自与SARS-CoV-2有遗传学亲缘关系的MERS冠状病毒的NP和SARS冠状病毒衍生的NP也表现出抗原抗体反应，对SARS-CoV-2衍生NP不具有特异性(非专利文献6)。因此，在使用抗体的免疫学检查中，有些样本的检查结果可能出现假阳性。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：2019-nCoV(新型冠状病毒)感染疑似患者的样本采集运输手册(国立感染症研究所，2020年4月16日)

非专利文献2：病原体检测手册2019-nCoV Ver.2.9.1(国立感染症研究所，2020年3月19日)

非专利文献3：Chen X.,et al.,Cell.Mol.Immunol.,(2020)doi:https://doi.org/10.1038/s41423-020-0426-7

非专利文献4：Qin E.,et al.,Geno.,Prot.Bioinfo.,1(2),101-107(2003)

非专利文献5：Wang J.,et al.,Geno.,Prot.Bioinfo.,1(2),145-154(2003)

非专利文献6：Li M.,et al.,medRxiv,(2020)doi:https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025999

发明内容

技术问题

本发明的课题在于提供一种用于检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的手段。

解决问题的手段

本发明人等对SARS-CoV-2衍生NP和其它冠状病毒衍生NP进行分析后，在SARS-CoV-2衍生NP的氨基酸序列和其它冠状病毒衍生NP的氨基酸序列之间发现了同源性低的区域。并且，鉴于上述课题，制作与该区域对应的SARS-CoV-2衍生NP的片段，以其为免疫原，通过常规方法制作抗体，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下方案。

[1]一种抗体或其片段，其与构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白结合，该抗体或其片段所识别的表位位于序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第419位。

[2]根据[1]的抗体或其片段，其中，表位位于序列号1所示的氨基酸序列的第208位～第222位、第332位～351位、第374位～第397位或第398位～第419位。

[3]根据[1]或[2]所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段与构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白特异性结合。

[4]根据[1]～[3]中任一项的抗体或其片段，其中，抗体为单克隆抗体。

[5]根据[1]～[4]中任一项的抗体或其片段，其中，其片段为Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab'片段或F(ab')₂片段。

[6]一种由样品检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的方法，包括使样品与[1]～[5]中任一项的抗体或其片段接触的工序。

[7]根据[6]的方法，其中，样品为生物体样品。

[8]根据[6]或[7]的方法，其中，进一步包括下述工序：

通过选自由ELISA法、免疫层析法及过滤抗原检测法组成的组中的至少一种免疫学检查检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的工序。

[9]一种用于检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的试剂盒，其包含[1]～[5]中任一项的抗体或其片段。

[10]根据[9]的试剂盒，其中，所述试剂盒为免疫层析试纸条的形式。

发明的效果

通过本发明的与SARS-CoV-2衍生NP特异性结合的抗体或其片段、使用该抗体或其片段检测SARS-CoV-2衍生NP的方法及包含该抗体或其片段的用于检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的试剂盒等，可以准确、简便且快速地检测有无SARS-CoV-2感染或既往史。即，根据本发明，能够提供一种在感染现场、防疫现场及临床现场等设备不足的场所中进行早期发现时具备实用性的免疫学检查。这是因为，本发明的与SARS-CoV-2衍生NP特异性结合的抗体或其片段所识别的表位由在SARS-CoV-2衍生NP的氨基酸序列和其它冠状病毒衍生NP的氨基酸序列之间同源性低的区域组成，因此可以从样本中特异性检测SARS-CoV-2衍生NP。

另外，通过使用利用本发明的与SARS-CoV-2衍生NP特异性结合的抗体或其片段检测检测SARS-CoV-2衍生NP的方法，可以减少产生假阳性及假阴性的案例。

附图说明

图1示出SARS-CoV-2衍生NP和其它冠状病毒(SARS、MERS、OC43、NL63、HKU1及229E)衍生NP之间的氨基酸序列的同源性。在SARS-CoV-2衍生NP中，将抗原性高且除去与其它冠状病毒衍生NP相同的基序后的SARS-CoV-2衍生NP的片段(序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第419位的区域)作为用于制作抗体的免疫原。

图2示出SARS-CoV-2衍生NP的片段的制备结果。图2A示出SARS-CoV-2衍生NP的片段的表达的确认结果。图2B示出SARS-CoV-2衍生NP的片段的纯化结果。

图3示出产生对于SARS-CoV-2衍生NP的片段显示高反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选结果。图3A示出了通过固相化有SARS-CoV-2衍生NP的片段的ELISA法进行筛选的结果。图3B示出了使用SARS-CoV-2衍生NP的片段通过AlphaScreen法进行筛选的结果。

图4示出了示例2中制作的各单克隆抗体的表位分析的结果。图4A示出制作分别缺失了SARS-CoV-2衍生NP的片段的氨基酸序列的各区域后的三种重组蛋白(缺失变异体)d1～d3(上方的示意图)，通过比较与它们的反应性来考察各单克隆抗体所识别的表位而得到的结果(下方的蛋白印迹结果)。图4B示出制作分别缺失了SARS-CoV-2衍生NP的片段的氨基酸序列的各区域后的八种重组蛋白(缺失变异体)d4～d11(上方的示意图)，通过比较与它们的反应性来考察各单克隆抗体所识别的表位而得到的结果(下方的蛋白印迹结果)。

图5示出示例2中制作的各单克隆抗体的特异性分析的结果。使用其它人冠状病毒(SARS、MERS、OC43、NL63、HKU1及229E)衍生的各NP，通过蛋白印迹分析各单克隆抗体的特异性。

图6示出SARS-CoV-2感染细胞的免疫染色的结果。图6A示出所述感染细胞中的SARS-CoV-2衍生NP的表达。图6B示出了所述感染细胞通过示例2中制作的单克隆抗体(#7、#98)进行免疫染色后的结果。

图7示出了通过使用示例2中制作的单克隆抗体(#9、#98)的ELISA法检测SARS-CoV-2衍生NP时的结果。

具体实施方式

在本说明书中，只要没有另外定义，则本说明书中使用的所有技术术语及科学术语具有与本领域技术人员通常的理解相同的含义。本说明书中所参考的全部专利、申请及其它出版物和信息整体通过参考引用在本说明书中。

[与构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白结合的抗体或其片段]

本发明的一方面涉及与构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白结合的抗体或其片段(以下，有时记作“本发明的抗体或其片段”)，该抗体或其片段所识别的表位位于序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第419位。在一种方案中，本发明的抗体或其片段所识别的表位位于序列号1所示的氨基酸序列的第208位～第222位、第332位～351位、第374位～第397位或第398位～第419位。在一种方案中，本发明的抗体或其片段与构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白特异性结合。

在本发明中，“SARS-CoV-2”是2019年最先确认产生的属于SARS相关冠状病毒的冠状病毒，可与“2019新型冠状病毒”交替使用。SARS-CoV-2对人类具有致病性，会引起急性呼吸道疾病(COVID-19)。与其它冠状病毒一样，SARS-CoV-2也由突刺、核壳体、内源膜蛋白、包膜蛋白及RNA构成。其中，核壳体与RNA结合形成NP，与脂质结合的突刺、内源膜蛋白、包膜蛋白围绕NP形成包膜。需要说明的是，SARS-CoV-2的基因组序列已按照GenBank登录编号MN908947.3公开。

在本发明中，“构成核壳体的蛋白”是指构成由核壳体及RNA组成的复合物的蛋白，可与“NP”交替使用。SARS-CoV-2衍生NP的氨基酸序列如序列号1所示。

在本发明中，“SARS-CoV-2衍生NP的片段”是指由SARS-CoV-2衍生NP的氨基酸序列(序列号1)中在SARS-CoV-2衍生NP的氨基酸序列和其它冠状病毒衍生NP的氨基酸序列之间同源性低的区域(序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第419位的区域)组成的蛋白的片段。SARS-CoV-2衍生NP的片段相对于序列号2所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性。从准确、简便且快速地检测SARS-CoV-2衍生NP的观点出发，SARS-CoV-2衍生NP的片段相对于序列号2所示的氨基酸序列优选具有95％以上的序列同源性，特别优选具有98％以上的序列同源性，进一步优选具有100％的序列同源性。在一种方案中，SARS-CoV-2衍生NP的片段由序列号2所示的氨基酸序列组成。SARS-CoV-2衍生NP的片段与在SARS-CoV-2衍生NP的氨基酸序列和其它冠状病毒衍生NP的氨基酸序列之间同源性低的区域相对应，因此能够制作该片段，将其作为免疫原，按照常规方法得到本发明的抗体或其片段。

本发明的抗体例如为完整的免疫球蛋白分子，优选为IgM、IgD、IgE、IgA或IgG，更优选为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4。另外，本发明的抗体可以为嵌合及人源抗体等经修饰和/或改造的抗体。另外，本发明的抗体可以为单克隆或多克隆抗体、经修饰和/或改造的单克隆或多克隆抗体、或重组或者合成方式产生的或合成的抗体。从准确、简便且快速检测SARS-CoV-2衍生NP的观点出发，本发明的抗体优选为单克隆抗体。

本发明的抗体的片段可以为Fab片段或VL-、VH-或CDR-区域等该免疫球蛋白分子的部分，但本发明的抗体的片段也可以与本发明的抗体等同地特异性识别并结合SARS-CoV-2衍生NP。本发明的抗体的片段可以为抗体片段、以及经单离的轻链及重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab'、F(ab')₂等的相应的部分。在一种方案中，本发明的抗体的片段为Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab'片段或F(ab')₂片段。

另外，本发明的抗体或其片段可以为双功能性抗体等抗体派生物、或单链Fv(scFv)、双特异性scFv或抗体融合蛋白等抗体构建物。

[从样品中检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的方法]

本发明的另一方面涉及从样品中检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的方法(以下，有时也记作“本发明的方法”)，包括使样品与本发明的抗体或其片段接触的工序。在一种方案中，在本发明的方法中，样品为生物体样品。在一种方案中，本发明的方法进一步包括通过选自由ELISA法、免疫层析法及过滤抗原检测法构成的组的至少一种免疫学检查检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的工序。

在一种方案中，本发明的方法包括在本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序。在一种方案中，本发明的方法包括多个在本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序。在一种方案中，每次该工序中，本发明的抗体或其片段的表位不同。在一种方案中，本发明的抗体或其片段经标识物质标识。例如，本发明的方法包括：在无标识的本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序；及在经标识物质标识的本发明的抗体或其片段(与所述无标识的本发明的抗体或其片段的表位不同)和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序。

在一种方案中，本发明的方法进一步包括：在本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序、和/或在本发明的抗体或其片段和识别该抗体或其片段的抗体或其片段之间进行抗原抗体反应的工序。在一种方案中，本发明的抗体或其片段和/或识别该抗体或其片段的抗体或其片段经标识物质标识。

在本发明中，“样品”是可包含SARS-CoV-2衍生NP的任意样品，不受特别限定，可列举例如生物体样品。在本发明中，“样品”可以与“样本”交替使用。

在本发明中，“生物体样品”是人或动物的血液、血浆、血清、尿液、精液、脊髓液、唾液、口腔粘膜、鼻涕、汗液、泪液、腹水、羊水、粪便、血管或者肝脏等脏器、组织、细胞或这些的提取物等可包含SARS-CoV-2衍生NP的任意样品、优选为容易采集的来自口腔、扁桃腺、鼻腔、咽、喉、气管、支气管及肺等的细胞及分泌液、或鼻腔拭子液、咽拭子液、漱口水、咳痰、气管吸引液、支气管肺泡灌洗液等。采集这些样本的方法不受特别限定，可以采用公知的方法。具体而言，多采用利用棉签的方法。动物只要可感染SARS-CoV-2即可，没有特别限定，可列举例如：犬、猫等。

生物体样品能够按照常规方法来采集。

例如，作为血清，如非专利文献1所述，将1～2ml分离后的血清放入可封闭的塑料管中，盖上盖子后，用石腊膜密封。还可以加入凝血剂，在使用加入了血清分离剂的采血管时，将1～2ml离心后的血清转移至塑料管(优选杀菌管)中并盖上盖子，然后用石腊膜密封。

例如，作为全血，如非专利文献1所述，采集全血至加入血液抗凝剂(EDTA-Na或K)的采血管中，将1～2ml分装至可封闭的塑料管中，盖上盖子后，用石腊膜密封。如可能，进行血细胞分离，并将外周血单核细胞悬浮在细胞保存液中冷冻保存。外周血单核细胞的分离使用BD Vacutainer(注册商标)CPT(商标)单核细胞分离用采血管较为简便。另外，当采血后不能进行分注或血细胞分离时，也可以预先使用PAXgene(注册商标)RNA采血管进行采血，并直接冷冻保存。

例如，作为来自下呼吸道的液体，如非专利文献1所述，当咳出痰时，采集咳痰。当处于人工呼吸器管理下时，在无菌操作下，使用杀菌后的导管采集气管吸引液。当没有临床禁忌时，也可以考虑采集支气管肺泡灌洗液。采集到的咳痰或吸引液放入带有螺纹盖的塑料管中并盖上盖子，用石腊膜密封。

例如，作为鼻咽拭子液，如非专利文献1所述，从鼻孔中插入杀菌棉签(一次性采样拭子及材质包括造丝或聚酯的棉签等。用于鼻腔的细物)，充分擦拭上咽喉，将棉签放入装有1～3ml病毒运输液(VTM/UTM)的杀菌尖底离心管中并盖上盖子，用石腊膜密封。当无病毒运输液时，则使用PBS或生理盐水等。

例如，作为尿液，如非专利文献1所示，将1～2ml放入试管(Falcon管等)中并盖上盖子后，用石腊膜密封。

例如，作为粪便，如非专利文献1所述，将约0.1g(小豆大小)采集至可密闭的塑料管中并盖上盖子后，用石腊膜密封。

在本发明中，“标识物质”是指标识本发明的抗体或其片段和/或识别该抗体或其片段的抗体或其片段的任意物质，只要能够检测抗原抗体反应，则不受特别限定。从准确、简便且快速地检测SARS-CoV-2衍生NP的观点出发，标识物质优选为选自酶、色素、金属胶体粒子、乳胶粒子、纤维素粒子等中的一种以上。

在本发明中，“识别本发明的抗体或其片段的抗体或其片段”是指可与本发明的抗体或其片段特异性结合的抗体或其片段。从准确、简便且快速地检测SARS-CoV-2衍生NP的观点出发，识别本发明的抗体或其片段的抗体优选为选自由IgG、IgM、IgA、IgD及IgE组成的组中的一种以上，特别优选为IgG和/或IgM，进一步优选为IgG。另外，识别本发明的抗体或其片段的抗体可以为嵌合及人源化抗体等经修饰和/或改造的抗体。另外，识别本发明的抗体或其片段的抗体可以为单克隆或多克隆抗体、经修饰或改造的单克隆或多克隆抗体、或重组或者合成方式产生的或合成的抗体。

识别本发明的抗体或其片段的抗体的片段可以为Fab片段或VL-、VH-或CDR-区域等该免疫球蛋白分子的部分，但识别本发明的抗体或其片段的抗体的片段也可以与识别本发明的抗体或其片段的抗体通等地特异性是识别且结合本发明的抗体或其片段。识别本发明的抗体或其片段的抗体的片段可以为抗体片段、以及分离的轻链及重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab'、F(ab')₂等相应的部分。在一种方案中，识别本发明的抗体或其片段的抗体的片段为Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab'片段或F(ab')₂片段。

另外，识别本发明的抗体或其片段的抗体或其片段可以为双功能性抗体等抗体派生物或单链Fv(scFv)、双特异性scFv或抗体融合蛋白等抗体构建物。

在本发明中，SARS-CoV-2衍生NP通过能够检测本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP的抗原抗体反应的任意免疫学检查来检测。免疫学检查包括例如酶联免疫检测法(ELISA、EIA)、荧光免疫检测法(FIA)、放射免疫检测法(RIA)、发光免疫检测法(LIA)、酶联抗体法、荧光抗体法、免疫色谱法(免疫层析法)、过滤抗原检测法、免疫比浊法、乳胶比浊法、乳胶凝集反应检测法、红细胞凝集反应法、或粒子凝集反应法等。从准确、简便且快速地检测SARS-CoV-2衍生NP的观点出发，SARS-CoV-2衍生NP优选通过ELISA法和/或免疫层析法检测。另外，还可以根据规定量的本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP的抗原抗体反应制作标准曲线，并将测定值内插于标准曲线，由此定量样品中所含的SARS-CoV-2衍生NP。

[用于检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的试剂盒]

本发明的另一方面涉及用于检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的试剂盒(以下，有时记作“本发明的试剂盒”)，其包含本发明的抗体或其片段。从准确、简便且快速地检测SARS-CoV-2衍生NP的观点及医务工作者者在感染现场、防疫现场及临床现场等设备不足的场所检测SARS-CoV-2衍生NP的观点、进行流行病学调查的观点等出发，本发明的试剂盒优选为免疫层析试纸条的形式。

例如，免疫层析试纸条是将本发明的抗体或其片段及抗鼠免疫球蛋白抗体分别固定化于其它部位、即测试线及对照线而成的。免疫层析试纸条的样品垫中预先含浸有经金胶体粒子、乳胶粒子、荧光粒子、磁粒子等标识后的本发明的抗体或其片段。滴加于样品垫的样品通过毛细管现象展开，达到测试线后，仅样品中的SARS-CoV-2衍生NP进行反应，到达对照线后，仅经金胶体等标识后的本发明的抗体或其片段进行反应。样品中的其它成分不进行反应，而是移动至吸水垫。通过利用免疫色谱读数仪测定测试线及对照线的颜色深浅、反射强度、吸光度、荧光强度、或磁强度等，不仅能够检测样品中的SARS-CoV-2衍生NP，还能够定量样品中的SARS-CoV-2衍生NP。

[用于测定构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的组合物]

本发明的另一方面涉及用于检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的组合物(以下，有时记作“本发明的组合物”)，其包含本发明的抗体或其片段。

[SARS-CoV-2感染的诊断方法]

本发明的另一方面涉及SARS-CoV-2感染的诊断方法(以下，有时记作“本发明的诊断方法”)，其包括使样品与本发明的抗体或其片段接触的工序。在一种方案中，本发明的诊断方法进一步包括通过选自由ELISA法、免疫层析法及过滤抗原检测法组成的组中的至少一种免疫学检查检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的工序。

在一种方案中，本发明的诊断方法包括在本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序。在一种方案中，本发明的诊断方法包括多个在本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序。在一种方案中，每个该工序中，本发明的抗体或其片段的表位不同。在一种方案中，本发明的抗体或其片段经标识物质标识。例如，本发明的诊断方法包括：在无标识的本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序；及在经标识物质标识的本发明的抗体或其片段(与所述无标识的本发明的抗体或其片段的表位不同)和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序。

在一种方案中，本发明的诊断方法进一步包括在本发明的抗体或其片段和SARS-CoV-2衍生NP之间进行抗原抗体反应的工序、和/或在本发明的抗体或其片段和识别该抗体或其片段的抗体或其片段之间进行抗原抗体反应的工序。在一种方案中，本发明的抗体或其片段和/或识别该抗体或其片段的抗体或其片段经标识物质标识。

【实施例】

示例1SARS-CoV-2衍生NP的片段的制备

[免疫原的设计]

基于数据库上公开的序列，分析SARS-CoV-2衍生NP的氨基酸序列和其它冠状病毒(SARS、MERS、OC43、NL63、HKU1、229E)衍生NP的氨基酸序列之间的同源性(图1)。结果可知，SARS-CoV-2衍生NP的氨基酸序列相对于SARS冠状病毒衍生NP的氨基酸序列具有约90％的氨基酸序列的同源性，相对于MERS冠状病毒衍生NP的氨基酸序列具有约47％的氨基酸序列的同源性，相对于其它冠状病毒衍生NP的氨基酸序列具有约30％以下的氨基酸序列的同源性。

因此，将除冠状病毒之间均保守的基序(FYYLGTGP)之外的SARS-CoV-2衍生NP中的氨基酸121～419的区域作为免疫原。

[SARS-CoV-2衍生NP的片段的无细胞蛋白合成]

通过下面的方法制备由序列号2所示的氨基酸序列组成的SARS-CoV-2衍生NP的片段。需要说明的是，SARS-CoV-2衍生NP由序列号1所示的氨基酸序列组成，与该氨基酸序列对应的RNA序列如序列号3所示，与该RNA序列对应的DNA序列如序列号4所示。需要说明的是，该DNA序列基于氨基酸序列进行密码子优化以用于在真核细胞中合成蛋白。

首先，人工合成序列号4所示的DNA序列，通过以该DNA序列为模板的PCR法，扩增与序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第419位的区域(图1)对应的序列号4所示的DNA序列的361～1260位的区域。将1μM正向引物(序列号5)5μL、1μM反向引物(序列号6)5μL、插入有序列号4所示的DNA序列的10ng/μL DNA载体(pUC57(Genewit公司))1μL、PrimeSTAR(注册商标)Max DNA Polymerase(Takara Bio公司)25μL及超纯水14μL混合，制备总量50μL的反应液。按照表1所示的热循环仪的设置进行PCR法。由此，得到包含序列号4所示的DNA序列的361～1260位的区域的DNA序列。接着，通过以pEU-E01-His-TEV-MCS-N2载体(CellFreeSciences公司)为模板的PCR法，使用序列号7及8所示的引物，通过相同方法扩增DNA载体。

【表1】

表1热循环仪的设置

接着，通过琼脂糖凝胶电泳纯化由所述PCR法得到的DNA序列及DNA载体之后，通过使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit(Takara Bio公司)，连接DNA，从而制备DNA载体。将得到的DNA载体转化至大肠杆菌JM109株，将转化后的大肠杆菌接种至含有氨苄青霉素的LB培养基。使用质粒纯化试剂盒(Promega公司)从增殖后的大肠杆菌中制备DNA载体。

接着，使用SP6RNA聚合酶从得到的DNA载体中转录mRNA，按照CellFree Sciences公司的WEPRO7240试剂盒的使用说明书，通过小麦胚芽提取液无细胞蛋白合成添加有His标签的SARS-CoV-2衍生NP的片段(序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第419位的区域(图1))。

[确认SARS-CoV-2衍生NP的片段的表达]

通过蛋白印迹法确认SARS-CoV-2衍生NP的片段的表达。首先，将添加有His标签的SARS-CoV-2衍生NP的片段与2×SDS样品缓冲液(125mM Tris-HCl、4％SDS、20％甘油、0.01％溴酚蓝及10％2-巯基乙醇)混合并进行热处理，供给聚丙烯酰胺凝胶用于电泳。接着，将电泳后的凝胶转录至PVDF膜。将膜用2％脱脂牛奶溶液封闭后，与经过氧化物酶标识的抗His标签抗体进行反应。然后，与HRP标识二抗进行反应，然后，加入过氧化物酶底物溶液使其发光，使用化学发光拍摄装置进行检测。

结果表明，添加有His标签的SARS-CoV-2衍生NP的片段的分子量为33.7kDa，在与该分子量对应的位置确认到条带(图2A)，由此能够确认SARS-CoV-2衍生NP的片段的表达。

[SARS-CoV-2衍生NP的片段的纯化]

使用Ni柱从无细胞蛋白合成的反应液中纯化添加有His标签的SARS-CoV-2衍生NP的片段。转录、无细胞蛋白合成及纯化的一系列工序使用自动合成装置(CellFreeSciences公司)来进行。将添加有His标签的SARS-CoV-2衍生NP的片段纯化三次，将第1～3次的纯化组分分别作为E1～E3。将E1～E3与2×SDS样品缓冲液(125mM Tris-HCl、4％SDS、20％甘油、0.01％溴酚蓝及10％2-巯基乙醇)混合并进行热处理，供给聚丙烯酰胺凝胶用于电泳，通过Rapid CBB KANTO 3S(关东化学株式会社)染色。

结果表明，与纯化前的溶液(S：可溶性组分)相比，E1～E3中夹杂蛋白的存在量降低(图2B)，由此能够确认SARS-CoV-2衍生NP的片段被纯化。

示例2针对SARS-CoV-2衍生NP的片段的抗体的制作

[小鼠的免疫、杂交瘤细胞的制作]

将纯化后的300μg SARS-CoV-2衍生NP的片段与弗氏佐剂混合，使其乳化，向BALB/c小鼠多次皮下注射用于免疫。一个月后，从免疫后的小鼠中回收B细胞，使用聚乙二醇溶液与SP2/0骨髓瘤细胞融合。将融合后的杂交瘤细胞与选择培养基一同接种于96孔微孔板。

[杂交瘤细胞的筛选及克隆]

接着，通过ELISA法及AlphaScreen法考察各杂交瘤所产生的单克隆抗体对于SARS-CoV-2衍生NP的片段的反应性。

在ELISA法中，首先，将SARS-CoV-2衍生NP的片段固定化在ELISA板上。将板封闭后，向板中加入杂交瘤的培养上清并进行反应，然后，加入经过氧化物酶标识的羊抗鼠免疫球蛋白抗体并进行反应。然后，加入过氧化物酶底物溶液使其显色，测定其吸光度(图3A)。

AlphaScreen法按照制造商推荐的方法来实施。首先，针对SARS-CoV-2衍生NP的片段，按照与示例1所述的方法相同的流程，无细胞蛋白合成经生物素标识的蛋白。然后，将合成的生物素标识蛋白和杂交瘤的培养上清添加在板中并混合，然后，在室温下孵育30分钟。接着，加入受体珠(Protein G包被)10μl及供体珠(链霉亲和素包被)。再于室温下孵育30分钟后，通过EnVision(PerkinElmer)进行测定(图3B)。

通过克隆按照以上的筛选所确定的杂交瘤，得到27种会产生对SARS-CoV-2衍生NP的片段显示高反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

示例3各单克隆抗体所识别的表位的分析

制作分别缺失了SARS-CoV-2衍生NP的片段的氨基酸序列的各区域后的三种重组蛋白(缺失变异体)，通过比较与它们的反应性，考察各单克隆抗体所识别的表位。

为了制备各重组蛋白，首先，以编码示例1中制作的序列号1所示的氨基酸序列的第121～第419位的氨基酸序列的小麦无细胞系表达用载体pEU-E01-His-TEV-SARS-CoV-2-NP(121-419)(序列号9)作为模板，分别按照PrimeSTAR(注册商标)Mutagenesis Basal Kit(Takara Bio公司)的方法制作缺失了分别编码序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第231位(d1)、第232位～第340位(d2)及第341～第419位(d3)的氨基酸序列区域的cDNA片段的表达载体。使用SP6RNA聚合酶由所制作的DNA的载体合成mRNA，通过CellFree Sciences公司的WEPRO7240试剂盒的使用方法，按照与示例1所述的方法相同的流程，无细胞蛋白合成各重组蛋白。

使用得到的各蛋白，通过蛋白印迹法分析各单克隆抗体的表位。首先，将得到的各蛋白与2×SDS样品缓冲液(125mM Tris-HCl、4％SDS、20％甘油、0.01％溴酚蓝及10％2-巯基乙醇)混合并进行热处理，供给聚丙烯酰胺凝胶用于电泳。接着，将电泳后的凝胶转录至PVDF膜。将膜用2％脱脂牛奶溶液封闭后，使其与示例2中制作的各单克隆抗体反应。然后，与HRP标识二抗进行反应，接着，加入过氧化物酶底物溶液使其发光，使用化学发光拍摄装置进行检测。

结果表明，#7仅不与所制作的三种SARS-CoV-2衍生NP的缺失变异体中的d1进行反应，由此可知，其识别序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第231位的区域。#2、#4、#9、#13、#40、#45、#55、#97、#104、#111及#128这11个克隆不与所制作的三种SARS-CoV-2衍生NP的缺失变异体中的d2及d3进行反应，由此可知，其识别序列号1所示的氨基酸序列的第232位～第419位的区域。#28、#35、#47、#60、#65、#67、#86、#96、#98、#102、#103、#112、#131、#135及#144这15个克隆仅不与所制作的三种SARS-CoV-2衍生NP的缺失变异体中的d3进行反应，由此可知，其识别序列号1所示的氨基酸序列的第341～第419位的区域。

综上所述，所制作的抗体分类为在序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第231位、第232位～第340位或第341～第419位的区域中具有表位的抗体(图4A)。

接着，为了考察更详细的识别区域，制作缺失了分别编码序列号1所示的氨基酸序列的第208位～第222位(d4)、203～222位(d5)、第198位～第222位(d6)、第190位～第222位(d7)、第147位～第162位(d8)、第398位～第419位(d9)、第374位～第419位(d10)及第332位～351位(d11)的氨基酸序列区域的cDNA片段的表达载体，并通过与上述相同的方法进行试验。

结果表明，#7不与五种缺失变异体(d4、d5、d6、d7及d8)中的d4、d5、d6及d7进行反应，由此可知，其识别序列号1所示的氨基酸序列的第208位～第222位的区域。#2、#4、#9、#13、#40、#45、#55、#97、#104、#111及#128的11个克隆不与三种缺失变异体(d9、d10及d11)中的d11进行反应，由此可知，其识别序列号1所示的氨基酸序列的第332位～351位的区域。#35、#47、#65、#67、#86、#96、#98、#103、#112及#131这10个克隆仅不与三种缺失变异体(d9、d10及d11)中的d10进行反应，由此可知，其识别序列号1所示的氨基酸序列的第374位～第397位的区域。#28、#60、#102、#135及#144这5个克隆不与三种缺失变异体(d9、d10及d11)中的d9及d10进行反应，由此可知，其识别序列号1所示的氨基酸序列的第398位～第419位的区域。

综上所述，所制作的抗体分类为在序列号1所示的氨基酸序列的第208位～第222位、第332位～351位、第374位～第397位或第398位～第419位的区域中具有表位的抗体(图4B)。

示例4各单克隆抗体的特异性的确认

各单克隆抗体不与来自其它人冠状病毒(SARS、MERS、OC43、NL63、HKU1及229E)的各NP进行反应，针对其是否特异性识别SARS-CoV-2衍生NP，合成各NP的重组蛋白进行考察。

首先，合成编码来自其它人冠状病毒(SARS、MERS、OC43、NL63、HKU1及229E)的各NP的各DNA序列(委托Genewit公司)(分别如序列号10、11、12、13、14及15所示)。需要说明的是，各DNA序列基于氨基酸序列进行密码子优化，以用于在真核细胞中合成蛋白。

接着，分别按照与示例1所述的方法相同的流程，无细胞蛋白合成来自其它人冠状病毒(SARS、MERS、OC43、NL63、HKU1及229E)的各NP。

使用得到的各蛋白，与示例3中记载的蛋白印迹法相同地分析各单克隆抗体的特异性。将结果示于图5。共得到八种识别SARS-CoV-2衍生NP且不与来自其它人冠状病毒(SARS、MERS、OC43、NL63、HKU1及229E)的各NP进行反应的抗体(一种识别208～222区域的抗体、三种识别332～351区域的抗体、三种识别374～397区域的抗体、一种识别398～419区域的抗体)。例如，#7、#9及#98均不与来自其它人冠状病毒(SARS、MERS、OC43、NL63、HKU1及229E)的各NP进行反应、并仅特异性识别SARS-CoV-2衍生NP。另一方面，#128及#144均与SARS-CoV-2衍生NP及SARS冠状病毒衍生NP进行反应，并特异性识别SARS-CoV-2衍生NP及SARS冠状病毒衍生NP。

示例5SARS-CoV-2感染细胞的免疫染色

针对示例2中制作的单克隆抗体(#7、#98)是否对SARS-CoV-2感染细胞显示反应性进行探讨。

首先，使来自非洲绿猴肾脏的细胞VeroE6/TMPRSS2(JCRB1819)在37℃下感染由国立感染症研究所提供的SARS-CoV-2 24小时。

[SARS-CoV-2衍生NP的表达的确认]

与示例1中记载的蛋白印迹法相同地，确认SARS-CoV-2衍生NP的表达。首先，将所述感染细胞的裂解物与2×SDS样品缓冲液(125mM Tris-HCl、4％SDS、20％甘油、0.01％溴酚蓝及10％2-巯基乙醇)混合并进行热处理，供给聚丙烯酰胺凝胶用于电泳。接着，将电泳后的凝胶转录至PVDF膜。将膜用2％脱脂牛奶溶液封闭之后，使其与经过氧化物酶标识的单克隆抗体(#7、#98)反应。然后，与HRP标识二抗进行反应，接着，加入过氧化物酶底物溶液使其发光，使用化学发光拍摄装置进行检测。

结果表明，SARS-CoV-2衍生NP的分子量为45.6kDa，在与该分子量对应的位置确认到条带，由此能够确认SARS-CoV-2衍生NP的表达(图6A)。

[SARS-CoV-2感染细胞的免疫染色]

将示例2中制作的单克隆抗体(#7、#98)加入所述感染细胞的培养液进行反应后，加入经荧光标识的羊抗鼠免疫球蛋白抗体，免疫染色所述感染细胞。然后，使用荧光显微镜对免疫染色后的所述感染细胞成像。需要说明的是，将非感染细胞作为阴性对照。

结果表明，仅所述感染细胞可见来自示例2中制作的单克隆抗体(#7、#98)的结合的荧光反应(图6B)。

示例6通过ELISA法检测SARS-CoV-2衍生NP

使用本发明中得到的单克隆抗体中表位不同的#9及#98实施ELISA法。基于序列号1，按照与示例1所述的方法相同的流程，无细胞蛋白合成SARS-CoV-2衍生NP(全长)。用PBS将#9稀释至2.5μg/mL后固定化于ELISA板，用2％的脱脂牛奶溶液封闭。将板用PBS-T清洗后，将连续稀释为0、1.25、5、20ng/mL的SARS-CoV-2衍生NP分装在孔中进行反应。将板用PBS-T清洗后，与经过氧化物酶标识的#98进行反应。将板用PBS-T清洗后，加入过氧化物酶底物溶液(KPL公司)使其显色，测定其的吸光度。

结果表明，能够检测各浓度的SARS-CoV-2衍生NP(图7)。

本说明书中记载的本发明的各种特征能够进行各种组合，通过这些组合得到的方案均属于本发明的范围，包括本说明书中未具体记载的组合。另外，本领域技术人员可以理解，可以不脱离本发明的精神进行各种变动，包括该变动的均等物也包括在本发明的范围内。因此，应理解，本说明书中记载的方案仅为示例，并非旨在限制本发明的范围。

序列表

<110> 公立大学法人横滨市立大学

关东化学株式会社

<120> 抗SARS-CoV-2抗体、使用其检测SARS-CoV-2的方法及包含其的试剂盒

<130> PCT3103KA

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 2

<211> 299

<212> PRT

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 2

Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu

1 5 10 15

Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala

20 25 30

Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro

35 40 45

Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser

50 55 60

Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly

65 70 75 80

Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp

85 90 95

Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser

100 105 110

Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys

115 120 125

Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala

130 135 140

Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu

145 150 155 160

Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr

165 170 175

Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser

180 185 190

Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly

195 200 205

Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro

210 215 220

Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr

225 230 235 240

Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala

245 250 255

Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val

260 265 270

Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln

275 280 285

Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala

290 295

<210> 3

<211> 1260

<212> RNA

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 3

auguccgaca augggcccca gaaucagcga aaugcgccua ggauuaccuu uggcggaccc 60

agcgacagca caggcagcaa ccagaauggc gagagaagug gcgcucgcuc uaagcagcgc 120

cgcccucaag ggcucccgaa uaacaccgcc uccugguuca cugcacucac gcagcauggg 180

aaggaggauc ugaaauuccc cagaggucaa gguguuccua ucaacaccaa cuccucaccc 240

gacgaucaga ucggcuauua uaggcgggcu acaagacgga uacggggcgg ugacgggaaa 300

augaaagauc ugagcccacg gugguacuuc uacuaucucg guacuggucc ugaggcagga 360

cugccauaug gggcaaacaa agaugggauc auuugggugg cuaccgaagg ugccuugaac 420

accccaaagg accacauagg cacgagaaac cccgccaaua augcugcaau cguccugcaa 480

cugccacaag gaacaacucu ccccaaaggg uucuacgcag aagggucacg aggcggaucu 540

caagccucaa guaggagcuc uuccaggagu cgaaauagcu cccggaacuc aacacccgga 600

agcucuagag gcaccagccc ugcucgcaug gccggaaaug gcggagaugc agccuuggca 660

cugcuucuuc uggaccgccu gaaccagcug gaaagcaaga ugucagggaa gggucagcag 720

cagcagggcc aaacugucac caagaaaagu gccgcagagg cuucaaagaa gcccaggcag 780

aaacggacug ccaccaaagc cuacaacgug acucaggcgu uuggccguag agggccagaa 840

cagacgcagg gaaacuuugg ggaucaggaa cuuaucaggc agggcacuga cuacaaacau 900

uggccccaga uugcccaguu ugcuccgucu gcgucugcuu ucuucggaau gucucguauu 960

ggcauggagg uaacaccguc cggaacaugg cugaccuaua caggagccau caaacuggau 1020

gacaaggacc cuaacuuuaa ggaccaagug auucuccuga auaagcacau cgaugccuac 1080

aaaaccuucc cuccaacgga gccuaagaag gacaagaaga agaaggccga ugagacucaa 1140

gcccugccac agcgccagaa gaaacaacag acagugaccu ugcuuccagc ugccgaucug 1200

gacgacuuuu ccaaacagcu gcagcagagc augagcagug cggauuccac acaggcuuga 1260

<210> 4

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 4

atgtccgaca atgggcccca gaatcagcga aatgcgccta ggattacctt tggcggaccc 60

agcgacagca caggcagcaa ccagaatggc gagagaagtg gcgctcgctc taagcagcgc 120

cgccctcaag ggctcccgaa taacaccgcc tcctggttca ctgcactcac gcagcatggg 180

aaggaggatc tgaaattccc cagaggtcaa ggtgttccta tcaacaccaa ctcctcaccc 240

gacgatcaga tcggctatta taggcgggct acaagacgga tacggggcgg tgacgggaaa 300

atgaaagatc tgagcccacg gtggtacttc tactatctcg gtactggtcc tgaggcagga 360

ctgccatatg gggcaaacaa agatgggatc atttgggtgg ctaccgaagg tgccttgaac 420

accccaaagg accacatagg cacgagaaac cccgccaata atgctgcaat cgtcctgcaa 480

ctgccacaag gaacaactct ccccaaaggg ttctacgcag aagggtcacg aggcggatct 540

caagcctcaa gtaggagctc ttccaggagt cgaaatagct cccggaactc aacacccgga 600

agctctagag gcaccagccc tgctcgcatg gccggaaatg gcggagatgc agccttggca 660

ctgcttcttc tggaccgcct gaaccagctg gaaagcaaga tgtcagggaa gggtcagcag 720

cagcagggcc aaactgtcac caagaaaagt gccgcagagg cttcaaagaa gcccaggcag 780

aaacggactg ccaccaaagc ctacaacgtg actcaggcgt ttggccgtag agggccagaa 840

cagacgcagg gaaactttgg ggatcaggaa cttatcaggc agggcactga ctacaaacat 900

tggccccaga ttgcccagtt tgctccgtct gcgtctgctt tcttcggaat gtctcgtatt 960

ggcatggagg taacaccgtc cggaacatgg ctgacctata caggagccat caaactggat 1020

gacaaggacc ctaactttaa ggaccaagtg attctcctga ataagcacat cgatgcctac 1080

aaaaccttcc ctccaacgga gcctaagaag gacaagaaga agaaggccga tgagactcaa 1140

gccctgccac agcgccagaa gaaacaacag acagtgacct tgcttccagc tgccgatctg 1200

gacgactttt ccaaacagct gcagcagagc atgagcagtg cggattccac acaggcttga 1260

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向引物

<400> 5

ggtggaggcg gaagtctgcc atatggggca aac 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物

<400> 6

caaaactagt gcggctcaag cctgtgtgga atc 33

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向引物

<400> 7

gccgcactag ttttgtatag 20

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物

<400> 8

acttccgcct ccaccgtgat gatgatgatg atg 33

<210> 9

<211> 4553

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 载体

<400> 9

atttaggtga cactatagaa ctcacctatc tccccaacac ctaataacat tcaatcactc 60

tttccactaa ccacctatct acatcaccaa tgggacatca tcatcatcat cacggtggag 120

gcggaagtct gccatatggg gcaaacaaag atgggatcat ttgggtggct accgaaggtg 180

ccttgaacac cccaaaggac cacataggca cgagaaaccc cgccaataat gctgcaatcg 240

tcctgcaact gccacaagga acaactctcc ccaaagggtt ctacgcagaa gggtcacgag 300

gcggatctca agcctcaagt aggagctctt ccaggagtcg aaatagctcc cggaactcaa 360

cacccggaag ctctagaggc accagccctg ctcgcatggc cggaaatggc ggagatgcag 420

ccttggcact gcttcttctg gaccgcctga accagctgga aagcaagatg tcagggaagg 480

gtcagcagca gcagggccaa actgtcacca agaaaagtgc cgcagaggct tcaaagaagc 540

ccaggcagaa acggactgcc accaaagcct acaacgtgac tcaggcgttt ggccgtagag 600

ggccagaaca gacgcaggga aactttgggg atcaggaact tatcaggcag ggcactgact 660

acaaacattg gccccagatt gcccagtttg ctccgtctgc gtctgctttc ttcggaatgt 720

ctcgtattgg catggaggta acaccgtccg gaacatggct gacctataca ggagccatca 780

aactggatga caaggaccct aactttaagg accaagtgat tctcctgaat aagcacatcg 840

atgcctacaa aaccttccct ccaacggagc ctaagaagga caagaagaag aaggccgatg 900

agactcaagc cctgccacag cgccagaaga aacaacagac agtgaccttg cttccagctg 960

ccgatctgga cgacttttcc aaacagctgc agcagagcat gagcagtgcg gattccacac 1020

aggcttgata tagaatttac ggctagcgcc ggatgcgacg ccggtcgcgt cttatccggc 1080

cttcctatat caggctgtgt ttaagacgcc gccgcttcgc ccaaatccct atgccggttc 1140

gacggctgga caaaatactg tttatcttcc cagcgcaggc aggttaatgt accaccccag 1200

cagcagccgg tatccagcgc gtatatacct tccggcgtac ctttgccctc cagcgatgcc 1260

cagtgaccaa aggcgatgct gtattcttca gcgacagggc caggaatcgc aaaccacggt 1320

ttcagtgggg caggggcctc ttccggcgat tcttactagc tagtatgcat aggtgctgaa 1380

atataaagtt tgtgtttcta aaacacacgt ggtacgtacg ataacgtaca gtgtttttcc 1440

ctccacttaa atcgaagggt agtgtcttgg agcgcgcgga gtaaacatat atggttcata 1500

tatgtccgta ggcacgtaaa aaaagcgagg gattcgaatt cccccggaac ccccggttgg 1560

ggcccacgcc tcgatcgagc aaaaaaaaaa aagaaaaaaa aaaaaaaagc tttcccgcgg 1620

ccagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 1680

ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 1740

gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 1800

gccggctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 1860

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgc tcggctgcgg cgagcggtat 1920

cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 1980

acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 2040

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 2100

ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 2160

gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 2220

gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 2280

ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 2340

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 2400

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 2460

ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 2520

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 2580

gtttttttgc ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 2640

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 2700

tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 2760

aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 2820

aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 2880

tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 2940

gagacccacg ctcaccggct ccggatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 3000

agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 3060

aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 3120

gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 3180

caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 3240

cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 3300

ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 3360

ccaagtcatt ctgagaatag cgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 3420

gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 3480

cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 3540

gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 3600

caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 3660

tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 3720

acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 3780

aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 3840

gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 3900

tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 3960

gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag 4020

agcagattgt actgagagtg caccattcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg 4080

aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc 4140

aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa 4200

caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata 4260

taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag 4320

aggatctggc tagcgatgac cctgctgatt ggttcgctga ccatttccgg gtgcgggacg 4380

gcgttaccag aaactcagaa ggttcgtcca accaaaccga ctctggcggc agtttacgag 4440

agagatgata gggtctgctt cagtaagcca gatgctacac aattaggctt gtacatactg 4500

tcgttagaac gcggctacaa ttaatacata accttatgta tcatacacat acg 4553

<210> 10

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 10

atgagcgaca atggacccca gagcaaccag agaagcgccc ctaggatcac ctttggcggc 60

cccaccgatt ccaccgataa caaccagaat ggcggcagga atggcgctag acccaagcag 120

aggagacccc agggcctgcc caacaatacc gcctcctggt ttacagctct gacccagcac 180

ggaaaggagg agctgagatt ccccaggggc cagggcgtgc ctatcaatac caacagcggc 240

cccgacgacc agatcggata ctacaggagg gccaccagaa gagtgagggg cggcgacggc 300

aagatgaaag agctgagccc caggtggtac ttctactacc tgggaaccgg ccccgaggct 360

tccctgcctt atggcgccaa caaggaaggc atcgtgtggg tggccacaga aggcgccctg 420

aacaccccca aggaccacat cggcaccagg aatcccaaca acaacgccgc cacagtgctg 480

cagctgcccc agggaacaac cctgcccaag ggcttttacg ccgaaggcag cagaggaggc 540

agccaggcta gctccaggag ctcctccagg agcaggggca acagcaggaa tagcaccccc 600

ggatccagca ggggcaatag ccctgccagg atggctagcg gcggaggaga aaccgccctg 660

gctctcctgc tgctggacag gctgaatcag ttagaaagca aggtgagcgg aaagggccag 720

cagcagcagg gccagacagt gaccaagaag tccgctgccg aagcctccaa gaagcccagg 780

cagaagagaa ccgccaccaa gcagtacaac gtgacccaag ccttcggcag aaggggcccc 840

gaacagaccc agggaaactt cggagaccag gatctcatca ggcagggcac cgactacaag 900

cattggcctc agatcgccca gttcgctccc tccgcctccg cctttttcgg catgtccaga 960

atcggaatgg aggtcacacc tagcggcaca tggctgacct accatggcgc cattaagctg 1020

gatgacaagg acccccagtt caaggataac gtgatcctgc tgaacaagca cattgacgcc 1080

tacaagacct tcccccccac agagcctaag aaggataaaa agaaaaagac cgatgaggcc 1140

cagcccctgc cccagagaca gaagaagcag cctaccgtga cactgctgcc tgccgccgac 1200

atggatgact tctccaggca gctgcaaaac agcatgagcg gcgcctccgc cgatagcacc 1260

caggcctga 1269

<210> 11

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 11

atggctagcc ccgccgctcc tagagccgtg agctttgccg acaacaacga catcaccaat 60

accaacctga gcaggggcag gggcagaaac cccaagccta gggccgcccc caacaatacc 120

gtgagctggt acaccggcct gacccaacac ggaaaggtgc ccctgacctt tccccctgga 180

cagggagtgc ccctgaacgc caatagcacc cccgctcaga atgccggata ctggaggaga 240

caggacagga agatcaatac cggcaatggc atcaagcagc tggcccccag gtggtacttc 300

tattacaccg gaaccggacc tgaagccgcc ctgcccttca gagccgtcaa ggacggcatc 360

gtgtgggtgc atgaggacgg agccacagat gcccccagca ccttcggcac caggaacccc 420

aacaacgata gcgccatcgt cacccagttc gcccccggaa ccaagctgcc caagaacttc 480

cacatcgagg gcaccggcgg aaactcccag tcctcctcca gggctagcag cctgtccaga 540

aactccagca ggtcctccag ccagggaagc aggagcggca actccacaag aggcacatcc 600

cccggcccta gcggcattgg cgctgtgggc ggagacctgc tctacctgga tctgctgaat 660

agactgcagg ccctggagag cggcaaggtg aagcagagcc aacctaaggt catcaccaag 720

aaggacgccg ccgccgctaa gaacaagatg agacacaaga ggacctccac caagtccttc 780

aacatggtgc aggccttcgg actcagagga cccggcgacc tgcagggaaa cttcggagac 840

ctgcagctga acaagctggg cacagaggac cccaggtggc ctcagatcgc cgaactggcc 900

cccacagcct ccgcctttat gggcatgtcc cagttcaagc tgacccacca gaacaacgac 960

gatcacggca accctgtcta cttcctgagg tattccggcg ctatcaagct ggatcccaag 1020

aaccccaact acaacaagtg gctggaactg ctggagcaga acatcgacgc ctacaagacc 1080

ttccctaaga aggagaaaaa gcagaaggcc cccaaggagg aaagcaccga tcagatgtcc 1140

gagcccccca aagagcagag agtgcaggga tccattaccc agaggacaag gacaagaccc 1200

agcgtccagc ccggccccat gatcgatgtg aacacagact ga 1242

<210> 12

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 12

atgagcttca cacctggcaa acagagcagc agcagagcca gcagcggcaa caggagcggc 60

aacggcatcc tgaagtgggc tgaccaatcc gaccagttca gaaacgtgca gacaagaggc 120

agaagggccc agcctaaaca gaccgctacc agccaacagc cctccggagg caacgtggtg 180

ccctactatt cctggttctc cggcatcaca cagtttcaga agggcaagga gttcgaattc 240

gtggagggcc aaggcgtgcc cattgctcct ggcgtgcctg ccacagaggc taagggctac 300

tggtacaggc acaacaggag gtccttcaag accgccgacg gcaatcagag gcaactcctg 360

cctaggtggt acttctacta cctgggcacc ggccctcacg ccaaggacca gtatggcacc 420

gacatcgacg gcgtgtactg ggtcgccagc aaccaggccg acgtgaacac acccgccgac 480

atcgtggaca gggaccctag ctccgacgaa gctatcccca ccaggtttcc tcctggcacc 540

gtgctgcccc agggctacta tatcgaggga agcggcagga gcgcccctaa cagcagaagc 600

acaagcagga caagcagcag agccagcagc gccggcagca gatccagggc caatagcggc 660

aataggacac ccacctccgg cgtgaccccc gatatggccg atcagattgc ctccctcgtc 720

ctggccaagc tgggcaagga tgccaccaaa ccccagcagg tgaccaaaca caccgccaag 780

gaggtgaggc agaagattct caacaagccc aggcagaaga ggagccccaa caaacagtgc 840

acagtgcagc agtgtttcgg caagaggggc cccaaccaaa actttggcgg aggcgagatg 900

ctgaaactgg gaacctccga ccctcaattc cccatcctgg ctgagctggc ccctacagcc 960

ggcgccttct tcttcggaag cagactggag ctggccaagg tgcaaaatct gagcggcaat 1020

cccgacgagc cccagaagga tgtgtacgag ctgagatata acggcgccat caggttcgac 1080

agcaccctgt ccggcttcga gaccatcatg aaggtgctga acgagaacct caacgcctac 1140

cagcaacaag acggcatgat gaatatgtcc cccaagcctc agagacagag gggccacaag 1200

aacggccagg gcgagaatga caacatcagc gtggctgtgc ctaaaagcag ggtgcagcag 1260

aacaagagca gggaactgac cgccgaagac attagcctgc tcaaaaagat ggatgagccc 1320

tacaccgagg acaccagcga gatctga 1347

<210> 13

<211> 1134

<212> DNA

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 13

atggccagcg tgaattgggc cgacgacagg gccgctagga agaagtttcc tcccccctcc 60

ttctacatgc ccctgctggt gtccagcgac aaggccccct atagggtgat tcccaggaac 120

ctggtgccca tcggaaaggg caacaaagac gagcagatcg gctactggaa cgtgcaggag 180

agatggagga tgagaagggg ccagagggtg gacctgcccc ctaaggtgca cttctactat 240

ctgggcaccg gcccccacaa ggacctgaag ttcagacaga ggtccgacgg cgtggtgtgg 300

gtggccaagg aaggcgccaa gaccgtgaac acctccctgg gcaacaggaa gaggaaccag 360

aagcccttag aacctaagtt cagcatcgcc ctgcctcctg agctgagcgt cgtcgagttc 420

gaggacagaa gcaacaactc cagcagggcc agcagcaggt ccagcaccag aaacaacagc 480

agagattcca gcaggtccac atccaggcag cagtccagaa caaggagcga cagcaaccag 540

agcagcagcg atctggtggc tgccgtcacc ctggccctga agaacctggg ctttgacaac 600

cagagcaaga gcccctcctc cagcggcacc agcaccccta agaagcctaa caagcccctg 660

agccagccta gggccgacaa gcccagccag ctcaaaaagc ccaggtggaa gagggtgccc 720

accagagagg agaacgtcat ccagtgcttc ggccccagag acttcaacca caacatgggc 780

gacagcgacc tggtgcagaa cggcgtggat gccaagggct tccctcaact ggccgaactc 840

atccccaacc aggccgccct gtttttcgac agcgaggtga gcaccgacga ggtgggcgac 900

aacgtgcaga tcacctacac ctacaagatg ctcgtggcca aggacaacaa gaacctcccc 960

aagttcatcg agcaaatcag cgccttcacc aagcccagca gcatcaagga gatgcagtcc 1020

cagagctccc acgtggccca gaataccgtg ctgaatgcca gcattcctga gagcaagccc 1080

ctggctgacg acgactccgc catcatcgag atcgtgaacg aggtgctgca ctga 1134

<210> 14

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 14

atgtcctaca cacccggcca ctacgccggc agcagatcca gcagcggcaa cagatccggc 60

atcctgaaaa agaccagctg ggctgaccaa tccgagagga actaccagac cttcaacagg 120

ggaaggaaaa cccagcccaa attcaccgtg agcacacagc ctcagggcaa caccatcccc 180

cactacagct ggttcagcgg catcacccaa ttccagaagg gcagggactt taagttctcc 240

gacggccagg gcgtgcctat tgccttcggc gtccctccca gcgaagctaa gggctattgg 300

tacaggcact ccaggaggtc ctttaagaca gccgacggcc agcagaagca gctgctgcct 360

aggtggtact tctattacct gggcaccggc ccctacgcca atgctagcta cggcgagagc 420

ctggagggcg tgttctgggt ggccaaccac caagccgaca ccagcacccc cagcgatgtc 480

tccagcaggg atcctaccac ccaggaggcc atccccacca gattccctcc cggaacaatt 540

ctgccccagg gctactatgt ggagggcagc ggcaggagcg ctagcaactc cagacccgga 600

tccagatccc agtccagagg ccccaacaac aggtccctgt ccaggagcaa ctccaacttc 660

aggcacagcg acagcatcgt gaaacccgac atggccgatg agattgccaa cctggtgctg 720

gccaagctcg gcaaagactc caaaccccag caagtgacca agcagaacgc caaggagatc 780

aggcataaga tcctgaccaa gcccaggcag aagaggaccc ctaacaagca ctgcaacgtg 840

cagcagtgct tcggcaagag aggccccagc cagaacttcg gaaacgccga aatgctgaag 900

ctgggcacca atgatcccca gtttcccatc ctcgccgaac tggcccccac ccccggcgct 960

ttcttttttg gcagcaagct ggacctggtg aagagggata gcgaggccga ttcccccgtg 1020

aaggatgtgt tcgagctgca ctacagcggc tccatcagat tcgactccac cctgcccggc 1080

ttcgagacca tcatgaaggt cttagaagag aacctgaatg cctacgtgaa cagcaaccag 1140

aataccgaca gcgacagcct gagctccaag ccccagagga agaggggcgt caagcagctg 1200

cccgagcagt tcgacagcct gaatctgagc gctggcacac agcacatcag caatgacttc 1260

acacccgaag accacagcct cctggccaca ctcgacgatc cctatgtgga agatagcgtg 1320

gcctga 1326

<210> 15

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人类冠状病毒(Human coronavirus)

<400> 15

atggccaccg tgaagtgggc tgacgcttcc gagcctcaga ggggcagaca gggcaggatc 60

ccctatagcc tgtactcccc tctgctggtg gacagcgagc agccctggaa ggtgatccct 120

aggaatctgg tgcccatcaa caagaaggat aagaacaagc tcatcggcta ctggaacgtc 180

caaaagagat tcaggaccag aaagggcaag agagtcgacc tcagccctaa gctgcacttc 240

tactacctgg gcaccggccc ccacaaagac gccaaattca gagagagggt ggagggcgtg 300

gtgtgggtcg ctgtggatgg cgccaagaca gaacccaccg gctacggcgt gagaagaaag 360

aactccgagc ccgagattcc ccactttaac cagaaactgc ccaacggagt gaccgtggtg 420

gaggagcctg atagcagggc ccctagcagg agccagagca ggagccaaag caggggcagg 480

ggcgaaagca agccccagag caggaatccc agctccgaca gaaaccataa ctcccaggac 540

gacatcatga aggccgtggc tgccgccctg aagagcctgg gcttcgacaa gccccaggag 600

aaggacaaga agagcgctaa gaccggcaca cccaagcctt ccaggaacca gtcccccgcc 660

tcctcccaaa ccagcgccaa gagcctcgcc aggagccaat ccagcgagac caaggagcag 720

aagcacgaga tgcagaagcc caggtggaag aggcagccta atgacgatgt gaccagcaac 780

gtgacccagt gcttcggccc cagggacctg gatcacaact tcggctccgc tggcgtcgtc 840

gccaatggcg tgaaagccaa gggatacccc cagttcgccg aactggtccc ttccacagct 900

gccatgctgt tcgacagcca catcgtgtcc aaggagtccg gaaataccgt ggtgctgacc 960

ttcaccacaa gggtgaccgt gcctaaggac caccctcacc tgggcaagtt cctggaggag 1020

ctcaacgcct ttaccaggga gatgcagcag caccccctgc tgaacccttc cgccctggag 1080

ttcaatccct cccagacaag ccccgccaca gctgagcctg tgagggacga ggtgagcatc 1140

gagaccgata tcatcgatga ggtgaattga 1170

Claims

1.一种抗体或其片段，其与构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白结合，

该抗体或其片段所识别的表位位于序列号1所示的氨基酸序列的第121位～第419位。

2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，

表位位于序列号1所示的氨基酸序列的第208位～第222位、第332位～351位、第374位～第397位或第398位～第419位。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其中，

所述抗体或其片段与构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白特异性结合。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体或其片段，其中，

抗体为单克隆抗体。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体或其片段，其中，

其片段为Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab'片段或F(ab')₂片段。

6.一种由样品中检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的方法，包括使样品与权利要求1～5中任一项所述的抗体或其片段接触的工序。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，样品为生物体样品。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，进一步包括下述工序：

通过选自由ELISA法、免疫层析法及过滤抗原检测法组成的组中的至少一种免疫学检查检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白。

9.一种用于检测构成SARS-CoV-2衍生核壳体的蛋白的试剂盒，其包含权利要求1～5中任一项所述的抗体或其片段。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述试剂盒为免疫层析试纸条的形式。