CN117362418A - 特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段及试剂盒 - Google Patents

特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体提供一种特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段及试剂盒。抗体或抗原结合片段含有重链可变区和轻链可变区，重链可变区为SEQ.ID No.2或SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列；轻链可变区为SEQ.ID No.4或SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列。其制备的胶体金检测试剂盒能高灵敏度的检测多种犬流感病毒流行株，与RT‑PCR检测方法符合率高，且能对不同地域的流行株和靶标检测，具有快速、简便、准确的优势，能满足现阶段临床上的迫切需求。

Description

特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体提供一种特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段及试剂盒。
背景技术
犬流感(Canine influenza,CI)是由犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)引起的犬急性接触性呼吸道传染病。主要通过空气传播，但经消化道或通过接触病毒污染的各种物品也是重要的传播途径。犬流感病毒在宿主体内可潜伏2～5d，大部分病犬表现出咳嗽、打喷嚏、流流涕、精神沉郁等临床症状，部分严重犬会出现体温升高，呼吸困难的现象，病程持续10～12d，不同品种、年龄、性别的犬对该病毒均易感。当病情恶化或发展为肺炎则往往意味着存在继发性细菌感染，病情加重时可能导致死亡。少部分犬会出现隐性感染，即不表现临床症状，但能够携带和传播病毒。2004年，美国首次发现H3N8CIV病例，此后对犬流感进行监测，发现了许多其他亚型的犬流感病毒，如H1N1、H3N2、H5N1、H5N2、H10N8等。目前在犬类中流行的主要为H3N8和H3N2两种亚型，其中，H3N8主要在美洲犬群中流行，H3N2主要在韩国、中国和美国犬群中流行。近年来，研究发现犬可以作为流感病毒中间宿主，可自然感染来自跨种群不同亚型的流感病毒，甚至作为流感病毒的“混合容器”产生新型重配病毒。
随着宠物犬在我国数量的逐年增多，对犬的疫病预防和控制需高度重视，并且CIV不仅可对犬的健康和养殖造成严重危害，对人类公共卫生也造成潜在的威胁。加强对犬流感的预防、诊断对于提高人类应对潜在流感大流行的能力具有重要意义，因此急需建立一种快速简便、特异性强、准确检测犬流感病毒的产品以用于临床实时诊断。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段。
本发明的第二目的在于提供上述抗体或抗原结合片段的应用。
本发明的第三目的在于提供一种犬流感病毒检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ.ID No.2或SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区为SEQ.ID No.4或SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体为单克隆抗体或单链抗体。
进一步地，所述抗体为单克隆抗体5A12，所述单克隆抗体5A12的重链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单克隆抗体5D7，所述单克隆抗体5D7的重链可变区为SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单链抗体5A12，所述单链抗体5A12的重链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单链抗体5D7，所述单链抗体5D7的重链可变区为SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单链抗体5A125D7，所述单链抗体5A125D7的重链可变区为SEQ.IDNo.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单链抗体5D75A12，所述单链抗体5D75A12的重链可变区为SEQ.IDNo.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列。
编码上述抗体或抗原结合片段的核苷酸片段，SEQ.ID No.2的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.1或其简并序列；SEQ.ID No.4的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.3或其简并序列；SEQ.ID No.6的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.5或其简并序列；SEQ.ID No.8的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.7或其简并序列。
上述抗体或抗原结合片段在制备检测犬流感病毒产品中的应用。
一种犬流感病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括有效量的单克隆抗体5A12、有效量的金标记的单克隆抗体5D7，以及用于对犬流感病毒进行抗原抗体反应的检测试剂；或所述试剂盒包括有效量的单克隆抗体5D7、有效量的金标记单克隆抗体5A12，以及对犬流感病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
进一步地，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得犬流感病毒抗原与所述单克隆抗体5D7的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体5D7，所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体5A12，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述单克隆抗体5A12固定含量为0.5～3.0mg/ml，所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为5～60μg/ml。
进一步地，所述单克隆抗体5A12固定含量为1.0～3.0mg/ml，所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为10～50μg/ml；所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为含1％V/V Triton X-100的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述单克隆抗体5A12固定含量为2.5mg/ml，所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为30μg/ml。
进一步地，所述试剂盒的检测样品为犬眼鼻拭子、病毒培养物及其它液体样品中的犬流感病毒。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的抗体或抗原结合片段，与目前不同地区的流行株反应性均良好。提供的试剂盒克服了现有技术检测灵敏度低的问题，避免了漏检、假阴性现象发生，可高灵敏地检测不同地域的流行株，且能高灵敏检测多种类型的靶标，且具有快速、简便、准确的优势，常温条件下具有长保存期，更有利于临床的推广应用。
具体实施方式
对本发明中涉及的相关术语进行定义
术语“犬流感”(Canine influenza,CI)是由犬流感病毒(Canine influenzavirus，CIV)引起的犬急性接触性呼吸道传染病。主要通过空气传播，但经消化道或通过接触病毒污染的各种物品也是重要的传播途径。犬流感病毒在宿主体内可潜伏2～5d，大部分病犬表现出咳嗽、打喷嚏、流涕、精神沉郁等临床症状，部分严重犬会出现体温升高，呼吸困难的现象，病程持续10～12d，不同品种、年龄、性别的犬对该病毒均易感。当病情恶化或发展为肺炎则往往意味着存在继发性细菌感染，病情加重时可能导致死亡。少部分犬会出现隐性感染，即不表现临床症状，但能够携带和传播病毒。
术语“犬流感病毒结构蛋白”是指与CIV抗原性有关的结构蛋白聚合酶蛋白(PB1，PB2，PA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、血凝素蛋白(HA)、神经氨酸酶(NA)。基于HA和NA蛋白分子的抗原性，目前的流感病毒被分为17种HA亚型(H1-H17)和9种NA亚型(N1-N9)，分别表示为H1-H17和N1-N9。核蛋白NP是病毒核衣壳的主要组成部分，是由片段5编码的单体磷酸化多肽结构蛋白，分子量约60kD。NP蛋白基因序列在不同亚型的流感病毒中保守度较高，各亚型间及亚型内各毒株间的氨基酸序列较为保守。NP蛋白对特异性宿主的选择及CIV在宿主体内的复制和表达过程中均起到一定的作用。NP磷酸化与CIV感染的宿主紧密相关。NP另一个重要的功能是它能够与病毒RNA和宿主RNA聚合酶一起构成核酸核蛋白体(RNP)，使后两者免受RNase的作用。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与犬流感病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体的氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽的序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽的非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
本发明提供一种特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段含有重链可变区和轻链可变区，重链可变区为SEQ.ID No.2或SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列；轻链可变区为SEQ.ID No.4或SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列。
需要说明的是，本发明提供的抗体或抗原结合片段，其重链可变区和轻链可变区例如可以为：SEQ.ID No.2和SEQ.ID No.4，SEQ.ID No.2和SEQ.ID No.8，SEQ.ID No.6和SEQ.ID No.4，SEQ.ID No.6和SEQ.ID No.8。
在优选地实施方式中，本发明的抗体可以为单克隆抗体或单链抗体，例如如下抗体：
抗体为单克隆抗体5A12，重链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列。
抗体为单克隆抗体5D7，重链可变区为SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列。
抗体为单链抗体5A12，重链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列。
抗体为单链抗体5D7，重链可变区为SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列。
抗体为单链抗体5A125D7，重链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列。
抗体为单链抗体5D75A12，重链可变区为SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列。
本发明又提供上述抗体或抗原结合片段的编码核苷酸片段，SEQ.ID No.2的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.1或其简并序列；SEQ.ID No.4的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.3或其简并序列；SEQ.ID No.6的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.5或其简并序列；SEQ.ID No.8的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.7或其简并序列。
本发明抗体的可变区序列能特异性结合犬流感病毒，其结合的抗原表位为NP蛋白上的抗原表位。
上述单克隆抗体5A12和单克隆抗体5D7均为犬流感病毒单克隆抗体；5A12对CIV的IFA效价≥1:3200，5D7对CIV的IFA效价≥1:3200，与CIV具有良好的反应性，且单克隆抗体5D7与单克隆抗体5A12结合不同的抗原表位。上述单链抗体对犬流感病毒IFA效价均≥1∶800，表明其与犬流感病毒具有良好的反应特性。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞5A12株，所述杂交瘤细胞5A12株分泌所述单克隆抗体5A12。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞5D7株，所述杂交瘤细胞5D7株分泌所述单克隆抗体5D7。
杂交瘤细胞5A12株、5D7株分别能有效分泌单克隆抗体5A12株、5D7株，分泌的单克隆抗体5A12株、5D7株纯度均较高。
本发明还涉及抗体或抗原结合片段的应用，其中，所述应用为表位鉴定研究、犬流感病毒抗原反应性研究。
本发明还涉及一种犬流感病毒检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的单克隆抗体5A12、有效量的金标记的单克隆抗体5D7，以及对犬流感病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂；或所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体5D7、有效量的金标记所述单克隆抗体5A12，以及对犬流感病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得犬流感病毒抗原与所述单克隆抗体5D7的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体5D7，所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体5A12，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述单克隆抗体5A12固定含量为0.5～3.0mg/ml，所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为5～60μg/ml。
所述单克隆抗体5A12固定含量可以为0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml、3.0mg/ml。
所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度可以为5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml、26μg/ml、27μg/ml、28μg/ml、29μg/ml、30μg/ml、31μg/ml、32μg/ml、33μg/ml、34μg/ml、35μg/ml、36μg/ml、37μg/ml、38μg/ml、39μg/ml、40μg/ml、41μg/ml、42μg/ml、43μg/ml、44μg/ml、45μg/ml、46μg/ml、47μg/ml、48μg/ml、49μg/ml、50μg/ml、51μg/ml、52μg/ml、53μg/ml、54μg/ml、55μg/ml、56μg/ml、57μg/ml、58μg/ml、59μg/ml、60μg/ml。
本发明的双抗体夹心法检测试剂盒能有效地检测犬流感病毒，对不同地域流行株均能高灵敏度检测，且对多种类型的靶标样品均能准确检测。
本发明通过对单克隆抗体5A12固定含量、单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度和羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗含量的选择，保证了检测的更高灵敏度。
作为本发明的一种优选实施方式，单克隆抗体5A12固定含量为1.0～3.0mg/ml，单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为10～50μg/ml；试剂盒还包括样品处理液，样品处理液为含1％V/V Triton X-100的磷酸盐缓冲液。
作为本发明的一种优选实施方式，单克隆抗体5A12固定含量为2.5mg/ml，所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为30μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的部件相互接触，而不相邻的部件之间不接触。
作为本发明的一种实施方式，试剂盒的检测样品为犬眼鼻拭子、病毒培养物及其它液体样品中的犬流感病毒。
本发明还涉及所述试剂盒的制备方法，其中，包括：
步骤1)用胶体金标记单克隆抗体5D7为金标抗体，制成金标垫；
步骤2)固定单克隆抗体5A12、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线；
步骤3)配制样品处理液，分装；
步骤4)将步骤1)所制备的金标垫、步骤2)所制备的的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在底板上，裁剪；连同步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒。
作为本发明的一种实施方式，步骤1)中单克隆抗体5D7标记时为5～60μg/ml，所述步骤2)中单克隆抗体5A12为0.5～3.0mg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤1)中单克隆抗体5D7标记时为30μg/ml，步骤2)中所述单克隆抗体5A12为2.5mg/ml。
作为本发明的一种实施方式，步骤3)中样品处理液为含1％V/V TritonX-100的磷酸盐缓冲液。
本发明还涉及试剂盒的检测方法，其中，检测方法包括：将采集的样品插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液中，将处理后的样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中，10分钟后判定结果。
本发明还涉及试剂盒在非免疫诊断目的的应用，其中，非免疫诊断目的的应用为流行病学调查、对离体组织进行检测。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
本发明实例中所用的样品处理液为含1％V/V Triton X-100的磷酸盐缓冲液，其1L体积磷酸盐缓冲液配方为：Na2HPO4·12H2O 2.90g、NaH2PO4·H2O 0.26g，但不限于此配方；若无特殊说明，均用磷酸盐缓冲液稀释，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1犬流感病毒的分离及鉴定
1.1犬流感病毒的分离
将流行病学调查时收集到的多份样品中的105份临床采集的疑似犬流感病毒感染犬的眼鼻拭子、咽拭子(来源于河南、安徽、四川、山东、湖北、广东、黑龙江等多个省份的宠物医院)，将病料分别用缓冲液处理后，离心取上清，用0.22μm滤膜过滤后，接种至10日龄鸡胚，每个样品接种3个胚，于37℃孵育箱孵育。96小时后用1％的鸡红细胞对鸡胚尿囊液进行血凝检测，对有血凝性样品用SPF鸡胚纯化后进行鉴定，无血凝性但有呼吸道症状样品盲传3代后进行血凝检测。结果5份样品具有血凝活性，其中HA效价最高为1∶64。
1.2犬流感病毒的鉴定
1.2.1病毒亚型的鉴定
对1.1分离的5株CIV进行结构蛋白HA、NA基因测序、序列比对和系统发育树分析，其中4株与GenBank已公布的流行株H3N2亚型CIV同属一个分支，表明分离的4株病毒亚型为H3N2，且为目前国内流行株，分别命名为C0104株、C0118株、C0127株、C0139株。
1.2.2特异性鉴定
将1.2.1鉴定的4株CIV分别进行犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等其他常见犬源传染病病原RT-PCR检测，结果均为阴性，表明分离得到的病毒为单一的CIV。
1.2.3HI效价测定
对1.2.1鉴定的4株CIV用鸡红细胞按《中国兽药典》进行红细胞凝集试验即HA试验，根据结果制备4单位抗原，再对待检样品进行红细胞凝集抑制试验即HI效价测定，结果C0127株效价最高为1∶1280，C0104株、C0118株、C0139株的效价分别为1∶320、1∶160、1∶640。
1.2.4病毒含量测定
取96孔细胞板，MDCK细胞铺板，每孔100μl，将1.2.1鉴定的C0104株、C0118株、C0127株、C0139株CIV病毒液用培养基作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，与MDCK细胞同步接种于96孔细胞板，每个稀释度平行重复6孔，每孔100μl，置37℃、5％CO2条件下培养5日。弃去培养液，用PBS洗涤1次后，每孔加入80％冷丙酮100μl，置2～8℃固定30分钟。弃去细胞板中液体，用PBS洗涤2次后，每孔加入1︰400稀释的CIV阳性血清100μl，37℃作用1小时，弃去细胞板中液体，用PBS洗涤3次后，每孔加入1︰400稀释的FITC标记的兔抗鼠IgG 100μl，37℃孵育40分钟。弃去细胞板中液体，用PBS洗涤3次后，每孔补加PBS 50μl，置荧光显微镜下观察，有黄绿色荧光的孔即判为阳性，根据每个稀释度的阳性孔数，按照Reed-Muench法计算病毒TCID50。结果4株CIV病毒C0104株、C0118株、C0127株、C0139株病毒含量分别为105.6TCID50/ml、105.5TCID50/ml、106.4TCID50/ml、106.0TCID50/ml。
将4株CIV病毒液接种至单层的MDCK细胞，37℃5％CO2条件下培养。待细胞病变80％以上时收毒，-20℃冻融2次后，3000转/分钟离心30分钟，去除细胞碎片后，上清进行分装，-70℃以下保存。
实施例2犬流感病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定
2.1犬流感病毒单克隆抗体的制备和纯化
将实施例1制备的CIV C0104株、C0118株、C0127株、C0139株4株病毒液，利用差速离心法纯化后制备相应的犬流感病毒抗原，分别免疫4～6周龄雌性Balb/C小鼠，首免使用弗氏完全佐剂进行乳化，二免、三免使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量为200μl/只。使用IFA方法检测二免、三免后小鼠血清效价。
CIV抗原板的制备及血清效价检测：将4株CIV病毒C0104株、C0118株、C0127株、C0139株分别接种培养至单层的MDCK细胞，设健康细胞对照孔。于37℃5％CO2培养箱内培养48小时，弃去培养液，用PBS洗涤3次，加入预冷的80％丙酮，4℃固定30分钟，弃液，晾干即为IFA抗原板。检测时，将待检测小鼠血清用PBS梯度稀释，取稀释液按100μl/孔加入检样孔内，同时设置阳性对照和阴性对照，37℃作用1h。弃液，用PBS洗涤3次后，加入1∶400倍稀释的FITC标记的兔抗鼠IgG，100μl/孔，37℃作用50分钟。弃液，用PBS洗涤3次，最后加入PBS，50μl/孔，在荧光显微镜下观察检测结果。判定标准：健康细胞对照孔无荧光，阳性对照细胞接毒孔有黄绿色荧光时试验成立。待检血清接毒细胞孔内可观察到黄绿色荧光，判为阳性孔，接毒细胞孔内未观察到黄绿色荧光，判为阴性孔。以可观察到黄绿色荧光的接毒细胞孔对应的最大稀释度作为小鼠血清的IFA效价。检测结果如下表：
表1免疫小鼠血清IFA效价
取IFA效价最高的小鼠进行细胞融合，融合前3天，将浓缩的病毒液注射小鼠腹腔，进行冲击免疫。将SP2/0与离心后的免疫脾细胞以1:10的比例混合后，用聚乙二醇(PEG)1500作为融合剂进行细胞融合。将融合细胞滴加于铺有饲养细胞的96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。8～10天后取细胞上清，用IFA方法进行杂交瘤细胞筛选，经过3～4次筛选及亚克隆后，获得4株能稳定性分泌抗CIV病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞。分别命名为1A6、4B2、5A12及5D7。将这4株杂交瘤细胞分别于母鼠体内制备腹水，通过IFA方法对腹水效价进行检测，4杂交瘤细胞株上清IFA效价均不低于1∶16，腹水纯化后的单克隆抗体效价均不低于1∶3200。
用Protein G亲和层析法对4株腹水分别进行纯化，获得纯化的单克隆抗体。然后用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，结果：4株单克隆抗体的纯度均不低于85％。用BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白含量，结果：4株单克隆抗体蛋白含量分别为4.8mg/ml、5.6mg/ml、4.5mg/ml、5.8mg/ml。
2.2单克隆抗体的鉴定
2.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定
用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对4株单克隆抗体的亚型进行鉴定，结果：4株单克隆抗体1A6、4B2、5A12、5D7的重链亚类分别为IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG2a，轻链亚类均为kappa。
2.2.2单克隆抗体特异性鉴定
采用IFA方法检测。分别将CIV H3N8型A/Canine/Florida/242/2003毒株(标准株，购自ATCC)、犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒1型(CAV-1)、犬腺病毒2型(CAV-2)、犬冠状病毒(CCoV)接种敏感细胞，培养48～72h后，用80％丙酮水溶液固定，对1︰200稀释的4株单克隆抗体1A6、4B2、5A12、5D7分别进行检测，同时设置各病毒阳性血清作为阳性对照，经荧光染色后对结果进行判定。结果：4株单克隆抗体与其它病毒均不反应，只与CIV反应，表明均为针对CIV的特异性单克隆抗体。
2.2.3单克隆抗体识别犬流感病毒不同蛋白的鉴定
为确定CIV单抗特异性识别的抗原蛋白，根据NCBI中公布的CIV基因序列分别设计NP、HA、PB1、PB2、PA、M1、M2和NA蛋白相应引物，并以分离株C0127株作为模板，扩增各蛋白基因；将鉴定正确的扩增产物克隆重组在真核表达载体中，分别转染293T细胞培养48小时后，用80％冷丙酮固定细胞，用IFA方法分别对4株单克隆抗体进行检测。结果显示，4株单克隆抗体均只与NP蛋白呈阳性反应而不识别其它蛋白，即均为识别CIV NP蛋白的单克隆抗体。
2.2.4单克隆抗体识别抗原表位异同的鉴定
采用单克隆抗体相加试验进行检测：将犬流感病毒包被于96孔酶标板、封闭，然后加入第一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应，洗涤，拍干，再加入另一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应。2株单克隆抗体反应完毕后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG与之反应，洗涤，显色，测定其A值。按公式分别计算单隆抗体两两叠加的增值指数AI。公式AI＝[(A1.2-A1)/A2]×100％，其中，Al、A2为单克隆抗体1和2的A值，A1.2为单克隆抗体1叠加单克隆抗体2的A值，若AI大于50％，表明2株单克隆抗体识别不同的抗原表位，若AI小于50％，表明2株单克隆抗体结合相同或相近的抗原表位。结果：2株单克隆抗体5A12、5D7两两相加指数AI均高于50％，表明2株抗体识别不同的抗原表位，见表2。
表2单克隆抗体两两叠加的增值指数AI
综上所述，单克隆抗体1A6、4B2、5A12、5D7均为针对犬副流感病毒NP蛋白特异性的单克隆抗体，且1A6、5A12、5D7识别NP蛋白不同的抗原表位，选择AI值较高的5A12、5D7这2株单克隆抗体进行双抗体夹心方法检测抗原的研究。
2.3单克隆抗体可变区序列的测定(见文末附件)
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计5A12重链可变区引物序列：
P1：5’-GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGT-3’(SEQ ID No.9)；
P2：5’-CCAGGGRCCARKGGATARACN-3’(SEQ ID No.10)；
设计5A12轻链可变区引物序列：
P3：5’-ACTAGTCGACATGAAGTTGCCT-3’(SEQ ID No.11)；
P4：5’-CCCAAGCTTACTGGATGGTG-3’(SEQ ID No.12)；
设计5D7重链可变区引物序列：
P5：5’-ACTAGTCGACATGGGATGGAGCT-3’(SEQ ID No.13)；
P6：5’-CCAGGGRCCARKGGATARACN-3’(SEQ ID No.14)；
设计5D7轻链可变区引物序列：
P7：5’-ACTAGTCGACATGGATTTWCARG-3’(SEQ ID No.15)；
P8：5’-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGG-3’(SEQ ID No.16)；
收集2株杂交瘤细胞5A12、5D7，提取RNA后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果：单克隆抗体5A12的重链可变区、轻链可变区分别如SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.3所示；单克隆抗体5D7的重链可变区、轻链可变区分别如SEQ.ID No.5、SEQ.ID No.7所示。
实施例3试纸条的制备及应用
3.1试纸条用单克隆抗体配对试验研究
分别用纯化后的单克隆抗体5A12及5D7标记胶体金，并与固定单克隆抗体5A12及5D7分别配对，用制备的试纸条检测1∶2倍，1∶8倍，1∶32倍，1∶128倍、1∶512倍稀释的CIVC0127株病毒液(106.4TCID50/ml)，并用犬PCR检测的CIV阳性样品做阳性质控，CIV阴性眼鼻拭子及咽拭子、样品稀释液做阴性质控，结果显示：金标单克隆抗体为5D7，固定单克隆抗体为5A12时，试纸条的检测灵敏度最高，CIV病毒液稀释1∶128仍能检出阳性，检测阴性眼鼻拭子和阴性咽拭子均为阴性，而当金标单克隆抗体为5A12，固定单克隆抗体为5D7时抗体配对模式检测的灵敏度均低于1∶128，且检测阳性样品的准确性也低。因此，确定最佳配对方式为：5D7作为金标单克隆抗体，5A12作为固定单克隆抗体用于后续研究。
表3单克隆抗体的配对结果
3.2胶体金检测试纸条的制备及检测
3.2.1试纸条的制备及检测
将0.01w/v％的HAuC14水溶液加热至煮沸，搅动下加入1w/v％柠檬酸钠溶液，此时，氯金酸水溶液颜色由浅黄色变为黑色然后变为酒红色，待溶液颜色稳定后继续加热搅拌15分钟。停止加热，自然冷却至室温后，用纯化水恢复至原体积，2～8℃密封保存。标记前用0.2mol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH值至8.0，匀速搅拌30分钟，再将单克隆抗体5D7以终浓度为10～30μg/ml加于胶体金溶液，匀速搅拌30分钟。逐滴加入10w/v％BSA进行封闭，匀速搅拌30分钟。在2～8℃条件下作用2小时后，在4℃2000转/分钟离心20分钟，取上清，再以4℃12000转/分钟离心30分钟，取沉淀，用1/10体积的金标缓冲液重悬后，即为金标单克隆抗体，用喷涂或浸泡使金标单克隆抗体5D7包被做成金标垫。将单克隆抗体5A12(包被浓度为0.5～3.0mg/ml)和羊抗鼠二抗(包被浓度为1～4mg/ml)喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线(T)和质控线(C)。将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴于底板上，即为犬流感病毒胶体金检测试纸条。样品处理管内含磷酸盐缓冲液制备的样品处理液。
3.2.2犬流感病毒胶体金检测试纸条检测方法的建立
检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加4滴(约100μl)混匀后的样品至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色即试验成立，则检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色即试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
3.3试纸条中单克隆抗体工作浓度的优化
分别按表4中的固定抗体5A12、金标抗体5D7的浓度制备试纸条，并对不同稀释度的CIV病毒液、样品处理液、PCR检测60份临床阳性样品(含36份眼鼻拭子、24份咽拭子)进行检测，选择试纸条检测灵敏度高、与PCR符合率高且检测样品处理液背景清晰的搭配模式，作为试纸条制备的优选固定抗体浓度、优选金标抗体浓度。结果参见表4：金标抗体5D7浓度为5～60μg/ml、固定抗体5A12浓度为0.5～3.0mg/ml时均可制备试纸条用于检测，但当金标抗体浓度为10～50μg/ml、固定抗体浓度为1.0～3.0mg/ml时制备的试纸条检测效果最优。
表4试纸条中单克隆抗体工作浓度
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另从评价结果和成本的角度考虑用试纸条1J用于后续评价。
实施例4试纸条的应用
4.1敏感性检测
使用3.3制备的试纸条1J分别对实施例1分离的4株CIV C0104株、C0118株、C0127株、C0139株病毒液、PCR检测为阳性的60份临床样品(犬眼鼻拭子、犬咽拭子)、PCR检测为阴性的60份临床样品(犬眼鼻拭子、犬咽拭子)进行检测。同时用商品化试纸条1(韩国安捷)的CIV胶体金检测试纸条、商品化试纸条2(南京申基医药科技)CIV胶体金检测试纸条进行检测，结果：自制试纸条检测4株CIV病毒液的灵敏度为102.91～103.72TCID50/ml，检测阳性样品符合率为95％，阴性样品符合率为100％，灵敏度和检测准确性均高于市售的临床常用商品化试纸条1和商品化试纸条2。表明自制试纸条敏感性和检测临床样品的符合率均高于市售产品，提高了国产试纸条检测CIV的灵敏度和准确性，降低了检测成本。
表5自制试纸条与市售临床常用产品比较结果
4.2特异性检测
将实施例2制备的胶体金检测试纸条分别检测CIV A/Canine/Florida/242/2003毒株、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型病毒、犬腺病毒2型病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒病毒液，结果除检测CIV病毒液为阳性外，检测其他犬源病毒液均为阴性；用自制犬流感病毒胶体金检测试纸条检测经犬细小病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒单独感染或混合感染的眼鼻拭子及咽拭子样品、健康犬的眼鼻拭子及咽拭子样品检测结果均为阴性，说明该试纸条具有良好的特异性。
4.3重复性检测
用不同批次、同一批不同的自制CIV胶体金试纸条对CIV病毒液、PCR检测CIV阳性的1份眼鼻拭子、1份咽拭子分别进行检测，结果：对病毒液检测的灵敏度一致，且检测同一样品的显色程度一致。同时，检测CPV、CAV-1、CAV-2、CPIV、CCoV、CDV病毒及样品处理液的结果均一致。表明重复性良好。
4.4保存期
分别将试纸条于2～30℃放置3、6、12、18、24、27个月进行敏感性、特异性、重复性检测，检测结果符合率均为100％，表明试纸条可在常温保存24个月甚至27个月；另外，将试纸条于37℃分别放置6日、9日，进行敏感性、特异性、重复性检测，检测结果符合率均为100％，表明试纸条在极端或实际使用，37℃条件下可以保存6日至9日。
4.5临床应用
收集来源于黑龙江省、吉林省、广东省、福建省、河南省、河北省、山东省、安徽省、江苏省、四川省共10个省份的526份临床样品，其中有犬流感病毒感染急性型临床症状的犬眼鼻拭子120份和咽拭子样品93份，亚急性和慢性型临床症状的犬眼鼻拭子165份和咽拭子样品148份。分别用本发明自制试纸条、CIV RT-PCR方法、商品化试纸条1(韩国安捷)、商品化试纸条2(南京申基医药科技)进行检测，结果见表6：三种试纸条检测RT-PCR阴性样品均为阴性，特异性良好，但两种商品化试纸条检测RT-PCR阳性样品的阳性符合率分别为86％、82％，均低于本发明试纸条的阳性符合率90％，存在漏检、假阴性现象，本发明试纸条检测临床适用性更优。
表6临床检测结果比较
4.6抗原消长规律检测
使用犬流感病毒C0127株(106.4TCID50/ml)对3只2～3月龄健康易感犬(编号D1、D2、D3)以滴鼻感染2ml/只的途径分别进行攻毒。用本发明自制试纸条及建立的犬流感病毒RT-PCR方法分别对攻毒后犬眼鼻拭子和咽拭子样品进行检测。结果见表7：自制试制条第2日可检出阳性样本，第4～10日试纸条检测眼鼻拭子、咽拭子样品结果均为阳性，第13日全部转为阴性；RT-PCR方法检测攻毒后犬的眼鼻拭子、咽拭子样品，第3～11日的检测结果均为阳性，第14日全部转为阴性。表明本发明自制试纸条与RT-PCR方法检出的抗原消长规律相符，可用于临床实时检测。
表7抗原消长规律检测结果
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综上所述，本发明所制备的试纸条提高了现有技术检测犬流感病毒的灵敏度，在相当程度上避免了漏检、假阴性现象的发生，并且增加了国产诊断试剂同类产品的可选择性，能够降低检测成本，有利于该疫病的预防控制。本发明所制备的试纸条与CIV RT-PCR抗原消长规律检出规律相符，为该动物健康提供了技术支持，减少了无临床症状的犬作为传染源传播的危险，降低了该疫病对人类公共卫生造成的潜在威胁；该方法检测快速、简便、准确，在临床上具有很好的应用前景，有一定的经济和社会价值，并为犬流感病毒流行病学调查、宠物健康体检提供了便利。
实施例5基因工程抗体的制备及应用
将实施例2中的单克隆抗体5A12、5D7的重链可变区、轻链可变区基因序列分别进行扩增，将重链可变区基因、轻链可变区基因通过连接肽链接，分别构建重组质粒5A12-ScFv、5D7-ScFv、5A12重+5D7轻-ScFv、5D7重+5A12轻-ScFv，将ScFv基因分别插入到pCDNA-3.1载体中，分别构建了pCDNA-5A12-ScFv、pCDNA-5D7-ScFv、pCDNA-5A12重+5D7轻-ScFv、pCDNA-5D7重+5A12轻-ScFv真核表达系统，分别转染MDCK细胞进行表达。
按照实施例2所述IFA方法对表达后的单链抗体5A12、5D7、5A12重+5D7轻(简称5A125D7)、5D7重+5A12轻(简称5D75A12)，依次编号为单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3、单链抗体4，并分别进行IFA效价检测，结果见表8：单链抗体1～4对不同CIV毒株的IFA效价均≥1:800，表明单链抗体1～4与不同CIV毒株均具有良好的反应特性。
表8基因工程抗体的IFA效价检测结果
以上结果显示SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.5和SEQ.ID No.7可用于犬流感病毒基因工程抗体的制备，可用于不同CIV毒株的反应性评价。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种特异性结合犬流感病毒的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ.ID No.2或SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列；所述轻链可变区为SEQ.ID No.4或SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体或单链抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体5A12，所述单克隆抗体5A12的重链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单克隆抗体5D7，所述单克隆抗体5D7的重链可变区为SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单链抗体5A12，所述单链抗体5A12的重链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单链抗体5D7，所述单链抗体5D7的重链可变区为SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单链抗体5A125D7，所述单链抗体5A125D7的重链可变区为SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.8所示的氨基酸序列；
或，所述抗体为单链抗体5D75A12，所述单链抗体5D75A12的重链可变区为SEQ.ID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ.ID No.4所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，SEQ.ID No.2的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.1或其简并序列；SEQ.ID No.4的编码核苷酸序列为SEQ.IDNo.3或其简并序列；SEQ.ID No.6的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.5或其简并序列；SEQ.IDNo.8的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.7或其简并序列。
5.权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备检测犬流感病毒产品中的应用。
6.一种犬流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有效量的权利要求3所述的单克隆抗体5A12、有效量的金标记的权利要求3所述的单克隆抗体5D7，以及用于对犬流感病毒进行抗原抗体反应的检测试剂；或所述试剂盒包括有效量的权利要求3所述的单克隆抗体5D7、有效量的金标记权利要求3所述的单克隆抗体5A12，以及对犬流感病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得犬流感病毒抗原与所述单克隆抗体5D7的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体5D7，所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体5A12，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述单克隆抗体5A12固定含量为0.5～3.0mg/ml，所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为5～60μg/ml。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体5A12固定含量为1.0～3.0mg/ml，所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为10～50μg/ml；所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为含1％V/V Triton X-100的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体5A12固定含量为2.5mg/ml，所述单克隆抗体5D7胶体金标记时浓度为30μg/ml。
10.根据权利要求6-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样品为犬眼鼻拭子、病毒培养物及其它液体样品中的犬流感病毒。
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