TW202307432A - SARS-CoV-2之免疫測定方法及免疫測定套組、以及單株抗體或其之抗體片段 - Google Patents
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Abstract
根據本發明，提供一種免疫測定方法，其係SARS-CoV-2之免疫測定方法，包括使生物樣本與會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白結合之單株抗體或其之抗體片段接觸的步驟，上述單株抗體或其之抗體片段會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合。
Description
本發明係關於一種SARS-CoV-2之免疫測定方法及免疫測定套組。又，本發明係關於一種單株抗體或其之抗體片段。
本案基於2021年6月16日於日本提出申請之特願2021-100117號主張優先權，並將其內容引用至本文中。
SARS-CoV-2係引起冠狀病毒病2019（COVID-19）之病毒。SARS-CoV-2屬於具有單股正鏈RNA作為基因組之冠狀病毒科。當前，冠狀病毒病2019流行於世界，產生了大量感染者。
為了檢測SARS-CoV-2，一直使用PCR檢查或抗原檢查。抗原檢查自採集檢體開始十幾分鐘左右便可確認結果，因此可較PCR檢查更簡便地進行檢查。另一方面，為了迅速檢測SARS-CoV-2，而要求高感度且特異性之檢查。然而，抗原檢查之感度一般低於PCR檢查。因此，要求更高感度之抗原檢查。
業界亦對自人體採集之SARS-CoV-2樣品進行了分析（非專利文獻1）。然而，尚不明確當以SARS-CoV-2之何種序列或何種樣品作為標的進行分析時可實現高感度之抗原檢查。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Journal of proteome research 2020, 19, 4389-4392 Mass Spectrometric Identification of SARS-CoV-2 Proteins from Gargle Solution Samples of COVID-19 Patients
[非專利文獻2]「Espline（註冊商標） SARS-CoV-2」（富士瑞必歐公司）體外診斷用醫藥品之隨附文件
[非專利文獻3]「QuickNavi（註冊商標）-COVID19 Ag」（DENKA公司）體外診斷用醫藥品之隨附文件
[發明所欲解決之課題]
本發明之課題在於提供一種能夠實現高感度且迅速之免疫測定之SARS-CoV-2免疫測定套組及SARS-CoV-2之免疫測定方法。又，本發明之另一課題在於提供一種能夠用於上述免疫測定套組及免疫測定方法之單株抗體或其之抗體片段。
[解決課題之技術手段]
本發明人等為了解決上述課題，而進行了積極研究。結果發現，藉由使用會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合之單株抗體或其之抗體片段，可解決上述課題，從而完成了本發明。
本發明人等在實施例中，將本發明之免疫測定方法之一實施形態、與市售之SARS-CoV-2抗原檢測用試劑Espline（註冊商標）SARS-CoV-2（富士瑞必歐公司）（非專利文獻2）及QuickNavi（註冊商標）-COVID19 Ag（DENKA公司）（非專利文獻3）之感度進行比較。相對於該等兩種試劑，本發明之免疫測定方法之一實施形態以更短之測定時間顯示出同等以上之感度。
具體而言，本發明如下所述。
[1]一種免疫測定方法，其係SARS-CoV-2之免疫測定方法，包括使生物樣本與會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白結合之單株抗體或其之抗體片段接觸的步驟，
上述單株抗體或其之抗體片段會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合。
[2]如[1]所記載之免疫測定方法，其中，上述單株抗體或其之抗體片段對序列編號21之胺基酸序列之第388～第414個胺基酸之序列產生反應。
[3]如[1]或[2]所記載之免疫測定方法，其中，上述單株抗體或其之抗體片段識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位、或AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位。
[4]如[1]至[3]中任一項所記載之免疫測定方法，其中，上述生物樣本經絲胺酸蛋白酶處理。
[5]如[1]至[4]中任一項所記載之免疫測定方法，其中，上述生物樣本為呼吸器官分泌液。
[6]如[1]至[5]中任一項所記載之免疫測定方法，其使用兩種會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白之肽片段結合之單株抗體或其之抗體片段，
上述兩種單株抗體或其之抗體片段分別為第一單株抗體或其之抗體片段及第二單株抗體或其之抗體片段，且第一單株抗體或其之抗體片段已與標記物質間接或直接地結合，第二單株抗體或其之抗體片段已與固相間接或直接地結合，
第一單株抗體或其之抗體片段與第二單株抗體或其之抗體片段所識別之表位不同。
[7]如[6]所記載之免疫測定方法，其中，上述接觸步驟進而包括：（1）使生物樣本與已與標記物質結合之第一單株抗體或其之抗體片段接觸而形成第一複合體之步驟；（2）使上述第一複合體與第二單株抗體或其之抗體片段接觸而形成第二複合體之步驟；及（3）測定源自標記物質之訊號之步驟。
[8]如[6]或[7]所記載之免疫測定方法，其中，上述第一單株抗體或其之抗體片段係識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段，上述第二單株抗體或其之抗體片段係識別AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段。
[9]如[1]至[8]中任一項所記載之免疫測定方法，其為免疫層析術、或ELISA。
[10]如[1]至[9]中任一項所記載之免疫測定方法，其中，上述單株抗體或其之抗體片段為選自由以下（1）～（4）所組成之群中之一種或兩種。
（1）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號4之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號5之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號6之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號7之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號8之胺基酸序列之CDR3。
（2）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號9之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號10之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號11之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號12之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號13之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號14之胺基酸序列之CDR3。
（3）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號15之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號16之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號17之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號18之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號19之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號20之胺基酸序列之CDR3。
（4）包含與上述（1）～（3）中之任一抗體或其之抗體片段之重鏈可變區及輕鏈可變區分別具有80%以上之胺基酸序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體或其之抗體片段。
[11]如[1]至[10]中任一項所記載之免疫測定方法，其中，使用1 μg/mL濃度之胰蛋白酶以37℃對SARS-CoV-2抗原進行30分鐘處理，測定該處理後之SARS-CoV-2抗原時之測定感度與測定胰蛋白酶處理前之SARS-CoV-2抗原時之感度相比為60%以上，較佳為70%以上，更佳為80%以上，進而較佳為90%以上。
[12]一種免疫測定套組，其係生物樣本中之SARS-CoV-2之免疫測定套組，包含會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白結合之單株抗體或其之抗體片段，上述單株抗體或其之抗體片段會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合。
[13]如[12]所記載之免疫測定套組，其中，上述單株抗體或其之抗體片段對序列編號21之胺基酸序列之第388～第414個胺基酸之序列產生反應。
[14]如[12]或[13]所記載之免疫測定套組，其中，上述單株抗體或其之抗體片段識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位、或AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位。
[15]如[12]至[14]中任一項所記載之免疫測定套組，其中，上述生物樣本經絲胺酸蛋白酶處理。
[16]如[12]至[15]中任一項所記載之免疫測定套組，其中，上述生物樣本為呼吸器官分泌液。
[17]如[12]至[16]中任一項所記載之免疫測定套組，其包含兩種會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白之肽片段結合之單株抗體或其之抗體片段，
上述兩種單株抗體或其之抗體片段分別為第一單株抗體或其之抗體片段及第二單株抗體或其之抗體片段，且第一單株抗體或其之抗體片段已與標記物質間接或直接地結合，第二單株抗體或其之抗體片段已與固相間接或直接地結合，
第一單株抗體或其之抗體片段與第二單株抗體或其之抗體片段所識別之表位不同。
[18]如[17]所記載之免疫測定套組，其中，上述第一單株抗體或其之抗體片段係識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段，上述第二單株抗體或其之抗體片段係識別AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段。
[19]如[12]至[18]中任一項所記載之免疫測定套組，其為免疫層析術、或ELISA用之套組。
[20]如[12]至[19]中任一項所記載之免疫測定套組，其中，上述單株抗體或其之抗體片段為選自由以下（1）～（4）所組成之群中之一種或兩種。
（1）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號4之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號5之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號6之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號7之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號8之胺基酸序列之CDR3。
（2）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號9之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號10之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號11之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號12之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號13之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號14之胺基酸序列之CDR3。
（3）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號15之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號16之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號17之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號18之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號19之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號20之胺基酸序列之CDR3。
（4）包含與上述（1）～（3）中之任一抗體或其之抗體片段之重鏈可變區及輕鏈可變區分別具有80%以上之胺基酸序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體或其之抗體片段。
[21]如[12]至[20]中任一項所記載之免疫測定套組，其中，使用1 μg/mL濃度之胰蛋白酶以37℃對SARS-CoV-2抗原進行30分鐘處理，測定該處理後之SARS-CoV-2抗原時之測定感度與測定胰蛋白酶處理前之SARS-CoV-2抗原時之感度相比為60%以上，較佳為70%以上，更佳為80%以上，進而較佳為90%以上。
[22]一種單株抗體或其之抗體片段，其係會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白結合之單株抗體或其之抗體片段，且上述單株抗體或其之抗體片段會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合。
[23]如[22]所記載之單株抗體或其之抗體片段，其識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位、或AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位。
[24]如[22]或[23]所記載之單株抗體或其之抗體片段，其選自由以下（1）～（4）所組成之群中。
（1）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號4之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號5之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號6之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號7之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號8之胺基酸序列之CDR3。
（2）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號9之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號10之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號11之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號12之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號13之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號14之胺基酸序列之CDR3。
（3）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號15之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號16之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號17之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號18之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號19之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號20之胺基酸序列之CDR3。
（4）包含與上述（1）～（3）中之任一抗體或其之抗體片段之重鏈可變區及輕鏈可變區分別具有80%以上之胺基酸序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體或其之抗體片段。
[25]一種複合體，其由第1抗體或其之抗體片段、第2抗體或其之抗體片段、及SARS-CoV-2之核鞘蛋白所構成，且上述第1抗體或其之抗體片段及上述第2抗體或其之抗體片段為如[22]至[24]中任一項所記載之抗體或抗體片段。
又，本發明亦包含以下實施形態。
（A）如[5]至[11]中任一項所記載之免疫測定方法，其中，上述第一單株抗體或其之抗體片段係識別LLPAA（序列編號25）所表示之胺基酸序列作為表位的單株抗體或其之抗體片段，上述第二單株抗體或其之抗體片段係識別LDDFSKQLQ（序列編號26）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段。
（B）如[17]至[21]中任一項所記載之免疫測定套組，其中，上述第一單株抗體或其之抗體片段係識別LLPAA（序列編號25）所表示之胺基酸序列作為表位的單株抗體或其之抗體片段，上述第二單株抗體或其之抗體片段係識別LDDFSKQLQ（序列編號26）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段。
（C）如[19]所記載之單株抗體或其之抗體片段，其識別LLPAA（序列編號25）所表示之胺基酸序列作為表位，或者識別LDDFSKQLQ（序列編號26）所表示之胺基酸序列中之表位。
[發明之效果]
根據本發明，可提供一種能夠實現高感度且迅速之分析之SARS-CoV-2免疫測定套組及SARS-CoV-2之免疫測定方法、以及能夠用於其等之單株抗體或其之抗體片段。
1.SARS-CoV-2之免疫測定方法
（生物樣本）
作為本說明書中之「生物樣本」，可主要例舉源自生物體之固形組織及體液。
作為生物樣本，可例舉：血液、血清、血漿、尿、淚液、耳垢、前列腺液、或呼吸器官分泌液。較佳為呼吸器官分泌液。於本說明書中，「呼吸器官分泌液」意指於呼吸器官之組織內或表面分泌之體液。作為呼吸器官分泌液，可例舉於鼻孔、鼻腔、咽部、鼻咽部、口腔、氣管、支氣管、或肺部等中分泌之體液，尤佳為鼻咽部拭液、鼻腔拭液、唾液、或咳痰。再者，於本說明書中，「呼吸器官」係指與呼吸相關之器官之總稱，意指自鼻前庭起，直至經過鼻腔、咽部、喉頭、氣管、支氣管、細支氣管後之肺泡（肺）為止之器官。
採集生物樣本之對象包括人類或動物（例如猴子、狗、或貓），較佳為人類。生物樣本可為來自對象之生物樣本本身，亦可為對所採集之生物樣本進行通常進行之稀釋、濃縮等處理所獲得者。再者，關於採集或製備本發明中所使用之生物樣本之人，可與進行本發明之免疫測定方法之人為同一人物，亦可為其他人物。又，本發明之免疫測定方法中所使用之生物樣本可為實施本發明之免疫測定方法時所採集或製備者，亦可為預先採集或製備並保存者。
生物樣本較佳為使用自表現有編碼絲胺酸蛋白酶之基因之部位採集之生物樣本，例如生物樣本之表面之拭液等。亦可自生物體採集生物樣本後，利用絲胺酸蛋白酶對生物樣本進行處理。於本說明書中，「生物樣本經絲胺酸蛋白酶處理」包括以下兩種情況：生物樣本為自表現有編碼絲胺酸蛋白酶之基因之部位採集之生物樣本；以及自生物體採集後，利用絲胺酸蛋白酶對生物樣本進行處理。
「絲胺酸蛋白酶」係具有進行親核攻擊之絲胺酸殘基作為觸媒殘基之蛋白酶，係對L-精胺酸及L-離胺酸之羧基側之肽鍵進行水解之酵素。
已知氣管上皮等器官中表現有TMPRSS2、TMPRSS4、TMPRSS11D等絲胺酸蛋白酶。認為自氣管上皮等器官採集之生物樣本中，亦存在經絲胺酸蛋白酶分解之源自SARS-CoV-2之蛋白質。本發明中，可對經絲胺酸蛋白酶分解之源自SARS-CoV-2之核鞘蛋白進行檢測。具體而言，可對SARS-CoV-2之核鞘蛋白經絲胺酸蛋白酶分解而產生之肽片段進行檢測。因此，根據本發明，可避免於生物體內因絲胺酸蛋白酶對SARS-CoV-2抗原之分解而造成之測定感度降低，因此可高感度地檢測SARS-CoV-2。作為本發明中之SARS-CoV-2抗原之測定感度，只要與利用胰蛋白酶等絲胺酸蛋白酶進行酵素處理之前相比，酵素處理後之測定感度為60%以上即可。例如使用1 μg/mL濃度之胰蛋白酶於37℃對SARS-CoV-2抗原進行30分鐘處理，測定該處理後之SARS-CoV-2抗原時之測定感度與測定胰蛋白酶處理前之SARS-CoV-2抗原時之感度相比為60%以上，較佳為70%以上，更佳為80%以上，進而較佳為90%以上。
源自SARS-CoV-2之蛋白質中所含之特定之抗體之表位可能被絲胺酸蛋白酶分解。於表位之胺基酸序列被絲胺酸蛋白酶切斷之情形時，該特定之抗體失去對源自SARS-CoV-2之蛋白質之反應性。即，無法利用特定之抗體來檢測SARS-CoV-2，或者利用特定之抗體進行之SARS-CoV-2之檢測感度發生降低。又，於使用表位各不相同之兩種抗體藉由三明治（sandwich）系統來檢測源自SARS-CoV-2之蛋白質之情形時，即便於表位之胺基酸序列未被切斷時，2個表位之間所存在之部分亦可能被絲胺酸蛋白酶切斷。於該情形時，無法利用兩種抗體來夾住（sandwich）源自SARS-CoV-2之蛋白質，因此於使用該等抗體之檢測系統中無法檢測SARS-CoV-2，或者藉由該檢測系統進行之SARS-CoV-2之檢測感度發生降低。於本發明中，藉由使用能夠夾住經絲胺酸蛋白酶分解之SARS-CoV-2所產生之肽片段之兩種抗體，可檢測經絲胺酸蛋白酶分解之SARS-CoV-2。因此，可降低由上述原因造成之SARS-CoV-2檢測中之偽陰性風險。
於本說明書中，「表位」意指由抗體識別之抗原（於本發明之情形時，為SARS-CoV-2）之一部分。
（SARS-CoV-2）
SARS-CoV-2係引起冠狀病毒病2019（COVID-19）之病毒。SARS-CoV-2之病毒粒子由作為棘蛋白、核鞘蛋白、膜蛋白、及套膜蛋白而為人所知之四種蛋白質、及RNA所構成。
SARS-CoV-2之核鞘蛋白係由419個胺基酸所構成之蛋白質（序列編號21）。核鞘蛋白可能發生變異，因此，核鞘蛋白包括與序列編號21所表示之胺基酸序列具有至少90%、例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之同一性之胺基酸序列所表示之肽片段。
核鞘蛋白中包含NTD抗原（包含N末端之RNA結合域）、CTD抗原（包含C末端之二聚化域）、及位於中央部之富含Ser/Arg（SR）之連接區域。
NTD抗原係核鞘蛋白之第1～第174個胺基酸之區域。其中第1～第49個胺基酸之區域為N末端區域，第50～第174個胺基酸之區域為RNA結合域。
將NTD抗原之胺基酸序列示於以下。
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAE（序列編號22）
連接區域係核鞘蛋白之第175～第247個胺基酸之區域。
將連接區域之胺基酸序列示於以下。
GSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVT（序列編號23）
CTD抗原係核鞘蛋白之第248～第419個胺基酸之區域。其中第248～第364個胺基酸之區域為二聚化域，第365～第419個胺基酸之區域為C末端區域。
將CTD抗原之胺基酸序列示於以下。
KKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA（序列編號24）
（單株抗體）
於本說明書中，「單株抗體」意指自源自單一抗體產生細胞之殖株所獲得之抗體或抗體分子。於本發明之免疫測定方法中，只要可獲得本發明之效果，亦可使用具有該單株抗體之功能之抗體片段。作為具有單株抗體之功能之抗體片段，例如可例舉：藉由單株抗體之酵素消化所獲得之包含該單株抗體之Fab部分的功能性片段、藉由基因重組所製作之包含該單株抗體之Fab部分的功能性片段、及藉由噬菌體顯示法所製作之包含scFv之功能性片段等。
（SARS-CoV-2之核鞘蛋白之肽片段）
本發明之免疫測定方法中所使用之單株抗體或其之抗體片段會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合。以下，有時將「與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合之單株抗體或其之抗體片段」稱為「本發明之單株抗體」。
本發明之單株抗體之第一實施形態可識別核鞘蛋白中之CTD抗原之第365～第419個胺基酸之區域中之表位，較佳為可識別C末端區域中所存在之序列編號1所表示之胺基酸序列中之表位，更佳為識別LLPAA（序列編號25）所表示之胺基酸序列作為表位。
本發明之單株抗體之第二實施形態可識別核鞘蛋白中之CTD抗原之第365～第419個胺基酸之區域中之表位，較佳為可識別C末端區域中所存在之序列編號2所表示之胺基酸序列中之表位，更佳為識別LDDFSKQLQ（序列編號26）所表示之胺基酸序列中之表位。
本發明之單株抗體可為經分離之單株抗體或其之抗體片段。
本發明之單株抗體較佳為特異性地識別經絲胺酸蛋白酶分解而產生之SARS-CoV-2之核鞘蛋白之肽片段中之表位。「特異性地識別表位」意指單株抗體或其之抗體片段不與特定之肽片段或表位以外實質性地結合。
本發明之單株抗體之第一實施形態更佳為不識別NTD抗原中之胺基酸序列、連接區域中之胺基酸序列、及CTD抗原中之二聚化域即第248～第364個胺基酸之區域之胺基酸序列中之任一者作為表位。
本發明之單株抗體之第二實施形態更佳為不識別NTD抗原中之胺基酸序列、連接區域中之胺基酸序列、及CTD抗原中之二聚化域即第248～第364個胺基酸之區域之胺基酸序列中之任一者作為表位。
為了確認本發明之單株抗體與具有某一胺基酸序列之肽片段是否「不實質性地結合」，例如可基於SPR法，使用Biacore（註冊商標）T100或T200，將本發明之單株抗體固定化而進行測定。藉由上述SPR法以外之業者周知之方法或手段，亦能夠確認「不實質性地結合」。
認為於核鞘蛋白之C末端側之區域，在位於序列編號1所表示之胺基酸序列之末端的K（離胺酸）與位於QLQQSMSSA（序列編號27）所表示之胺基酸序列之開端的Q（麩醯胺）之間，絲胺酸蛋白酶切斷核鞘蛋白。認為結果產生由序列編號1所表示之胺基酸序列所構成之肽片段。認為本發明之單株抗體可與該肽片段結合。
又，考慮到下述S32217抗體之表位分析之結果，較由序列編號1所表示之胺基酸序列所構成之肽片段之末端進而包含C末端側之肽片段（具體而言，為包含由LDDFSKQLQ（序列編號26）所構成之胺基酸序列之肽片段）亦可能包含於經絲胺酸蛋白酶處理之樣品中。
例如可採用下述競爭法，僅使用一種本發明之單株抗體，藉此進行SARS-CoV-2之免疫測定。然而，較佳為使用兩種本發明之單株抗體，進行SARS-CoV-2之免疫測定。於該情形時，兩種單株抗體較佳為識別不同之表位。「識別不同之表位」意指被識別為表位之胺基酸序列不重複。再者，關於使用「兩種」本發明之單株抗體，只要使用「至少兩種」本發明之單株抗體便足夠，並不將使用大於兩種本發明之單株抗體的實施形態排除在本發明之範圍外。
於使用兩種本發明之單株抗體之情形時，兩種單株抗體較佳為分別識別KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQ（序列編號28）所表示之胺基酸序列中之不同之表位，更佳為一單株抗體識別序列編號1所表示之胺基酸序列中之表位，另一單株抗體識別序列編號2所表示之胺基酸序列中之表位，進而較佳為一單株抗體識別LLPAA（序列編號25）所表示之胺基酸序列作為表位，另一單株抗體識別LDDFSKQLQ（序列編號29）所表示之胺基酸序列中之表位。
本發明之單株抗體較佳為選自由以下（1）～（4）所組成之群中之任一種或兩種。
（1）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號4之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號5之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號6之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號7之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號8之胺基酸序列之CDR3。
（2）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號9之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號10之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號11之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號12之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號13之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號14之胺基酸序列之CDR3。
（3）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號15之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號16之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號17之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號18之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號19之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號20之胺基酸序列之CDR3。
（4）包含與上述（1）～（3）中之任一抗體或其之抗體片段之重鏈可變區及輕鏈可變區分別具有80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之胺基酸序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體或其之抗體片段。
上述胺基酸序列同一性較佳為相對於構成重鏈可變區之CDR1、CDR2、及CDR3、以及輕鏈可變區之CDR1、CDR2、及CDR3之胺基酸序列（HCCDR1＋HCCDR2＋HCCDR3＋LCCDR1＋LCCDR2＋LCCDR3）的序列同一性。
再者，「具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1」意指CDR1由序列編號3之胺基酸序列所構成。其他CDR（Complementarity-determining region，互補決定區）亦同樣如此。
本發明之單株抗體除重鏈可變區及輕鏈可變區以外，亦可包含恆定區（C區域）。作為恆定區，於輕鏈中可包含CL區域，於重鏈中可包含CH區域（CH1、CH2、及CH3）。
本發明之單株抗體更佳為分別為選自由以下（1）、（2）、及（4）所組成之群中之任一種或兩種。
（1）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號4之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號5之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號6之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號7之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號8之胺基酸序列之CDR3。
（2）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號9之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號10之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號11之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號12之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號13之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號14之胺基酸序列之CDR3。
（4）包含與上述（1）～（2）中之任一抗體或其之抗體片段之重鏈可變區及輕鏈可變區分別具有80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為98%以上之胺基酸序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體或其之抗體片段。
於使用兩種本發明之單株抗體之情形時，兩種單株抗體較佳為（1）之抗體及（2）之抗體。最佳為使用（1）之抗體作為標記抗體，使用（2）之抗體作為固相抗體。
作為與上述抗體（1）類似之抗體，可例舉識別序列編號1所表示之胺基酸序列中之表位的抗體，例如S32213抗體及S32212抗體。又，作為上述抗體（1），可例舉識別LLPAA（序列編號25）所表示之胺基酸序列作為表位之抗體，例如S32213抗體。
作為與上述抗體（2）類似之抗體，可例舉識別AADLDDFSKQLQQSMSSA（序列編號30）之胺基酸序列中之表位的抗體，例如S32217抗體及S32209抗體。又，作為上述抗體（2），可例舉識別LDDFSKQLQ（序列編號29）所表示之胺基酸序列中之表位的抗體，例如S32217抗體。
作為上述抗體（3），可例舉識別CTD抗原中之C末端區域中之表位的抗體，例如S32223抗體。認為S32223抗體具有與S32217抗體相同之反應性。
於本說明書中，單株抗體或其之抗體片段與特定之物質或胺基酸序列「反應」、「識別」、及「結合」係同義地使用。於確認單株抗體是否與抗原（化合物）「反應」時，可藉由抗原固相化ELISA、競爭ELISA、或三明治ELISA等進行。此外，可藉由利用表面電漿子共振（surface plasmon resonance）之原理之方法（SPR法）等進行。SPR法可使用名稱為Biacore（註冊商標）之市售之裝置、感測器、或試劑類而進行。
例如於進行與下述實施例1之表位分析（抗體之表位分析1）相同之操作之情形時，可評價為，識別「吸光度變得最高之肽片段中所含之胺基酸序列」作為表位。
（單株抗體之製備方法）
本發明之單株抗體可藉由以下方式而製備：將全長核鞘蛋白作為抗原（免疫原）溶解至磷酸鹽緩衝生理鹽水等溶劑中，將該溶液投予至非人類動物而進行免疫。亦可視需要向上述溶液中添加適宜之佐劑後，使用乳狀液進行免疫。作為佐劑，除了油包水型乳劑、水包油包水型乳劑、水包油型乳劑、脂質體、氫氧化鋁凝膠等通用佐劑以外，亦可使用源自生物成分之蛋白質或肽性物質等。例如適宜使用弗氏之不完全佐劑或弗氏之完全佐劑等。佐劑之投予路徑、投予量、投予時期並無特別限定，但較理想為以「於對抗原免疫之動物中可增強所需之免疫反應」之方式進行適當選擇。
關於用於免疫之動物之種類，亦無特別限定，較佳為哺乳動物，例如小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、綿羊、羊駝、小鼠、或大鼠，更佳可使用小鼠或大鼠。動物之免疫只要依據一般手法進行即可，例如可藉由將抗原之溶液、較佳為將其與佐劑之混合物注射至動物之皮下、皮內、靜脈、或腹腔內而進行。免疫反應一般根據被免疫之動物之種類及系統而有所不同，因此免疫程序較理想為根據所使用之動物進行適當設定。抗原投予較佳為在最初之免疫後反覆進行多次。
為了獲得本發明之單株抗體，可繼續進行以下操作，但並不限於其等。單株抗體本身之製造方法是業界周知且通用的，因此業者可藉由使用上述抗原來製備本發明之單株抗體（例如參照Antibodies，A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988）第6章等）。
可於最終免疫後，自經免疫之動物中摘除作為抗體產生細胞之脾臟細胞或淋巴結細胞，與具有較高之增殖能力之源自骨髓瘤之細胞株進行細胞融合，藉此製作融合瘤。細胞融合時較佳為使用抗體產生能力（質、量）較高之細胞，又，更佳為源自骨髓瘤之細胞株與所融合之抗體產生細胞之來源動物具有相容性。細胞融合可於該領域內依據公知之方法進行。例如可採用：聚乙二醇法、使用仙台病毒之方法、或利用電流之方法等。所獲得之融合瘤可依據業界通用之條件進行增殖。可確認所產生之抗體之性質，並且選擇所需之融合瘤。融合瘤之選殖例如可藉由極限稀釋法或軟瓊脂法等周知之方法進行。
可於選殖步驟後，使用ELISA、RIA法、或螢光抗體法等方法來檢定所產生之單株抗體與全長核鞘蛋白之結合能力。藉由該等操作，可確認所選擇之融合瘤是否產生具有所需性質之單株抗體。
藉由大量培養以上述方式篩選之融合瘤，可製造具有所需特性之單株抗體。大量培養之方法並無特別限定，例如可例舉：將融合瘤於適當之培養基中進行培養，於培養基中產生單株抗體之方法；及向哺乳動物之腹腔內注射融合瘤而進行增殖，於腹水中產生單株抗體之方法；等。
作為本發明之單株抗體，除了整個抗體分子以外，亦可使用具有抗原抗體反應活性之單株抗體之抗體片段。除了如上所述經由對動物之免疫步驟所獲得者以外，亦可使用利用基因重組技術而獲得之單株抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體等。作為單株抗體之片段，例如可例舉F(ab')
2、Fab'、scFv等。該等片段可藉由以下方式而製備：利用蛋白質分解酵素（例如胃蛋白酶或木瓜酶等）對以上述方式所獲得之單株抗體進行處理；或者選殖該抗體之DNA，於使用大腸桿菌或酵母之培養系統進行表現。
藉由使用兩種會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白之肽片段結合之單株抗體，亦可於本發明之免疫測定方法中構建三明治系統。三明治系統係指利用識別不同表位之兩種抗體來夾住被檢測物質而獲得較高之特異性及感度之方法。
於構建三明治系統之情形時，較佳為兩種單株抗體中至少一種為固相抗體，至少一種為標記抗體。於本說明書中，固相抗體意指直接或間接地固相化於固相上之單株抗體。於本說明書中，標記抗體意指於測定源自標記物質之訊號時，已被下述之業者周知且慣用之標記物質直接或間接地標記之單株抗體。
例如可藉由使單株抗體物理性地吸附於固相、或與固相化學性地結合（可隔著適當之間隔件）而製造固相抗體。作為固相，可使用由聚苯乙烯樹脂等高分子基材、玻璃等無機基材、或者纖維素或瓊脂糖等多醣類基材等所構成之固相。固相之形狀並無特別限定，可選擇盤（plate）狀（例如微量盤（microplate）或膜（membrane））、珠粒或粒子狀（例如乳膠粒子、磁性粒子）、或者筒狀（例如試管）等任意形狀。
藉由使用能夠與本發明之免疫測定方法中所使用之單株抗體直接結合之標記抗體（二級抗體），亦可測定已與SARS-CoV-2或其之肽片段結合之抗體之量。於本說明書中，將與本發明之單株抗體結合且結合有標記物質之抗體稱為二級抗體。亦可使用該二級抗體而使標記物質與本發明之單株抗體間接地結合。
可測定標記物質所發出之訊號之強度，測定生物樣本中之SARS-CoV-2或其之肽片段之量。作為用於製備標記抗體之標記物質，例如可例舉：金屬錯合物、酵素、不溶性粒子、螢光物質、化學發光物質、生物素、抗生物素蛋白、放射性同位素、金膠體粒子、或著色乳膠。作為標記物質與單株抗體之結合法，可使用：業者可利用之物理吸附、戊二醛法、馬來醯亞胺法、吡啶基二硫化物法、或過碘酸法。於將山葵過氧化酶（HRP）或鹼性磷酸酶（ALP）等酵素用作標記物質之情形時，可使用該酵素之特異性受質來測定酵素活性。例如於酵素為HRP之情形時，可使用O-苯二胺（OPD）或3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB），於為ALP之情形時，可使用磷酸對硝基苯酯來測定酵素活性。於使用生物素作為標記物質之情形時，亦可利用生物素來標記單株抗體，使經酵素、色素、或螢光標記（較佳為HRP）標記之抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白進行反應。於本發明之免疫測定方法中，較佳為使用金膠體粒子作為標記物質。
於本說明書中，有時將使抗原或抗體物理性或化學性地載持於固相、或已使抗原或抗體物理性或化學性地載持於固相之狀態表達為「固定化」或「固相化」。又，「分析」、「檢測」、或「測定」之用語包括SARS-CoV-2或其之肽片段之存在之證明及SARS-CoV-2或其之肽片段之定量。
作為本發明之免疫測定方法，可例舉包括如下所述之步驟（1）～（4）之競爭法即競爭ELISA。於使用競爭ELISA之情形時，可使用一種本發明之單株抗體來進行免疫測定方法。
（1）將SARS-CoV-2或其之肽片段固定於微量盤等固相之步驟。
（2）將要分析之生物樣本添加至微量盤之步驟。
（3）將經酵素標記之本發明之單株抗體添加至微量盤之步驟。
（4）添加上述酵素之受質，測定源自酵素反應之訊號之步驟。
若生物樣本中之SARS-CoV-2或其之肽片段與固定於固相之SARS-CoV-2或其之肽片段之間發生競爭，則訊號之強度降低。又，亦可利用生物素來標記抗體。可使經HRP等標記之鏈球菌親生物素蛋白與該生物素結合。並且，可測定藉由添加OPD作為受質所產生之顯色訊號。
於本發明之免疫測定方法中，較佳為使用識別不同表位之兩種單株抗體。再者，為了方便，有時將一單株抗體稱為第一單株抗體，將另一單株抗體稱為第二單株抗體。
於第一單株抗體為標記抗體，第二單株抗體為固相抗體之情形時，本發明之免疫測定方法可包括以下之步驟（1）～（3）。
（1）使生物樣本與已與標記物質結合之第一單株抗體接觸而形成第一複合體（包含SARS-CoV-2或其之肽片段、標記物質、及第一單株抗體）之步驟。
（2）使上述第一複合體與第二單株抗體接觸而形成第二複合體（包含SARS-CoV-2或其之肽片段、標記物質、第一單株抗體、及第二單株抗體）之步驟。
（3）測定源自標記物質之訊號之步驟。
第二複合體中包含標記物質。訊號之測定可根據標記物質採用業者周知之測定方法。訊號之測定可使用測定機器進行，亦可藉由目視來進行。
於使用上述一種或兩種單株抗體之情形時，本發明之免疫測定方法亦可視需要包括對生物樣本進行預處理之步驟、及/或將所獲得之訊號之強度與第一閾值進行比較之步驟。作為預處理，可例舉生物樣本之過濾、及利用檢體稀釋液對生物樣本進行之稀釋等。第一閾值可考慮感度及生物樣本等之種類而適當設定。
第一閾值亦可為範圍。「第一閾值為範圍」意指在所示之範圍之間存在具體閾值，藉由判定測定值比該具體閾值大或者小來判斷有無疾病。
第一閾值例如可為1.1×10
2TCID
50/mL。
於第一閾值為範圍之情形時，第一閾值可存在於1.1×10
2TCID
50/mL～2.0×10
2TCID
50/mL之間、1.1×10
2TCID
50/mL～1.8×10
2TCID
50/mL之間、或1.1×10
2TCID
50/mL～1.5×10
2TCID
50/mL之間。
本發明之免疫測定方法中，可包括：於訊號之強度低於（高於）第一閾值之情形時，判定為已感染SARS-CoV-2之步驟；或者於訊號之強度高於（低於）第一閾值之情形時，判定為未感染SARS-CoV-2之步驟。
本發明之免疫測定方法可基於訊號之測定值來判定特定醫藥對已感染SARS-CoV-2之對象之治療效果。於該情形時，本發明之免疫測定方法可除上述步驟以外還包括以下步驟。
將特定醫藥投予至對象之步驟、及/或將訊號之強度與第二閾值進行比較之步驟。
於該情形時，第二閾值可考慮感度及生物樣本之種類等而適當設定，亦可為將特定醫藥投予至對象前之上述對象中之SARS-CoV-2或其之肽片段之測定值。
本發明之免疫測定方法中，可包括：於訊號之強度低於（高於）第二閾值之情形時，判定為特定醫藥具有治療效果之步驟；或者於訊號之強度高於（低於）第二閾值之情形時，判定為特定醫藥無治療效果之步驟。
上述治療效果之判定可每隔幾天進行測定，監測治療效果。
（免疫測定方法）
「免疫測定方法」係利用抗原與抗體之反應，測定生物樣本中所含之物質之程度的方法。「程度」包括物質之量、濃度、或者存在或不存在之確認等。
作為本發明之免疫測定方法，可例舉電化學發光免疫測定法（ECL法）、酵素免疫測定法（ELISA）、乳膠免疫比濁法（LTIA法）、化學發光免疫測定法、免疫層析術、及螢光抗體法，但並不限於其等。本發明之免疫測定方法較佳為ELISA、或免疫層析術，更佳為免疫層析術。
本發明之免疫測定方法可為活體內或活體外之免疫測定方法。又，為了增強感度，亦可使用增感劑。
本發明之免疫測定方法可對以相當於1.1×10
2TCID
50/mL以上之量含有在生物樣本中之SARS-CoV-2或其之肽片段進行分析。
本發明之免疫測定方法中，關於將本發明之單株抗體與生物樣本添加至測定系統中之順序，只要可獲得本發明之效果，便無限定。即，可將本發明之單株抗體於添加生物樣本之前、與添加生物樣本同時、或於添加生物樣本之後添加至測定系統中。
以下，針對所採用之每種免疫測定方法，對測定步驟及原理進行說明。以下僅例示本發明之一實施形態中之測定步驟及原理，並非對本發明之範圍進行任何限定。
本發明之免疫測定方法較佳為使用本發明之單株抗體之第一實施形態作為標記抗體，使用本發明之單株抗體之第二實施形態作為固相抗體。
於下述各個免疫測定方法中，關於單株抗體向固相之固定化方法、單株抗體與標記物質之結合方法、標記物質之種類等具體方法，可包括上述內容在內無限制地使用業者周知之方法。
（免疫層析術）
免疫層析術係利用已與被檢測物質結合之標記抗體、或標記抗體在膜上流動之性質的免疫測定方法。免疫層析術之測定被檢測物質之一般原理如下所述。
將針對作為被檢測物質之抗原之抗體，於作為層析介質之不溶性膜載體上進行固定化而製作作為固定相之檢測部。然後，使用結合物（conjugate）（利用能夠與上述被檢測物質結合之抗體而受感應之標記物質）作為流動相。使被檢測物質與作為流動相之結合物進行特異性反應，進而於作為固定相之檢測部中，使已與結合物結合之被檢測物質與被固定化於檢測部之抗體進行特異性反應。
關於採用免疫層析術作為本發明之免疫測定方法時之測定步驟及原理，如下所述。
（1）使用於供給生物樣本之樣品供給部與生物樣本接觸。
（2）生物樣本中之SARS-CoV-2或其之肽片段與結合物接觸，形成第一複合體（包含SARS-CoV-2或其之肽片段、標記物質、及第一單株抗體）。結合物係第一單株抗體已與標記物質結合者。
（3）上述第一複合體、與被固定化於檢測部之第二單株抗體接觸，形成第二複合體（包含SARS-CoV-2或其之肽片段、標記物質、第一單株抗體、及第二單株抗體）。
（4）藉由測定源自結合物中所含之標記物質之訊號之強度來確認上述第二複合體之形成。
作為標記物質，可例舉金膠體粒子、鉑膠體粒子、有色乳膠粒子、及磁性粒子等。較佳為金膠體粒子。該等標記物質之種類及粒徑可由業者根據所需感度進行適當調整。
（ELISA）
免疫測定方法中，使用酵素標記之ELISA亦可簡單且迅速地測定目標，故較佳。本說明書中，ELISA意指如下所述之方法：對於試樣中所含之作為被檢測物質之抗原或抗體，利用針對上述被檢測物質之抗體或抗原進行捕捉後，利用酵素反應進行檢測。固相較佳為盤（plate）（免疫盤（immunoplate））。作為標記，可使用HRP或ALP。
關於使用三明治ELISA作為本發明之免疫測定方法時之測定步驟及原理，如下所述。
（1）當向固定化有固相抗體之固相添加生物樣本而進行反應時，生物樣本中之SARS-CoV-2或其之肽片段與固相抗體結合，於固相上形成固相抗體與SARS-CoV-2或其之肽片段之複合體。
（2）當將經標記之識別另一表位之標記抗體添加至固相而進行反應時，標記抗體與上述所捕捉之SARS-CoV-2或其之肽片段結合，與上述固相抗體-SARS-CoV-2或其之肽片段複合體形成三明治。
（3）於清洗後，與酵素之受質進行反應而顯色，測定吸光度。
可根據所測得之標記物質之量來測定生物樣本中之SARS-CoV-2或其之肽片段之量。
於三明治ELISA法中，亦可使用二級抗體。藉由使用二級抗體，反應被放大，可提高檢測感度。於下述例之情形時，二級抗體係特異性地識別一級抗體（第二單株抗體）之抗體。
於使用二級抗體之情形時，可採用以下之步驟（1）～（5）。
（1）向固定化有第一單株抗體之固相添加經適當處理並稀釋之生物樣本後，進行培養，去除生物樣本並進行清洗。
（2）添加一級抗體（第二單株抗體）並進行培養及清洗。
（3）進而添加經酵素標記之二級抗體並進行培養。
（4）添加受質使其顯色。
（5）使用盤分析儀（plate reader）等來測定顯色，藉此測定SARS-CoV-2或其之肽片段之量。
（電化學發光免疫測定法）
電化學發光免疫測定法意指如下所述之方法：藉由通電使標記物質發光，檢測該發光量，藉此測定被檢測物質之量。電化學發光免疫測定法中，可使用釕錯合物作為標記物質。於固相（微量盤等）設置電極，於該電極上產生自由基，藉此使釕錯合物成為激發狀態而使其發光。並且，可檢測該釕錯合物之發光量。
關於使用磁性粒子作為固相，並且使用釕錯合物作為標記物質時之測定步驟及原理，如下所述。
（1）當使固定化有固相抗體之磁性粒子與生物樣本接觸時，生物樣本中之SARS-CoV-2或其之肽片段與固相抗體結合。
（2）當磁性粒子清洗後與標記抗體接觸時，標記抗體會與已與磁性粒子結合之SARS-CoV-2或其之肽片段結合。
（3）當磁性粒子清洗後進行通電時，會根據已與SARS-CoV-2或其之肽片段結合之標記抗體之量進行發光。藉由測量該發光量，可準確地測定生物樣本中之被檢測物質之量。
（乳膠免疫比濁法）
乳膠免疫比濁法係利用結合於乳膠表面之抗體與被檢測物質（抗原）之凝集的免疫測定方法。作為乳膠粒子，只要為體外診斷試劑中一般使用之乳膠粒子，便無特別限制。凝集反應測定時之乳膠粒子之濃度、乳膠粒子之平均粒徑等可根據感度或性能進行適當設定。
關於使用乳膠免疫比濁法作為本發明之免疫測定方法時之測定步驟及原理，如下所述。
（1）使第一單株抗體及第二單株抗體與乳膠粒子結合後，與生物樣本接觸。
（2）生物樣本中之SARS-CoV-2或其之肽片段與第一單株抗體及第二單株抗體結合，凝集成抗體結合乳膠粒子。
（3）對生物樣本照射近紅外線，進行吸光度之測定或散射光之測定。可基於測定值求出抗原之濃度。
於使用乳膠免疫比濁法作為本發明之免疫測定方法之情形時，乳膠為固相，且作為標記物質發揮作用。即，第一單株抗體及第二單株抗體均已與固相及標記物質各者結合。
2.生物樣本中之SARS-CoV-2之免疫測定套組
本發明之生物樣本中之SARS-CoV-2之免疫測定套組（以下，有時簡稱為本發明之免疫測定套組）包含本發明之單株抗體。
本發明之免疫測定套組可為包含一種本發明之單株抗體且用於競爭法、較佳為競爭ELISA之免疫測定套組。
本發明之免疫測定套組中，較佳為使用兩種會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白之肽片段結合之單株抗體，對SARS-CoV-2進行分析。於該情形時，兩種單株抗體較佳為識別不同之表位。兩種單株抗體亦可放入至個別之容器中。
作為本發明之免疫測定套組，可例舉用於實施免疫層析術、ELISA、電化學發光免疫測定法、乳膠免疫比濁法、化學發光免疫測定法、及螢光抗體法之免疫測定套組，但並不限於其等。本發明之免疫測定套組較佳為用於實施ELISA、或免疫層析術之免疫測定套組，更佳為用於實施免疫層析術之免疫測定套組。
本發明之免疫測定套組可為用於對活體內或活體外之樣品進行分析之免疫測定套組。
本發明之免疫測定套組中亦可另外包含標準抗原物質、精度管理用抗原試樣等其他檢查試劑、檢體稀釋液、及/或使用說明書等。包含抗體之試劑等之濃度可由業者適當調整。
以下，針對所採用之每種免疫測定方法，對套組中所含之試劑進行說明。本發明之免疫測定套組較佳為使用本發明之單株抗體之第一實施形態作為標記抗體，使用本發明之單株抗體之第二實施形態作為固相抗體。
於使用免疫層析術之情形時，本發明之免疫測定套組可為將免疫層析術用測試條儲存、搭載於適當之容器（殼）中之形態。
免疫層析術用測試條可由具有樣品供給部之樣品墊、作為層析介質之不溶性膜載體、及配置於上述不溶性膜載體之下游側端部之吸收墊所構成。
可於不溶性膜載體上配置固定化有第一單株抗體之檢測部，將配置有結合物之結合物墊配置於樣品墊與不溶性膜載體之間。
亦可於樣品墊或不溶性膜載體上含有結合物。
此外，作為免疫層析術之構成，例如可適當地採用國際公開第2018/012517或國際公開第2016/031892中所記載者。
作為標記物質，可例舉：金膠體粒子、鉑膠體粒子、有色乳膠粒子、及磁性粒子等。較佳為金膠體粒子。該等標記物質之種類及粒徑可由業者進行適當調整。
於使用三明治ELISA之情形時，本發明之免疫測定套組可包含以下（A）及（B）。（A）包含第二單株抗體與酵素（HRP或ALP等）之結合體之標記試劑（B）固定化有第一單株抗體之固相。
於此種套組中，首先向固定化有第一單株抗體之固相中添加生物樣本後進行培養，去除生物樣本並進行清洗。繼而，添加標記試劑後進行培養，加入受質進行顯色。藉由使用盤分析儀等來測定顯色，可分析SARS-CoV-2或其之肽片段。
於競爭ELISA之情形時，本發明之免疫測定套組可包含以下（A）及（B）。（A）固定有SARS-CoV-2或其之肽片段之固相（B）經酵素標記之本發明之單株抗體。固相與SARS-CoV-2或其之肽片段亦可個別包含於免疫測定套組中。於該情形時，進行分析者將包含SARS-CoV-2或其之肽片段之肽片段固定化於固相。
亦可使用生物素。生物素亦可與經HRP等標記之鏈球菌親生物素蛋白結合。亦可進而包含OPD作為受質。
於使用電化學發光免疫測定法之情形時，本發明之免疫測定套組可包含以下（A）及（B）。
（A）包含第二單株抗體與電化學發光物質（例如釕錯合物等）之結合物之標記試劑。
（B）固定化有會與SARS-CoV-2或其之肽片段結合之第一單株抗體之固相。
例如於使用磁性粒子作為固相之套組中，向「固定化有會與SARS-CoV-2或其之肽片段結合之第一單株抗體之磁性粒子」添加生物樣本並使其反應後，去除生物樣本並進行清洗。然後，添加結合物使其反應。對磁性粒子進行清洗後，施加電能使其發光。然後，藉由測定標記物質之發光量，可分析SARS-CoV-2或其之肽片段。
於使用乳膠免疫比濁法之情形時，本發明之免疫測定套組可包含以下之（1）及（2）。
（1）結合有第一單株抗體之乳膠粒子。
（2）結合有第二單株抗體之乳膠粒子。
於使用乳膠免疫比濁法用套組作為本發明之免疫測定套組之情形時，乳膠為固相，且為標記物質。因此，第一單株抗體及第二單株抗體均已與固相及標記物質各者結合。
以上，分為發明之態樣（aspect）進行了說明，但各個態樣中所記載之事項、語句之定義、及實施形態亦可應用於其他態樣。
其次，例舉實施例來具體地說明本發明，但其等並不限定本發明之範圍。再者，只要無特別說明，%便意指質量%。
[實施例]
[製備例1 單株抗體之製備]
將SARS-CoV-2（COVID-19）Nucleocapsid protein, His-tag 1-419 aa（以下為Nu抗原，acrobiosystems公司製造，NUN-C5227）作為免疫原。初次免疫係將Nu抗原與弗氏完全佐劑（Difco Laboratories）以1：1進行混合而使用，第2次免疫以後係將Nu抗原與弗氏不完全佐劑（Difco Laboratories）以1：1進行混合而使用。對Balb/c，初次免疫使用20 μg、第2次免疫以後使用10 μg（以PBS進行稀釋）之免疫原量，每隔一週繼續進行皮下免疫。實施3次免疫後，藉由抗原固相化ELISA來評價血中抗體力價。對於確認到充分之力價上升之個體，於解剖之1～3天前，以經PBS稀釋之免疫原進行腹腔免疫。然後，回收脾臟細胞、腸骨淋巴結細胞及鼠蹊部淋巴結細胞，藉由電融合法而與骨髓瘤細胞SP2/0融合。融合細胞係於96孔盤中進行培養，自融合起7或8天後回收培養上清液。然後，實施藉由下述抗原固相化ELISA之篩選，選擇對Nu抗原表現反應性且對NHis-cBSA不表現反應性之株。再者，於篩選前一天進行培養基更換。
[製備例2 抗Nu抗原抗體之篩選（抗原固相化ELISA）]
向ELISA用96孔盤（NUNC442404）中分注Nu抗原及NHis-cBSA（將His-tag抗原結合至BSA所獲得者（本公司製備品），100 ng/mL in PBS）（50 μL/孔），於室溫靜置2小時。以PBST清洗3次後（400 μL/孔），分注阻斷液（1%BSA-PBST）（100 μL/孔），於室溫靜置1小時或於4℃靜置一整夜。去除阻斷液後，分注細胞培養上清液（稀釋2倍）、抗血清（稀釋1000及10000倍）（50 μL/孔），於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後，分注山羊抗小鼠IgG（H＋L）PAb-HRP（SouthernBiotech公司製造，1031-05，稀釋9500倍）（50 μL/孔），於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後，分注OPD顯色液（50 μL/孔），於室溫靜置10分鐘。分注停止液（50 μL/孔），停止反應後，利用盤分析儀進行測定（Abs.492 nm）。挑選對Nu抗原表現反應性且對NHis-cBSA不表現反應性之抗體。將所挑選之抗體，基於反應性等分類為群組A（3種）、群組B（15種）、群組C1（8種）、群組C2（3種）、群組C3（3種）、群組C4（一種）、及群組D（一種）。
[分析例1 藉由三明治ELISA進行之抗體分類]
自所獲得之抗體群中選擇兩種來實施三明治ELISA之情形時，藉由下述步驟來確認能否檢測出Nu抗原。
向ELISA用96孔盤（NUNC442404）中分注一種抗體，於室溫靜置2小時。以PBST清洗3次後，分注阻斷液（1%BSA-PBST）（100 μL/孔），於4℃靜置一整夜。去除阻斷液後，分注Nu抗原並於室溫靜置30分鐘。以PBST清洗3次後，添加經生物素標記之另一種抗體，於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後，將稀釋5000倍後之鏈球菌親生物素蛋白-HRP以50 μL/孔進行分注，於室溫靜置30分鐘。以PBST清洗3次後，分注OPD顯色液，於室溫靜置10分鐘。分注反應停止液，利用盤分析儀來測定吸光度（波長492 nm）。
於無法藉由三明治ELISA來檢測Nu抗原之情形時，判斷為該兩種抗體之抗原識別部位相近，而將該兩種分類為同一群。關於藉由各群之抗體對可否夾住，如下述表1所示。
[表1]
| 固相抗體 | ||||||||
| 群組A | 群組B | 群組C1 | 群組C2 | 群組C3 | 群組C4 | 群組D | ||
| 液相抗體 | 群組A | - | + | + | + | + | + | + |
| 群組B | + | - | + | + | + | + | + | |
| 群組C1 | + | + | - | - | + | - | + | |
| 群組C2 | - | + | - | - | + | + | + | |
| 群組C3 | + | + | + | + | - | - | + | |
| 群組C4 | - | + | - | + | - | - | + | |
| 群組D | + | - | - | - | - | + | - | |
| +：可夾住，-：不可夾住 |
[分析例2 藉由免疫層析術進行之抗體分類]
藉由下述步驟來製作免疫層析術用測試條。
1）金膠體標記抗體液之製備
向1 OD/mL之金膠體溶液20 mL中添加包含25 μg/mL之抗SARS-CoV-2抗體之磷酸緩衝液1 mL，於室溫攪拌10分鐘。繼而，向金膠體溶液中添加10%BSA溶液2 mL，於室溫攪拌5分鐘。於10℃以10,000 rpm對所獲得之溶液進行45分鐘離心，去除上清液。使殘渣於結合物稀釋緩衝液（Scripps公司）中懸浮而獲得金膠體標記抗體液。
2）結合物墊之製作
利用1.33%酪蛋白、4%蔗糖溶液（pH7.5）將1）中所製備之金膠體標記抗體液稀釋至4 OD/mL而製備結合物液。將結合物液呈線狀塗佈於玻璃纖維墊，使其乾燥而獲得結合物墊。
3）抗體固相化膜之製作
製備包含0.75 mg/mL之抗SARS-CoV-2抗體及2.5%蔗糖之PBS，作為測試線塗佈液。製備包含1.0 mg/mL山羊抗小鼠IgG單株抗體及2.5%蔗糖之PBS，作為控制線塗佈液。使用免疫層析術用分配器「XYZ3050」（BIO DOT公司製造），於硝化纖維素膜上分別以1.0 μL/cm塗佈測試線塗佈液及控制線塗佈液，使其乾燥，藉此獲得抗體固相化膜。
4）試驗裝置之製作
將抗體固相化膜、結合物墊、吸收墊貼附於塑膠製黏著片，裁剪成5 mm寬，藉此獲得免疫層析術用測試條。
試驗方法
1）試樣
利用Universal Transport Medium（BD公司）將SARS-CoV-2（分離：USA-WA1/2020）培養液（加熱非活化）（ZeptoMetrix公司）稀釋至5.0×10
5TCID
50/mL。利用Rapid Testa FLU・NEXT用檢體稀釋液（積水醫療公司）進而稀釋11倍而製成試樣。
2）試驗步驟
將試樣120 μL滴加至測試條，10分鐘後，藉由目視來判定抗體固相化膜上之測試線是否發生顯色。
使用以各種抗體組合製作之測試條所得之SARS-CoV-2不活化抗原之檢測試驗結果如下述表2所示。可知能夠藉由ELISA夾住之一部分抗體群對中，能夠藉由免疫層析術來檢測SARS-CoV-2不活化抗原。
[表2]
| 固相抗體 | ||||||||
| 群組A | 群組B | 群組C1 | 群組C2 | 群組C3 | 群組C4 | 群組D | ||
| 標記抗體 | 群組A | - | - | - | - | - | - | - |
| 群組B | - | - | - | - | - | - | - | |
| 群組C1 | - | - | - | - | + | - | - | |
| 群組C2 | - | + | - | - | ++ | ++ | - | |
| 群組C3 | - | - | - | + | - | - | - | |
| 群組C4 | - | - | - | + | - | - | - | |
| 群組D | - | - | - | - | - | + | - | |
| ++：可夾住且高感度，+：可夾住，-：不可夾住 |
[實施例1 抗體之表位分析1]
自各抗體群中分別選擇一種抗體，確認該等抗體對Nu抗原之N末端側與C末端側之哪一者產生反應。
將調整為5 μg/mL之抗His-tag抗體以50 μL/孔分注至96孔ELISA用微量盤，於4℃靜置一夜。以PBST清洗3次後，以100 μL/孔分注包含1%BSA之PBST（阻斷液），於4℃靜置一夜。去除阻斷液後，將製備成100 ng/ml之Nu抗原、SARS-CoV-2（COVID-19）NP NTD domain V2 Recombinant Protein His-tag, 44-180 aa（以下為NTD側區域抗原，ProSci，92-749）、或Recombinant nucleoprotein （C-term）antigen for COVID-19（NP-CTD）, His-tag 212-417 aa（以下為CTD側區域抗原，rekom biotech，RAG0071）以50 μL/ml進行分注，於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後，將調整為1 μg/ml之經生物素標記之各抗體以50 μL/孔進行分注，於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後，將稀釋5000倍之鏈球菌親生物素蛋白-HRP以50 μL/孔進行分注，於室溫靜置30分鐘。以PBST清洗3次後，分注OPD顯色液，於室溫靜置10分鐘。分注反應停止液，利用盤分析儀來測定吸光度（波長492 nm）。
將結果示於以下表3。
[表3]
| 群組 | 抗體 | Nu抗原 | NTD側區域抗原 | CTD側區域抗原 |
| A | S32201 | 0.680 | 4.177 | 0.012 |
| B | S32202 | 0.585 | 0.019 | 4.236 |
| C1 | S32212 | 1.949 | 0.006 | 4.281 |
| C2 | S32213 | 0.679 | 0.006 | 4.209 |
| C3 | S32217 | 1.935 | 0.003 | 4.379 |
| C4 | S32209 | 0.609 | 0.003 | 4.298 |
| D | S32205 | 0.357 | 4.177 | 0.014 |
屬於群組A及D之抗體對NTD側區域抗原產生反應，識別出Nu抗原之N末端側。屬於群組B及C之抗體對CTD側區域抗原產生反應，識別出Nu抗原之C末端側。表1及2中均可夾住之組合為群組B與C之組合、及群組C彼此之組合，因此認為於使用兩種識別Nu抗原之C末端側之抗體之情形時，可高感度地檢測Nu抗原。
[實施例2 抗體之表位分析2]
關於對Nu抗原之C末端側產生反應之抗體，為了更詳細地分析表位，而實施抗原固相ELISA。
將與Nu抗原之特定胺基酸序列對應之合成肽（10 μg/mL）（參照圖2）分注至96孔ELISA用微量盤（50 μL/孔），於室溫靜置2小時或於4℃靜置一夜。以PBST清洗3次後，分注阻斷液（1%BSA-PBST）（100 μL/孔），於室溫靜置1小時或於4℃靜置一夜。去除阻斷液後，分注經生物素標記之S32202、S32213、S32212、S32217、或S32209抗體（1 μg/mL）（50 μL/孔），於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後（400 μL/孔），分注鏈球菌親生物素蛋白-HRP（×5000）（50 μL/孔），於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後（400 μL/孔），分注OPD顯色液（2 mg/mL）（50 μL/孔），於室溫靜置10分鐘。分注反應停止液（50 μL/孔），利用盤分析儀來測定吸光度（波長492 nm）。
將代表各群之抗體與合成肽之反應性示於表4。將產生反應者以「+」表示，將未產生反應者以「-」表示。任一抗體均對核鞘蛋白（序列編號21）之第388-第414胺基酸之序列產生反應。屬於群組C1及C2之抗體對核鞘蛋白之第388-第405號胺基酸之序列（序列編號51）產生反應。屬於群組B、C3、及C4之抗體對第397-第414胺基酸之序列（序列編號52）產生反應。
[表4]
| B | C1 | C2 | C3 | C4 | |||
| 部位 | 胺基酸序列 | 序列編號 | S32202 | S32212 | S32213 | S32217 | S32209 |
| 208-225 | ARMAGNGGDAALALLLLD | 序列編號31 | - | - | - | - | - |
| 217-234 | AALALLLLDRLNQLESKM | 序列編號32 | - | - | - | - | - |
| 226-243 | RLNQLESKMSGKGQQQQG | 序列編號33 | - | - | - | - | - |
| 235-252 | SGKGQQQQGQTVTKKSAA | 序列編號34 | - | - | - | - | - |
| 244-261 | QTVTKKSAAEASKKPRQK | 序列編號35 | - | - | - | - | - |
| 253-270 | EASKKPRQKRTATKAYNV | 序列編號36 | - | - | - | - | - |
| 262-279 | RTATKAYNVTQAFGRRGP | 序列編號37 | - | - | - | - | - |
| 271-288 | TQAFGRRGPEQTQGNFGD | 序列編號38 | - | - | - | - | - |
| 280-297 | EQTQGNFGDQELIRQGTD | 序列編號39 | - | - | - | - | - |
| 289-306 | QELIRQGTDYKHWPQIAQ | 序列編號40 | - | - | - | - | - |
| 298-315 | YKHWPQIAQFAPSASAFF | 序列編號41 | - | - | - | - | - |
| 307-324 | FAPSASAFFGMSRIGMEV | 序列編號42 | - | - | - | - | - |
| 316-333 | GMSRIGMEVTPSGTWLTY | 序列編號43 | - | - | - | - | - |
| 325-342 | TPSGTWLTYTGAIKLDDK | 序列編號44 | - | - | - | - | - |
| 334-351 | TGAIKLDDKDPNFKDQVI | 序列編號45 | - | - | - | - | - |
| 343-360 | DPNFKDQVILLNKHIDAY | 序列編號46 | - | - | - | - | - |
| 352-369 | LLNKHIDAYKTFPPTEPK | 序列編號47 | - | - | - | - | - |
| 361-378 | KTFPPTEPKKDKKKKADE | 序列編號48 | - | - | - | - | - |
| 370-387 | KDKKKKADETQALPQRQK | 序列編號49 | - | - | - | - | - |
| 379-396 | TQALPQRQKKQQTVTLLP | 序列編號50 | - | - | - | - | - |
| 388-405 | KQQTVTLLPAADLDDFSK | 序列編號51 | - | + | + | - | - |
| 397-414 | AADLDDFSKQLQQSMSSA | 序列編號52 | + | - | - | + | + |
| 406-419 | QLQQSMSSADSTQA | 序列編號53 | - | - | - | - | - |
[實施例3 抗體之表位分析3]
利用PEPperPRINT公司之PEPperMAP（註冊商標）肽微陣列受託分析服務來實施S32213及S32217抗體之詳細之表位分析。將藉由線性表位作圖（利用15個胺基酸殘基之肽鏈長、與14個胺基酸殘基重疊肽進行分析）、及立體構形表位作圖（利用7、10、13個胺基酸殘基之肽鏈長、與6、9、12個胺基酸殘基重疊肽各者進行分析）所獲得之分析結果之一部分摘錄示於表5及6。顯示出S32213抗體識別SARS-CoV-2核鞘蛋白之第394-398號之胺基酸序列即LLPAA（序列編號25），S32217抗體識別相同蛋白質之第400-408號之胺基酸序列即LDDFSKQLQ（序列編號29）中所存在之表位。
[表5]
| 部位 | 胺基酸序列 | 序列編號 | 與S32213抗體之反應性 |
| 385-391 | RQKKQQT | 序列編號54 | - |
| 386-392 | QKKQQTV | 序列編號55 | - |
| 387-393 | KKQQTVT | 序列編號56 | - |
| 388-394 | KQQTVTL | 序列編號57 | - |
| 389-395 | QQTVTLL | 序列編號58 | - |
| 390-396 | QTVTLLP | 序列編號59 | - |
| 391-397 | TVTLLPA | 序列編號60 | + |
| 392-398 | VT LLPAA | 序列編號61 | +++ |
| 393-399 | T LLPAAD | 序列編號62 | +++ |
| 394-400 | LLPAADL | 序列編號63 | +++ |
| 395-401 | LPAADLD | 序列編號64 | + |
| 396-402 | PAADLDD | 序列編號65 | - |
| 397-403 | AADLDDF | 序列編號66 | - |
| 398-404 | ADLDDFS | 序列編號67 | - |
| 399-405 | DLDDFSK | 序列編號68 | - |
| 400-406 | LDDFSKQ | 序列編號69 | - |
| +++：有反應且高感度，+：有反應，-：無反應 |
[表6]
| 部位 | 胺基酸序列 | 序列編號 | 與S32217抗體之反應性 |
| 389-403 | QQTVTLLPAADLDDF | 序列編號70 | - |
| 390-404 | QTVTLLPAADLDDFS | 序列編號71 | - |
| 391-405 | TVTLLPAADLDDFSK | 序列編號72 | - |
| 392-406 | VTLLPAADLDDFSKQ | 序列編號73 | - |
| 393-407 | TLLPAADLDDFSKQL | 序列編號74 | + |
| 394-408 | LLPAAD LDDFSKQLQ | 序列編號75 | ++ |
| 395-409 | LPAAD LDDFSKQLQQ | 序列編號76 | ++ |
| 396-410 | PAAD LDDFSKQLQQS | 序列編號77 | ++ |
| 397-411 | AAD LDDFSKQLQQSM | 序列編號78 | ++ |
| 398-412 | AD LDDFSKQLQQSMS | 序列編號79 | ++ |
| 399-413 | D LDDFSKQLQQSMSS | 序列編號80 | ++ |
| 400-414 | LDDFSKQLQQSMSSA | 序列編號81 | +++ |
| 401-415 | DDFSKQLQQSMSSAD | 序列編號82 | + |
| 402-416 | DFSKQLQQSMSSADS | 序列編號83 | - |
| 403-417 | FSKQLQQSMSSADST | 序列編號84 | - |
| 404-418 | SKQLQQSMSSADSTQ | 序列編號85 | - |
| +++：有反應且感度尤其高，++：有反應且高感度，+：有反應，-：無反應 |
[實施例4 針對胰蛋白酶消化Nu抗原之抗體之反應性]
用PBS來稀釋源自豬胰臟之胰蛋白酶，製備胰蛋白酶溶液（0或2000 ng/mL）。將用PBS來稀釋各胰蛋白酶溶液而製備之Nu抗原（2000 ng/mL）以1：1之比率進行混合，於37℃使其反應10分鐘。反應後，以溶液之百分之一之量添加蛋白酶抑制劑使酵素反應停止，將其作為胰蛋白酶消化Nu抗原。
將五種試驗用抗體（5 μg/mL）分注至96孔ELISA用微量盤（50 μL/孔），於室溫靜置2小時。以PBST清洗3次後，分注阻斷液（1%BSA-PBST）（100 μL/孔），於室溫靜置1小時。去除阻斷液後，分注胰蛋白酶消化Nu抗原（1000 ng/ml）（50 μL/ml），於室溫靜置30分鐘。以PBST清洗3次後（400 μL/孔），分注合成肽（2 μg/mL，25 μL/孔）、經生物素標記之五種試驗用抗體（1 μg/ml）（50 μL/孔），於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後（400 μL/孔），分注鏈球菌親生物素蛋白-HRP（×5000）（50 μL/孔），於室溫靜置1小時。以PBST清洗3次後（400 μL/孔），分注OPD顯色液（2 mg/mL）（50 μL/孔），於室溫靜置10分鐘。分注反應停止液（50 μL/孔），利用盤分析儀來測定吸光度（波長492 nm）。將結果示於表7。
[表7]
| 液相抗體 | S32213（C2） | S32217（C3） | S32212（C1） | S32209（C4） | S32231（B） |
| 固相抗體 | S32217（C3） | S32213（C2） | S32217（C3） | S32213（C2） | S32217（C3） |
| 無胰蛋白酶消化 | 4.245 | 4.369 | 4.634 | 4.229 | 4.409 |
| 有胰蛋白酶消化 | 4.595 | 4.284 | 4.456 | 4.511 | 0.122 |
關於屬於群組C之抗體彼此之組合，即便於進行了胰蛋白酶消化之情形時，亦能夠檢測出Nu抗原。然而，關於群組B與群組C3之組合，抗原與抗體之反應因胰蛋白酶消化而大幅度降低。認為屬於群組B之抗體識別QLQQSMSSA（序列編號27）中之任意胺基酸序列作為表位。
[實施例5 藉由免疫層析術進行之SARS-CoV-2之檢測]
與分析例2同樣地製作免疫層析術用測試條。標記抗體使用S32213抗體，固相抗體使用S32217抗體。
試驗方法 將Rapid Testa FLU・NEXT用檢體稀釋液（積水醫療）以500 μL為單位分注至稀釋液管中。向SARS-CoV-2 PCR positive swab（Trina公司）添加Universal Transport Medium（BD公司）而製成試樣。向試樣中插入檢體採集用棉棒，採集檢體後，利用稀釋液管內之稀釋液提取檢體。向稀釋液管安裝檢體過濾過濾器，進行全量過濾。將上述試樣以120 μL為單位滴加至試驗裝置，10分鐘後藉由目視來判定測試線之有無。
使用QIAmp Viral RNA mini Kit（QIAGEN公司）自相同試樣提取RNA。基於國立感染症研究所之『病原體檢測手冊2019-nCoV Ver.2.9.1』實施RT-PCR。將結果示於表8。再者，RT-PCR之結果中，29個檢體為陽性，26個檢體為陰性。採集檢體時購入了陽性檢體用於試驗，但認為受到運輸、凍結融解、及檢體稀釋之影響而導致一部分檢體發生陰性化。
[表8]
| 實施例免疫層析 | 合計 | |||
| 陽性 | 陰性 | |||
| RT-PCR | 陽性 | 29 | 0 | 29 |
| 陰性 | 2 | 24 | 26 | |
| 合計 | 31 | 24 | 55 |
免疫層析術中之與RT-PCR之陽性一致率為100%（29/29×100）。免疫層析術中之與RT-PCR之陰性一致率為92.3%（24/26×100）。針對所使用之檢體，確認每1個試驗之SARS-CoV-2之複製數。陽性檢體29例均包含每1個試驗為1600個複製以上之SARS-CoV-2。
此處，市售之SARS-CoV-2抗原檢測用試劑之隨附文件中記載有測定1600個複製/試驗之檢體時之陽性一致率。
Espline（註冊商標）SARS-CoV-2（富士瑞必歐公司）之測定時間為30分鐘，陽性一致率為92%（12/13×100）。
QuickNavi（註冊商標）-COVID19 Ag（DENKA公司）之測定時間為15分鐘，陽性一致率為96.3%（26/27×100）。
因此，與市售之SARS-CoV-2抗原檢測用試劑相比，本實施例之免疫層析術以更短之測定時間顯示同等以上之感度。因此，可謂藉由使用本實施例之免疫層析術，可迅速且高感度地檢測SARS-CoV-2。
[實施例6 免疫層析術之特異性評價]
使用與實施例5相同之試驗裝置。將Rapid Testa FLU・NEXT用檢體稀釋液以500 μL為單位分注至稀釋液管中，針對1根稀釋液管，自同一健康人之2根鼻咽部擦拭棉棒中提取檢體。向稀釋液管安裝檢體過濾過濾器，進行全量過濾。將上述試樣以120 μL為單位滴加至與實施例5相同之試驗裝置，10分鐘後及30分鐘後藉由目視及裝置進行判定。又，藉由與實施例5相同之方法亦實施RT-PCR。將供體各不相同之30個例之試樣之判定結果示於表9。
[表9]
| 檢體 | 判定 | ||
| 實施例免疫層析 | RT-PCR | ||
| 測定時間10分鐘 | 測定時間30分鐘 | ||
| 1 | - | - | - |
| 2 | - | - | - |
| 3 | - | - | - |
| 4 | - | - | - |
| 5 | - | - | - |
| 6 | - | - | - |
| 7 | - | - | - |
| 8 | - | - | - |
| 9 | - | - | - |
| 10 | - | - | - |
| 11 | - | - | - |
| 12 | - | - | - |
| 13 | - | - | - |
| 14 | - | - | - |
| 15 | - | - | - |
| 16 | - | - | - |
| 17 | - | - | - |
| 18 | - | - | - |
| 19 | - | - | - |
| 20 | - | - | - |
| 21 | - | - | - |
| 22 | - | - | - |
| 23 | - | - | - |
| 24 | - | - | - |
| 25 | - | - | - |
| 26 | - | - | - |
| 27 | - | - | - |
| 28 | - | - | - |
| 29 | - | - | - |
| 30 | - | - | - |
檢體1～30均於RT-PCR中為陰性。於實施例之免疫層析術之10分鐘後之判定中，均判定為陰性。進而，即便於超過實施例之免疫層析術之既定測定時間的30分鐘後之判定中，亦判定所有檢體為陰性。因此，本實施例之免疫層析術表現出良好之特異性。
[實施例7 單株抗體之胺基酸序列之分析]
利用公益財團法人Kazusa DNA研究所之抗體可變區分析，對S32213抗體、S32217抗體、及S32223抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別進行分析。其結果為，重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列分別如以下表10所示。
[表10]
| 抗體名 | 重鏈或輕鏈 | CDR | 胺基酸序列 | 序列編號 |
| S32213 | 重鏈 | CDR1 | GFSLSTSGMG | 序列編號3 |
| CDR2 | IYWDDDK | 序列編號4 | ||
| CDR3 | ARRDYGYNFDY | 序列編號5 | ||
| 輕鏈 | CDR1 | SSVSSTY | 序列編號6 | |
| CDR2 | STS | 序列編號7 | ||
| CDR3 | HQWSSYPPT | 序列編號8 | ||
| S32217 | 重鏈 | CDR1 | GFTFSDYY | 序列編號9 |
| CDR2 | ITDGDNYT | 序列編號10 | ||
| CDR3 | ARDGNYYASSPFTY | 序列編號11 | ||
| 輕鏈 | CDR1 | TGAVTTSNY | 序列編號12 | |
| CDR2 | GTN | 序列編號13 | ||
| CDR3 | ALWYSNHWV | 序列編號14 | ||
| S32223 | 重鏈 | CDR1 | GFTFSDYY | 序列編號15 |
| CDR2 | ISDGYSYT | 序列編號16 | ||
| CDR3 | ARDQDYFGSSLAY | 序列編號17 | ||
| 輕鏈 | CDR1 | TGAVTTSNY | 序列編號18 | |
| CDR2 | GTN | 序列編號19 | ||
| CDR3 | ALWYSNRWV | 序列編號20 |
S32223抗體係於分析例1之藉由三明治ELISA進行之抗體分類中，屬於與S32217抗體相同之群組C3之抗體。S32223抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之CDR1～CDR3之胺基酸序列分別與S32217抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之CDR1～CDR3之胺基酸序列具有較高之同一性。因此，認為S32223抗體相對於SARS-CoV-2抗原具有與S32217抗體相同之反應性。
[實施例8 由絲胺酸蛋白酶分解產生之影響]
＜實驗1＞胰蛋白酶處理時間與測定感度之關係
向檢體輸送培養基中，以256 ng/mL之濃度添加不活化抗原（Vero細胞 SARS-CoV-2感染細胞溶解液 MOI＝3；國立感染症研究所）而製備試樣。將溶解於PBS中之胰蛋白酶以最終濃度成為1 μg/mL之方式添加至試樣中，以37℃進行加溫。反應2、5、15、30分鐘後，依據隨附文件添加蛋白酶抑制劑混合物套裝（cocktail set）I, 無動物源成分（通用）（×100）（富士膠片和光純藥股份有限公司）使反應停止，於Rapid Testa FLU・NEXT用檢體稀釋液（積水醫療）、Espline（註冊商標）SARS-CoV-2檢體處理液（富士瑞必歐公司）、或QuickNavi（註冊商標）檢體懸浮液（COVID19 Ag用）（DENKA公司）中分別添加50 μL之反應液而獲得測定用試樣。
利用實施例5中所使用之免疫層析術用測試條、既有之SARS-CoV-2測定試劑即Espline（註冊商標）SARS-CoV-2（富士瑞必歐公司）及QuickNavi（註冊商標）-COVID19 Ag（DENKA公司）對測定用試樣進行測定。
將結果示於圖3。
如圖3所示，既有之測定試劑之測定感度根據胰蛋白酶處理時間變長而降低，經30分鐘胰蛋白酶處理之試樣之測定感度相對於胰蛋白酶處理前之試樣之測定感度為20%以下，相對於此，本發明之測定試劑（實施例5）之測定感度隨著胰蛋白酶處理時間變長而增加。
＜實驗2＞鼻腔拭液處理時間與測定感度之關係
將利用棉棒自3位健康人採集之鼻腔拭液，以每3根棉棒500 μL之PBS之方式進行懸浮而混合。將重組抗原（SARS-CoV-2 （COVID-19） Nucleocapsid protein，His Tag；ACROBiosystems公司製造）以1 μg/mL之濃度添加至鼻腔拭液懸浮液混合物中而製備試樣。以37℃對試樣進行加溫，反應30、60分鐘後，依據隨附文件添加蛋白酶抑制劑混合物套裝I, 無動物源成分（通用）（×100）（富士膠片和光純藥股份有限公司）使反應停止，向Rapid Testa FLU・NEXT用檢體稀釋液（積水醫療）或QuickNavi（註冊商標）檢體懸浮液（COVID19 Ag用）（DENKA公司）中以10 μL為單位添加反應液而獲得測定用試樣。
利用實施例5中所使用之免疫層析術用測試條及既有之SARS-CoV-2測定試劑即QuickNavi（註冊商標）-COVID19 Ag（DENKA公司）對測定用試樣進行測定。
將結果示於圖4。
如圖4所示，既有之SARS-CoV-2測定試劑之測定感度根據鼻腔拭液處理時間而降低，另一方面，本發明之測定試劑（實施例5）之測定感度未發生變動。
＜結果之說明＞
實驗1之結果表明，本發明之免疫測定方法可檢測經絲胺酸蛋白酶分解之SARS-CoV-2。
又，實驗2之結果表明，本發明之免疫測定方法可檢測經氣管上皮等器官中所表現出之絲胺酸蛋白酶進行分解後之核鞘蛋白。
因此，實驗1及2之結果表明，本發明之免疫測定方法藉由使用「會與經胰蛋白酶等絲胺酸蛋白酶分解之SARS-CoV-2所生成之肽片段結合」之兩種單株抗體，可實施SARS-CoV-2之高感度之免疫測定。
[序列一覽]
[表11]
[表12]
[表13]
[表14]
[表15]
[產業上之可利用性]
| SEQ ID NO： | 胺基酸序列（N末端→C末端） |
| 1 | KQQTVTLLPAADLDDFSK |
| 2 | AADLDDFSKQLQ |
| 3 | GFSLSTSGMG |
| 4 | IYWDDDK |
| 5 | ARRDYGYNFDY |
| 6 | SSVSSTY |
| 7 | STS |
| 8 | HQWSSYPPT |
| 9 | GFTFSDYY |
| 10 | ITDGDNYT |
| 11 | ARDGNYYASSPFTY |
| 12 | TGAVTTSNY |
| 13 | GTN |
| 14 | ALWYSNHWV |
| 15 | GFTFSDYY |
| 16 | ISDGYSYT |
| 17 | ARDQDYFGSSLAY |
| 18 | TGAVTTSNY |
| 19 | GTN |
| 20 | ALWYSNRWV |
| SEQ ID NO： | 胺基酸序列（N末端→C末端） |
| 21 | MSDNGPQNQR NAPRITFGGP SDSTGSNQNG ERSGARSKQR RPQGLPNNTA SWFTALTQHG KEDLKFPRGQ GVPINTNSSP DDQIGYYRRA TRRIRGGDGK MKDLSPRWYF YYLGTGPEAG LPYGANKDGI IWVATEGALN TPKDHIGTRN PANNAAIVLQ LPQGTTLPKG FYAEGSRGGS QASSRSSSRS RNSSRNSTPG SSRGTSPARM AGNGGDAALA LLLLDRLNQL ESKMSGKGQQ QQGQTVTKKS AAEASKKPRQ KRTATKAYNV TQAFGRRGPE QTQGNFGDQE LIRQGTDYKH WPQIAQFAPS ASAFFGMSRI GMEVTPSGTW LTYTGAIKLD DKDPNFKDQV ILLNKHIDAY KTFPPTEPKK DKKKKADETQ ALPQRQKKQQ TVTLLPAADL DDFSKQLQQS MSSADSTQA |
| 22 | MSDNGPQNQR NAPRITFGGP SDSTGSNQNG ERSGARSKQR RPQGLPNNTA SWFTALTQHG KEDLKFPRGQ GVPINTNSSP DDQIGYYRRA TRRIRGGDGK MKDLSPRWYF YYLGTGPEAG LPYGANKDGI IWVATEGALN TPKDHIGTRN PANNAAIVLQ LPQGTTLPKG FYAE |
| 23 | GSRGGSQASS RSSSRSRNSS RNSTPGSSRG TSPARMAGNG GDAALALLLL DRLNQLESKM SGKGQQQQGQ TVT |
| 24 | KKSAAEASKK PRQKRTATKA YNVTQAFGRR GPEQTQGNFG DQELIRQGTD YKHWPQIAQF APSASAFFGM SRIGMEVTPS GTWLTYTGAI KLDDKDPNFK DQVILLNKHI DAYKTFPPTE PKKDKKKKAD ETQALPQRQK KQQTVTLLPA ADLDDFSKQL QQSMSSADST QA |
| SEQ ID NO： | 胺基酸序列（N末端→C末端） |
| 25 | LLPAA |
| 26 | LDDFSKQLQ |
| 27 | QLQQSMSSA |
| 28 | KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQ |
| 29 | LDDFSKQLQ |
| 30 | AADLDDFSKQLQQSMSSA |
| 31 | ARMAGNGGDAALALLLLD |
| 32 | TAALALLLLDRLNQLESKM |
| 33 | RLNQLESKMSGKGQQQQG |
| 34 | SGKGQQQQGQTVTKKSAA |
| 35 | QTVTKKSAAEASKKPRQK |
| 36 | EASKKPRQKRTATKAYNV |
| 37 | RTATKAYNVTQAFGRRGP |
| 38 | TQAFGRRGPEQTQGNFGD |
| 39 | EQTQGNFGDQELIRQGTD |
| 40 | QELIRQGTDYKHWPQIAQ |
| 41 | YKHWPQIAQFAPSASAFF |
| 42 | FAPSASAFFGMSRIGMEV |
| 43 | GMSRIGMEVTPSGTWLTY |
| 44 | TPSGTWLTYTGAIKLDDK |
| 45 | TGAIKLDDKDPNFKDQVI |
| 46 | DPNFKDQVILLNKHIDAY |
| 47 | LLNKHIDAYKITFPPTEPK |
| 48 | KTFPPTEPKKDKKKKADE |
| 49 | KDKKKKADETQALPQRQK |
| 50 | TQALPQRQKKQQTVTLLP |
| 51 | KQQTVTLLPAADLDDFSK |
| 52 | AADLDDFSKQLQQSMSSA |
| 53 | QLQQSMSSADSTQA |
| SEQ ID NO： | 胺基酸序列（N末端→C末端） |
| 54 | RQKKQQT |
| 55 | QKKQQTV |
| 56 | KKQQTVT |
| 57 | KQQTVTL |
| 58 | QQTVTLL |
| 59 | QTVTLLP |
| 60 | TVTLLPA |
| 61 | VTLLPAA |
| 62 | TLLPAAD |
| 63 | LLPAADL |
| 64 | LPAADLD |
| 65 | PAADLDD |
| 66 | AADIDDF |
| 67 | ADLDDFS |
| 68 | DLDDESK |
| 69 | LDDFSKQ |
| SEQ ID NO： | 胺基酸序列（N末端→C末端） |
| 70 | QQTVTLLPAADLDDF |
| 71 | QTVTLLPAADLDDFS |
| 72 | TVTLLPAADLDDFSK |
| 73 | VTLLPAADLDDESKQ |
| 74 | TLLPAADLDDFSKQL |
| 75 | LLPAADLDDESKQLQ |
| 76 | LPAADLDDFSKQLQQ |
| 77 | PAADLDDFSKQLQQS |
| 78 | AADLDDFSKQLQQSM |
| 79 | ADLDDFSKQLQQSMS |
| 80 | DLDDFSKQLQQSMSS |
| 81 | LDDFSKQLQQSMSSA |
| 82 | DDFSKQLQQSMSSAD |
| 83 | DFSKQLQQSMSSADS |
| 84 | FSKQLQQSMSSADST |
| 85 | SKQLQQSMSSADSTQ |
根據本發明，可提供一種能夠實現高感度且迅速之分析之SARS-CoV-2免疫測定套組及SARS-CoV-2之免疫測定方法、以及能夠用於其等之單株抗體或其之抗體片段。
無
[圖1]係表示核鞘蛋白之胺基酸序列之圖。
[圖2]係表示抗體之表位分析中所使用之合成肽之胺基酸序列與核鞘蛋白上之胺基酸序列之對應關係的圖。
[圖3]係表示SARS-CoV-2抗原之胰蛋白酶處理時間與測定感度之關係的圖。
[圖4]係表示SARS-CoV-2核鞘蛋白之鼻腔拭液處理時間與測定感度之關係的圖。
Claims (20)
- 一種免疫測定方法，其係SARS-CoV-2之免疫測定方法，包括使生物樣本與會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白結合之單株抗體或其之抗體片段接觸的步驟， 上述單株抗體或其之抗體片段會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合。
- 如請求項1之免疫測定方法，其中，上述單株抗體或其之抗體片段識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位、或AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位。
- 如請求項1或2之免疫測定方法，其中，上述生物樣本經絲胺酸蛋白酶處理。
- 如請求項1或2之免疫測定方法，其中，上述生物樣本為呼吸器官分泌液。
- 如請求項1或2之免疫測定方法，其使用兩種會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白之肽片段結合之單株抗體或其之抗體片段， 上述兩種單株抗體或其之抗體片段分別為第一單株抗體或其之抗體片段及第二單株抗體或其之抗體片段，且第一單株抗體或其之抗體片段已與標記物質間接或直接地結合，第二單株抗體或其之抗體片段已與固相間接或直接地結合， 第一單株抗體或其之抗體片段與第二單株抗體或其之抗體片段所識別之表位不同。
- 如請求項5之免疫測定方法，其中，上述接觸步驟進而包括：（1）使生物樣本與已與標記物質結合之第一單株抗體或其之抗體片段接觸而形成第一複合體之步驟；（2）使上述第一複合體與第二單株抗體或其之抗體片段接觸而形成第二複合體之步驟；及（3）測定源自標記物質之訊號之步驟。
- 如請求項5之免疫測定方法，其中，上述第一單株抗體或其之抗體片段係識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段，上述第二單株抗體或其之抗體片段係識別AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段。
- 如請求項1或2之免疫測定方法，其為免疫層析術、或ELISA。
- 如請求項1或2之免疫測定方法，其中，上述單株抗體或其之抗體片段為選自由以下（1）～（4）所組成之群中之一種或兩種： （1）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號4之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號5之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號6之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號7之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號8之胺基酸序列之CDR3； （2）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號9之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號10之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號11之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號12之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號13之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號14之胺基酸序列之CDR3； （3）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號15之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號16之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號17之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號18之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號19之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號20之胺基酸序列之CDR3； （4）包含與上述（1）～（3）中之任一抗體或其之抗體片段之重鏈可變區及輕鏈可變區分別具有80%以上之胺基酸序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體或其之抗體片段。
- 一種免疫測定套組，其係生物樣本中之SARS-CoV-2之免疫測定套組，包含會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白結合之單株抗體或其之抗體片段，上述單株抗體或其之抗體片段會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合。
- 如請求項10之免疫測定套組，其中，上述單株抗體或其之抗體片段識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位、或AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位。
- 如請求項10或11之免疫測定套組，其中，上述生物樣本經絲胺酸蛋白酶處理。
- 如請求項10或11之免疫測定套組，其中，上述生物樣本為呼吸器官分泌液。
- 如請求項10或11之免疫測定套組，其包含兩種會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白之肽片段結合之單株抗體或其之抗體片段， 上述兩種單株抗體或其之抗體片段分別為第一單株抗體或其之抗體片段及第二單株抗體或其之抗體片段，且第一單株抗體或其之抗體片段已與標記物質間接或直接地結合，第二單株抗體或其之抗體片段已與固相間接或直接地結合， 第一單株抗體或其之抗體片段與第二單株抗體或其之抗體片段所識別之表位不同。
- 如請求項14之免疫測定套組，其中，上述第一單株抗體或其之抗體片段係識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段，上述第二單株抗體或其之抗體片段係識別AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位的單株抗體或其之抗體片段。
- 如請求項10或11之免疫測定套組，其為免疫層析術、或ELISA用之套組。
- 如請求項10或11之免疫測定套組，其中，上述單株抗體或其之抗體片段為選自由以下（1）～（4）所組成之群中之一種或兩種： （1）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號4之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號5之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號6之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號7之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號8之胺基酸序列之CDR3； （2）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號9之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號10之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號11之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號12之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號13之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號14之胺基酸序列之CDR3； （3）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號15之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號16之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號17之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號18之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號19之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號20之胺基酸序列之CDR3； （4）包含與上述（1）～（3）中之任一抗體或其之抗體片段之重鏈可變區及輕鏈可變區分別具有80%以上之胺基酸序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體或其之抗體片段。
- 一種單株抗體或其之抗體片段，其係會與SARS-CoV-2之核鞘蛋白結合之單株抗體或其之抗體片段，且上述單株抗體或其之抗體片段會與經絲胺酸蛋白酶處理之SARS-CoV-2結合。
- 如請求項18之單株抗體或其之抗體片段，其識別KQQTVTLLPAADLDDFSK（序列編號1）所表示之胺基酸序列中之表位、或AADLDDFSKQLQ（序列編號2）所表示之胺基酸序列中之表位。
- 如請求項18或19之單株抗體或其之抗體片段，其選自由以下（1）～（4）所組成之群中： （1）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號3之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號4之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號5之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號6之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號7之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號8之胺基酸序列之CDR3； （2）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號9之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號10之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號11之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號12之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號13之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號14之胺基酸序列之CDR3； （3）包含下述重鏈可變區及下述輕鏈可變區之抗體或其之抗體片段，上述重鏈可變區包含具有序列編號15之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號16之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號17之胺基酸序列之CDR3，上述輕鏈可變區包含具有序列編號18之胺基酸序列之CDR1、具有序列編號19之胺基酸序列之CDR2、及具有序列編號20之胺基酸序列之CDR3； （4）包含與上述（1）～（3）中之任一抗體或其之抗體片段之重鏈可變區及輕鏈可變區分別具有80%以上之胺基酸序列同一性之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗體或其之抗體片段。
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