JP6484562B2 - 可溶性gpc3タンパク質の測定方法 - Google Patents
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Description
GPC3は細胞表面に発現後、その特定の部位においてコンバルターゼ、フォスフォリパーゼDまたはNotumによってプロセッシングを受けることが知られている(非特許文献4)。こうした現象によって、患者の血漿中に存在する、GPC3を測定することによって、HCC患者を選択する方法が開示されている(特許文献1)。また、血漿中に分泌された分泌型GPC3のエピトープに結合する抗体を含む肝癌の診断薬または診断方法が開発されている(特許文献2,3)。また、患者から単離された組織標本等に存在する、プロセッシングを受けた後に細胞表面になお存在する係留型GPC3のエピトープに結合する抗体を含む肝癌の診断薬または診断方法が開発されている(特許文献4)。肝癌の他には、血液中のGPC3レベルを測定することで、前立腺がん患者を選択する方法が開示されている(特許文献5)。
本発明が解決しようとする課題は、健常者の体液中に含まれる可溶性GPC3の濃度を定量的に測定可能な可溶性GPC3の高感度測定方法を提供することである。
すなわち、本発明は以下の[1]〜[12]に関する。
[1] 配列番号70で示されるアミノ酸配列からなるGPC3タンパク質の第128番目のアミノ酸から第357番目のアミノ酸配列中に含まれる異なるエピトープに結合する2つの異なる抗体を用いることを特徴とする、被検試料中の可溶性GPC3タンパク質の測定方法;
[2] 異なるエピトープの一方が、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目、および344番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープである、上記[1]に記載の測定方法;
[3] 異なるエピトープの一方が、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープである、上記[1]又は[2]に記載の測定方法。
[4] 異なるエピトープが下記の(A)または(B)の組合せである、上記[1]に記載の測定方法;
(A)異なるエピトープの一方が、GPC3タンパク質の第341番目、第343番目、346番目、347番目、348番目、349番目および350番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープであり、もう一方が、GPC3タンパク質の第297番目、300番目、304番目、306番目、311番目、312番目、313番目、314番目および315番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープである
(B)異なるエピトープの一方が、GPC3タンパク質の第128番目、129番目、131番目、132番目、133番目、134番目、135番目、171番目、208番目、209番目、210番目、211番目、212番目、214番目、215番目、218番目、322番目、325番目、326番目、328番目、329番目、330番目、332番目、333番目、335番目、336番目および338番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープであり、もう一方が、GPC3タンパク質の220番目、228番目、231番目、232番目、235番目、291番目、294番目および295番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープである
[5] 異なるエピトープが下記の(A)または(B)の組合せである、上記[1]に記載の測定方法;
(A)異なるエピトープの一方が、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目、および344番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第341番目、343番目、346番目、347番目、348番目、349番目および350番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープであり、もう一方が、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第297番目、300番目、304番目、306番目、311番目、312番目、313番目、314番目および315番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープである
(B)異なるエピトープの一方が、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目および344番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第128番目、129番目、131番目、132番目、133番目、134番目、135番目、171番目、208番目、209番目、210番目、211番目、212番目、214番目、215番目、218番目、322番目、325番目、326番目、328番目、329番目、330番目、332番目、333番目、335番目、336番目および338番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープであり、もう一方が、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、220番目、228番目、231番目、232番目、235番目、291番目、294番目および295番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープである;
[6] 異なるエピトープが、
配列番号38と相同性が80%以上の配列で示される重鎖可変領域および配列番号39と相同性が80%以上の配列で示される軽鎖可変領域を有する抗体が結合するエピトープと、配列番号40と相同性が80%以上の配列で示される重鎖可変領域および配列番号41と相同性が80%以上の配列で示される軽鎖可変領域を有する抗体が結合するエピトープ、または配列番号44と相同性が80%以上の配列で示される重鎖可変領域および配列番号45と相同性が80%以上の配列で示される軽鎖可変領域を有する抗体が結合するエピトープと、配列番号42と相同性が80%以上の配列で示される重鎖可変領域および配列番号43と相同性が80%以上の配列で示される軽鎖可変領域を有する抗体が結合するエピトープである、上記[1]に記載の測定方法;
[7] 2つの異なる抗体が、
配列番号38で示される重鎖可変領域に含まれるCDR領域および配列番号39で示される軽鎖可変領域に含まれるCDR領域と同一のCDR領域を有する抗体と、配列番号40で示される重鎖可変領域に含まれるCDR領域および配列番号41で示される軽鎖可変領域に含まれるCDR領域と同一のCDR領域を有する抗体の組合せ、または、
配列番号44で示される重鎖可変領域に含まれるCDR領域および配列番号45で示される軽鎖可変領域に含まれるCDR領域と同一のCDR領域を有する抗体と、配列番号42で示される重鎖可変領域に含まれるCDR領域および配列番号43で示される軽鎖可変領域に含まれるCDR領域と同一のCDR領域を有する抗体の組合せである、上記[1]に記載の測定方法;
[8] CDR領域がKabatナンバリングに基づくCDR1、2、および3領域である、上記[7]に記載の測定方法;
[9] 2つの異なる抗体が、
重鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号46、47および48で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号49、50および51で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体と、重鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号52、53および54で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号55、56および57で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体の組合せ、または、
重鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号58、59および60で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号61、62および63で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体と、重鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号64、65および66で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号67、68および69で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体の組合せである、上記[1]に記載の測定方法;
[10] 2つの異なる抗体が、
配列番号38で示される重鎖可変領域および配列番号39で示される軽鎖可変領域を有する抗体と、配列番号40で示される重鎖可変領域および配列番号41で示される軽鎖可変領域を有する抗体の組合せ、または、
配列番号44で示される重鎖可変領域および配列番号45で示される軽鎖可変領域を有する抗体と、配列番号42で示される重鎖可変領域および配列番号43で示される軽鎖可変領域を有する抗体の組合せである、上記[1]に記載の測定方法;
[11] 2つの異なる抗体のいずれか一方が磁性粒子と結合している、上記[1]〜[10]のいずれかに記載の測定方法;
[12] 被験試料が、ヒトから単離された組織試料、全血試料、血漿試料、または血清試料である、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の測定方法。
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して用いられる化学的用語および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。
「一つの(a)」および「一つの(an)」という不定冠詞は、本発明において、一つのまたは二つ以上の(すなわち少なくとも一つの)その不定冠詞の文法上の対象をいう。例えば「一つの(a)要素」は、一つの要素または二つ以上の要素を意味する。
本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法(Kunkelら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン(アンバーコドン)の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム(Clover Direct(Protein Express))等も好適に用いられる。
(a) 43位、(b) 52位、(c) 105位、(d) 43位および52位、(e) 43位および105位、(f) 52位および105位、(g) 43位および52位および105位。
本発明において、抗体のCDRに割り当てられるアミノ酸位置は、公知の方法に従って規定することができるが、例えばKabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)にしたがって規定することができる。
本発明において「被験試料」という用語は、対象から単離される組織または流体の試料をいう。そのような試料の非限定な一態様として、例えば血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、気道、腸管、および尿生殖路の外部切片、涙、唾液、痰、乳、尿、全血またはあらゆる血液画分、血液誘導体、血球、腫瘍、神経組織、器官またはあらゆるタイプの組織、洗浄により得られるあらゆる試料(例えば気管支系のもの)、ならびにインビトロでの細胞培養物の構成成分の試料が含まれる。
本発明において「可溶性GPC3」とは、GPC3を発現する細胞に係留されていない可溶性のGPC3をいい、生体内または試験管内の特定の条件下でGPC3を発現する細胞に係留されたGPC3から容易に解離し得る分泌型GPC3断片を含む。「可溶性GPC3」の非限定な一態様として、配列番号70で規定されるポリペプチドからなるGPC3の358位よりアミノ末端側のポリペプチド、配列番号:70で規定されるポリペプチドからなるGPC3の374位よりアミノ末端側のポリペプチド、カルボキシ末端に存在するGPIアンカーが分解され遊離したGPC3ポリペプチドおよびそれらの断片等が例示され得る(特許文献2)。可溶性GPC3の構造を特定するために当業者は公知の手法を適宜選択することが可能である。非限定の態様として上記特許文献2に記載された方法等によって患者またはモデル動物の血清または血漿中に存在する可溶性GPC3を直接検出してその構造を解析する方法のほか、たとえば試験管内で培養された細胞に発現するGPC3にコンバルターゼ、フォスフォリパーゼDまたはNotum等の可溶性GPC3を解離する酵素が作用することによって生じた可溶性GPC3を検出してその構造を解析する方法等も適宜使用され得る(J.Cell.Biol. (2003) 163 (3), 625-635等)。
本発明において、可溶性GPC3濃度は第128番目のアミノ酸から第357番目、好ましくは第219番目のアミノ酸から第357番目のアミノ酸配列中に含まれる異なるエピトープに結合する2つの異なる抗体を用いて、免疫学的方法により測定する。可溶性GPC3を適切な酵素でさらに消化した可溶性GPC3断片を検出する方法も適宜採用され得る。
本発明で使用される「2つの異なる抗体」は、GPC3の第128番目のアミノ酸から第357番目のアミノ酸領域中に含まれる「異なるエピトープ」に結合する。「異なるエピトープ」は、「2つの異なる抗体」が可溶性GPC3との結合を相互に阻害し合わない関係にあれば特に限定されない。具体的には、例えば、実施例に記載のGT30抗体が結合するGPC3上のエピトープとGT607抗体が結合するGPC3上のエピトープの組合せ、或いは、GT114抗体が結合するGPC3上のエピトープとGT165抗体が結合するGPC3上のエピトープの組合せを挙げることができる。そのような異なるエピトープの組合せとしては、例えば、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目および344番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT30とGT165)と、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目(GT607とGT114)から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープの組合せが挙げられる。或いは、GPC3タンパク質の第343番目、346番目、347番目、348番目、349番目および350番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT30)と、GPC3タンパク質の第297番目、300番目、304番目、306番目、311番目、312番目、313番目、314番目および315番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT607)の組合せ、または、GPC3タンパク質の第128番目、129番目、131番目、132番目、133番目、134番目、135番目、171番目、208番目、209番目、210番目、211番目、212番目、214番目、215番目、218番目、322番目、325番目、326番目、328番目、329番目、330番目、332番目、333番目、335番目、336番目および338番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT165)と、GPC3タンパク質の220番目、228番目、231番目、232番目、235番目、291番目、294番目および295番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT114)の組合せが挙げられる。更に、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目および344番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第341番目、343番目、346番目、347番目、348番目、349番目および350番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT30)と、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第297番目、300番目、304番目、306番目、311番目、312番目、313番目、314番目および315番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT607)の組合せ、または、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目および344番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第128番目、129番目、131番目、132番目、133番目、134番目、135番目、171番目、208番目、209番目、210番目、211番目、212番目、214番目、215番目、218番目、322番目、325番目、326番目、328番目、329番目、330番目、332番目、333番目、335番目、336番目および338番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT165)と、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、220番目、228番目、231番目、232番目、235番目、291番目、294番目および295番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープ(GT114)の組合せを挙げることができる。
GT30抗体は、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目、341番目、344番目、第343番目、346番目、347番目、348番目、349番目および350番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープを認識する。GT30抗体は、配列番号38で示される重鎖可変領域および配列番号39で示される軽鎖可変領域を有し、Kabatナンバリングに基づくCDR1,2および3のアミノ酸配列が、配列番号46、配列番号47、および配列番号48でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号49、配列番号50、および配列番号51でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を有する。
GT607抗体は、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目、309番目、第297番目、300番目、304番目、306番目、311番目、312番目、313番目、314番目および315番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープを認識する。GT607抗体は、配列番号40で示される重鎖可変領域および配列番号41で示される軽鎖可変領域を有し、Kabatナンバリングに基づくCDR1,2および3のアミノ酸配列が、配列番号52、配列番号53、および配列番号54でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号55、配列番号56、および配列番号57でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を有する。
GT165抗体は、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目、344番目、第128番目、129番目、131番目、132番目、133番目、134番目、135番目、171番目、208番目、209番目、210番目、211番目、212番目、214番目、215番目、218番目、322番目、325番目、326番目、328番目、329番目、330番目、332番目、333番目、335番目、336番目および338番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸をエピトープを認識する。GT165抗体は、配列番号44で示される重鎖可変領域および配列番号45で示される軽鎖可変領域を有し、Kabatナンバリングに基づくCDR1,2および3のアミノ酸配列が、配列番号58、配列番号59、および配列番号60でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号61、配列番号62、および配列番号63でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を有する。
GT114抗体は、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、220番目、228番目、231番目、232番目、235番目、291番目、294番目および295番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープを認識する。GT114抗体は、配列番号42で示される重鎖可変領域および配列番号43で示される軽鎖可変領域を有し、Kabatナンバリングに基づくCDR1,2および3のアミノ酸配列が、配列番号64、配列番号65、および配列番号66でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号67、配列番号68、および配列番号69でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を有する。
GT30H鎖塩基配列 (配列番号30)
ATGGAATGGATCTGGATCTTTCTCTTCATCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCAATCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAACTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCTGGATGATGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGAAGTGGTATTACTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGTCTCTGATGGTTACCTTTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAA
GT30L鎖塩基配列 (配列番号31)
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAACAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTACCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTACTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCT
GT607H鎖塩基配列 (配列番号32)
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACGTAGTGAGACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATGGCATGTCCTGGGTTCGCCAGCTTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAAGTGTTGGTAATGGAGGTAGTTACAGGTACTATCCAGAGAATTTGAAGGGGCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATACCAAGAACACCCTATACCTGCAAATTAGTGGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATTTATTACTGTGCAAGACGGGGGGCTTTCCCGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAA
GT607L鎖塩基配列 (配列番号33)
ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAGTATCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCCTGGCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGAAACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTCCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCT
GT114H鎖塩基配列 (配列番号34)
ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTGGCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTATCCTATCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTCTGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGCCTACATAATGTACAGTGGTATCACTAGCTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACAGCCAAGAACCAGTTCTTTCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACTCAGCCACATATTACTGTTCACGAGGCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACTACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAA
GT114L鎖塩基配列 (配列番号35)
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGAGTGTGAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCATCCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCTTCAGTGGATTACTTATCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCT
GT165H鎖塩基配列 (配列番号36)
ATGTGTTGGAGCTGTATCATCCTCTTCCTGTTAGCAACAGCTGCACGTGTGCACTCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGGGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTTTGGCTACACCTTCACAAACCATCATATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTGGACTGGATTGGATATATTAATCCTTATAATGATTATACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTATATGGAGCTTAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCAGACCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAA
GT165L鎖塩基配列 (配列番号37)
ATGAGACCCTCCATTCAGTTCCTGGGGCTCTTGTTGTTCTGGCTTCATGGTGCTCAGTGTGACATCCAGATGACACAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTCTGGGAGGCAAAGTCACCATCACTTGCAAGGCAAGCCAAGACATTAACAAGAATATAGCTTGGTACCAACACAAGCCTGGAAAAGGTCCTAGGCTGCTCATATGGTACACATATACATTACAACCAGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGAGAGATTATTCCTTCAGCATCAGCAACCTGGAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTACTGTCTACAGTATGATAATCTTCCATTCACGTTCGGCACGGGGACAAAATTGGAAATAAAACGGGCT
GT30H鎖可変領域のアミノ酸配列 (配列番号38)
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCRASGYTFTSYGISWMMQRTGQGLEWIGEIYPRSGITYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDVSDGYLFPYWGQGTLVTVSAAK
GT30L鎖可変領域のアミノ酸配列 (配列番号39)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLPEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPPTFGGGTKLEIKRA
GT607H鎖可変領域のアミノ酸配列 (配列番号40)
EVQLVESGGDVVRPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQLPDKRLEWVASVGNGGSYRYYPENLKGRFTISRDNTKNTLYLQISGLKSEDTAIYYCARRGAFPYFDVWGAGTTVTVSSAK
GT607L鎖可変領域のアミノ酸配列 (配列番号41)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLACSASSSVTYMHWYQQKSGTSPKRWIYETSKLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRA
GT114H鎖可変領域のアミノ酸配列 (配列番号42)
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNKLEWMAYIMYSGITSYNPSLKSRISITRDTAKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCSRGYWYFDVWGAGTTVTVSSAK
GT114L鎖可変領域のアミノ酸配列 (配列番号43)
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSILASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCLQWITYRTFGGGTKLEIKRA
GT165H鎖可変領域のアミノ酸配列 (配列番号44)
QVQLQQSGAELVGPGASVKISCKAFGYTFTNHHINWVKQRPGQGLDWIGYINPYNDYTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSDPAWFAYWGQGTLVTVSAAK
GT165L鎖可変領域のアミノ酸配列 (配列番号45)
DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKNIAWYQHKPGKGPRLLIWYTYTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLPFTFGTGTKLEIKRA
上記抗体とそれぞれ同じエピトープに結合する抗体の組合せもまた、本発明の「2つの異なる抗体」として利用できる。各抗体と同じエピトープに結合する抗体は、競合ELISAなどの公知の方法を用いて、可溶性GPC3タンパク質あるいは各抗体が認識するエピトープ断片に対する上記各抗体との競合(交差反応性)を測定することにより得ることができる。
GT30抗体、GT607抗体、GT165抗体、およびGT114抗体とそれぞれ同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体の組合せ、あるいは、前記抗体とそれぞれ同じ重鎖CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)領域および軽鎖CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)を有する抗体の組合せもまた、本発明の「2つの異なる抗体」として利用できる。さらに、これらの抗体のキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体の組合せもまた本発明の「2つの異なる抗体」として利用できる。
より具体的には、健常人の可溶性GPC3の濃度範囲は15〜174pg/mL程度であることから、この範囲を超える可溶性GPC3が検出された場合には、肝臓ガンに罹患、又は、再発している可能性が示され、早期発見によるリスク低減が可能であることが示唆される。
ヒトグリピカン3(GPC3:配列番号70)の2つのヘパラン硫酸結合部位(495位ならびに509位)のセリンをアラニンに変換した変異体GPC3 coreの細胞外ドメイン(25位−563位)のC末端にHisタグを付与したGPC3 core(sGPC3-His)蛋白をBalb/cあるいはMRL/lprマウスに計6〜9回免疫し、最終免疫の3日後、マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞SP2/0を、PEG1500を用いた常法あるいはHVJ-E(石原産業)を用いて細胞融合した。
sGPC3-His蛋白質は還元条件下のSDS-PAGEにおいて約86 kDa, 約43 kDa, 約33 kDaのバンドが認められ、それぞれ全長型、プロテアーゼで切断されたN末断片、C末断片であることが明らかにされている(WO 2006/006693)。上記のスクリーニングにより得られたマウス抗体を用いてsGPC3-Hisに対してウエスタンブロットを行い、C末断片を認識しない抗体を選抜した。その結果、N末断片認識抗体としてGT30、GT114、GT607、認識部位未同定のGT165を得た(図1)。
上記抗体のエピトープをより詳細に同定するため、GPC3のアミノ酸配列を10残基の重なりを含んだ30残基のペプチドに分割し、対応するペプチドを合成した(表2 配列番号 1−29)。合成ペプチドを1 mg/mLとなるようジメチルスルホキシドに溶解した後、PBSを用いて1 μg/mLに希釈した。96ウェルプレートに希釈したペプチド溶液を一ウェル当たり70 μLで添加し、室温で1時間固相化した。未固相のペプチドを除去し、ブロッキング緩衝液20% Blocking-one(ナカライテスク)を一ウェル当たり200 μL添加して一晩ブロッキングを行った。ブロッキング緩衝液を除去し、TBS-Tで3回洗浄したのち、2 μg/mLとるようブロッキングバッファーで希釈した抗体を70 μL/ウェルで添加した。一時間後に抗体を除去し、TBS-Tを一ウェル当たり200 μL添加して3回洗浄した。各ウェルにHRP結合抗マウス抗体を一ウェル当たり70 μLで添加して一時間反応させた。抗体を除去し一ウェル当たり200 μLのTBS-Tにて3回洗浄後、発色試薬ABTS Peroxidase Substrate System(1component, KPL社)を70 μL/ウェル添加し室温で15〜30分発色させ、一ウェル当たり70 μLの1% SDSを添加して反応を停止してプレートリーダーにて405 nmの吸光度を測定した。その結果図3に示すようにGT30は配列番号17番のペプチドと結合することが明らかとなったが、GT114、GT165ならびにGT607は特異的に結合するペプチドは見出されなかった。
次に、GPC3 N末端側フラグメントを認識する各抗体の結合競合性を解析するため、各抗体を用いた結合阻害試験を行った。
具体的には、96ウェル透明マイクロプレート(Thermo Scientific社製 MaxiSoap)に1 μg/mLのsGPC3溶液(PBS)を50 μL加え、室温で一晩静置した。次いで、マイクロプレートを洗浄液(0.01% Triton X-100を含むTBS)で1回洗浄後、ブロッキング溶液(ナカライテスク株式会社製 BlockingOne)を200 μL加え、室温で1時間静置した。また、マイクロプレートを洗浄液で3回洗浄後、50 μg/mLの未標識の抗GPC3抗体溶液(20% BlockingOneを含むPBS)を25 μL加え、室温で1分間撹拌した。さらに、0.5 μg/mLのビオチン標識した抗GPC3抗体溶液(20% BlockingOneを含むPBS)を25 μL加え、室温で1時間撹拌した。次いで、マイクロプレートを洗浄液で3回洗浄後、StreptAvidin-HRP(Prozyme社製)を希釈液(10% Block Ace, 0.1% Tween 20を含むTBS)で10,000倍希釈した溶液を50 μL加え、室温で30分間撹拌した。また、マイクロプレートを洗浄液で5回洗浄後、発色基質液(Thermo Scientific社製 1-Step Turbo TMB)を50 μL加え、マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度(O.D. 450)を測定した。
以上の結果から、GT114、GT165ならびにGT607は立体構造を認識し、特にGT165はGT30のエピトープ領域である321位から350位の部位の近傍に結合することが示唆されたことから、ヒトGPC3の立体構造モデルにより結合が考えられる領域を同定した。
(磁性粒子を用いたELISA測定系の構築)
実施例4の結果から、可溶性GPC3の測定系が構築可能な抗体の組み合わせとして表6に示す2種を選抜した。
(磁性粒子を用いた化学発光免疫酵素測定法による可溶性GPC3の測定)
磁性粒子を用いた化学発光免疫酵素測定法による可溶性GPC3の測定は、以下の方法で実施した。
(検出限界および定量限界)
検出限界については、0〜10pg/mLに調製した可溶性GPC3溶液サンプルを10回ずつ測定し、各濃度の測定発光量の平均値および標準偏差(SD)を算出後、測定発光量平均値±3SDの範囲が、濃度0pg/mLの発光量平均値±3SDの範囲と重ならない最低の濃度を検出限界とした。
(肝癌検体の希釈直線性試験)
0,10,25,50,100,250,500,1000pg/mLに調製した各可溶性GPC3溶液を検量線とし、実施例7と同様の手順で段階希釈した肝癌検体中の可溶性GPC3を測定した。
(健常者検体の測定)
0,10,25,50,100,250,500,1000pg/mLに調製した各可溶性GPC3溶液を検量線とし、実施例7と同様の手順で健常者血清中の可溶性GPC3を測定した。なお、健常者血清については、21例を測定し、平均値を求めた。
取得抗体の配列解析
上記で得られた抗体GT30、GT114、GT165、GT607およびGT30を産生するハイブリドーマより全RNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成したのち、マウス抗体遺伝子をPCRにて増幅しアミノ末端から可変領域の塩基配列を決定した(配列番号30−37)。可変領域のアミノ酸配列を配列番号38-45に示す。さらに、その各CDR領域の配列を配列番号46〜69に示す。
GC33の進行および/または再発性肝細胞癌(HCC)患者における有効性、安全性を確認するため、前治療歴のある切除不能進行性または転移性肝細胞癌成人患者を対象としたGC33 1600 mgを隔週投与する多施設共同無作為化二重盲検プラセボ対照第II相臨床試験が実施された(NP27884試験)。なお、GC33は、ヒトGPC3に高い親和性をもって結合する遺伝子組換えヒト化IgG1モノクローナル抗体である(WO2006/006693)。
Claims (8)
- 配列番号70で示されるアミノ酸配列からなるGPC3タンパク質の第128番目のアミノ酸から第357番目のアミノ酸配列中に含まれる異なるエピトープに結合する2つの異なる抗体を用いることを特徴とする、被検試料中の可溶性GPC3タンパク質の測定方法であって、
異なるエピトープが下記の(A)または(B)の組合せである、測定方法。
(A)異なるエピトープの一方が、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目、および344番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第341番目、343番目、346番目、347番目、348番目、349番目および350番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープであり、もう一方が、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第297番目、300番目、304番目、306番目、311番目、312番目、313番目、314番目および315番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープである。
(B)異なるエピトープの一方が、GPC3タンパク質の第337番目、339番目、340番目および344番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、第128番目、129番目、131番目、132番目、133番目、134番目、135番目、171番目、208番目、209番目、210番目、211番目、212番目、214番目、215番目、218番目、322番目、325番目、326番目、328番目、329番目、330番目、332番目、333番目、335番目、336番目および338番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープであり、もう一方が、GPC3タンパク質の第221番目、298番目、301番目、302番目、305番目、308番目および309番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含み、かつ、220番目、228番目、231番目、232番目、235番目、291番目、294番目および295番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープである。 - 異なるエピトープが、
配列番号38と相同性が80%以上の配列で示される重鎖可変領域および配列番号39と相同性が80%以上の配列で示される軽鎖可変領域を有する抗体が結合するエピトープと、配列番号40と相同性が80%以上の配列で示される重鎖可変領域および配列番号41と相同性が80%以上の配列で示される軽鎖可変領域を有する抗体が結合するエピトープ、または配列番号44と相同性が80%以上の配列で示される重鎖可変領域および配列番号45と相同性が80%以上の配列で示される軽鎖可変領域を有する抗体が結合するエピトープと、配列番号42と相同性が80%以上の配列で示される重鎖可変領域および配列番号43と相同性が80%以上の配列で示される軽鎖可変領域を有する抗体が結合するエピトープである、請求項1に記載の測定方法。 - 2つの異なる抗体が、
配列番号38で示される重鎖可変領域に含まれるCDR領域および配列番号39で示される軽鎖可変領域に含まれるCDR領域と同一のCDR領域を有する抗体と、配列番号40で示される重鎖可変領域に含まれるCDR領域および配列番号41で示される軽鎖可変領域に含まれるCDR領域と同一のCDR領域を有する抗体の組合せ、または、
配列番号44で示される重鎖可変領域に含まれるCDR領域および配列番号45で示される軽鎖可変領域に含まれるCDR領域と同一のCDR領域を有する抗体と、配列番号42で示される重鎖可変領域に含まれるCDR領域および配列番号43で示される軽鎖可変領域に含まれるCDR領域と同一のCDR領域を有する抗体の組合せである、請求項1に記載の測定方法。 - CDR領域がKabatナンバリングに基づくCDR1、2、および3領域である、請求項3に記載の測定方法。
- 2つの異なる抗体が、
重鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号46、47および48で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号49、50および51で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体と、重鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号52、53および54で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号55、56および57で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体の組合せ、または、
重鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号58、59および60で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号61、62および63で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体と、重鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号64、65および66で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域のCDR1,2および3がそれぞれ配列番号67、68および69で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体の組合せである、請求項1に記載の測定方法。 - 2つの異なる抗体が、
配列番号38で示される重鎖可変領域および配列番号39で示される軽鎖可変領域を有する抗体と、配列番号40で示される重鎖可変領域および配列番号41で示される軽鎖可変領域を有する抗体の組合せ、または、
配列番号44で示される重鎖可変領域および配列番号45で示される軽鎖可変領域を有する抗体と、配列番号42で示される重鎖可変領域および配列番号43で示される軽鎖可変領域を有する抗体の組合せである、請求項1に記載の測定方法。 - 2つの異なる抗体のいずれか一方が磁性粒子と結合している、請求項1〜6のいずれか1項に記載の測定方法。
- 被験試料が、ヒトから単離された組織試料、全血試料、血漿試料、または血清試料である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の測定方法。
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