ES2353967T3

ES2353967T3 - Anticuerpo anti-glipicano 3 .

Info

Publication number: ES2353967T3
Application number: ES05760156T
Authority: ES
Inventors: Kiyotaka Nakano; Takeshi Yoshino; Jun-Ichi Nezu; Hiroyuki Tsunoda; Tomoyuki Igawa; Hiroko Konishi; Megumi Tanaka; Izumi Sugo; Shigeto Kawai; Takahiro Ishiguro; Yasuko Kinoshita
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-07-09
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2011-03-08
Anticipated expiration: 2025-07-08
Also published as: CN111925445A; JP4011100B2; EP1674111B1; CA2544692A1; EP1674111A4; BRPI0506125B8; PT1674111E; DK1674111T3; RU2611751C2; EP2216046A3; ATE486610T1; NO20063539L; US7919086B2; CN1842540A; KR20130014698A; CY1111649T1; WO2006006693A1; NO343105B1; AU2005256113B2; KR101413402B1

Abstract

Un anticuerpo capaz de unirse al glipicano 3, siendo el anticuerpo: (a) un anticuerpo que comprende: (i) una región variable de cadena pesada que tiene CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 123, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 124 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 125 y (ii) una región variable de cadena ligera que tiene CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:142, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158; (b) un anticuerpo que comprende (i) y que puede inhibir competitivamente la unión del anticuerpo de (a) a glipicano (c) un anticuerpo que comprende (ii) y que puede inhibir competitivamente la unión del anticuerpo de (a) a glipicano 3; (d) un anticuerpo que tiene la misma actividad de unión al glipicano 3 como el anticuerpo de cualquiera de (a) a (c), en el que un resto de aminoácido se sustituye, elimina o añade y/o inserta a partir de la de las secuencias de aminoácidos expuestas en (a); (e) un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo al que el anticuerpo de (a) es capaz de unirse, comprimiendo el anticuerpo de (a) tanto las secuencias de región variable de cadena ligera como pesada especificadas en (a); o (f) un anticuerpo capaz de unirse a un péptido que consiste en la secuencia de los restos de aminoácidos 546-551 de glipicano 3.

Description

Anticuerpo anti-glipicano 3.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-glipicano 3, un inhibidor del crecimiento celular y un agente anticanceroso que contiene el anticuerpo como un ingrediente activo.

Descripción de la técnica relacionada

El glipicano 3 (GPC3) es uno de la familia de glipicanos de proteoglicanos de sulfato de heparano que están presentes en las superficies celulares. Se sugiere que GPC3 puede estar implicado en la división celular en el desarrollo o crecimiento celular de cáncer, sin embargo, su función no se ha elucidado todavía.

Se ha descubierto que un determinado tipo de anticuerpo que se une a GPC3 tiene una actividad de inhibición del crecimiento celular por medio de una actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y una actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (Solicitud de Patente Internacional WO 2003/000883). Además, se ha sugerido que GPC3 se escinde in vivo y se secreta en la sangre como una forma secretada de GPC3 y el diagnóstico de cánceres puede ser posible usando un anticuerpo capaz de detectar la forma secretada de GPC3 (Solicitudes de Patentes Internacionales WO 2004/022739, WO 03/100429 y WO 2004/018667). El documento WO 2 004 022 597 describe anticuerpos frente a los extremos N y C de GPC3.

Cuando se desarrolla un agente anticanceroso basándose en la actividad citotóxica de un anticuerpo, se prefiere que el anticuerpo que se va a usar tenga una actividad ADCC o actividad CDC alta. Por consiguiente, un anticuerpo anti-GPC3 que tiene una actividad de citotoxicidad alta se ha deseado como un anticuerpo que reconoce GPC3.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo anti-GPC3 que tiene una actividad ADCC y actividad CDC más altas en comparación con las de un anticuerpo convencional.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han tenido éxito en la obtención de un anticuerpo que tiene una actividad de citotoxicidad más alta en comparación con la de un anticuerpo anti-glipicano 3. Además, los inventores analizaron epítopos para dicho anticuerpo y tuvieron éxito en la determinación de las regiones en GPC3 reconocido por el anticuerpo con una actividad de citotoxicidad alta.

La presente invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse a glipicano 3, siendo el anticuerpo:

(a): un anticuerpo que comprende:

(i): una región variable de cadena pesada que tiene CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 123, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 124 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 125 y

(ii): una región variable de cadena ligera que tiene CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 143, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(b): un anticuerpo que comprende (i) y que puede inhibir competitivamente la unión del anticuerpo de (a) al glipicano 3;

(c): un anticuerpo que comprende (ii) y que puede inhibir competitivamente la unión del anticuerpo de (a) al glipicano 3;

(d): un anticuerpo que tiene la misma actividad de unión al glipicano 3 que el anticuerpo de cualquiera de (a) a (c), en el que un resto de aminoácido se sustituye, elimina o añade y/o inserta a partir de las secuencias de aminoácidos expuestas en (a);

(e): un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo al que el anticuerpo de (a) es capaz de unirse, en el que dicho anticuerpo de (a) comprende las secuencias de región variable tanto de cadena ligera como pesada especificadas en (a) o

(f): un anticuerpo capaz de unirse a un péptido que consiste en la secuencia de los restos de aminoácidos 546-551 del glipicano 3.

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También se ha mencionado un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR1, 2 y 3 de uno cualquiera de (1)-(12):

(1): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 123, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 124 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 125;

(2): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 109, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 110 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 111;

(3): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 106, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 107 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 108;

(4): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 132, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 133 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 134;

(5): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 106, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 135 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 136;

(6): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 126, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 127 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 128;

(7): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 129, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 130 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 131;

(8): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 103, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 104 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 105;

(9): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 118, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 121 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 122;

(10): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 115, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 116 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 117;

(11): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 112, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 113 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 114 o

(12): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 118, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 119 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 120.

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También se menciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 de uno cualquiera de (1)-(13):

(1): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 143, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(2): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 143, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 145;

(3): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 140, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 141 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 142;

(4): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 167, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 168 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 169;

(5): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 170, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 171;

(6): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 159, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 160 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 161;

(7): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 162, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 147 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 163;

(8): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 164, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 165 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 166;

(9): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 137, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 138 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 139;

(10): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 155, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 146 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 157;

(11): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 149, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 150 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 151;

(12): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 146, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 147 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 148 o

(13): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 152, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 153 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 154;

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También se menciona un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de (1)-(13):

(1): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 143, 144 y 158, respectivamente;

(2): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 109, 110 y 111, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 143, 144 y 145, respectivamente;

(3): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 106, 107 y 108, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 140, 141 y 142, respectivamente;

(4): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 132, 133 y 134, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 167, 168 y 169, respectivamente;

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(5): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 106, 135 y 136, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 170, 144 y 171, respectivamente;

(6): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 126, 127 y 128, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 159, 160 y 161, respectivamente;

(7): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 129, 130 y 131, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 162, 147 y 163, respectivamente;

(8): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 129, 130 y 131, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 164, 165 y 166, respectivamente;

(9): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 103, 104 y 105, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 137, 138 y 139, respectivamente;

(10): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 118, 121 y 122, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 155, 156 y 157, respectivamente;

(11): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 115, 116 y 117, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 149, 150 y 151, respectivamente;

(12): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 112, 113 y 114, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 146, 147 y 148, respectivamente y

(13): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 118, 119 y 120, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 152, 153 y 154, respectivamente.

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También se mencionan un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada de uno cualquiera de (1)-(17):

(1): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 84;

(2): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 85;

(3): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 86;

(4): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87;

(5): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 88;

(6): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 89 o

(7): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 90.

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Adicionalmente se menciona un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92.

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo de uno cualquiera de (1)-(7):

(1): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 84 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos dispuesta en la SEC ID Nº: 92;

(2): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 85 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92;

(3): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 86 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos dispuesta en la SEC ID Nº: 92;

(4): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos dispuesta en la SEC ID Nº: 92;

(5): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 88 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92;

(6): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 89 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 y

(7): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 90 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92.

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También se menciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 de uno cualquiera de (1)-(15):

(1): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 174, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(2): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 175, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(3): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 176, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(4): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 177, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(5): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 178, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(6): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 179, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(7): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 180, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

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(8): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 181, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(9): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 182, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(10): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 183, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(11): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 184, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(12): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 185, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(13): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 186, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(14): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 187, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158 o

(15): CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 188, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158.

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En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo de (1)-(15):

(1): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 174, 144 y 158, respectivamente;

(2): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 175, 144 y 158, respectivamente;

(3): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 176, 144 y 158, respectivamente;

(4): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 177, 144 y 158, respectivamente;

(5): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 178, 144 y 158, respectivamente;

(6): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 179, 144 y 158, respectivamente;

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(7): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 180, 144 y 158, respectivamente;

(8): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 181, 144 y 158, respectivamente;

(9): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 182, 144 y 158, respectivamente;

(10): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 183, 144 y 158, respectivamente;

(11): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 184, 144 y 158, respectivamente;

(12): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 185, 144 y 158, respectivamente;

(13): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 186, 144 y 158, respectivamente;

(14): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 187, 144 y 158, respectivamente y

(15): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 188, 144 y 158, respectivamente.

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También se menciona un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera seleccionada de (1)-(15):

(1): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 191;

(2): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 192;

(3): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 193;

(4): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 194;

(5): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 195;

(6): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 196;

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(7): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 197;

(8): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 198;

(9): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 199;

(10): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 200;

(11): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201;

(12): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 202;

(13): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 203;

(14): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 204 y

(15): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 205.

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En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en (1)-(15):

y una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en (1)-(7):

(6): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 89 y

(7): una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 90.

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La región variable de cadena pesada, una región variable de cadena ligera y la secuencia de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3, así como las SEC ID Nº se resumen en la tabla a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

3

4

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También la invención se ocupa de un anticuerpo que tiene una actividad equivalente a la actividad del anticuerpo descrito anteriormente, en el que uno o más restos de aminoácido se sustituyen, eliminan o añaden e/o insertan a partir de las secuencias de aminoácidos descritos anteriormente.

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado.

Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado capaz de unirse al glipicano 3.

También se menciona un anticuerpo capaz de unirse a un péptido que consiste en la secuencia de los restos de aminoácidos 524-563 de glipicano 3.

También se menciona un anticuerpo capaz de unirse a un péptido que consiste en la secuencia de los restos de aminoácidos 537-563 de glipicano 3. También se menciona un anticuerpo que no se une a un péptido que consiste en la secuencia de los restos de aminoácidos 550-563 de glipicano 3.

Preferiblemente, el anticuerpo es capaz de unirse a un péptido que consiste en la secuencia de los restos de aminoácidos 542-551, 544-553 ó 546-555 de glipicano 3 o un péptido que consiste en la secuencia de los restos de aminoácidos 546-551 de glipicano 3.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo al que es capaz de unirse un segundo anticuerpo, comprendiendo dicho segundo anticuerpo una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 143, 144 y 158, respectivamente. Concretamente, el anticuerpo de la invención es capaz de competir en la unión de GPC3 con el segundo anticuerpo.

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención es capaz de unirse al glipicano 3 y tiene una actividad CDC alta frente a una célula que expresa glipicano 3 y/o tiene una actividad ADCC alta frente a una célula que expresa glipicano 3.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera del anticuerpo de la invención.

En un aspecto, el polinucleótido es uno que tiene una cualquiera de las secuencias expuestas en las SEC ID Nº: 57, 67, 77-83 ó 91.

Preferiblemente, el polinucleótido de la invención tiene la secuencia expuesta en las SEC ID Nº: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70 y 77-83.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un inhibidor del crecimiento celular y un agente anticanceroso que comprende el anticuerpo de la invención como ingrediente activo. Preferiblemente, el agente anticanceroso de la invención se usa para el tratamiento de hepatomas.

También se menciona un péptido que comprende la secuencia de los restos de aminoácidos 524-563 de glipicano 3, la secuencia de los restos de aminoácidos 537-563 de glipicano 3, la secuencia de los restos de aminoácidos 544-553 de glipicano 3 o la secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 546-551 de glipicano 3.

También se proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la invención. La invención proporciona adicionalmente una célula hospedadora que comprende dicho vector.

La invención proporciona adicionalmente un método para la producción de un anticuerpo que comprende:

(a): cultivar la célula hospedadora de la invención,

(b): aislar un anticuerpo a partir de un cultivo de (a) y

(c): purificar el anticuerpo de la misma.

La invención también proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.

Se proporciona adicionalmente un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 546-551 de glipicano 3.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la actividad de unión del anticuerpo anti-GPC3 a una célula CHO, una célula CHO que expresa HuH-7, HepG2 y GPC3 de longitudes totales, que se evaluó por citometría de flujo. M1E7 (línea continua) y M11F1 (línea discontinua) se usaron a concentraciones de 5 \mug/ml, respectivamente.

La Figura 2 es una tabla que muestra los resultados de la clasificación de epítopos por un ELISA competitivo. Los grados de inhibición competitiva frente a la unión del anticuerpo anti-GPC3 biotinilado se indican en porcentaje. Los epítopos se clasificaron en 5 grupos, de a hasta e, de acuerdo con el patrón de inhibición competitivo.

La Figura 3 muestra los resultados de la evaluación por transferencia de Western si un anticuerpo anti-GPC3 se une al fragmento N terminal de 40 kDa de la forma soluble de la proteína de núcleo GPC3 o al fragmento C terminal de 30
kDa de la misma. Se descubrió que L9G11 se une al fragmento N terminal y M3C11 se une al fragmento C terminal.

La Figura 4 muestra los resultados de la detección de una forma secretada de GPC3 que está presente en el sobrenadante de cultivo de HepG2 por un ELISA de sándwich. Se detectó fuertemente con la combinación de anticuerpos que se unen al fragmento N terminal tales como M6B1, M18D4 o M19B11 y no se detectó fuertemente con anticuerpo que se une al fragmento C terminal tal como M3C11, M13B3 o M3B8.

La Figura 5 muestra los resultados de la inmunoprecipitación del sobrenadante de cultivo de HepG2 con el uso de un anticuerpo anti-GPC3 y la detección de una forma secretada de GPC3. El medio como control (carriles 1 y 3) y el sobrenadante de cultivo de HepG2 (carriles 2 y 4) se inmunoprecipitaron usando M1E7 (carriles 1 y 2) y M10D2 (carriles 3 y 4). Se detectó GPC3 secretada por M10D2 que se une al fragmento de N terminal.

La Figura 6 muestra los resultados del análisis de los epítopos de los anticuerpos que se unen al fragmento C terminal de GPC3 por transferencia de Western con el uso de una proteína de fusión del péptido C terminal de GPC3 y GST. La forma soluble de la proteína de núcleo GPC3 (carril 1), GST (carril 2), GC-1 (carril 3), GC-2 (carril 4), GC-3 (carril 5), GC-4 (carril 6) y GC-5 (carril 7) se sometieron a electroforesis SDS en condiciones reductoras y se detectaron por transferencia de Western usando M3C11 y M11F1.

La Figura 7 muestra los resultados de la evaluación de la actividad CDC del anticuerpo quimérico ratón-ser humano anti-GPC3 frente a una célula CHO que expresa GPC3.

La Figura 8 muestra los resultados de la evaluación de la actividad ADCC del anticuerpo quimérico ratón-ser humano anti-GPC3 frente a una célula CHO que expresa GPC3 y HepG2.

La Figura 9 muestra los resultados de la evaluación de la actividad ADCC de GC33 frente a una línea celular de hepatoma humano, HuH-7, usando una célula efectora que procede de médula ósea de ratón.

La Figura 10 muestra los resultados de la evaluación de la actividad antitumoral del anticuerpo GC33 frente a un modelo de ratón al que se le ha trasplantado hepatoma humano.

La Figura 11 muestra los resultados de la evaluación de la actividad CDC del anticuerpo quimérico humano-ratón GC33 frente a una célula CHO que expresa GPC3.

La Figura 12 muestra los resultados de la evaluación de la actividad ADCC del anticuerpo quimérico ratón-ser humano GC33 frente a HepG2.

La Figura 13 muestra secuencias derivadas de GPC3 contenidas en proteínas de fusión GST (GC-4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 y 14) preparadas para analizar el epítopo de GC33.

La Figura 14 muestra los resultados de una transferencia Western con el uso de GC33 después de separar GST, GC-7, 8, 9, 11, 12, 13 y 14 por SDS-PAGE en condiciones reductoras.

La Figura 15 muestra los resultados de la evaluación de la actividad de unión de GC33 humanizado frente a GPC3 por un ELISA.

La Figura 16 muestra un panel de anticuerpos que resume los isotipos y resultados de un ELISA, BIAcore, FACS, un análisis de epítopos y un ensayo de inmunoprecipitación para clones derivados de un ratón inmunizado con una forma soluble de GPC3.

La Figura 17 muestra un panel de anticuerpos en el que se resumen los isotipos y resultados de un ELISA, FACS y un análisis de epítopos para clones derivados de un ratón inmunizado con GC-3.

La Figura 18 muestra los resultados de la evaluación de la actividad de unión de los anticuerpos modificados frente a la forma soluble de la proteína de núcleo GPC3 por un ELISA. Gly34 situada en CDR1 en una región variable de cadena L GC33 se sustituyó con cualquiera de los 17 aminoácidos distintos de Cys y Met.

La Figura 19 muestra los resultados de la evaluación de la actividad CDC de los anticuerpos quiméricos ratón-ser humano GC33, M3C11 y M1E7 frente a una célula CHO que expresa GPC3 de longitud total.

La Figura 20 muestra los resultados de la evaluación de la actividad ADCC de los anticuerpos quiméricos ratón-ser humano GC33, M3C11 y M1E7 frente a una línea celular de hepatoma humano SK-03 que expresa GPC3 de longitud total.

Descripción detallada de la invención Anticuerpo

La presente invención proporciona anticuerpos descritos en las siguientes (I) a (XI).

(I): Un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 (GC33). El anticuerpo reconoce en el péptido de C terminal de glipicano 3 (un péptido que comprende del aminoácido 374º al aminoácido 530º de glipicano 3) y es útil como un anticuerpo terapéutico.

(II): Un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 143, 144 y 158 (GC33). El anticuerpo reconoce el péptido C terminal de glipicano 3 (un péptido que comprende del aminoácido 374º al aminoácido 530º del glipicano 3) y es útil como un anticuerpo terapéutico.

(III): Un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos descritos en la siguientes (1) a (13):

(1): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que consisten en la secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones de variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en la secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 143, 144 y 158 (GC33).

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El anticuerpo descrito reconoce el péptido C terminal de glipicano 3 (un péptido que comprende desde el aminoácido 374º al aminoácido 580º de glipicano 3) y es útil como un anticuerpo terapéutico.

(IV): Un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada descrita en cualquiera de las siguientes de (1) a (7):

(1): región variable de cadena pesada que contiene la secuencia aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 84 (GC33VH ver. a),

(2): región variable de cadena pesada que contiene la secuencia aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 85 (GC33VH ver. c),

(3): región variable de cadena pesada que contiene la secuencia aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 86 (GC33VH ver. f),

(4): región variable de cadena pesada que contiene la secuencia aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87 (GC33VH ver. h),

(5): región variable de cadena pesada que contiene la secuencia aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 88 (GC33VH ver. i),

(6): región variable de cadena pesada que contiene la secuencia aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 89 (GC33VH ver. j) y

(7): región variable de cadena pesada que contiene la secuencia aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 90 (GC33VH ver. k).

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Entre los anticuerpos descritos de (1) a (7), se prefieren particularmente los anticuerpos descritos de (2) a (7).

(V): Un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VL ver.a).

(VI): Un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos descritos en los siguientes de (1) a (7):

(1): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 84 (GC33 VH ver. a) y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VL ver. a),

(2): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 85 (GC33 VH ver. c) y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VL ver. a),

(3): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 86 (GC33 VH ver. f) y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VL ver. a),

(4): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87 (GC33 VH ver. h) y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VL ver. a),

(5): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 88 (GC33 VH ver. i) y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VL ver. a),

(6): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 89 (GC33 VL ver. j) y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VH ver. a) y

(7): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 90 (GC33 VH ver. k) y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VH ver. a).

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Entre los anticuerpos descritos de (1) a (7), se prefieren particularmente anticuerpos descritos de (2) a (7).

(VII): Un anticuerpo descrito en cualquiera de los siguientes de (1) a (15):

(1): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 174, 144 y 158,

(2): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 175, 144 y 158,

(3): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 176, 144 y 158,

(4): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 177, 144 y 158,

(5): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 178, 144 y 158,

(6): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 179, 144 y 158,

(7): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 180, 144 y 158,

(8): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 181, 144 y 158,

(9): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 182, 144 y 158,

(10): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 183, 144 y 158,

(11): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 184, 144 y 158,

(12): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 185, 144 y 158,

(13): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 186, 144 y 158,

(14): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 187, 144 y 158 y

(15): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 188, 144 y 158.

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Entre los anticuerpos descritos en de (1) a (15), se prefiere el anticuerpo descrito en (15).

(VIII): Un anticuerpo descrito en cualquiera de los siguientes de (1) a (15):

(1): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 174, 144 y 158,

(2): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 175, 144 y 158,

(3): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 176, 144 y 158,

(4): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 177, 144 y 158,

(5): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 178, 144 y 158,

(6): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 179, 144 y 158,

(7): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 180, 144 y 158,

(8): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 181, 144 y 158,

(9): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 182, 144 y 158,

(10): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 183, 144 y 158,

(11): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 184, 144 y 158,

(12): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 185, 144 y 158,

(13): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 186, 144 y 158,

(14): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 187, 144 y 158 y

(15): un anticuerpo que contiene regiones variables de cadena pesada que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125 y regiones variables de cadena ligera que tienen CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 188, 144 y 158.

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Entre los anticuerpos descritos en (1) a (15), se prefiere el anticuerpo descrito en (15).

(IX): Un anticuerpo descrito en uno cualquiera de los siguientes de (1) a (15):

(1): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 191,

(2): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 192,

(3): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 193,

(4): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 194,

(5): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 195,

(6): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 196,

(7): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 197,

(8): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 198,

(9): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 199,

(10): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 200,

(11): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201,

(12): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 202,

(13): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 203,

(14): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 204 y

(15): un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 205.

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Entre los anticuerpos descritos de (1) a (15), se prefiere el anticuerpo descrito (15).

(X): Un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las regiones variables de cadena ligera descritas en las siguientes de (1) a (15):

(1): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 191,

(2): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 192,

(3): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 193,

(4): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 194,

(5): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 195,

(6): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 196,

(7): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 197,

(8): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 198,

(9): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 199,

(10): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 200,

(11): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201,

(12): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 202,

(13): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 203,

(14): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 204 y

(15): una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 205 y una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las regiones variables de cadena descritas en los siguientes (1) a (7):

(1): una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 84,

(2): una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 85,

(3): una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 86,

(4): una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87,

(5): una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 88,

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(6): una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 89 y

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Entre los anticuerpos descritos anteriormente, se prefiere el anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera que contienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 205 y una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 90.

(XI): Un anticuerpo, en el que se ha sustituido, eliminado, añadido y/o insertado un aminoácido en la secuencia de aminoácidos descrita en una cualquiera de los mencionadas anteriormente (I) a (X) y que tiene una actividad equivalente a la del anticuerpo descrito en cualquiera de (I) a (X).

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En la presente invención, el equivalente de actividad al que el anticuerpo descrito en cualquiera de (I) a (X) significa que la actividad de unión al anticuerpo glipicano 3 humano o la actividad de citotoxicidad en una célula que expresa glipicano 3 humano (por ejemplo, HepG2 o unas células CHO recombinantes que expresan el glipicano 3 humano, etc.) es equivalente.

Anticuerpo humanizado

Una realización preferida del anticuerpo de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo humanizado que se une al glipicano 3. El anticuerpo humanizado se puede preparar usando un método conocido.

El anticuerpo humanizado también se menciona como un anticuerpo humano reformado, que se produce transplantando la región de determinación de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero no humano, por ejemplo un anticuerpo de ratón, en la CDR de un anticuerpo humano. La tecnología de ADN recombinante general para la preparación de dichos anticuerpos también se conoce (véase la Solicitud de Patente Europea EP 125023 y la Solicitud de Patente Nacional WO 96/02576).

Específicamente, por ejemplo, en el caso en el que una CDR proceda de un anticuerpo de ratón, una secuencia de ADN que se ha diseñado para unirse a las CDR del anticuerpo de ratón con la región de fase de lectura (FR) de un anticuerpo humano se sintetiza por el método de PCR usando varios oligonucleótidos como cebadores, que se han preparado para tener partes que solapan entre ellas en ambos extremos de la CDR y la FR (véase el método descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO 98/13388).

Para la región de fase de lectura de un anticuerpo humano esté unida con la CDR, se selecciona la que permita que una región de determinación de complementariedad forme un sitio de unión de antígenos favorable. Si es necesario, un aminoácido en la región de fase de lectura de una región variable del anticuerpo puede sustituirse de modo que la región de determinación de complementariedad de un anticuerpo humano reformado puede formar un sitio de unión de antígenos apropiado (Sako, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

La región C de un anticuerpo humano se puede usar como la región C de un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, por ejemplo, C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3 y C\gamma4 pueden usarse en la cadena H y C\kappa y C\lambda se pueden usar en la cadena L. La región C de un anticuerpo humano se puede modificar para mejorar la estabilidad del anticuerpo o la producción del mismo. El anticuerpo humano a usar en la humanización puede ser cualquier isotipo de anticuerpo humano, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, preferiblemente, IgG, más preferiblemente IgG1 o IgG3 y particularmente preferiblemente IgG1. La IgG1 de la presente invención es eficaz cuando se usa un anticuerpo como un agente anticanceroso en términos de tener una alta actividad de citotoxicidad (Chemical Immunology, 65: 88 (1997).

Además, después de que se prepare el anticuerpo humanizado, puede sustituirse un aminoácido en una región variable (por ejemplo, FR) o una región constante con otro aminoácido.

El origen de la CDR en un anticuerpo humanizado no está limitado particularmente y la CDR puede proceder de cualquier animal. Por ejemplo, es posible usar una secuencia derivada de un anticuerpo de ratón, un anticuerpo de rata, un anticuerpo de conejo, un anticuerpo de camello o similares. Se prefiere una secuencia de CDR de un anticuerpo de ratón.

Respecto a la humanización de un anticuerpo, generalmente es difícil humanizarlo mientras que se mantiene la actividad agonista del anticuerpo original. En la presente invención, sin embargo, un anticuerpo humanizado que tiene una actividad agonista equivalente a la del anticuerpo de ratón original se adquirió con éxito. Puesto que la antigenicidad del anticuerpo humanizado en el cuerpo humano está reducida, es útil al administrarlo en el ser humano para un fin terapéutico.

Los ejemplos preferidos del anticuerpo anti-glipicano 3 humanizado en la presente invención incluyen, por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada expuesto en las SEC ID Nº: 84 (GC33 VH ver.a), SEC ID Nº: 85 (GC33 VH ver.c), SEC ID Nº: 86 (GC33 VH ver.f), SEC ID Nº: 87 (GC33 VH ver.h), SEC ID Nº: 88 (GC33 VH ver.i), SEC ID Nº: 89 (GC33 VH ver.j) o en SEC ID Nº: 90 (GC33 VH ver.k) o un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VL ver.a). Los ejemplos particularmente preferidos de los mismos incluyen un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada expuesta en las SEC ID Nº: 84 (GC33 VH ver.a), SEC ID Nº: 85 (GC33 VH ver.c), SEC ID Nº: 86 (GC33 VH ver.f), SEC ID Nº: 87 (GC33 VH ver.h), SEC ID Nº: 88 (GC33 VH ver.i), SEC ID Nº: 89 (GC33 VH ver.j) o en SEC ID Nº: 90 (GC33 VH ver.k) y una región variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID Nº: 92 (GC33 VL ver.a).

Además, un ejemplo preferido del anticuerpo anti-glipicano 3 humanizado incluye un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 90 y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 205.

Una realización preferida del anticuerpo de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo que se une al epítopo al que se une el anticuerpo expuesto en (1):

(1): un anticuerpo que contiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 62 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 73 (GC33).

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El anticuerpo que se une al epítopo al que se une el anticuerpo mencionado anteriormente es útil porque tiene una citotoxicidad particularmente alta.

El anticuerpo descrito en (1) se une a una región del aminoácido 524º al aminoácido 580º del glipicano 3 humano. En particular, se une a la región del aminoácido 524º al aminoácido 563º. El anticuerpo descrito en (1) se une a la región del aminoácido 537º al aminoácido 563º del glipicano humano 3. El anticuerpo descrito en (1) se une a una región del aminoácido 544º al aminoácido 553º del glipicano 3 humano. En particular, se une a una región del aminoácido 546º al aminoácido 551º.

Los anticuerpos que reconocen los epítopos mencionados anteriormente tienen una alta citotoxicidad, por lo tanto son útiles en el tratamiento de una enfermedad tal como el cáncer. En particular, el anticuerpo que se une a una región del aminoácido 546º al aminoácido 551º es útil ya que tiene citotoxicidad particularmente alta.

Por consiguiente, la presente invención incluye los anticuerpos que se unen a un epítopo en una región del aminoácido 524º al aminoácido 580º del glipicano 3 humano, preferiblemente a una región del aminoácido 524º al aminoácido 563º, más preferiblemente una región del aminoácido 537º al aminoácido 563º, adicionalmente más preferiblemente a una región del aminoácido 544º el aminoácido 553º, particularmente preferiblemente a una región del aminoácido 546º al aminoácido 551º.

Otra realización preferida de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo que reconoce una región del aminoácido 524º al aminoácido 563º del glipicano 3 humano y no reconoce una región del aminoácido 537º al aminoácido 563º.

Una realización preferida adicionalmente de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo que reconoce una región del aminoácido 537º al aminoácido 563º del glipicano 3 humano y no reconoce una región del aminoácido 550º al aminoácido 563º.

El análisis de un epítopo reconocido por un anticuerpo se puede realizar por un método conocido para los expertos en la materia, por ejemplo, por transferencia de Western descrita en los ejemplos a continuación.

El anticuerpo que reconoce las regiones mencionadas anteriormente como un epítopo se puede obtener por un método conocido para los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede obtener preparando un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos de una región diana basándose en la secuencia de aminoácidos del glipicano 3 humano y preparando un anticuerpo con el uso del péptido como un inmunogén o preparando un anticuerpo por un método convencional y determinando un epítopo que reconoce el anticuerpo obtenido y después seleccionando un anticuerpo que reconoce el epítopo diana.

Un ejemplo preferido del anticuerpo anti-glipicano 3 de la presente invención es un anticuerpo que tiene una actividad ADCC alta o un anticuerpo que tiene una actividad CDC alta frente a una célula que expresa glipicano
3.

La frase "una actividad ADCC alta" o "una actividad CDC alta" como se usa en el presente documento significa que el anticuerpo de la invención tiene una actividad ADCC más alta o una actividad CDC más alta que la de un anticuerpo anti-glipicano 3 conocido. Los anticuerpos glipicano 3 conocidos incluyen, por ejemplo, M3C11 y M1E07 descritos en la Solicitud de Patente Internacional WO 2004/22739.

La actividad ADCC o la actividad CDC se puede medir por un método conocido para los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede medir por el ensayo de liberación de cromo. Las condiciones específicas del ensayo de liberación de cromo para medir la actividad ADCC no están particularmente limitadas, sin embargo, por ejemplo, se puede medir usando las condiciones descritas en los Ejemplos a continuación.

Los ejemplos de las células que expresan glipicano 3 incluyen, por ejemplo, una línea celular de hepatoma tal como HepG2, una línea celular CHO que tiene un gen que codifica el glipicano 3 incorporado en el mismo y similares. Para medir la actividad ADCC, se prefiere usar una línea celular HepG2 y para medir la actividad de CDC, se prefiere usar una línea celular CHO recombinante que expresa GPC3. La línea celular recombinante CHO que expresa GPC3 puede prepararse por cualquier método, sin embargo, se puede preparar mediante, por ejemplo, el método descrito en los Ejemplos a continuación.

En el caso en el que el anticuerpo anti-glipicano 3 se use como un agente anticanceroso, se prefiere que tenga una actividad ADCC al mismo nivel que la de un anticuerpo que contiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 62 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 73 (GC33). En el caso en el que se use el anticuerpo anti-glipicano 3 como un agente anticanceroso, se prefiere que tenga una actividad CDC al mismo nivel que la de un anticuerpo que contiene una región variable de cadena pesada que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 62 y una región variable de cadena ligera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 73
(GC33).

Adicionalmente, la presente invención incluye un anticuerpo que tiene una actividad de unión alta al glipicano 3.

En la presente invención, se puede medir la actividad de unión del anticuerpo al glipicano 3 usando un método conocido para los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede medir utilizando la resonancia en un plasmón de superficie con BIAcore. Específicamente, una proteína glipicano 3 se inmoviliza en una microplaca sensora para reaccionar con un anticuerpo y la interacción entre el anticuerpo y el glipicano 3 se puede calcular como una constante de velocidad de reacción del valor de medida. Además, respecto a la evaluación de la actividad de unión, se puede usar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), un inmunoensayo enzimático (EIA), un radioinmunoensayo (RIA) o una técnica de anticuerpos fluorescente. Por ejemplo, en el caso en el que se use un inmunoensayo enzimático, se añade una muestra que contiene un anticuerpo a ensayar, por ejemplo, un sobrenadante de cultivo de una célula que produce un anticuerpo a ensayar o un anticuerpo purificado a una placa que se ha recubierto con un antígeno al que se une el anticuerpo a ensayar. Después, se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima tal como fosfatasa alcalina y las placas se incuban y se lavan. Después, se añade un sustrato enzimático tal como p-nitrofenil fosfato y se mide la absorbancia, por lo cual se puede evaluar una actividad de unión de antígeno. El límite superior de la actividad de unión no está particularmente limitado. Sin embargo, por ejemplo, el límite superior se puede definir dentro del intervalo lo que es técnicamente posible por los expertos en la materia. Se apreciará que el intervalo que es técnicamente posible se expandirá por el avance de la tecnología.

Adicionalmente, en la presente invención, se puede sustituir un aminoácido que se va a desamidar o un aminoácido adyacente a un aminoácido que se va a desamidar con otro aminoácido para el fin de, por ejemplo, suprimir la desamidación para aumentar la estabilidad del anticuerpo. El aminoácido que se va a desamidar incluye, asparagina y glutamina, preferiblemente asparagina. Un aminoácido adyacente a asparagina no está particularmente limitado y puede ser cualquier aminoácido. Se sabe que una secuencia asparagina-glicina es particularmente susceptible a la desamidación, por tanto, se prefiere glicina como el aminoácido adyacente a asparagina. Un aminoácido usado para sustituir no está particularmente limitado y puede ser cualquier aminoácido distinto de asparagina y glutamina. Se prefiere un aminoácido distinto de valina y prolina. Por lo tanto, en la presente invención, en caso en el que un anticuerpo se desamide, se prefiere sustituir el aminoácido con un aminoácido distinto de asparagina, glutamina, valina y prolina. La supresión de la desamidación por sustitución de aminoácidos se puede realizar con referencia a, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional WO 03/057881. En el caso en el que la sustitución de aminoácidos se realice para el fin de la supresión de la desamidación, se prefiere que la actividad de unión del antígeno se mantenga antes de la sustitución.

Otra realización de estabilización del anticuerpo incluye la sustitución de ácido glutámico con otro aminoácido. Además, en la presente invención se descubrió que, en el caso en el que el 6º aminoácido de la cadena pesada de un anticuerpo sea ácido glutámico, el anticuerpo se puede estabilizar significativamente sustituyendo el ácido glutámico con glutamina. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método de estabilizar un anticuerpo sustituyendo el ácido glutámico en la posición 6º de la cadena pesada del anticuerpo con glutamina. La numeración de aminoácidos del anticuerpo la conocen los expertos en la materia (por ejemplo, Kabat, E. et al. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services 1983).

El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo conjugado estando conjugado el anticuerpo con diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG), materiales radiactivos y toxinas. Dicho anticuerpo conjugado puede prepararse por modificación química del anticuerpo obtenido como anteriormente. Los métodos para modificar anticuerpos ya se han establecido en la técnica. El anticuerpo de la invención abarca dicho anticuerpo conjugado.

El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374). El anticuerpo bispecífico puede reconocer glipicano 3 y otro antígeno o puede reconocer diferentes epítopos en una molécula GPC3.

Adicionalmente, el anticuerpo de la invención puede portar una determinada proteína fusionada al extremo N o C del anticuerpo (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). La proteína que se va a fusionar al anticuerpo puede seleccionarse convenientemente por los expertos en la materia.

Además, el anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo con una citotoxicidad potenciada. Los ejemplos del anticuerpo con una citotoxicidad potenciada incluyen un anticuerpo que no tiene fucosa, un anticuerpo que tiene N-acetil glucosamina (GlcNAc) de bisección unida a su cadena de azúcares y un anticuerpo que tiene actividad de unión alterada para el receptor Fc\gamma obtenida sustituyendo uno o más aminoácidos en la región Fc. Dichos anticuerpos con una citotoxicidad potenciada se pueden preparar por un método conocido en la técnica.

Métodos de preparación de anticuerpos

El anticuerpo que se une a glipicano 3 puede prepararse por un método conocido para los expertos en la materia. Por ejemplo, un hibridoma que produce anticuerpos monoclonales se puede preparar de la siguiente manera básicamente usando una técnica conocida. Es decir, el hibridoma se puede preparar inmunizando a un mamífero de acuerdo con un método de inmunización convencional usando una proteína glipicano 3 o una célula que expresa glipicano 3 como un agente sensibilizante. El inmunocito obtenido de esta manera se fusiona con una célula parental conocida por un método de fusión celular en común y después se selecciona una célula productora de anticuerpos monoclonales por un método de exploración común.

Específicamente, un anticuerpo monoclonal se puede preparar de la siguiente manera. Primero, se obtiene una proteína glipicano 3 basándose en la secuencia aminoácidos/gen de glipicano 3 mostrada en las SEC ID Nº: 3 y 4, que se usa como un antígeno sensibilizante para obtener un anticuerpo. Más específicamente, la secuencia génica que codifica glipicano 3 se inserta en un sistema de vector de expresión conocido y se transforma una célula hospedadora apropiada con el vector y después se purifica una proteína glipicano 3 humana diana por un método conocido a partir de la célula hospedadora o el sobrenadante de cultivo.

Posteriormente, esta proteína glipicano 3 purificada se usa como un antígeno sensibilizante. Como alternativa, se puede usar un péptido parcial de glipicano 3 como agente sensibilizante. En este caso, el péptido parcial también se puede obtener por síntesis química de acuerdo con la secuencia de aminoácidos del glipicano 3 humano.

Un mamífero a inmunizar con un agente sensibilizante no está particularmente limitado, pero se selecciona preferiblemente en vista de la compatibilidad con una célula parental a usar para la fusión celular. Por ejemplo, se usan generalmente roedores tales como ratones, ratas y hámster, conejos o monos.

La inmunización de un animal con un antígeno sensibilizante se realiza de acuerdo con un método conocido. Por ejemplo, la inmunización se realiza por un método general en el que se inyecta un antígeno sensibilizante por vía intraperitoneal o subcutánea a un mamífero. Específicamente, un antígeno sensibilizante se diluye con o se suspende en una cantidad apropiada de PBS (solución salina tamponada con fosfato), suero fisiológico o similares, una cantidad apropiada de un adyuvante estándar tal como el adyuvante completo de Freund se mezcla con el producto si es necesario y después la solución se emulsiona y se administra a un mamífero varias veces cada de 4 a 21 días. Además, se puede usar también un vehículo apropiado tras la inmunización con un agente sensibilizante.

Un mamífero se inmuniza como se describe anteriormente y después se confirma un aumento del nivel de un anticuerpo diana en el suero. Posteriormente, se extraen inmunocitos del mamífero y después se someten a fusión celular. Un inmunocito particularmente preferido es un esplenocito.

Como una célula parental compañera a fusionar con el inmunocito mencionado anteriormente, se usa una célula de mieloma de mamífero. Los ejemplos de una línea celular de la célula de mieloma que preferiblemente se usan en el presente documento incluyen varias líneas celulares conocidas tales como P3 (P3x63 Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63 Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell 8 (1976), 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exped. Med. (1978) 148, 313-323) y R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

La fusión celular de los inmunocitos mencionados anteriormente con células de mieloma se puede realizar básicamente de acuerdo con un método conocido, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein et al. (Kohler. G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Más específicamente, la fusión celular mencionada anteriormente se realiza en una solución de cultivo de nutrición normal en presencia de, por ejemplo, un acelerador de la fusión celular. Como el acelerador de fusión celular, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), un virus sendai (HVJ). Si se desea, se puede añadir un adyuvante tal como dimetilsulfóxido para potenciar adicionalmente la eficacia de fusión.

La relación de inmunocitos frente a células de mieloma puede seleccionarse apropiadamente. Por ejemplo, se prefiere que el número de inmunocitos sea de 1 a 10 veces mayor que el de las células de mieloma. La solución de cultivo a usar para la fusión celular mencionada anteriormente incluye, por ejemplo, una solución de cultivo RPMI 1640, una solución de cultivo MEM que es adecuada para el crecimiento de la línea celular de mieloma mencionada anteriormente u otra solución de cultivo normal que se usa para este tipo de cultivo celular. Además, un complemento de suero tal como suero de ternero fetal (FCS) se puede usar en combinación con lo mismo.

La fusión celular se realiza de la siguiente manera. Se mezclan bien cantidades predeterminadas de células de mieloma e inmunocitos mencionados anteriormente en la solución de cultivo mencionado anteriormente, se añade una solución de PEG (por ejemplo, con un peso molecular medio de aproximadamente 1000 a 6000) (a una concentración general del 30 al 60% (p/v)), que se ha precalentado a aproximadamente 37ºC y después se mezcla la solución, por lo que se forma una célula de fusión diana (hibridoma). Posteriormente, se añade una solución de cultivo apropiada sucesivamente y después se repite una etapa de eliminación de sobrenadante por centrifugación para eliminar el reactivo para fusión celular o similares que no es favorable con el crecimiento del hibridoma.

El hibridoma obtenido de esta manera se selecciona por cultivo del hibridoma en una solución de cultivo selectiva convencional tal como solución de cultivo HAT (una solución de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en la solución de cultivo HAT mencionada anteriormente continúa por un período de tiempo suficiente para que mueran las células (células no fusionadas) distintas de los hibridoma diana (normalmente, de varios días a varias semanas). Posteriormente, un método de dilución limitante convencional se realiza para explorar respecto a un monoclón de hibridoma que produce un anticuerpo diana.

Además del método para inmunizar un animal no humano con un antígeno para obtener un hibridoma, se puede obtener también un anticuerpo humano deseado que tiene una actividad de unión al glipicano 3 sensibilizando un linfocito humano con un glipicano 3 in vitro y permitiendo al linfocito sensibilizado fusionarse con una célula de mieloma de origen humano que tiene un potencial de división permanente (véase el documento JP-B-1-59878). En otro método, un antígeno de glipicano 3 se administra a un animal transgénico que tiene todos los repertorios de genes de anticuerpo humanos para obtener células productoras de anticuerpo anti-glipicano 3, que se inmortalizan después y se puede obtener un anticuerpo humano para glipicano 3 a partir de las células productoras de anticuerpo anti-glipicano 3 inmortalizadas (véanse las Solicitudes de Patentes Internacionales WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 y WO 94/02602).

El hibridoma preparado de esta manera que produce un anticuerpo monoclonal puede ser un cultivo de pases en una solución de cultivo convencional o se puede almacenar durante un período largo en nitrógeno líquido.

Un ejemplo de un método empleado para obtener un anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma implica el cultivo del hibridoma y la obtención de un anticuerpo monoclonal a partir del sobrenadante de cultivo de acuerdo con un método convencional. Otro método implica la administración del hibridoma a un mamífero que es compatible con el hibridoma para permitirlo que prolifere y obtener un anticuerpo monoclonal a partir de ascitis. El primer método es adecuado para obtener un anticuerpo de alta pureza, mientras que el último método es adecuado para la producción en masa de anticuerpos.

También es posible preparar un anticuerpo recombinante clonando el gen de anticuerpo a partir del hibridoma, incorporando el gen en un vector apropiado, introduciendo el vector en un hospedador y después permitiendo al hospedador producir el anticuerpo recombinante por una técnica de ingeniería genética (por ejemplo, véase Vandamme, A. M. et al., Eur. J Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990).

Específicamente, el ARNm que codifica la región variable (V) de un anticuerpo anti-glipicano 3 se aísla de un hibridoma que produce el anticuerpo anti-glipicano 3. El ARNm se aísla por un método conocido tal como método de ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) o un método AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) y se prepara el ARN total y después el ARNm diana se prepara usando un kit de purificación de ARNm (Pharmacia) o similares. Además, también se puede preparar directamente ARNm usando un kit de purificación de ARNm de QuickPrep (Pharmacia).

El ADNc de la región V del anticuerpo se sintetiza usando una transcriptasa inversa a partir del ARNm obtenido de esta manera. El ADNc se puede sintetizar usando un Kit de Síntesis de ADNc de Primera Cadena con Transcriptasa Inversa de AMV (SEIKAGAKU CORPORATION) o similares. Además, por ejemplo, un kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech), el método 5'-RACE (Frohman, M. A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) que usa PCR se puede emplear para sintetizar y amplificar ADNc.

Se purifica un fragmento de ADN diana a partir del producto de PCR obtenido de esta manera y después se liga a un vector de ADN. Un vector recombinante se prepara a partir del producto y después el vector se introduce en E. coli o similares y se selecciona una colonia, por lo tanto preparando un vector recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos del ADN diana se determina después por un método conocido tal como método de terminación de cadena con didesoxinucleótido.

Después de que se obtenga un ADN que codifica la región V del anticuerpo anti-glipicano 3 diana, este ADN se incorpora en un vector de expresión que contiene ADN que codifica la región constante (región C) del anticuerpo diana.

Para producir el anticuerpo anti-glipicano 3 usado en la presente invención, el gen de anticuerpo se incorpora en un vector de expresión de modo que el gen se expresa bajo la regulación de la región de control de expresión génica incluyendo, por ejemplo, un potenciador y un promotor. A continuación, se transforma una célula hospedadora con el vector de expresión, por lo tanto permitiendo al hospedador expresar anticuerpo.

Un gen de anticuerpo se puede expresar incorporando un polinucleótido que codifica la cadena H o un polinucleótido que codifica la cadena L por separado en un vector de expresión y después transformando simultáneamente una célula hospedadora con los vectores o incorporando polinucleótidos que codifican la cadena H y la cadena L en un vector de expresión individual y después transformando una célula hospedadora con el vector (véase Solicitud de Patente Internacional WO 94/11523).

Polinucleótido

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, el polinucleótido de la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos descrita en cualquiera de las SEC ID Nº: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70 y 77-83. Además, un polinucleótido que está hibridado con el polinucleótido mencionado anteriormente en condiciones estrictas y codifica un anticuerpo que tiene una actividad equivalente a la del anticuerpo de la presente invención también está dentro del alcance de la presente invención.

El polinucleótido de la presente invención no está limitado particularmente siempre que codifique el anticuerpo de la presente invención. Es un polímero compuesto de una pluralidad de nucleótidos, tales como ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN). Puede contener una base distinta que una base de origen natural. El polinucleótido de la presente invención se puede usar para producir un anticuerpo por una técnica de ingeniería genética. Además, el polinucleótido de la presente invención se puede usar como una sonda para seleccionar un anticuerpo que tiene una función equivalente a la del anticuerpo de la presente invención. Es decir, se puede usar un polinucleótido que codifica el anticuerpo de la presente invención o un fragmento parcial del mismo como una sonda para obtener ADN que está hibridado con el polinucleótido en condiciones estrictas y codifica un anticuerpo que tiene una actividad equivalente a la del anticuerpo de la presente invención por técnicas tales como una técnica de hibridación, una técnica de amplificación génica (por ejemplo, PCR). Dicho ADN también se incluye en el polinucleótido de la presente invención.

La técnica de hibridación (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2º ed., 9.47-9,58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) se conoce bien por los expertos en la materia. Los ejemplos de las condiciones de hibridación incluyen, por ejemplo, condiciones poco estrictas. Las condiciones poco estrictas son, por ejemplo, las condiciones de 42ºC, 0,1 \times SSC y 0,1% de SDS, preferiblemente las condiciones de 50ºC, 0,1 \times SSC y 0,1% de SDS cuando se realiza el lavado después de la hibridación. Los ejemplos más preferidos de las condiciones de hibridación incluyen, por ejemplo, condiciones muy estrictas. Las condiciones muy estrictas son, por ejemplo, las condiciones de 65ºC, 5 \times SSC y SDS al 0,1%. En estas condiciones, se puede esperar que un polinucleótido que tenga una homología más alta se pueda obtener eficazmente a temperatura más alta. Casualmente, hay factores plurales que afectan el grado de estrictez de hibridación, tales como temperatura y la concentración de sales y los expertos en la materia pueden conseguir una estrictez similar seleccionando apropiadamente estos factores.

Un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención codificado por un polinucleótido obtenido por dicha técnica de hibridación y una técnica de amplificación génica normalmente tiene una homología alta con el anticuerpo en términos de la secuencia de aminoácidos. El anticuerpo de la presente invención también incluye un anticuerpo que es funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención y tiene una homología alta con la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Una homología alta significa generalmente al menos el 50% o más identidad, preferiblemente el 75% o más identidad, más preferiblemente el 85% o más identidad y aún más preferiblemente el 95% o más identidad a nivel de aminoácidos. Para determinar la homología de los polipéptidos, se puede emplear el algoritmo descrito en la bibliografía (Wilbur, W. J. y Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730).

La presente invención también proporciona un vector que contiene el polinucleótido de la presente invención. Dicho vector se puede usar para preparar el anticuerpo de la presente invención. Como para el vector de la presente invención, en el caso en el que se usa E. coli como hospedador, por ejemplo, no se limita particularmente siempre que tenga un "ori" para su uso en la amplificación en E. coli para producir y amplificar el vector en gran cantidad en E. coli (por ejemplo, JM109, DH5\alpha, HB101 o XLIBlue) y tiene un gen marcador para seleccionar una E. coli transformada (por ejemplo, un gen de resistencia a fármaco que se puede identificar por un fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, kanamicina o cloranfenicol). Los ejemplos del vector incluyen vectores de serie M13, vectores de serie pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script y similares. Además, pGEM-T, pDIRECT y pT7 también se pueden usar para subclonar y extraer ADNc así como los vectores descritos anteriormente.

Como el vector de la presente invención, es particularmente útil un vector de expresión. Por ejemplo, un vector de expresión que se va a expresar en E. coli debería tener las características anteriores para amplificarse en E. coli. Además, en el caso en el que E. coli, tal como JM109, DH5\alpha, HB101 o XL1-Blue se use como célula hospedadora, es indispensable que el vector tenga un promotor, por ejemplo, el promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043) promotor T7 o similares, que pueden expresar eficazmente el producto deseado en E. coli. Los ejemplos de dichos vectores incluyen pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress System" (Qiagen), pEGFP, pET (en este caso, el hospedador preferiblemente es BL21 que expresa la ARN polimerasa T7) y similares, así como los vectores descritos anteriormente.

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Además, el vector también puede contener una secuencia de señal para la secreción de polipéptidos. Como para la secuencia de señal para la secreción de proteínas, en el caso en el que se produzca un polipéptido en el periplasma de E. coli, se puede usar la secuencia de señal pelB (Lei S. P. et al., J. Bacteriol (1987) 169, 4379). La introducción del vector en una célula hospedadora se puede realizar usando, por ejemplo, el método de cloruro de calcio y el método de electroporación.

Además de E. coli, por ejemplo, los vectores de expresión derivados de mamíferos (por ejemplo, pcDNA3 (Invitrogen) y pEGF-BOs (Nucleic Acids Res. (1990) 18(17), pág. 5322), pEF y pCDM8), los vectores de expresión que proceden de células de insectos (por ejemplo, "sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac" (GIBCO BRL) y pBacPAK8), los vectores de expresión que proceden de plantas (por ejemplo, pMH1 y pMH2), vectores de expresión que proceden de virus animales (por ejemplo, pHSV, pMV, pMV y pAdexLcw), vectores de expresión derivados de retrovirus (por ejemplo, pZIPneo), vectores de expresión derivados de levadura (por ejemplo, "Kit de Expresión de Pichia" (Invitrogen), pNV11 y SP-Q01) y vectores de expresión que proceden de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608 y pKTH50) se pueden usar como el vector de la presente invención.

Para el fin de expresar el vector en una célula animal tal como una célula CHO, una célula COS, una célula NIH3T3 o similares, es indispensable para el vector tener un promotor requerido para la expresión en una célula tal como un promotor SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), promotor MMTV-LTR, promotor EF1\alpha (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), promotor CMV o similares y más preferiblemente tener un gen marcador (tal como un gen de resistencia a fármaco que se pueda identificar por un fármaco tal como neomicina o G418) para seleccionar la transformación en la célula. Los ejemplos del vector que tiene dichas características incluyen, por ejemplo, pMAM, pDR2, pBK,-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13.

Adicionalmente, para el fin de expresar establemente un gen y, al mismo tiempo, amplificar el número de copias del gen en la célula, se introduce un vector (por ejemplo, pCHOI, etc.) que tiene el gen DHFR en la célula CHO deficiente en la vía sintética del ácido nucleico para complementar la deficiencia y se amplifica con metrotexato (MTX). Además, para el fin de la expresión transitoria de un gen, la transformación se efectúa con un vector (tal como pcD) que tiene el origen de replicación para SV40 usando una célula COS que tiene en el cromosoma un gen que expresa el antígeno SV40 T. Como el origen de replicación, también se pueden usar el derivado de un virus polioma, un adenovirus, un virus del papiloma bovino (BPV) y similares. Adicionalmente, para la amplificación del número de copias del gen en el sistema de la célula hospedadora, el vector de expresión puede incluir, como un marcador seleccionable, el gen de la aminoglucósido transferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la xantina guaninafosforibosil transferasa de E. coli (Ecogpt), el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr) y similares.

Para preparar el anticuerpo de la presente invención, el vector se introduce en una célula hospedadora. La célula hospedadora en la que se introduce el vector no está particularmente limitada, pero incluye, por ejemplo, E. coli o cualquiera de diversas células animales. Por ejemplo, la célula hospedadora se puede usar como un sistema para la producción o expresión del anticuerpo de la presente invención. Como para el sistema de producción de la preparación de polipéptidos, hay un sistema de producción in vitro y un sistema de producción in vivo. El sistema de producción in vitro incluye un sistema de producción que emplea células eucariotas y un sistema de producción que emplea células procariotas.

En el caso de que se use la célula eucariota, por ejemplo, se puede usar en una célula animal, una célula vegetal o una célula fúngica. Las células animales conocidas incluyen una célula de mamífero tal como una célula CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), una célula COS, una célula 3T3, una célula de mieloma, una célula de riñón de cría de hámster (BHK), una célula HeLa y una célula Vero, una célula de anfibio tal como un oocito de Xenopus (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340) o una célula de insecto tal como Sf9, Sf21 y Tn5. En la presente invención, se usan preferiblemente CHO-DG44, CHO-DXB11 una célula COS7, una célula BHK. Entre las células animales, para el fin de realizar una gran cantidad de expresión, se prefiere particularmente una célula CHO. La introducción del vector en las célula hospedadora se puede realizar mediante, por ejemplo, el método del fosfato de calcio, el método de dextrano-DEAE, el ribozoma catiónico DOTAP (Boehringer Mannheim), el método de electroporación, el método de lipofección o similares.

Como para la célula vegetal, por ejemplo, se conoce una célula que procede de Nicotiana tabacum como un sistema de producción de proteínas, que puede estar sometida a cultivo de callos. Los ejemplos de las células fúngicas incluyen levaduras tales como el género Saccharomyces, más específicamente Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe y hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, más específicamente Aspergillus niger.

En el caso en el que se use una célula procariota, el sistema de producción se puede emplear usando una célula bacteriana. Los ejemplos de las células bacterianas incluyen Escherichia coli (E. coli) tales como JM109, DH5\alpha y HB101 y Bacillus subtilis.

Preparación del anticuerpo recombinante

El anticuerpo de la presente invención se puede preparar cultivando las células hospedadoras mencionadas anteriormente. El anticuerpo se puede obtener cultivando in vitro una célula transformada con un polinucleótido deseado. El cultivo se puede realizar de acuerdo con un método conocido. El medio de cultivo para células animales incluye, por ejemplo, DMEM, MEM, RPMI 1640 e IMDM. Un complemento de suero tal como FBS o suero de ternero fetal (FCS) se puede usar en combinación o se puede usar medio sin suero. El pH durante el cultivo está preferiblemente aproximadamente de 6 a 8. El cultivo se va a realizar normalmente a aproximadamente de 30 a 40ºC durante aproximadamente de 15 a 200 horas con, según se necesite, agitación, aireación y cambio de medio.

Por otro lado, los sistemas para producir un polipéptido in vivo incluyen, por ejemplo, un sistema de producción que emplea un animal y un sistema de producción que emplea una planta. El polinucleótido diana se introduce en dicho animal o planta y el polipéptido se introduce en el cuerpo del animal o la planta y se recupera. La expresión "célula hospedadora" como se usa en el presente documento abarca dicho animal y planta.

Cuando se usa el animal, los sistemas de producción que emplean un mamífero o un insecto están disponibles. Como el mamífero, se pueden usar cabras, cerdos, ovejas, ratones y ganado (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). También se puede usar un animal transgénico como mamífero.

Por ejemplo, el polinucleótido diana se prepara como un gen de fusión con un gen que codifica un polipéptido que se produce inherentemente en la leche tal como caseína de cabra \beta. Después, el fragmento de ADN que contiene este gen de fusión se inyecta en un embrión de cabra y el embrión se transplanta en una cabra hembra. El anticuerpo diana se puede obtener a partir de la leche producida por la cabra transgénica nacida de la cabra que recibió el embrión o la descendencia de la misma. Para aumentar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo producido por la cabra transgénica, se puede dar hormonas a la cabra transgénica según se necesite (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Además, como un insecto, por ejemplo, se puede usar un gusano de seda. En el caso en el que se use un gusano de seda, se infecta un gusano de seda con un baculovirus en el que se ha insertado el polinucleótido que codifica el anticuerpo diana. El anticuerpo se puede obtener a partir del fluido corporal del gusano de seda (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).

En el caso en el que se use una planta, por ejemplo, se puede usar tabaco. En el caso en el que se use tabaco, se inserta un polinucleótido que codifica el anticuerpo diana en un vector de expresión para una planta, por ejemplo pMON 530 y después se introduce el vector en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. Después, se infecta tabaco tal como Nicotiana tabacum con la bacteria, por lo cual el anticuerpo diana se puede obtener a partir de las hojas del tabaco (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

El anticuerpo obtenido de esta manera se puede aislar a partir del interior o el exterior (medio de cultivo, etc.) de la célula hospedadora y después se puede purificar hasta un anticuerpo sustancialmente puro y uniforme. La separación y purificación del anticuerpo se puede realizar por un método de separación y purificación normalmente usado en la purificación de polipéptidos. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden separar y purificar por cualquier método incluyendo columnas de cromatografía, filtración, ultrafiltración, precipitación por sales, precipitación de disolvente, extracción de disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, isoelectroenfoque, diálisis, recristalización y combinación de los mismos.

Los ejemplos de cromatografía, incluyen, por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization; A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbol Laboratory Press, 1996). Estas cromatografías se pueden realizar usando cromatografía de fase líquida tal como HPLC y FPLC. Los ejemplos de una columna a usar para una cromatografía de afinidad incluyen una columna de proteína A o una columna de proteína G. Un ejemplo de la columna de proteína A es Sepharose F. F. Hyper D, POROS, (Pharmacia).

Adicionalmente, antes o después de la purificación del anticuerpo, el anticuerpo se puede modificar o los péptidos se pueden eliminar parcialmente según se necesite permitiendo que una enzima modificadora de proteínas adecuada actúe sobre lo mismo. La enzima modificadora de proteínas para este fin incluye, por ejemplo, tripsina, quimiotripsina, lisil endopeptidasa, proteína quinasa y glucosidasa.

Composición farmacéutica

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de la presente invención. La composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de la presente invención es útil en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada con la proliferación celular tal como el cáncer y particularmente es útil en el tratamiento y/o prevención del cáncer hepático. En el caso en el que el anticuerpo de la presente invención se use como una composición farmacéutica, el anticuerpo se puede formular en una forma de dosificación por un método conocido para los expertos en la materia. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede usar por vía parenteral en forma de una inyección de una solución o suspensión estéril con agua u otra solución farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el anticuerpo se puede formular en una forma de dosificación mezclándolo apropiadamente con un disolvente o vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua estéril, suero fisiológico, un aceite vegetal, un emulsionante, una suspensión, un tensioactivo, un estabilizante, un saporífero, un excipiente, un vehículo, un conservante, un aglutinante para preparar una forma de dosificación unitaria requerida para implementación farmacológica generalmente aceptada. La cantidad de ingredientes activos en estas preparaciones se selecciona para permitir la administración de una dosificación adecuada dentro del intervalo indicado.

Se puede formular una composición estéril para inyección usando un vehículo tal como agua destilada para inyección de acuerdo con la aplicación farmacológica general.

Los ejemplos de la solución acuosa para la inyección incluyen, por ejemplo, suero salino, glucosa y otros líquidos isotónicos que incluyen adyuvantes tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico. Se pueden usar en combinación con un solubilizante adecuado, tal como un alcohol, específicamente etanol, un polialcohol tal como propilenglicol y polietilenglicol y un tensioactivo no iónico tal como Polisorbato 80 ^{TM} y HCO-50.

El aceite de sésamo o aceite de soja se puede usar como un fluido oleaginoso y se puede usar en combinación con benzoato de bencil o alcohol bencílico como un solubilizante. Se puede formular con un tampón tal como un tampón fosfato o un tampón de acetato sódico, un analgésico tal como hidrocloruro de procaína, un estabilizante tal como alcohol bencílico o fenol o un antioxidante. La inyección preparada generalmente se introduce en una ampolla adecuada.

El método de administración preferiblemente es parenteral y los ejemplos específicos del mismo incluyen inyección, administración transnasal, administración transpulmonar, administración transdérmica y similares. La formulación de inyección puede administrarse por vía sistémica o tópica por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea o similares.

El método de administración se puede seleccionar apropiadamente de acuerdo con la edad y los síntomas de un paciente. Por ejemplo, una dosis de la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo o el polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede seleccionar del intervalo de 0,0001 mg a 1.000 mg por kg de peso corporal. Como alternativa, por ejemplo la dosis se puede seleccionar del intervalo de 0,001 mg a 100.000 mg/peso corporal por paciente, sin embargo no se limita siempre a estos valores numéricos. La dosis y el método de administración varían de acuerdo con el peso corporal, la edad y los síntomas de un paciente y se seleccionan apropiadamente por los expertos en la materia.

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Ejemplo

La presente invención se describirá con más detalles con referencia a los Ejemplos a continuación. Sin embargo, la presente invención no está limitada a estos Ejemplos.

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Ejemplo 1 Clonación de ADNc de glipicano 3 humano (GPC3)

Un ADNc de longitud total humano GPC3 se amplificó por reacción por PCR con un kit Advantage 2 (CLONTECH) usando ADNc de primera cadena de preparado por un método común a partir de una línea celular de cáncer de colon, Caco2, como un molde. Más específicamente, 50 \mul de una mezcla de reacción que contenía 2 \mul de ADNc derivado de Caco2, 1 \mul de un cebador en sentido (GATATCATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT: SEC ID Nº: 1), 1 \mul de un cebador antisentido (GCTAGCTCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC: SEC ID Nº: 2), 5 \mul de tampón de PCR Advantage 2 10x 8 \mul de mezcla de dNTP (1,25 mM) y 1,0 \mul de mezcla de polimerasa Advantage se sometió a 35 ciclos que consistían en 1 minuto a 94ºC, 30 segundos a 63ºC y 3 minutos a 68ºC. El producto amplificado de la reacción de PCR se insertó en un vector TA, pGEM-T Easy, usando un Sistema pGEM-T Easy I Vector (Promega). La secuencia se confirmó usando un secuenciador de ADN ABI 3100. En este sentido, se aisló un ADNc que codificaba GPC3 humano de longitud completa. La secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 3 indica la secuencia de nucleótidos del gen GPC3 humano y la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 4 indica la secuencia de aminoácidos de la proteína GPC3 humana.

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Ejemplo 2 Preparación de forma soluble de GPC2

Como inmunoproteína para la generación de un anticuerpo anti-GPC3, se preparó una forma soluble de proteína GPC, en la que se eliminó una región hidrófoba en el lado C terminal (aminoácidos 564-580).

Usando el ADNc de GPC3 humano de longitud total como molde, se realizó una reacción de PCR usando un cebador antisentido (ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C: SEC ID Nº: 5) y un cebador sentido, al que se añadieron una secuencia de reconocimiento EcoRI y una secuencia Kozak, (ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C: SEC ID Nº: 6). El fragmento de PCR obtenido (1711 bp) se clonó en un pCXND2-Flag. El pCXND2-Flag se diseñó para expresar una proteína marcada por flag insertando la región para la expresión del gen DHFR de pCHOI (Hirata et al., FEBS Letter 1994; 356; 244-248) en el sitio de HindIII de pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108; 193-199) y añadiendo una secuencia de marca Flag cadena abajo del sitio de multiclonación. El plásmido de expresión construido de ADN se introdujo en una línea celular CHO, una línea celular CHO y DXB11 que expresaban altamente la forma soluble de GPC3 se obtuvo por selección con 500 \mug/ml de Geneticina. El cultivo a gran escala de la línea celular CHO que expresaba altamente la forma soluble de GPC3 se realizó usando un frasco rotativo de 1700-cm^{3} y se recuperó el sobrenadante de cultivo para la purificación de anticuerpos. El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de flujo rápido de Sepharose DEAE (Amersham) y después de lavar, se eluyó el anticuerpo con un tampón que contenía NaCl 500 mM y afinidad purificada usando gel de afinidad de agarosa anti-flag M2 (SIGMA). Se realizó la elución con 200 \mug/ml de péptido FLAG. Después de que el eluato se concentrará con Centriprep-10 (Millipore), el péptido FLAG se eliminó por filtración en gel utilizando Superdex 200 HR 10/30 (Amersham). Por último, se concentró el filtrado usando una columna de flujo rápido de Sepharose de DEAE y se eluyó con PBS (que contenía NaCl 500 mM) sin Tween 20 para efectuar al intercambio de
tampón.

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Ejemplo 3 Preparación de forma soluble de proteína de núcleo GPC3

GPC3 se modifica por sulfato de heparano para convertirse en una macromolécula. Para eliminar un anticuerpo frente sulfato de heparano en una exploración respecto a un anticuerpo anti-GPC3, se preparó una forma soluble de proteína de núcleo GPC3 que tiene una mutación puntual en el sitio de unión se sulfato de heparano y se usó en la exploración.

Utilizando la forma soluble mencionada anteriormente de GPC3 (1-563) como un molde, un ADNc en el que los restos de Ser en las posiciones 495º y 509º se sustituyeron con Ala se preparó por el método de PCR de ensamblaje, en el que se diseñaron cebadores para añadir un marcador de His al extremo C. El ADNc obtenido se clonó en un vector pCXND3. El pCXND3 se construyó insertando la región de expresión del gen DHFR de pCHOI en el sito HindIII de pCXN2. El plásmido de expresión construido de ADN se introdujo en una línea celular DXB11 y se obtuvo una línea celular CHO que expresaba altamente una forma soluble de proteína de núcleo GPC3 por selección con 500 \mug/ml de Geneticina.

El cultivo a gran escala se realizó usando un frasco rotativo de 1700-cm^{2} y el sobrenadante de cultivo se recuperó para la purificación de anticuerpos. El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de flujo rápido de Sepharose Q (Amersham). Después del lavado, se eluyó el anticuerpo con un tampón de fosfato que contenía NaCl 500 mM y se purificó por afinidad usando una columna de flujo rápido de Sepharose quelante (Amersham). El anticuerpo se eluyó con un gradiente de imidazol de 10 a 150 mM. Finalmente, el eluato se concentró usando una columna de flujo rápido de Sepharose Q y se eluyó con un tampón fosfato que contenía NaCl 500 mM.

La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en condiciones reductoras mostró tres bandas de 70 kDa, 40 kDa y 30 kDa. El resultado de la secuenciación de aminoácidos usando un secuenciador de proteínas ABI492 (Applied Biosystems) indicó que la banda de 30 kDa correspondió a la secuencia de aminoácidos del 359º y su parte cadena abajo o el 375º y su parte cadena abajo de GPC3, lo que sugirió que GPC3 se escindió entre Arg358 y Ser359 o entre Lys374 y Val375, por tanto, estaba separada en 40 kDa del fragmento N terminal y 30 kDa del fragmento C
terminal.

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Ejemplo 4 Preparación de la línea celular CHO que expresaba GPC3 humano de longitud total

Para obtener una línea celular para evaluar una actividad de unión usando citometría de flujo, se estableció una línea celular CHO que expresaba GPC3 de longitud total.

Se mezclaron diez microgramos de un vector de expresión del gen GPC3 humano de longitud total y 60 \mul de SuperFect (QIAGEN). Después de que se formara un complejo la introducción del gen se realizó añadiéndolo a una línea celular CHO, DXB11. Después de un cultivo de 24 horas en una incubadora de CO_{2} se comenzó la selección usando \alphaMEM (GIBCO BRL) que contenía Geneticina a una concentración final de 0,5 mg/ml y FBS al 10%. Se recogieron las colonias resistentes a Geneticina resultantes y se realizó el clonaje por el método de dilución limitante. Cada clon celular se solubilizó y se confirmó la expresión de GPC3 humana de longitud total por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-GPC3. De este modo se obtuvo una línea celular que se expresaba
establemente.

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Ejemplo 5 Evaluación de la actividad de unión por ELISA

La forma soluble de proteína de núcleo GPC3 se diluyó a 1 \mug/ml con un tampón de recubrimiento (NaHCO_{3} 0,1 mol/l (pH 9,6), NaN_{3} al 0,02%) y se añadió a una inmunoplaca y se dejó a 4ºC durante una noche para que recubriera la placa. Después de que la placa se bloqueó con un tampón de dilución (Tris-HCl 50 mmol/l (pH 8,1), MgCl_{2} 1 mmol/l, NaCl_{2} 150 mmol/l, Tween 20 al 0,05% (v/v), NaN_{3} al 0,02% (p/v), BSA al 1% (p/v)) se añadió un anticuerpo anti-GPC3 y se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con un tampón de aclarado (Tween 20 al 0,05% (v/v), PBS), se añadió un anticuerpo anti-IgG de ratón (ZYMED) marcado con fosfatasa alcalina y se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con el tampón de aclarado, se añadió SIGMA 104 (SIGMA) diluido a 1 m/ml con un tampón sustrato (NaHCO_{3} 50 mmol/l (pH 9,8), MgCl_{2} 10 mmol/l) y se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora para el desarrollo de color. Después se midió la absorbancia (a 405 nm, longitud de onda de referencia de 655 nm) usando un Benchmark Plus (BIO-RAD).

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Ejemplo 6 Inmunización con forma soluble de GPC3 y selección de hibridoma

Puesto que GPC3 humano y GPC3 de ratón mostraron una alta homología del 94% a nivel de aminoácidos, se consideró difícil obtener un anticuerpo anti-GPC3 si se inmunizaba un ratón normal. Por lo tanto, un ratón con enfermedad autoinmune, ratón MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr (en lo sucesivo denominado ratón MRL/lpr, obtenido de Charles River Japón, Inc.) se usó como un animal inmunizado. Se comenzó la inmunización a la edad de 7 semanas a 8 semanas. Para la primera inmunización, se preparó una forma soluble de GPC3 a 100 \mug/individuo y se emulsionó usando adyuvante completo de Freund (FCa, Becton Dickinson) y se administró por vía subcutánea. Dos semanas más tarde, una forma soluble de GPC3 se preparó a 50 \mug/individuo y se emulsionó usando adyuvante incompleto de Freund (FIA, Becton Dickinson) y se administró por vía subcutánea. Después de eso, se realizó una inmunización adicional cada dos semanas 5 veces en total. Se diluyó una forma soluble de GPC3 con PBS a 50 \mug/individuo y después se administro por vía intravenosa por medio de la cola a dos de los ratones inmunizados como la inmunización final. El cuarto día después de la inmunización final, se extirpó el bazo para obtener una célula de bazo, que se mezcló con una célula de mieloma de ratón, P-X63Ag8U1 (P3U1, obtenida de ATCC) en una relación de 2:1. Se realizó la fusión celular añadiendo gradualmente PEG 1500 (Roche Diagnostic). Se añadió con cuidado medio RPMI 1640 (GIBCO BRL) para diluir PEG 1500 y después se eliminó PEG 1500 por centrifugación, se suspendieron las células en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10% y se inocularon en una placa de cultivo de 96 pocillos a 100 \mul/pocillo. Al día siguiente, medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10%, complemento de medio HAT 1x (SIGMA) y complemento de clonación de hibridoma BM-Condimed H10,5x (Roche Diagnostic) (en lo sucesivo denominado medio HAT) se añadieron a 100 \mul/pocillo. Después de 2, 3 y 5 días, la mitad de la solución de cultivo se sustituyó con el medio HAT. Después de 7 días, se realizó la exploración usando el sobrenadante de cultivo. La exploración se realizó por un ELISA usando una inmunoplaca recubierta con la forma soluble de proteína de núcleo GPC3. Se monoclonó un clon positivo con el método de dilución limitante. Como resultado, se obtuvieron 11 clones de anticuerpos (M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, L9G11, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, y M10D2) que tienen una actividad de unión fuerte frente a GPC3.

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Ejemplo 7 Determinación de isotipo y purificación de anticuerpo anti-GPC3

Se determinó el isotipo por un ELISA dependiente de antígeno usando un Kit de Isotipificación de Anticuerpo Monoclonal Inmunopure (PIERCE). La purificación de anticuerpo se realizó de la siguiente manera. El sobrenadante de cultivo de hibridoma cultivado con el medio HAT complementado con FBS (Ultra Low IgG) (GIBCO BRL) se adsorbió a Hi Trap ProteinG HP (Amersham) y se lavó con un tampón de unión (fosfato sódico 20 mM (pH 7,0)). El anticuerpo se eluyó con un tampón de elución (glicina-HCl 0,1 M (pH 2,7)). El eluato se neutralizó inmediatamente con un tampón de neutralización (Tris-HCl (pH 9,0)) y se dializó frente a PBS durante un día y una noche para el intercambio de tampón.

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Ejemplo 8 Evaluación de la actividad de unión por ELISA

Para evaluar convenientemente la actividad de unión del anticuerpo anti-GPC3 obtenido de esta manera, se detectó la unión dependiente de concentración del anticuerpo frente a una inmunoplaca que contenía la forma soluble de la proteína de núcleo GPC3 inmovilizada en la misma. Se añadió una serie de dilución de 3 veces (12 diluciones en total) del anticuerpo purificado a una concentración de 10 \mug/ml y se añadió un anticuerpo anti-IgG de ratón como el anticuerpo secundario. El desarrollo de color se realizó utilizando SIGMA 104. Puesto que el grado de desarrollo de color varía dependiendo del tiempo de desarrollo de color, se analizaron los datos medidos de manera precisa después de 1 hora. Cada anticuerpo mostró un desarrollo de color dependiente de la concentración. La correlación entre la concentración de un anticuerpo y el grado de desarrollo de color se representó gráficamente y se obtuvo una curva aproximada usando un software de análisis, GraphPad Purism. Su valor de CE50 se determinó como el índice de la actividad de unión. Los valores de CE50 para todos los clones se muestran en la Figura
16.

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Ejemplo 9 Evaluación de la actividad de unión por citometría de flujo

Se disociaron células con EDTA 1 mM pH 8,0 (GIBCO)/PBS y se suspendieron en tampón FACS (FBS/PBS 1%) a 1 x 10^{6} células/ml. Se distribuyó la solución a una Placa de Filtro Multiscreen-HV (Millipore) a 100 \mul/pocillo y se eliminó el sobrenadante por centrifugación. Se añadió un anticuerpo anti-GPC3 diluido a una concentración apropiada y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. Se lavaron las células una vez con tampón FACS y se añadió un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. Después de la reacción, se centrifugaron las células a 500 rpm durante 1 minuto y se eliminó sobrenadante. Se suspendieron las células en 400 \mul de tampón FACS y se sometieron a citometría de flujo. Se usó EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter) como citómetro de flujo. Se fijó una cota en la población de células vivas con el histograma de dispersión frontal y dispersión lateral. Como se muestra en la Figura 1, un anticuerpo anti-GPC3 (M3C11, M11F1) se unió fuertemente a la célula CHO que expresaba GPC3 y no se unió a la célula parental CHO, lo que indicó que el anticuerpo se une específicamente a GPC3 presentado en la membrana celular. Además, el anticuerpo mostró la actividad de unión a una línea celular de hepatoma, HepG2 (adquirida de ATCC) y HuH-7 (adquirida de Health Science Research Resources Bank), sugiriendo que el anticuerpo puede reconocer específicamente el hepatoma. La actividad de unión de los clones derivados del ratón inmunizado con una forma soluble de GPC3 medido por citometría de flujo se muestra en la Figura 16, en la que se indican los valores de modo X del histograma a la concentración de anticuerpo de
5 \mug/ml.

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Ejemplo 10 Clasificación de epitomo por ELISA competitiva

Los anticuerpos obtenidos se clasificaron de acuerdo con los epítopos por un ELISA competitivo. Los anticuerpos se biotinilaron usando un Kit de Marcaje con Biotina (Roche). La forma soluble de proteína de núcleo GPC3 se diluyó hasta 1 \mug/ml con el tampón de recubrimiento y se añadió una placa a 100 \mul/pocillo y se almacenó a 4ºC durante una noche para recubrir la placa. Al día siguiente, se añadieron 200 \mul del tampón de sustrato para el bloqueo. La placa se dejó a 4ºC durante una noche o más y se añadió un anticuerpo anti-GPSC3 a la placa a 100 \mul/pocillo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de eso, sin lavar la placa, se añadieron 10 \mul de 10 \mug/ml de anticuerpo anti-GPC3 marcado con biotina y se hizo reaccionar adicionalmente durante 1 hora. La placa se lavó con 300 \mul/pocillo del tampón de aclarado 3 veces. Un conjugado de estreptavidina-AP (ZYMED) se diluyó a 1000 veces con el tampón de dilución y se añadió a 100 \mul/pocillo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó con 300 \mul/pocillo del tampón de aclarado 5 veces. SIGMA 104 se diluyó a 1 mg/ml con el tampón de sustrato y se añadió a 100 \mul/pocillo. Después de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, se midió la absorbancia (a 405 nm, longitud de onda de referencia de 655 nm).

Los resultados del ELISA competitivo se muestran en la Figura 2. Como para el anticuerpo que inhibió competitivamente la unión del anticuerpo biotinilado en el 50% o más, se consideró que sus epítopos se sitúan juntos cerca en la conformación tridimensional. Como resultado de la clasificación de acuerdo con el patrón de inhibición competitiva del desarrollo de color frente a la unión de los 8 tipos de anticuerpo biotinilados, los 11 clones procedían del ratón inmunizado con una forma soluble de GPC3 y se clasificaron en 5 grupos (a, b, c, d y e) (Figura 16).

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Ejemplo 11 Clasificación de Epítopos por transferencia Western

La forma soluble de la proteína de núcleo GPC3 se aplicó a una mini SDS-PAGE al 10% (TEFCO) y se realizó una electroforesis en condiciones reductoras. Se transfirió a Immobilon-P (Millipore) usando una Celda de Transferencia Electroforética Semi-Seca Trans-Blot SD (BIO-RAD). Después de que la membrana se lavó brevemente con TBS-T (Tween 20 al 0,05%, TBS), se agitó en TBS-T que contenía leche desnatada al 5% durante una hora. La membrana se agitó en TBS-T aproximadamente 10 minutos, después se añadió a cada anticuerpo anti-GPC3 se diluyó con TBS-T que contenía leche desnatada al 1% y la membrana se agitó durante una hora. La membrana se lavó con TBS-T y se agitó en la solución de anticuerpo HRP-anti IgG de ratón (Amersham) diluída con TBS-T que contenía leche desnatada al 1% durante una hora y después se lavó con TBS-T. El desarrollo de color se realizó utilizando ECL-Plus (Amersham) y se detectó usando Hyperfilm ECL (Amersham).

Como se muestra en la Figura 3, L9G11 se determinó que era un anticuerpo que se unía al lado del N terminal porque se unió a la banda de aproximadamente 40 kDa. Se determinó que M3C11 era un anticuerpo que se unía al lado C terminal porque se unió a la banda de aproximadamente 30 kDa. Todos los anticuerpos que pertenecían al grupo c, d o e basándose en el ELISA competitivo se unieron al lado N terminal y todos los que pertenecían a los grupos a ó b se unieron al lado C terminal (Figura 16). L9G11 tuvo sensibilidad de detección más alta en la transferencia de Western en los otros anticuerpos que se unieron al lado N terminal, lo que sugirió que ese anticuerpo es útil para detectar el fragmento N terminal por transferencia de Western.

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Ejemplo 12 Detección de la forma secretada de GPC3

Puesto que se descubrió que GPC3 se excinde en el resto de aminoácido 358º o el resto de aminoácido 374º, los inventores formularon la hipótesis de que una forma secretada de GPC3 se secreta en la sangre de un paciente con cáncer hepático. Por lo tanto, un sistema de ELISA de sándwich de GPC3 se construyó para detectar una forma secretora de GPC3.

Se recubrió una inmunoplaca con un anticuerpo anti-GPC3 a 10 \mug/mL y se bloqueó por el tampón de sustrato. Después la inmunoplaca se almacenó durante varias horas a temperatura ambiente o durante una noche a 4ºC, se añadió el sobrenadante del cultivo de HepG2 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La inmunoplaca se lavó a con 300 PL/pocillo del tampón de aclarado 3 veces y se añadió un anticuerpo anti-GPC3 marcado con biotina diluido a 10 \mug/mL y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Se lavó la inmunoplaca con 300 \mul/pocillo del tampón de aclarado 3 veces, y se añadió una APestreptavidina y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Se lavó la inmunoplaca con 300 \mul/pocillo del tampón de aclarado 5 veces. Se desarrolló el color usando AMPAK (DAKO) de acuerdo con el protocolo adjunto y se midió la absorbancia usando un lector de microplacas. Los anticuerpos que se unían al lado N terminal (M6B1, M19B11 y M18D4) y aquellos que se unían al lado C terminal (M3C11, M13B3 y M3B8) se combinaron para construir cinco sistemas de ELISA de sándwich. Cada una de esas combinaciones mostró una sensibilidad equivalente en la curva patrón usando la forma secreta de GPC3. Estos sistemas se evaluaron usando el sobrenadante de cultivo de HepG2. La forma secretada de GPC3 se detectó a una concentración alta de aproximadamente 1 \mug/mL con una combinación de los anticuerpos que se unían al lado N terminal (Figura 4). La concentración detectada con una combinación de los anticuerpos que se unían al lado C terminal fue baja, lo que sugirió que el fragmento N terminal estaba presente de manera dominante en la forma secretada de
GPC3.

Posteriormente, el sobrenadante de cultivo de HepG2 se inmunoprecipitó usando un anticuerpo anti-GPC3 para detectar la forma secretada de GPC3. En el caso en el que se usó M10D2 que se une al fragmento N terminal, se detectó la forma secretada de GPC3 de 40 kDa (Figura 5). Por otro lado, en el caso en el que se usó M1E7 que se unía al fragmento C terminal, no se detectó la forma secretada de GPC3. El ensayo de inmunoprecipitación se realizó para todos los anticuerpos de GPC3 sostenidos. Cada anticuerpo que se une al fragmento N terminal detectó fuertemente la forma secretada de GPC3, mientras que la forma secretada de GPC3 no se detectó o se detectó débilmente con el uso de anticuerpos que se unían al fragmento C terminal (Figura 16). El anticuerpo que puede detectar la forma secretada de GPC3 por inmunoprecipitación se espera que sea útil como un anticuerpo para diagnosticar hepatoma. Además, el anticuerpo que puede detectar escasamente la forma secretada de GPC3 se espera que sea útil en el desarrollo de un anticuerpo terapéutico que tenga una actividad ADCC y una actividad CDC, puesto que dicho anticuerpo puede migrar a la lesión de hepatoma sin quedar atrapado en la forma secretada de GPC3 presente en la sangre.

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Ejemplo 13 Clonación de la región variable de anticuerpo anti-GPC3

Una región variable del anticuerpo anti-GPC3 se amplificó por el método RT-PCR usando el ARN total extraído de un hibridoma que producía anticuerpo anti-GPC3. El ARN total se extrajo de 1 x 10^{7} del hibridoma con el uso de Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN). Usando 1 \mug del ARN total, el fragmento génico 5'-terminal se amplificó con el uso de un Kit de Amplificación de ADNc SMART RACE (CLONTECH) y cualquiera de los siguientes oligonucleótidos sintéticos:

un oligonucleótido sintético MHC-IgGl complementario a la secuencia de una región constante de una IgGl de ratón:

: GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG (SEC ID Nº 7);

un oligonucleótido sintético MHC-IgG2a complementario de la secuencia de una región constante de una IgG2a de ratón:

: CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG (SEC ID Nº 8);

un oligonucleótido sintético MHC-IgG2b complementario a la secuencia de una región constante de la IgG2b de ratón:

: CAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATG (SEC ID Nº 9); y

un oligonucleótido kappa sintético complementario a la secuencia de una región constante de una cadena kappa de ratón:

: GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (SEC ID Nº 10).

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Una reacción de transcripción inversa se realizó a 42ºC durante 1 hora y 30 minutos. La mezcla de PCR (50 \mul) contenía 5 \mul de tampón de PCR Advantage 10x, 5 \mul de mezcla de Cebador Universal A 10x, de dNTPs 0,2 mM (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 1 \mul de mezcla de Polimerasa Advantage 2 (todos de CLONTECH), 2,5 \mul del producto de la reacción de transcripción inversa y 10 pmol de el oligonucleótido sintético MHC-IgGl, MHC-IgG2a, MHC-IgG2b o kappa. Se realiza la PCR con 5 ciclos que consistían de 30 segundos a 94ºC, 5 segundos a 94ºC, y 3 minutos a 72ºC, 5 ciclos que consistían de 5 segundos a 94ºC, 10 segundos a 70ºC y 3 minutos a 72ºC y 25 ciclos que consistían en 5 segundos a 94ºC 10 segundos a 68ºC y 3 minutos a 72ºC. Finalmente, el producto de reacción se calentó a 72ºC durante 7 minutos cada producto de PCR se purificó a partir del gel de agarosa usando un Kit de Extracción en Gel QIAquick (QIAGEN), clonado en el vector pGEM-T Easy (Promega) y se determinó la secuencia de
nucleótido.

La secuencias de nucleótidos de las regiones variables cadena H de M3C11, M13B3, MlE7, M3BB, M11F1, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, M10D2 y L9G11 se muestran en SEC ID Nº 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de las mismas se muestran en SEC ID Nº 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de las regiones variables de cadena L de las mismas se muestran en las SEC ID Nº 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 y 43, respectivamente y las secuencias de aminoácidos de las mismas se muestran en las SEC ID Nº 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 y 54,
respectivamente.

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Ejemplo 14 Clasificación de Epítopos usando la proteína de fusión GST

Para realizar un análisis detallado de los epítopos para los anticuerpos que se unen al fragmento C terminal, se prepararon las proteínas de fusión de péptidos C terminal acortados de manera sucesiva de GPC3 con GST, concretamente GC-1 (de Ser495 a Lys563), GC-2 (de Gly510 a Lys563), GC-3 (de Ala524 a Lys563), GC-4 (de Gly537 a Lys563) y GC-5 (de Ser550 a Lys563). La región C terminal de GPC3 se clonó en pGEX-4T-3 (Amersham) para construir un ADN plasmídico en la que la región C-terminal de GPC3 se une al lado C-terminal de GST. El ADN plasmídico se introdujo en DH5\alpha, por lo que se obtuvo un transformante. Después, se añadió IPTG a un 1 mM a un cultivo del transformante de la fase de crecimiento logarítmico para inducir la expresión de una proteína de fusión GST. Las células bacterianas se recogieron después de 2 horas de cultivo. Se homogenizaron las células por sonicación y se centrifugaron a 35,000 rpm durante 30 minutes con la ultracentrífuga XL-80 (Beckman, rotor 70.1 Ti). Después, se recuperó el sobrenadante de cultivo y se purificó con Módulos de Purificación GST (Amersham). Las proteínas de fusión GST purificadas de esta manera se separaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras y se realizó una transferencia de Western con los anticuerpos anti-GPC3 (Figura 6). M3C11 y M1E7 detectaron GC-1 y GC-2, mientras que no detectaron GC-3, GC-4 y GC-5, lo que indicó que los epítopos de estos anticuerpos están contenidos en la región de GC-2 y que la región de GC-3 no es suficiente. M3B8 y M11F1 detectaron GC-1 GC-2, GC-3 y GC-4, mientras que no detectaron GC-5, lo que indicó que los epítopos de estos anticuerpos están contenidos en la región de GC-4 y que la región de GC-5 no es suficiente. La región mínima de la proteína de fusión GST a la que se puede unir cada anticuerpo se enumera en la columna encabezada por "transferencia Western" de la Figura
16.

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Ejemplo 15 Preparación de anticuerpo quimérico ratón-ser humano anti-GPC3

Las secuencias de las regiones variables de la cadena H y la cadena L de los anticuerpos anti-GPC3 se unieron a las secuencias de unas regiones constantes de cadena kappa e IgG1 humana. Se realizó una PCR usando un oligonucleótido sintético, que es complementario a la secuencia de nucleótidos 5'-terminal de la región variable de cadena H de cada anticuerpo y tiene una secuencia Kozak y un oligonucleótido sintético, que es complementario a la secuencia de nucleótidos de 3'-terminal y tiene un sitio NheI. El producto de PCR obtenido se clonó en un vector pB-CH en el que se insertó una región constante de IgG1 en el vector pBluescript KS(+) (Toyobo). La región variable de la cadena de ratón H y la región constante de la cadena humana H (\gamma1) están unidas por el sitio NheI. El fragmento génico de la cadena H preparado se clonó en un vector de expresión, pCXND3. Por otro lado, se realizó una PCR usando un oligonucleótido sintético, que es complementario a la secuencia nucleótido 5'-terminal de la región variable de la cadena L de cada anticuerpo y tiene una secuencia Kozak y un oligonucleótido sintético que es complementario a la secuencia de nucleótidos 3'-terminal y tiene un sitio BsiWI. El producto de PCR obtenido se clonó en un vector pB-CL en el que la región constante de la cadena kappa humana se insertó en un vector pBluescript KS (+) (Toyobo). La región variable de la cadena L humana y la región constante están unidas por el sitio BsiWI. El fragmento génico de la cadena L preparado se clonó en un vector de expresión, pUCAG. Este vector pUCAG se obtuvo clonando un fragmento de 2,6 kbp obtenido digiriendo pCXN (Niwa et al., Gene 1991: 108: 193-200) con una enzima de restricción BamHI en el sitio BamHI del vector pUC19 (Toyobo).

Para preparar un vector de expresión para un anticuerpo quimérico ratón-ser humano anti-GPC3, se obtuvo un fragmento génico digiriendo el vector pUCAG que contenía el fragmento génico de la cadena L con la enzima de restricción HindIII (Takara Shuzo) y se clonó en el sitio HindIII de el pCXND3 que contenía el gen de la cadena H. Este plásmido expresará un gen de resistencia a neomicina, el gen DHFR y un anticuerpo quimérico ratón-ser humano anti-GPC3 en una célula animal.

Se preparó una línea celular CHO (línea celular GD44) que expresaba establemente el anticuerpo de la siguiente manera. El gen se introdujo en las células por el método de electroporación usando un Gene Pulser II (Bio-Rad). Una mezcla obtenida mezclando 25 \mug del vector de expresión de cada anticuerpo quimérico ratón-ser humano anti-GPC3 y 0,75 mL de una solución de células CHO suspendidas en PBS (1 x 10^{7} células/mL) se enfrió en hielo durante 10 minutos y se transfirió a una cubeta. Después, se aplicó un pulso a 1,5 kV y una capacitancia de 25 \muFD. Después de un periodo de recuperación de 10 minutos a temperatura ambiente, las células que se habían sometido a electroporación se resuspendieron en 40 mL de medio CHO-S-SFM II (Invitrogen) que contenían complemento 1xHT (Invitrogen). Se diluyó la suspensión a 50 veces con el mismo medio y se distribuyó en de 24 horas en una incubadora de CO_{2} (CO_{2} al 5%), se añadió Geneticina (Invitrogen) a 0,5 mg/mL y se cultivaron las células durante dos semanas. El sobrenadante de cultivo se tomó de los pocillos que tenían una colonia celular transformada resistente a Geneticina y se midió la cantidad de IgG por el método de determinación de la concentración descrito a continuación. Una línea celular con producción alta se expandió sucesivamente para obtener una línea celular que expresaba establemente un anticuerpo quimérico ratón-ser humano anti-GPC3. La línea celular se cultivó a gran escala y se recogió el sobrenadante del cultivo. La purificación de cada anticuerpo quimérico ratón-ser humano anti-GPC3 se realizó usando Hi Trap ProteinG HP (Amersham).

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Ejemplo 16 Medida de la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (actividad CDC) 16.1 Preparación de tampón veronal albumina humana (HAVB)

Se disolvieron en agua milli-Q 12,75 g de NaCl (calidad más alta, Wako Pure Chemicals), 0,5625 g de Na-Barbital (calidad más alta, Wako Pure Chemicals) y 0,8625 g de Barbital (calidad más alta, Wako Pure Chemicals) a un volumen final de 200 mL y se esterilizaron en autoclave a 121ºC durante 20 minutos. Después, se añadieron 100 mL de agua milli-Q caliente esterilizada en autoclave. El pH fue 7,43 (recomendado pH: 7,5). Se usó la solución como un tampón veronal 5x. Se disolvieron 0,2205 g de CaCl_{2}.2H_{2}O (calidad más alta, Junsei Chemical) en 50 mL de agua milli-Q, a una concentración final de 0,03 mol/l, que se usó como una solución de CaCl_{2}. Se disolvieron 1,0165 g de MgCl_{2}.6H_{2}O (calidad más alta, Junsei Chemical) en 50 m/L de agua milli-Q a una concentración final de 0,1 mol/l, que se usó como una solución de MgCl_{2}. Se disolvieron en agua milli-Q, 100 mL del tampón veronal 5x, 4 mL de albúmina sérica humana (25% de Buminato (marca registrada), la concentración de albúmina sérica humana: 250 mg/mL, Baxter Healthcare), 2,5 mL de la solución de CaCl_{2}, 2,5 mL de la solución MgCl_{2}, 0,1 g de KCl (calidad más alta, Junsei Chemical), 0,5 g de glucosa (D(+)- glucosa, glucosa anhídrida, calidad más alta, Wako Pure Chemical) a un volumen final de 500 mL, que se usó como HAVB. Después de la esterilización por filtro, se almacenó el HAVB a una temperatura prefijada de 5ºC.

16.2 Preparación de la célula diana

La célula CHO que expresaba GPC3 humanos de longitud total preparada en el Ejemplo 4 se cultivó en medio \alpha-MEM que contenía ácido nucleico (+) (GIBCO) complementado con FBS al 10% y 0,5 mg/mL de Genetina (GIBCO). Se disociaron las células de la placa usando un tampón de disociación celular (Invitrogen Corp) dispensado a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos (Falcon) a 1 x 10^{4} células/pocillos y se cultivó durante tres días. Después del cultivo, se añadieron 5,55 MBq de cromo-51 y las células se cultivaron en una incubadora de gas de dióxido de carbono al 5% a 37ºC durante una hora. Estas células se lavaron con HAVB dos veces y se añadió 50 \mul de HAVB y se usó como una célula diana.

16.3 Ensayo de liberalización de Cromo (actividad CDC)

Cada anticuerpo quimérico se diluyó con HAVB para preparar una solución de anticuerpos de 40 \mug/mL. Se añadieron 50 \mul de cada solución de anticuerpos para la célula diana y se dejaron en hielo durante 15 minutos. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 100 \mul del suero humano de la sangre periférica de un voluntario sano, que se había diluido con HAVB a una concentración final del 25% (la concentración final de anticuerpo: 10 \mug/mL) se dejó en una incubadora de gas de dióxido de carbono al 5% a 37ºC durante 90 minutos. Después de que se centrifugara la placa, se recogieron 100 \mul de sobrenadante de cada pocillo, se midió la radiactividad usando un contador gamma. La velocidad de liberación de cromo específica se obtuvo por la siguiente fórmula.

Velocidad de liberación de cromo específica (%) = (A-C) x 100/(B-C)

"A" representa la radiactividad (cpm) en cada pocillo, "B" representa el valor medio de radiactividades (cpm) en los pocillos en los que se añadieron 100 \mul de solución acuosa de NP-40 al 2% (Nonidet P-40, Código Nº 252-23, Nacalai Tesque) y 50 \mul de HAVB a la célula diana y "C" representa el valor medio de las radiactividades (cpm) en los pocillos en los que se añadieron 150 \mul de HAVB a las células diana. El ensayo se realizó por triplicado y el valor medio y la desviación estándar se calcularon para la actividad CDC (%).

Los resultados se muestran en la Figura 7. Entre los 9 tipos de los anticuerpos quiméricos anti-GPC3, M3B8 y M11F1 que son unos anticuerpos que reconocen el lado C terminal, mostraron una actividad CDC fuerte frente a las células CHO que expresaban GPC3, sin embargo, la actividad CDC no se observó en los otros anticuerpos. M3B8 y M11F1 pertenecen al grupo llamado "b" basándose en ELISA competitivo y se podría encontrar un epítopo importante para mostrar una actividad CDC fuerte.

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Ejemplo 17 Medida de la actividad ADCC usando PBMC derivados de sangre periférica humana 17.1. Preparación de la solución de PBMC humana

La sangre periférica heparinizada obtenida de un voluntario sano se diluyó dos veces con PBS (-) y se aplicó una capa en Ficoll-Paque TM PLUS (Amersham). Después de la centrifugación a 500 x g durante 30 minutos a 20ºC, se recogió la capa del medio, que es la fracción de leucocitos mononucleares. Se lavó 3 veces a las células, se suspendió en SFB/RPMI a un 10% y se usaron como una solución de PBMC humanas.

17.2. Preparación de células diana

Las células HepG2 cultivadas en medio FBS/RPMI 1640 al 10% se disociaron de la placa usando tripsina-EDTA (Invitrogen), se distribuyeron a cada pocillo de una placa de fondo en U de 96 pocillos (Falcon) a 1 x 10^{4} células/pocillo y se cultivaron durante 2 días. Las células CHO que expresaban GPC3 de longitud total humana preparadas en el Ejemplo 4 se cultivaron en medio \alpha-MEM con ácidos nucleicos (+)(GIBCO) complementado con FBS al 10% y 0,5 mg/ml Geneticina (GIBCO). Las células se disociaron de la placa usando un tampón de disociación celular (Invitrogen Corp.) distribuyendo a cada pocillo una placa de fondo plano de 96 pocillos (Falcon) a 1 x 10^{4} células/pocillo y se cultivó durante 3 días. Se añadió cromo-51 (5,55 MBq) a cada célula y las células se cultivaron en una incubadora de gas de dióxido de carbono al 5% a 37ºC durante 1 hora. Estas células se lavaron el medio una vez y se añadió 50 \mul de SFB/RPMI 1640 al 10% y se usó como una célula diana.

17.3 Ensayo de liberación de cromo (Actividad ADCC)

Se añadieron para la célula diana 50 \mul de una solución de anticuerpos preparada a concentraciones diferentes y se hicieron reaccionar en hielo durante 15 minutos. Posteriormente, se añadieron 100 \mul de la solución de PBMC humanas a 5 x 10^{5} células/pocillo y las células se cultivaron en una incubadora de gas de dióxido de carbono al 5% a 37ºC durante 4 horas. Después del cultivo, se centrifugó la placa, y se midió la radiactividad en 100 \mul del sobrenadante cultivo usando un contador gamma. La velocidad de liberación de cromo específica se obtuvo por la siguiente
fórmula.

Velocidad específica de liberación cromo (%) = (A-C) x 100/(B-C)

"A" representa el valor medio de las radiactividades (cpm) en cada pocillo, "B" representa el valor medio de las radiactividades (cpm) en los pocillos en los que se añadieron 100 \mul de solución acuosa de NP-40 al 2% (Nonidet P-40, Código Nº 252-23, Nacalai Tesque) y 50 \mul de medio SFB/RPMI al 10% a la célula diana y "C" representa el valor medio de las radiactividades (cpm) en los pocillos en los que se añadieron 150 \mul de medio FBS/RPMI al 10% a la célula diana. El ensayo se realizó por triplicado y el valor medio y la desviación estándar se calcularon respecto a la actividad ADCC (%). Se muestran los resultados en la Figura 8. Entre 9 tipos de los anticuerpos quiméricos anti-GPC3, los anticuerpos que reconocerán el lado C terminal tienen una tendencia a mostrar una actividad ADCC
fuerte.

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Ejemplo 18 Inmunización con GC-3 y selección de hibridomas

Entre los anticuerpos anti-GPC3 obtenidos, solo M11F1 y M3B8 mostraron una actividad CDC fuerte, lo que indicó que la actividad CDC es dependiente epítopo. Para obtener un anticuerpo que tiene tanto actividad ADCC como actividad CDC, se usó una proteína de fusión GST que contiene el epítopo para M11F1 y M3B8, denominado GC-3 para la inmunización. Una gran cantidad de GC-3 se purificó por el método mencionado anteriormente. El tampón se cambió a PBS por filtración en gel usando Superdex 75 (Amersham). El producto obtenido se usó como una inmunoproteína. Usando tres ratones Balb/c (obtenidos de Charles River Japan, Inc.) y 3 ratones MRL se inmunizaron con GC-3 de acuerdo con el método mencionado anteriormente. Para la primera inmunización, se preparó GC-3 a 100 \mug/individuo y sé emulsionó usando FCA, que se administró por vía subcutánea. Dos semanas más tarde, se preparó GC-3 a 50 \mug/individuo y se emulsionó usando FIA que se administró por vía subcutánea. Después de la quinta inmunización, la inmunización final (50 \mug/individuo) se realizó para todos los ratones administrándoles por vía intravenosa la inmunoproteína por medio de la cola. Después de la fusión celular, se seleccionaron los hibridomas mediante un ELISA usando una inmunoplaca recubierta con la forma soluble de la proteína de núcleo GPC3. Se monoclonó un clon positivo por el método de dilución limitante. Como resultado, se obtuvieron cinco clones de anticuerpos (GC199, GC202, GC33, GC179 y GC194) que tenían una actividad de unión fuerte frente a
GPC3.

El anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante de cultivo del hibridoma usando un Hi Trap ProteinG HP, y se analizó de acuerdo con el método mencionado anteriormente. El valor CE50 se calculó por un ELISA usando una inmunoplaca recubierta con la forma soluble de la proteína de núcleo GPC3 y el valor de modo X del histograma a 5 \mug/ml; se midió por citrometría de flujo (Figura 17). De acuerdo con la clasificación de epítopos por un ELISA competitivo, los anticuerpos se clasificaron en el grupo b (GC199, GC202 y GC33) y un nuevo grupo de epítopos f (GC179 y GC194). La clasificación de epítopos usando las proteínas de fusión GST indicó que GC1999, GC202 y GC33 detectaron GC-1, GC-2, GC-3 y GC-4, pero no detectaron GC-5, lo que sugirió que los epítopos para esos anticuerpos estaban contenidos en la región de GC-4 del mismo modo que los epítopos para M11F1 y M3B8 y que la región de GC-5 no es suficiente. Por otro lado, GC179 y GC194 detectaron GC-1, GC-2 y GC-3, pero no detectaron GC-4 y GC-5, lo que sugiere que los epítopos para estos anticuerpos están contenidos en la región de CG-3 y que la región de GC-4 no es suficiente. La región mínima de la proteína de fusión GST a la que se puede unir cada anticuerpo se enumera en la columna encabezada por "Transferencia de Western" de la Figura 17.

La regiones variables de la cadena H y la cadena L de GC-199, GC-202, GC33, GC179 y GC194 se clonaron de acuerdo con el método mencionado anteriormente y se determinaron sus secuencias. Como para la cadena L de GC194, se clonaron dos tipos de secuencias. Las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de la cadena H de GC199, GC202, GC33, GC179 y GC194 se muestran en las SEC ID Nº: 55, 56, 57, 58 y 59 respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de las mismas se muestran en SEC ID Nº: 60, 61, 62, 63 y 64, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de la cadena L de GC199, GC202, GC33, GC179 y GC194(1) y GC194(2) se muestran en las SEC ID Nº: 65, 66, 67, 68, 69 y 70 respectivamente y las secuencias de aminoácidos de los mismos se muestran en las SEC ID Nº: 71, 72, 73, 74, 75 y 76, respectivamente.

Adicionalmente, estas secuencias de aminoácidos se examinan respecto a la homología comparando con las bases de datos de las secuencias de aminoácidos de anticuerpos conocidos, por lo que sus regiones CDR se determinan de la siguiente manera.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 19 Medida de la actividad ADCC usando células efectoras que proceden de médula ósea de ratón 19.1 Preparación de solución de células efectoras que proceden de médula ósea de ratón

Se recogieron células de médula ósea del fémur de un ratón SCID (CLEA Japan, Inc., macho, 10 semanas de edad) y se suspendieron en medio FBS/RPMI 1640 al 10% al 5 x 10^{5} células/ml. Los ratones GM-CSF (PeproTech) e IL-2 humana (PeproTech) se añadieron a 10 ng/ml y 50 ng/ml, respectivamente y las células se cultivaron en una incubadora de gas de dióxido de carbono al 5% a 37ºC durante 5 días. Después del cultivo, las células se rasparon con un raspador y se lavaron con el medio una vez. Después las células se suspendieron en medio FBS/RPMI 1640 al 10% a 5 x 10^{6} células/ml y se usaron como una solución de células efectoras que procedían de médula ósea de
ratón.

19.2 Preparación de la célula diana

Una línea celular de hepatoma humano, HuH-7, se mantuvo y subcultivó con el medio DMEM (SIGMA) que contenía FBS al 10% (ThermoTrace). Las células se disociaron de la placa usando Tampón de Disociación Celular (Invitrogen), se distribuyeron a cada pocillo de placas de fondo en U de 96 pocillos (Falcon) a 1 x 10^{4} células/pocillo y se cultivaron durante 1 día. Después del cultivo, se añadieron 5,55 MBq de cromo-51 y las células se cultivaron en una incubadora de gas de dióxido de carbono al 5% a 37% durante 1 hora. Estas células se lavaron con el medio una vez y se añadieron 50 \mul de medio FBS/RPMI 1640 al 10% y se usaron como una célula diana.

19.3 Ensayo de liberación de Cromo (Actividad ADCC)

Se añadieron 50 \mul a la célula diana de una solución de anticuerpos preparada a diferentes concentraciones y se hicieron reaccionar en hielo durante 15 minutos. Posteriormente, se añadieron 100 \mul de una solución de células efectoras que procedían de médula ósea de ratón (5 x 10^{5} células/pocillo) y se cultivaron las células en una incubadora de gas de dióxido de carbono al 5% a 37ºC durante 4 horas. Después del cultivo, se centrifugó la placa y se midió la radiactividad en 100 \mul del sobrenadante de cultivo usando un contador gamma. La velocidad de liberación de cromo específica se obtuvo por la fórmula.

Velocidad de liberación de cromo específica (%) = (A-C) x 100/(B-C)

"A" representa el valor medio de las radiactividades (cpm) en cada pocillo, "B" representa el valor medio de las radiactividades (cpm) en los pocillos en los que se añadieron 100 \mul de solución acuosa de NP-40 al 2% (Nonidet P-40, Código Nº 252-23, Nacalai Tesque) y se añadieron 50 \mul de medio FBS/RPMI al 10% a la célula diana y "C" representa el valor medio de las radiactividades (cpm) en los pocillos en los que se añadieron 150 \mul de medio FBS/RPMI al 10% a la célula diana. El ensayo se realizó por triplicado y se calcularon el valor medio y la desviación estándar para la actividad ADCC (%).

Los resultados se muestran en la Figura 9. Se desveló que el anticuerpo GC33 muestra una actividad ADCC cuando la concentración del anticuerpo es 0,1 \mug/ml o mayor y muestra actividad más fuerte que el anticuerpo GC199.

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Ejemplo 20 Actividad antitumoral del anticuerpo GC33 frente al modelo de ratón trasplantado con hepatoma humano 20.1 Preparación del modelo de ratón trasplantado con hepatoma humano

Una línea celular de hepatoma humano, HuH-7 se preparó a 5 x 10^{7} células/ml en una solución que contenía medio de DMEM y MATRIGEL (BD Bioscience) a una relación de 1:1. El día anterior, se administraron por vía introperitoneal 100 \mul de una solución de anticuerpos anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemicals, se disolvió un vial con 1 ml de agua destilada para inyección después se añadió 4 ml de suero fisiológico) a un ratón SCID (macho, 5 semanas de edad, CLEA Japan, Inc.). Se trasplantaron 100 \mul de la suspensión celular mencionada anteriormente (5 x 10^{6} células/ratón) al ratón por vía subcutánea en el área abdominal.

20.2 Preparación y administración de anticuerpo

Empezando el día 20 después del trasplante celular, se administró una solución de anticuerpo preparada el día de la administración al 0,5 mg/ml (grupo de administración de 5 mg/kg) y 0,1 mg/ml (grupo de administración de 1 mg/kg) con PBS(-) al modelo de ratón trasplantado con células de hepatoma humano a 10 ml/kg por medio de la vena de la cola una vez a la semana durante 3 semanas. Como control negativo, se administró PBS(-) (vehículo) a 10 ml/kg por medio de la vena de la cola una vez a la semana durante 3 semanas de un modo similar. Ambos grupos consistieron en 6 ratones cada uno.

20.3 Evaluación del efecto antitumoral

El efecto antitumoral del anticuerpo GC33 en el modelo del ratón trasplantado con células de hepatoma humanos se evaluó con el cambio en el volumen tumoral con el tiempo y el peso del tumor una semana después de la administración final. El volumen tumoral se calculó por la siguiente fórmula.

Volumen tumoral = (eje mayor) x (eje menor) x (eje menor)/2

Como se muestra en la Figura 10, se observo una inhibición significativa del crecimiento tumoral en el grupo de anticuerpos GC33 en comparación con el grupo de vehículo.

Consecuentemente, se mostró que GC33 tenía un efecto antitumoral en el modelo de ratón trasplantado con células de hepatoma humano.

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Ejemplo 21 Preparación del anticuerpo quimérico ratón-ser humano GC33

Se amplificaron la cadena H y la cadena L de GC33 por PCR usando un oligonucleótido sintético, que es complementario a la secuencia de nucleótidos 5' terminal y tiene una secuencia Kozak y un sitio HindIII y un oligonucleótido sintético, que es complementario a la secuencia de nucleótidos 3' terminal y tiene un sitio BamHI. Después de la digestión con HindIII y BamHI, el producto PCR obtenido se clonó en un vector de expresión, HEFg\gamma1, en el que se insertó una región constante de IgG1 humana y un vector de expresión HEFg\kappa, en el que se insertó una región constante de cadena kappa (Sato et al., Mol Immunol. 1994:371-381). Se introdujeron los vectores en una célula CHO (línea celular DG44) de acuerdo con el método mencionado anteriormente y se estableció una línea celular de expresión estable. El anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante de cultivo usando Hi Trap ProteinG HP (Amersham). La concentración de IgG en el sobrenadante de cultivo se midió por un ELISA de sándwich de IgG humana usando anti-IgG humana de cabra (BIOSOURCE) y un conjugado de fosfatasa alcalina anti-IgG humana de cabra (BIOSOURCE)) y se determinó la concentración por la comparación con una IgG humana disponible en el mercado (Cappel).

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Ejemplo 22 Medida de la actividad CDC y actividad ADCC usando un anticuerpo quimérico ratón-ser humano GC33

De acuerdo con los métodos descritos Ejemplos 16 y 17, se midieron las actividades de CDC y actividades ADCC de los anticuerpos quiméricos ratón-ser humano de GC 33, M3C11 y M1E7. Como para la célula diana, la célula CHO que expresaba GPC3 de longitud total se usó para medir la actividad CDC y HepG2 se usó para medir la actividad ADCC. Los resultados se muestran en la Figura 11 y Figura 12, respectivamente. Se desveló que, en cada uno de los sistemas de ensayo, GC33 muestra una actividad CDC y actividad ADCC fuertes en comparación con los otros dos anticuerpos.

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Ejemplo 23 Análisis de Epítopos para GC33

Para determinar el epítopo GC33 en detalle, se prepararon proteínas de fusión de un péptido C terminal más corto de GPC3 y GST y se analizaron por transferencia de Western. Las secuencias de péptidos que procedían de GPC3 contenidas en la proteína de fusión GST se muestra en la Figura 13. Puesto que GC33 se puede unir a GC-4 (aa 537-563), pero no se puede unir a GC-5 (aa 550-563), se consideró que el epítopo se localiza la región que contiene al menos parte de la región de 537-550 aa. Primero, se prepararon los péptidos GC-6 (GNSQQATPKDNEIS (SEC ID Nº:93)), GC-7 (GNSQQATP (SEC ID Nº:94)), GC-8 (QQATPKDN (SEC ID Nº: 95)) y GC-9 (TPKDNEIS (SEC ID Nº:96)). Se prepararon un oligo de ADN directo y un oligo de ADN inverso los cuales se diseñaron de un modo que el sitio de escisión de la secuencia de reconocimiento de EcoRI está unido al extremo 5' y el sitio de escisión de la secuencia reconocimiento de SalI está unido al extremo 3', respectivamente. La síntesis de los oligos de ADN se realizó por Espec Oligo Service. Se purificó el ADN con un cartucho C-18, se fosforiló en el extremo 5' y se usó para el análisis. Se mezclaron veinticinco microlitros del oligo de ADN directo (10 \muM) y 25 \mul del oligo de ADN inverso (10 \muM) y se hicieron reaccionar durante 5 minutos a 94ºC, durante 10 minutos a 37ºC y durante 15 minutos a temperatura ambiente, después se dejaron durante 10 minutos a 4ºC para que hibridaran el oligo de ADN directo y el oligo de ADN inverso. La concentración de los oligos se determinó por la medida de la absorbancia a la relación molar de inserto frente a vector de 3:1. Se clonaron los oligos en pGEX4T-3 digerido por EcoRI y SaII y la secuencia de nucleótidos se confirmó. Se preparó una proteína de fusión GST de acuerdo con el método mencionado anteriormente y se purificó usando Gluthatione Sepharose 4B. Las proteínas purificadas se separaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras y se analizaron por transferencia de Western usando GC33. Como resultado, el anticuerpo GC33 no podía detectar proteína de fusión GST fuertemente, lo que sugirió que una secuencia más larga en el lado C terminal se necesita para la unión de GC33 (Figura 14). Basándose en la predicción anterior, GC-11 (ATPKDNEIST (SEC ID Nº:97)), GC-12 (PKDNEISTFH (SEC ID Nº:98)), GC-13 (DNEISTFHNL (SEC ID Nº: 99)) y GC-14 (EISTFHNLGN (SEC ID Nº: 100)), se prepararon y evaluaron del mismo modo. Como resultado, unión más fuerte de GC-11, GC-12 y GC-13 a GC33, lo que sugiere que el epítopo para GC33 se localice la secuencia de 544º a 553º (P K D N E I S T F H) en el extremo C de GPC3.

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Ejemplo 24 Humanización de GC33

Los datos de la secuencia anticuerpo se obtuvieron de la base de datos Kabat desvelada públicamente
(ftp:ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) y de la base de datos de ImMunoGene Tics (IMGT). La región variable de cadena H y la región variable de cadena L se sometieron por separado a búsqueda de homología. Como resultado, la región variable de cadena H se descubrió que tenía una alta homología con DN13 (Smithson et al., Mol Immunol. 1999:36: 113-124) y la región variable de cadena L se descubrió que tenía un alta homología con el ARNm de IGK de homo sapiens para la región VLJ de cadena ligera kappa de inmunoglobulina, cds parcial, clon: K64 de número de acceso AB064105. La secuencia de señal del número de acceso de S40357 que tiene una alta homología con AB064105 se usó como la secuencia de señal de la cadena L. La determinación de la región de la complementariedad (en lo sucesivo denominada CDR) de GC33 se trasplantó en las regiones de fase de lectura (en lo sucesivo denominadas FR) de estos anticuerpos humanos para preparar un anticuerpo humanizado.

Específicamente, los oligos de ADN sintéticos de aproximadamente 50 bases se diseñaron de un modo que aproximadamente 20 de sus bases estaban hibridadas y estos oligo de ADN sintéticos se ensamblaron juntos por el método de PCR para preparar genes que codificaban cada una de las regiones variables. Se digirieron en el sitio HindIII insertado en el extremo del oligo de ADN sintético 5' terminal y el sitio BamHI insertado en el extremo del oligo de ADN sintético 3' terminal. Los fragmentos se clonaron en un vector de expresión, HEFg\gamma1, en el que una región constante de IgG se clonó o un vector de presión, HEFg\kappa1, en el que se clonó una región constante de cadena kappa humana (Sato et al., Mol Immunol. 1994: 371-381). La cadena H y la cadena L de GC33 humanizado construido como anteriormente se denominaron ver.a, respectivamente. La actividad de unión de GC33 humanizado, cuyas cadenas H y cadena L fueron ambas ver.a (ver.a/ver.a), fue menor que la del un anticuerpo con regiones variables GC33 de ratón(ratón/ratón). Se construyeron los anticuerpos en los que la secuencia GC33 de ratón y la secuencia ver. a se combinaron quiméricamente (ratón/ver. a, ver. a/ratón) respecto a la cadena H y la cadena L y se evaluaron sus actividades de unión. Como resultado, se observó una disminución en la actividad de unión en ver. a/ratón, lo que indicó que la disminución en la actividad de unión debido a la sustitución de aminoácidos se atribuyó a la cadena H (Figura 15). Después, se prepararon las cadenas H modificadas, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k. Todos estos GC33 humanizados mostraron una actividad de unión equivalente a la de un anticuerpo quimérico que tiene la región variable GC33 de ratón (Figura 15). Las secuencias de nucleótidos de la región variable de la cadena H de GC33 humanizada ver.a, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k se mostraron en la SEC ID Nº: 77,78, 79,80, 81,82 y 83, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de los mismos se mostraron en las SEC ID Nº: 84, 85, 86, 87, 88, 89 y 90, respectivamente. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena L de GC33 humanizada, ver.a se muestran en las SEC ID Nº: 91 y 92, respectivamente. En las regiones variables de cadena H de GC33 humanizada ver.i, ver.j y ver.k, el 6º resto de ácido glutámico se sustituye con resto de glutamina. La estabilidad al calor de estos anticuerpos aumentó significativamente.

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Ejemplo 25 Modificación de la cadena L de GC33 humanizada

Como para la desamidación de la proteína, la constante velocidad de la reacción de desamidación se sabe que depende de la secuencia primaria. También se sabe que Asn-Gly es particularmente susceptible a la desamidación (Rocinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001: 98: 944-949). Como para el Asn33 en la CDR1 de una cadena L de GC33 humanizada ver.a mostrada en SEC ID Nº: 91, la secuencia primaria es Asn-Gly que se predice que es muy susceptible a la desamidación.

Para evaluar el efecto de la desamidación de Asn33 en la actividad de unión, se preparó un anticuerpo modificado en el que Asn33 se sustituyó con Asp. Una mutación puntual se introdujo que usaba el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio Quick Change (Stratagene). Más específicamente, 50 \mul de una reacción que contenía 125 ng de un cebador sentido (CTT GTA CAC AGT GAC GGA AAC ACC TAT: SEC ID Nº: 172), 125 ng de un cebador antisentido (ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG: SEC ID Nº: 173), 5 \mul de tampón de reacción 10x, 1\mul de mezcla de dNTP, 10 ng de HEFg\kappa en el que se había clonado una cadena L de GC33 humanizada y 1 \mul de polimerasa de ADN Pfu Turbo se sometieron a PCR de 12 ciclos que consistían en 30 segundos a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y 9 minutos 68ºC. Posteriormente, se añadió una enzima de restricción, DpnI y se realizó la digestión a 37ºC durante 2 horas y el producto digerido se introdujo en una célula competente XL1-Blue incluida al kit, por lo que se obtuvo un transformante. La región variable se escindió del clon en que cada mutación se introdujo de manera apropiada y se clonó en HEFg\kappa de nuevo. Se introdujo en una célula COS7 usando Fugene (Roche) junto con HEGg\gamma1, en el que se había clonado una cadena H GC33 humanizada ver.k. El anticuerpo expresado transitoriamente en la célula se recuperó del sobrenadante de cultivo. La concentración de anticuerpo se determinó por un ELISA de sándwich usando el anticuerpo anti-IgG humana. La actividad de unión del anticuerpo modificado se evaluó por un ELISA usando una inmunoplaca recubierta con la forma soluble de la proteína de núcleo GPC3. Como se muestra en la Figura 18, la actividad de unión se perdió en el anticuerpo modificado (N33D) en la que Asn33 se había sustituido con Asp, lo que sugirió que el efecto de la desamidación de Asn33 sobre la actividad de unión fue significativo.

Como método de supresión de la desamidación de Asn33, la sustitución de Gly34 con otro aminoácido se ha notificado (Solicitud de Patente Internacional WO 03057881A1). De acuerdo con el método mencionado anteriormente, se sustituyó G34 con cualquiera de los 17 aminoácidos distintos de Cys y Met usando un Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio Quick Change para preparar una serie de anticuerpos modificados, concretamente, G34A, G34D, G34E, G34F, G34H, G34N, G34P, G34Q, G34I, G34K, G34L, G34V, G34W, G34Y, G34R, G34S y G34T. Esos anticuerpo se expresaron transitoriamente en células COS7 y la actividad de unión se evaluó usando el sobrenadante del cultivo. Se descubrió que la actividad de unión se mantiene incluso si G34 se sustituye con otro aminoácido, excepto para Pro (G34P) y Val (G34V).

Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera CDR1 de los anticuerpos modificados mencionados anteriormente se muestran en SEC ID Nº:174 (G34A), SEC ID Nº: 175 (G34D), SEC ID Nº: 176 (G34E), SEC ID Nº: 177 (G34F), SEC ID Nº: 178 (G34H), SEC ID Nº: 179 (G34N), SEC ID Nº: 180 (G34T), SEC ID Nº: 181 (G34Q), SEC ID Nº: 182 (G34I), SEC ID Nº: 183 (G34K), SEC ID Nº: 184 (G34L), SEC ID Nº: 185 (G34S), SEC ID Nº: 186 (G34W), SEC ID Nº: 187 (G34Y), SEC ID Nº: 188 (G34R), SEC ID Nº: 189 (G34V), y SEC ID Nº: 190 (G34P), respectivamente. La secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera de anticuerpos modificados mencionados anteriormente se muestran en SEC ID Nº:191 (G34A), SEC ID Nº: 192 (G34D), SEC ID Nº: 193 (G34E), SEC ID Nº: 194 (G34F), SEC ID Nº: 195 (G34H), SEC ID Nº: 196 (G34N), SEC ID Nº: 197 (G34 T), SEC ID Nº: 198 (G34Q), SEC ID Nº: 199 (G34I), SEC ID Nº: 200 (G34K), SEC ID Nº: 201 (G34L), SEC ID Nº: 202 (G34S), SEC ID Nº: 203 (G34W), SEC ID Nº: 204 (G34Y), SEC ID Nº: 205 (G34R), SEC ID Nº: 206 (G34V), y SEC ID Nº: 207 (G34P), respectivamente.

El anticuerpo de la presente invención se puede usar como un inhibidor del crecimiento celular, un agente anticanceroso o un agente para el diagnóstico de cánceres.

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Ejemplo 26 Preparación de la línea celular de hepatoma humano (SK-03) que expresa GPC3 humano de longitud total

Para obtener una línea celular para evaluar una actividad biológica de los anticuerpos anti-GPC3, se estableció una línea celular de hepatoma humano que expresaba GPC3 de longitud total.

Se mezcló un microgramo de un vector de expresión génico de GPC3 humano de longitud total tratado con Pvu I con 2 \mul de FuGENE (Roche) para permitir la formación de complejos. El complejo se añadió a células SK-HEP-1 (adquirido de ATCC) para la introducción génica. Después de la incubación en una incubadora de CO2 durante 24 horas, se seleccionaron las células que expresaban GPC3 usando MEM de Dulbecco's (D-MEM, SIGMA) que contenía Geneticina a una concentración final de 1 mg/mL y FBS al 10%. Las colonias resistentes a Geneticina resultantes se recogieron y para la clonación celular se realizó por el método de dilución limitante. Se ensayó la expresión de GPC3 humano de cada clon celular por citometría de flujo usando el anticuerpo quimérico GC33 y anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con FITC (ICN). De este modo, se obtuvo una línea celular con expresión estable SK-03.

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Ejemplo 27 Comparación de actividad CDC y actividad ADCC de anticuerpos quiméricos ratón-ser humano

Para comparar directamente la actividad CDC y actividad ADCC de los anticuerpos quiméricos ratón-ser humano GC33, M3C11 y M1E7 descritos en el Ejemplo 22, se midió la actividad CDC y actividad ADCC de los tres anticuerpos en el mismo sistema de ensayo de acuerdo con el método descrito en los Ejemplos 16 y 17. Como para la célula diana, la célula CHO que expresaba GPC3 de longitud total se usó para medir la actividad CDC y SK-03 se usó para medir la actividad ADCC. Los resultados se muestran en la Figura 19 y Figura 20, respectivamente. Se desveló que, en cualquiera de los sistemas de ensayo, GC33 muestra una actividad CDC y actividad ADCC más fuerte en comparación con los otros dos anticuerpos.

Aplicabilidad industrial

El anticuerpo de la presente invención se puede usar como un inhibidor del crecimiento celular, agente anticanceroso y un agente para el diagnóstico de cánceres.

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<110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha

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<120> Anticuerpos anti-glipicano 3

\vskip0.400000\baselineskip

<130> N96765 GCW

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2004-203637

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 09-07-2004

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\hskip1cm

8

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<210> 2

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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<400> 2

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\hskip1cm

9

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<210> 3

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<211> 1743

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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10

11

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<210> 4

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<211> 580

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

12

13

14

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<210> 5

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 5

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\hskip1cm

15

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<210> 6

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip1cm

16

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<210> 7

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 7

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\hskip1cm

17

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<210> 8

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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<400> 8

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\hskip1cm

18

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<210> 9

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\hskip1cm

19

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<210> 10

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 10

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\hskip1cm

20

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<210> 11

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<211> 1392

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 11

21

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<210> 12

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<211> 342

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 12

22

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<210> 13

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<211> 1413

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 13

23

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<210> 14

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<211> 354

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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25

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<210> 16

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<211> 1416

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 16

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26

27

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<210> 17

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<211> 366

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 17

28

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<210> 18

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<211> 1413

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 357

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 19

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30

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<210> 20

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<211> 372

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 20

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31

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<210> 21

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<211> 372

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 21

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32

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<210> 22

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<211> 463

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

\newpage

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<400> 22

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33

34

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<210> 23

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<211> 114

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 23

35

350

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<210> 24

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<211> 470

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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36

37

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<210> 25

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 25

38

380

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<210> 26

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<211> 118

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 26

39

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<210> 27

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<211> 471

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 27

40

41

42

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<210> 28

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<211> 122

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 28

43

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<210> 29

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<211> 470

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 29

44

45

46

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<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 30

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47

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<210> 31

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<211> 124

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 31

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48

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<210> 32

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<211> 124

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 32

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49

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 717

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

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50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

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51

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<210> 35

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<211> 717

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 35

52

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<210> 36

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<211> 324

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

53

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<210> 37

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<211> 336

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

54

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<210> 38

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<211> 705

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

55

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<210> 39

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<211> 321

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 720

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 238

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

\newpage

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<400> 44

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61

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

\newpage

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<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

66

660

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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<400> 49

67

670

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

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<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 50

68

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<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 51

69

70

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<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

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71

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 53

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 333

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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74

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

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<211> 372

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 56

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75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 58

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 59

78

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<210> 60

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<211> 111

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 60

79

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<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 61

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

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82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

85

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<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip1.000000\baselineskip

90

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<210> 72

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<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

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91

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<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

\newpage

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<400> 80

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

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\vskip0.400000\baselineskip

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100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

101

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<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

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\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

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<211> 115

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

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<400> 84

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103

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<211> 115

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

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104

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

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<211> 115

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

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<400> 86

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105

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<210> 87

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<211> 115

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

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<400> 87

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106

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<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

108

109

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<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena H de anticuerpo quimérico ratón-humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

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<211> 336

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena L de anticuerpo quimérico ratón-humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena L de anticuerpo quimérico ratón-humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

112

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<210> 93

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<211> 14

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

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\hskip1cm

114

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

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\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

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\hskip1cm

119

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

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\hskip1cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

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<213> Mus Musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

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\hskip1cm

126

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

127

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

128

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus Musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211>15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

211

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

212

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

213

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

214

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

215

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

216

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

217

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

218

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\vskip1.000000\baselineskip

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

220

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

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<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

221

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

222

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 203

223

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<210> 204

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

224

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

225

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

226

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<210> 207

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<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cadena L de anticuerpo mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

227

Claims

1. Un anticuerpo capaz de unirse al glipicano 3, siendo el anticuerpo:

(a) un anticuerpo que comprende:

(ii): una región variable de cadena ligera que tiene CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:142, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 144 y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 158;

(b) un anticuerpo que comprende (i) y que puede inhibir competitivamente la unión del anticuerpo de (a) a glipicano 3;

(c) un anticuerpo que comprende (ii) y que puede inhibir competitivamente la unión del anticuerpo de (a) a glipicano 3;

(d) un anticuerpo que tiene la misma actividad de unión al glipicano 3 como el anticuerpo de cualquiera de (a) a (c), en el que un resto de aminoácido se sustituye, elimina o añade y/o inserta a partir de la de las secuencias de aminoácidos expuestas en (a);

(e) un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo al que el anticuerpo de (a) es capaz de unirse, comprimiendo el anticuerpo de (a) tanto las secuencias de región variable de cadena ligera como pesada especificadas en (a); o

(f) un anticuerpo capaz de unirse a un péptido que consiste en la secuencia de los restos de aminoácidos 546-551 de glipicano 3.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado de:

(1) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 84 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92;

(2) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 85 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 92;

(3) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 86 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92;

(4) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92;

(5) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 88 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92;

(6) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 89 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92 o

(7) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 90 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 92.

\vskip1.000000\baselineskip

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 (f), en el que el anticuerpo se une al péptido separado por SDS-PAGE en condiciones reductoras se analiza por transferencia de Western.

\newpage

4. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado de:

(1) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 174,144 y 158, respectivamente;

(2) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 175,144 y 158, respectivamente;

(3) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 176,144 y 158, respectivamente;

(4) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 177,144 y 158, respectivamente;

(5) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 178,144 y 158, respectivamente;

(6) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 179,144 y 158, respectivamente;

(7) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 180,144 y 158, respectivamente;

(8) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 181,144 y 158, respectivamente;

(9) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 182,144 y 158, respectivamente;

(10) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 183,144 y 158, respectivamente;

(11) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 184,144 y 158, respectivamente;

(12) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 185,144 y 158, respectivamente;

(13) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 186,144 y 158, respectivamente;

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(14) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 187,144 y 158, respectivamente, o

(15) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 123, 124 y 125, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que tiene CDR 1, 2 y 3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nº: 188,144 y 158, respectivamente.

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5. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene una región variable de cadena ligera seleccionada de:

(1) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 191;

(2) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 192;

(3) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 193;

(4) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 194;

(5) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 195;

(6) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 196;

(7) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 197;

(8) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 198;

(9) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 199;

(10) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 200;

(11) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 201;

(12) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 202;

(13) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 203;

(14) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 204, o

(15) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 205 y una región variable de cadena pesada seleccionada de:

(1): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 84;

(2): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 85;

(3): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 86;

(4): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 87;

(5): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 88;

(6): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 89 o

(7): una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 90.

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6. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 4 que es un anticuerpo humanizado.

7. Un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera del anticuerpo como se reivindica en las reivindicaciones 2, 5 ó 6.

8. El polinucleótido como se reivindica la reivindicación 7 que tiene una cualquiera de las secuencias expuestas en las SEC ID Nº: 57, 67, 77-83 o 91.

9. Un vector que comprende un polinucleótido como se reivindica la reivindicación 7 o 8.

10. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 9.

11. Un método para producir un anticuerpo que comprende:

(a): cultivar la célula hospedadora como se reivindica en la reivindicación 10,

(b): aislar un anticuerpo de un cultivo de (a) y

(c): purificar el anticuerpo del mismo.

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12. Un inhibidor del crecimiento celular que comprende como ingrediente activo el anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

13. El anticuerpo de una cualquiera de reivindicaciones 1-6 para uso en el tratamiento del cáncer.

14. El anticuerpo de la reivindicación 13 para uso en el tratamiento de hepatoma.

15. Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 546-551 del glipicano 3.