BRPI0506125B1

BRPI0506125B1 - Anticorpo anti - glipicano 3, seu método de produção, polinucleotídeo, vetor e inibidor do crescimento de células

Info

Publication number: BRPI0506125B1
Application number: BRPI0506125-3A
Authority: BR
Inventors: Kiyotaka Nakano; Takeshi Yoshino; Nezu Jun-Ichi; Hiroyuki Tsunoda; Tomoyuki Igawa; Hiroko Konishi; Megumi Tanaka; Izumi Sugo; Shigeto Kawai; Takahiro Ishiguro; Yasuko Kinoshita
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2004-07-09
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2019-10-15
Also published as: JPWO2006006693A1; NZ545720A; EP2898897A2; ATE486610T1; NZ579543A; JP4011100B2; AU2005256113B2; ES2353967T3; NO343105B1; EP2216046A2; IL172938A; AU2005256113A8; CY1111649T1; EP2898897A3; RU2427588C2; CA2544692C; WO2006006693A1; CA2544692A1; AU2005256113A1; US7919086B2

Abstract

"anticorpo antiglipicano 3". a presente invenção refere-se a um anticorpo capaz de se ligar a uma região específica de glipicano 3, assim como um anticorpo humanizado criado com base neste anticorpo são descritos. o anticorpo antigpc3 da invenção apresenta atividade de adcc e atividade de cdc maiores comparadas com as de um anticorpo convencional. o anticorpo da presente invenção é utilizável como um inibidor do crescimento de células, um agente anti-câncer e um agente para o diagnóstico de cânceres.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO ANTI-GLIPICANO 3, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR E INIBIDOR DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS.

Antecedentes da invenção

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a um anticorpo antiglipicano 3, um inibidor do crescimento de células e um agente anticâncer contendo o anticorpo como o ingrediente ativo.

Descrição da Técnica relacionada

Glipicano 3 (GPC3) é um dentre a família de glipicano de proteoglicanos de sulfato de heparano que estão presentes sobre as superfícies das células. Sugere-se que GPC3 possa estar envolvido em divisão celular no desenvolvimento ou crescimento de células de câncer, no entanto, sua função não foi ainda elucidada.

Verificou-se que um certo tipo de anticorpo se ligando a GPC3 tem uma atividade inibidora do crescimento celular via uma atividade de cit otoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) e uma at ividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (pedido de patente internacional WO 2003/000883). Além disso, foi sugerido que GPC3 é clivado in vivo e secretado no sangue como uma forma secretada de GPC3, e a diagnose de cânceres pode ser possível por uso de um anticorpo capaz de detectar a forma secretada de GPC3 (pedidos de patente internacional WO 2004/022739, WO 03/100429 e WO 2004/018667).

Quando se desenvolve um agente anticâncer com base na atividade de citotoxicidade de um anticorpo, prefere-se que o anticorpo a ser usado tenha uma atividades de ADCC ou atividade de CDC elevadas. Conseqüentemente, um anticorpo antiGPC3 tendo uma elevada atividade de citotoxicidade tem sido desejado como um anticorpo reconhecendo GPC3.

Um objeto da presente invenção é prover um anticorpo antiGPC3 tendo maiores atividade de ADCC e atividade de CDC comparadas com as de um anticorpo convencional.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores obtiveram sucesso na obtenção de um

Petição 870190067438, de 17/07/2019, pág. 8/21 anticorpo tendo uma maior atividade de citotoxicidade comparada com a um anticorpo antiglipicano 3 convencionai. A.ém disso, eles ana^ram. ptopos para este anticorpo e obtiveram sucesso na determ.naçao da re^ em GPC 3 reconhecido pelo anticorpo com uma elevada atMdade

Em um aspecto, a presente invenção provê um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1. 2 e 3 de qualquer um dentre (1) - (12):

(1) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 124, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 125;

(2) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 109, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 110, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 111;

(3) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 106, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 107, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 108;

(4) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 132, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 133, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 134;

(5) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO; 106, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 135, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 136;

(6) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 126, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 127, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 128;

(7) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especifica- da em SEQ ID NO: 129, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 130, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 131;

(g) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 103, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 104, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 105;

(gj CQR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 118, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 121, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 122;

(10) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 115, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 116, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 117;

(ΊΊ) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 112, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 113, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 114; ou (12) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 118, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 119, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 120.

Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 de qualquer um dentre (1) - (13):

(1) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 143, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(2) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especifica- da em SEQ ID NO: 143, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 145;

(3) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 140, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 141, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 142;

(4) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 167, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 168, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 169;

(5) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 170, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 171;

(θ) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 159, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 160, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 161;

(7) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 162, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 147, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 163;

(8) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 164, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 165, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 166;

(9) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 137, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 138, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 139;

(10) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especifica da em SEQ ID NO: 155, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 156. e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 157;

(11) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 149, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 150, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 151;

(12) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 146, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 147, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 148; ou (13) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 152, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 153, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 154.

Preferivelmente, o anticorpo da invenção é selecionado dentre o grupo consistindo em qualquer um dentre (1) - (13):

(1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1. 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 143,144 e 158, respectivamente, (2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 109, 110 e 111, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 143. 144 e 145, respectivamente;

(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 106, 107 e 108, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1. 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 140.141 e 142. respectivamente;

¢4) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 132, 133 e 134, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 167,168 e 169, respectivamente: ^5) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 106, 135 e 136, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 170,144 e 171, respectivamente;

um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 126, 127 e 128, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 159, 160 e 161, respectivamente:

(7) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 129, 130 e 131, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 162, 147 e 163, respectivamente, (8) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 129, 130 e 131, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 164, 165 e 166, respectivamente:

(9) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos es- • pecificada em SEQ ID NO: 103, 104 e 105, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 137,138 e 139, respectivamente:

(10) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos es pecificada em SEQ ID NO: 118. 121 e 122, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 155,156 e 157, respectivamente;

(11) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 115, 116 e 117, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 149,150 e 151, respectivamente;

(12) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 112, 113 e 114, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 146, 147 e 148, respectivamente;

e um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 118, 119 e 120, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 152, 153 e 154, respectivamente.

Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada de qualquer uma dentre (1) - (7):

(1) uma região variável de cadeia pesada compreendendo qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 84;

(2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 85;

(3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 86;

(4) uma região variável de cadeia pesada compreendendo qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 87;

(5) uma região variável de cadeia pesada compreendendo qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 88;

(6) uma região variável de cadeia pesada compreendendo sesesesesese8 região ,.ãã«,i d. ο.«= »«. compreendendo . saneie de »—<*» especificada em SEQ ID NO: 92.

Preferivelmente, o anticorpo da invenção é selecionado dentre grupo consistindo no anticorpo de qualquer um dentre (1) - (7).

₍₁) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 84 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92;

(2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92;

(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 86 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92;

(4) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 87 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92;

(5) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92;

(6) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pecompreendendo a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID

NO: 89 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92; e _{(7) um} anticorpo compreendendo uma região variáve^ ^{a seqüència}de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92. _compreenEm outro aspecto, a invenção provê um ant.corpo compreen dendo uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1. 2 e 3 de guaiguer um dentre (1)-(15):

₍₁) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos espec.ficada em SEQ ID NO: 174. CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144. e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(2) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 175, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(3) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 176, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(4) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 177, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(5) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 178, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(θ) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 179, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(7) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especifica da em SEQ ID NO: 180, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(8) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 181, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(9) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 182, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 158, (10) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 183, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(11) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO; 184, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(12) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 185, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos

X especificada ém SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(13) GDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especifica- dá érri SEQ ID NO: 186, CDR2 compreendendo a seqüênciade aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158;

(14) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 187, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158; ou (15) CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos especifica- da em SEQ ID NO: 188, CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 144, e CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 158.

Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo selecionado dentre o grupo consistindo no anticorpo de (1) - (15).

um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 174,144 e 158, respectivamente;

(2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 175,144 e 158, respectivamente;

(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 176,144 e 158, respectivamente;

(4) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 177,144 e 158, respectivamente;

(5) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO; 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 178,144 e 158, respectivamente;

(6) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos es- pecificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 179,144 e 158, respectivamente: (yj υιγι anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 180,144 e 158, respectivamente; (gj um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 181,144 e 158, respectivamente; (g) _un3 anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 182,144 e 158, respectivamente; 00) urn anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 183,144 e 158, respectivamente;

(11) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 184,144 e 158, respectivamente;

(12) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124, e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 185, 144, e 158, respectivamente;

(13) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124, e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 186, 144 e 158, respectivamente;

(14) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 187, 144 e 158, respectivamente;

e (15) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO; 188, 144 e 158, respectivamente.

Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve selecionada dentre (1)-(15).

(1) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 191;

(2) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 192;

(3) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 193;

(4) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 194;

(5) urna região variável de cadeia4eve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 195;

(6) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 196;

(7) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 197;

(8) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 198;

(9) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 199;

(10) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 200, (11) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 201;

(12) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 202;

(13) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 203;

(14) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 204; e (15) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 205.

Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve selecionada dentre o grupo consistindo em (1) -(15):

(1) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 191;

(4) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 194, (5) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 195;

(6) _uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 196, (7) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 197;

(0) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 199;

(10) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO*. 200, (11) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 201;

(13) _Uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO; 203;

(14) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 204; e (15) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO. 205, e uma região variável de cadeia pesada selecionada dentre o grupo consistindo em (1)-(7):

(Ί) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 84;

(2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 85;

(3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 86;

(6) uma região variável de cadeia pesada compreendendo qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 89; e sesese (7) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 90.

A região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, e a seqüência de aminoácidos dos CDRs 1, 2 e 3, assim como 5 SEQ ID NOs são resumidas na tabela abaixo. .

Anticorpo e regiões variáveis	SEQ ID NO
M3C11	H	22
M13B3	H	23
M1E7	H	24
M3B8	_______H_______	25
M11F1	_______H_______	26
M19B11	H	27
M6B1	H	28
M18D4	H	29
M5B9	H	30
M10D2	H	31
L9G11	H	32
M3C11	L	44
M13B3	L	45
M1E7	L	___________46_____________
M3B8	L	47
M11F1	L	48
M19B11	L	49
. M6B1	L	50
M18D4	L	51
M5B9	L	52
M10D2	L	53
L9G11	L	54
GC199	H	60
GC202	H	61
GC33	H	62
GC179	H	63
GC194	H	64

17	t· *· · ··· · ·· · · Λ · ··· · · · · · · · • · ······ ·· · · ·· ··· ······ · « · ·«······ · · • ··· < · « · ··· ···
Anticorpo e regiões variáveis_____	SEQ ID NO
GC199	L I	71
GC202	L	72
GC33	L	73
GC179	L	74
GC194(1)	L	75
GC194(2)	L	76
GC33.ver.a	H	84
GC33.ver.c	H	85
GC33.ver.f	H	86
GC33.ver.h	H	87
GC33.ver.i	H	88
GC33.ver.j	H	89
GC33.ver.k	H	90
GC33.ver.a	L	92
M13B3(H)	CDR1	103
	CDR2	104
	CDR3	105
M3B8(H)	CDR1	106
	CDR2 ;	107
	CDR3	108
M11F1(H)	CDR1	109
	CDR2	110
	CDR3	111
M5B9(H)	CDR1	112
	CDR2	113
	CDR3	114
M6B1(H)	CDR1	115
	CDR2	116
	CDR3	117
M10D2(H)	CDR1	118
	CDR2 L	119
	CDR3	120

Anticorpo e regiões variáveis	SEQ ID NO
L9G11(H)	CDR1	_____________118______________
	CDR2	121
	CDR3	122
GC33(H)	CDR1	123
	CDR2	124
	CDR3	_____________125_____________
GC179(H)	CDR1	126
	CDR2	127
	CDR3	128
GC194(H)	CDR1	129
	CDR2	130
	CDR3	131
GC199(H)	CDR1	132
	CDR2	133
	CDR3	134
GC202(H)	CDR1	106
	CDR2	135
	CDR3	136
M13B3(L)	CDR1	137
	CDR2	138
	CDR3	139
M3B8(L)	CDR1	140
	CDR2	141
	CDR3	142
M11F1(L)	CDR1	143
	CDR2	144
	CDR3	_____________145__
M5B9(L)	CDR1	146
	CDR2	147
	CDR3	148
M6B1(L)	CDR1	149
—-------------	CDR2	150

Anticorpo e regiões variáveis______	SEQ ID NO
	CDR3	151
M10D2(L)	CDR1	____________152_____________
	CDR2	153
	CDR3	154
L9G11(L)	CDR1	155
	CDR2	156
	CDR3	157
GC33(L)	CDR1	143
	CDR2	144
	CDR3	158
GC179(L)	CDR1	159
	CDR2 I	160
	CDR3	161
GC194(L)1	CDR1	162
	CDR2	147
	CDR3	163
GC194(L)2	CDR1	164
	CDR2	165,
	CDR3	166
GC199(L)	CDR1	167
	CDR2	168
	CDR3	169
GC202(L)	CDR1	170
	CDR2	144
	CDR3	171
GC33(L)	G34A	174
GC33ÇL)	G34D	175
GC33(L)	G34E	176
GC33(L)	G34F	177
GC33(L)	G34H	178
GC33(L)	G34N	179
GC33(L)	G34P l	180

Anticorpo e regiões variáveis ____	______SEQ ID NO________
GC33(L)	G34Q	181
GC33(L)	G34I___	182
GC33(L)	G34K	183
GC33(L)	G34L	__________184_____________
GC33(L)	G34V	185
GC33(L)	G34W	186
GC33(L)	G34Y	187
GC33(L)	G34R	188

Também, a invenção refere-se a um anticorpo tendo uma atividade equivalente à atividade do anticorpo descrito acima, em que um ou mais resíduos de aminoácido são substituídos, deletados ou adicionados e/ou inseridos das seqüências de aminoácidos descritas acima.

» g Preferivelmente, o anticorpo da invenção é um anticorpo huma„ nizado.

Assim, em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo humanizado capaz de se ligar a glipicano 3.

Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo capaz de se 10 ligar a um peptídeo consistindo na seqüência de resíduos de aminoácidos 524 - 563 de glipicano 3.

Preferivelmente, o anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um peptídeo consistindo na seqüência de resíduos de aminoácidos 537 563 de glipicano 3. Mais preferivelmente, o anticorpo da invenção não se liga 15 a peptídeo consistindo na seqüência de resíduos de aminoácidos 550 - 563 de glipicano 3.

Preferivelmente, o anticorpo é capaz de se ligar a um peptídeo consistindo na seqüência de resíduos de aminoácidos 544 - 553 de glipicano 3 ou um peptídeo consistindo na seqüência de resíduos de aminoácidos 546 20 - 551 de glipicano 3.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê um anticorpo capaz de se ligar a um epitopo ao qual um segundo anticorpo é capaz de se ligar, em que referido segundo anticorpo compreende uma região variável de ca21 * deia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO; 143, 144 e 158, res5 pectivamente. Ou seja, o anticorpo da invenção é capaz de competir em ligação a GPC3 com o segundo anticorpo.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção é capaz de se ligar a glipicano 3 e tem uma elevada atividade de CDC contra uma célula expressando glipicano 3 e/ou tem uma elevada atividade de ADCC 10 contra uma célula expressando glipicano 3.

Em outro aspecto, a invenção provê um polinucleotídeo codificando para uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve do anticorpo da invenção.

Preferivelmente, o polinucleotídeo da invenção tem uma se15 qüêncía especificada em SEQ ID NOs: 11-21,33-43, 55-59, 65-70 e 77-83.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê um inibidor do crescimento celular e um agente anticâncer compreendendo como um ingrediente ativo o anticorpo da invenção. Preferivelmente, o agente anticâncer da Invenção é usado para o tratamento de hepatoma.

2q Em outro aspecto, a invenção provê um peptídeo compreendendo a seqüência dos resíduos de aminoácidos 524 - 563 de glipicano 3, a sequência dos resíduos de aminoácidos 537 - 563 de glipicano 3, a seqüência dos resíduos de aminoácidos 544 - 553 de glipicano 3 ou a seqüência de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos 546 - 551 de glipicano 3.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS.

Afigura 1 mostra a atividade de ligação do anticorpo antiGPC3 a uma célula CHO, uma célula CHO expressando GPC3, HepG2 e HuH-7 de comprimento completo, o que foi avaliado por citometria de fluxo. M1E7 (linha cheia) e M11F1 (linha pontilhada) foram usados em uma concentração 30 de 5 μρ/πιΐ, respectivamente.

A figura 2 é uma tabela mostrando os resultados da classificação de epítopos por um ELISA competitivo. Os graus de inibição competitiva con22 > tra a ligação do anticorpo antiGPC3 biotinilado são indicados por porcenta* gem. Os epítopos foram classificados em 5 grupos, a a e, de acordo com o padrão de inibição competitivo.

A figura 3 mostra os resultados de avaliação de Western Blotting ou se um anticorpo antiGPC3 se liga ao fragmento N-terminal de 40 kDa da forma solúvel da proteína de núcleo GPC3 ou ao fragmento C-terminal de 30 kDa do mesmo. Verificou-se que L9G11 se liga ao fragmento N-terminal e M3C11 se liga ao fragmento C-terminal.

A figura 4 mostra os resultados de detecção de uma forma se10 cretada de GPC3 que está presente no sobrenadante de cultura de HepG2 por um ELISA sanduíche. Ele foi fortemente detectado com a combinação de anticorpos que ligam ao fragmento N-terminal como M6B1, M18D4 ou M19B11, e não foi fortemente detectado com um anticorpo que liga ao fragmento C-terminal como M3C11, M13B3 ou M3B8.

* 15 A figura 5 mostra os resultados da imuno-precipitação do sobrenadante de cultura de HepG2 com o uso de um anticorpo antiGPC3 e detecção de uma forma secretada de GPC3. O meio como um controle (trilhas 1 e 3) e o sobrenadante de cultura de HepG2 (trilhas 2 e 4) foram imunoprecipitados usando M1E7 (trilhas 1 e 2) e M10D2 (trilhas 3 e 4). GPC3 se20 cretório foi detectado por M10D2 que liga ao fragmento N-terminal.

A figura 6 mostra os resultados de análise do epitopo dos anticorpos que ligam ao fragmento Ç-terminal de GPC3 por Western blotting com o uso de uma proteína de fusão do peptídeo C-terminal de GPC3 e GST. A forma solúvel da proteína de núcleo GPC3 (trilha 1), GST (trilha 2), 25 GC-1 (trilha 3), GC-2 (trilha 4), GC-3 (trilha 5), GC-4 (trilha 6) e GC-5 (trilha 7) foi submetida a eletroforese SDS sob condições de redução, e detectada por Western blot usando M3C11 e M11F1.

A figura 7 mostra os resultados de avaliação·, da atividade de CDC de anticorpo quimérico camundongo-humano antiGPC3 a uma célula 30 CHO que expressa GPC3.

A figura 8 mostra os resultados de avaliação da atividade de ADCC de anticorpo quimérico camundongo-humano antiGPC3 a uma célula

CHO que expressa GPC3 e HepG2.

A figura 9 mostra os resultados de avaliação da atividade de ADCC de GC33 a uma linhagem de células de hepatoma humano, HuH-7, usando uma célula efetuadora derivada de medula óssea de camundongo.

A figura 10 mostra os resultados de avaliação de atividade antitumor de anticorpo GC33 para um modelo de camundongo transplantado com hepatoma humano.

Figura 11 os resultados de avaliação da atividade de CDC de anticorpo quimérico camundongo-humano GC33 a uma célula CHO que ex10 pressa GPC3.

A figura 12 mostra os resultados de avaliação da atividade de

- ADCC do anticorpo quimérico camundongo-humano GC33 para HepG2.

' A figura 13 mostra as sequências derivadas de GPC3 contidas nas proteínas de fusão GST (GC-4, 5, 6, 7, 8, 9,11, 12, 13 e 14) preparadas « 15 para análise do epitopo de GC33.

A figura 14 mostra os resultados de Western blot com o uso de GC33 após separação de GST, GC-7, 8, 9, 11, 12, 13 e 14 por SDS-PAGE sob condições de redução.

A figura 15 mostra os resultados de avaliação da atividade de 20 ligação de GC33 humanizado para GPC3 por um ELISA.

A figura 16 mostra um painel de anticorpos que resume os isotipos e os resultados de um ELISA, BlAcore, FACS, uma análise de epitopos e um teste de imuno-precipitação para clones derivados de um camundongo imunizado com uma forma solúvel de GPC#.

Afigura 17 mostra um painel de anticorpos em que isotipos e os resultados de um ELISA, FACS e uma análise de epitopos para clones derivados de um camundongo imunizado com GC-3 são resumidos.

, A figura 18 mostra os resultados de avaliação da atividade de , ligação dos anticorpos modificados para a forma solúvel de proteína de nú30 cleo GPC3 por um ELISA. Gly34 localizado em CDR1 em uma região variável de cadeia GC33 L humanizada foi substituído com qualquer um dos 17 aminoácidos diferentes de Cys e Met.

A figura 19 mostra os resultados de avaliação da atividade de CDC de anticorpos quiméricos camundongo-humano GC33, M3C11, e M1E7 para uma célula CHO que expressa GPC3 de comprimento completo.

A figura 20 mostra os resultados de avaliação da atividade de 5 ADCC dos anticorpos quiméricos camundongo-humano GC33, M3C11, e M1E7 para uma linhagem de células de hepatoma humano SK-03 que expressa GPC3 de comprimento completo.

nFSGRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Anticorpo

Iq a presente invenção provê anticorpos descritos nos seguintes (I) a (XI).

(η Anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo

CDRs 1, 2 e 3 consistindo em sequências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: em qualquer uma das seguintes (1) a (12):

(1)SEQ ID NOs: 123,124 e 125(GC33), (2) SEQ ID NOs: 109,110 e 111 (M11F1), (3) SEQ ID NOs: 106,107 e 108 (M3B8), (4) SEQ ID NOs: 132,133 e 134 (GC199), (5) SEQ ID NOs: 106,135 e 136 (GC202), (6) SEQ ID NOs: 126,127 e 128 (GC179), (7) SEQ ID NOs: 129,130 e 131 (GC194), (8) SEQ ID NOs: 103,104 e 105 (M13B3), (9) SEQ ID NOs: 118,121 e 122 (L9G11), (10) SEQ ID NOs: 115,116 e 117 (M6B1), (11) SEQ ID NOs: 112,113 e 114 (Μ5Β9), e (12) SEQ ID NOs: 118,119 e 120 (M10D2).

Dentre os anticorpos descritos em (1) a (12), são preferidos os anticorposdescritos em (1) a (8), mais preferidos são os anticorpos descritos em (1) a (5), e particularmente preferido é o anticorpo descrito em (1). Os 30 anticorpos descritos em (1) a (8) reconhecem o peptídeo C-terminal de glipicano 3 (um peptídeo compreendendo do 374^a aminoácido ao 580^a aminoácido de glipicano 3); e são utilizáveis como um anticorpo terapêutico. Além disso, os anticorpos descritos em (9) a (12) reconhecem o peptídeo Nterminal de glipicano 3 (um peptídeo compreendendo do 1^a aminoácido ao 373^a aminoácido de glipicano 3); e são utilizáveis como um anticorpo diagnóstico.

(II) Anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: em qualquer uma das seguintes (1) a (13):

(1) SEQ ID NOs: 143,144 e 158 (GC33), (2) SEQ ID NOs: 143, 144 e 145 (M11F1), (3) SEQ ID NOs: 140,141 e 142 (M3B8), (4) SEQ ID NOs: 167, 168 e 169 (GC199), (5) SEQ ID NOs: 170, 144 e 171 (GC202), (6) SEQ ID NOs: 159, 160 e 161 (GC179), (7) SEQ ID NOs: 162, 147 e 163 (GC194 (1)), (8) SEQ ID NOs: 164,165 e 166 (GC194 (2)), (9) SEQ ID NOs: 137, 138 e 139 (M13B3), (10) SEQ ID NOs: 155,156 e 157 (L9G11), (11) SEQ ÍD NOs: 149,150 e 151 (M6B1), (12) SEQ ID NOs: 146,147 e 148 (M5B9), e (13) SEQ ID NOs: 152,153 e 154 (M10D2).

Dentre os anticorpos descritos em (1) a (13), são preferidos os anticorpos descritos em (1) a (8), mais preferidos são os anticorpos descritos em (1) a (5), e particularmente preferido é o anticorpo descrito em (1). Os anticorpos descritos em (1) a (8) reconhecem o peptídeo C-terminal de ghpi25 cano 3 (um peptídeo compreendendo do 374^a aminoácido para o 580 ^a aminoácido de glipicano 3); e são utilizáveis como um anticorpo terapêutico. Além disso, os anticorpos descritos em (9) a (13) reconhecem o peptídeo Nterminal de glipicano 3 (um peptídeo compreendendo do 1^a aminoácido ao 373^a aminoácido de glipicano 3); e são utilizáveis como anticorpo diagnósti30 co.

(III) Um anticorpo selecionado dentre o grupo consistindo dos anticorpos descritos nos seguintes (1) a (13):

(1) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 123,124 e 125, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 143,144 e 158 (GC33), (2) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 109,110 e 111, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 143, 144 e 145 (M11F1), (3) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 140, 141 e 142 (M3B8), (4) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 132,133 e 134, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 167,168 e 169 (GC199), (5) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 106,135 e 136, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 170, 144 e 171 (GC202), (6) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 126,127 e 128, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 159, 160 e 161 (GC179), (7) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 129,130 e 131, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 162,147 e 163 (GC194 (1)), (8) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 129, 130 e 131, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 164,165 e 166 (GC194 (2)), (9) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 103,104 e 105, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 137, 138 e 139 (M13B3), (10) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs:118, 121 e 122, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 155, 156 e 157 (L9G11), (11) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 115,116e117, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 149,150 e 151 (M6B1), (12) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 112,113e114, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 146, 147 e 148 (M5B9), (13) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 118,119 e 120, e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 152,153 e 154 (M10D2).

Dentre os anticorpos descritos em (1) a (13), são preferidos os anticorpos descritos em (1) a (8), mais preferidos são os anticorpos descritos em (1) a (5), e particularmente preferido é o anticorpo descrito em (1). Os 5 anticorpos descritos em (1) a (8) reconhecem o peptídeo C-terminal de glipicano 3 (um peptídeo compreendendo do 374^e aminoácido ao 580² aminoácido de glipicano 3); e são utilizáveis como um anticorpo terapêutico. Além disso, os anticorpos descritos em (9) a (13) reconhecem o peptídeo Nterminal de glipicano 3 (um peptídeo compreendendo do 1^fi aminoácido ao 10 373² aminoácido de glipicano 3); e são utilizáveis como um anticorpo diag15 nóstico.

(IV) Anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada descrita em qualquer uma das seguintes (1) a (7):

(1) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), (2) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), (3) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f), (4) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), (5) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 88 (GC33VH ver.i), (6) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j), e (7) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k).

Dentre os anticorpos descritos em (1) a (7), particularmente são preferidos os anticorpos descritos em (2) a (7).

(V) Anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO; 92 (GC33 VL ver.a).

(VI) Um anticorpo selecionado dentre o grupo consistindo dos anti- ;w!ííí!Ííhí :·. ·:· .·. :·· ··· .·· .j ·’_: · corpos descritos nos seguintes (1) a (7):

(1) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a) e uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (2) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c) e uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (3) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f) e uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (4) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h) e uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (5) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i) e uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), (6) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j) e uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a), e (7) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k) e uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a).

(VII) Anticorpo descrito em qualquer um das seguintes (1) a (15):

(1) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID e

NOs: 174,144 e 158, (2) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 175,144 e 158, (3) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 176,144 e 158, (4) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID e

NOs: 177,144 e 158, (5) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID e

NOs: 178,144 e 158, (6) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 179, 144 e 158, (7) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 180,144 e 158, (8) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1,2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 181,144 e 158, (9) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID e

NOs: 182,144 e 158, (10) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 183,144 e 158, (11) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID ·· «>·· · ··· ·. »^t· .2 ·*· ·** «a. a · · ft ftftft ft* ft ft ft

2 2 « 2 ·· < · »· · · ·· ?· : ·· .J

NOs: 184, 144e 158, (12) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 185,144 e 158, (13) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 186,144 e 158, (14) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID 10 NOs: 187,144 e 158, e (15) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 188,144 e 158.

Dentre os anticorpos descritos em (1) a (15), prefere-se o anti15 corpo descrito em (15).

(VIII) Anticorpo descrito em qualquer um das seguintes (1) a (15):

(1) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 174,144 e 158, (2) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 123,124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 175, 144 e 158, (3) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 123,124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 176,144 e 158, (4) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ * ID NOs: 123,124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 177, 144 e 158, (5) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 123,124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 178,144 e 158, (6) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ • ID NOs: 123,124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 179,144 e 158, • 15 (7) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 180,144 e 158, (8) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 123,124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NÓs: 181,144 e 158, (9) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendó CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 . e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ JDi

NOs: 182,144 e 158, (10) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID * NOs: 183, 144 e 158, (11) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 184,144 e 158, (12) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID ^{NOs: 185}’^{144e 158}>

t·’ (13) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs

1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ * 15 ID NOs: 123, 124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID

NOs: 186,144 e 158, (14) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1₍ 2 e3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

NOs: 187,144 e 158, e (15) um anticorpo contendo regiões variáveis de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ

ID NOs: 123,124 e 125 e regiões variáveis de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 consistindo em seqüências de aminoácidos especificadas em SEQ ID NOs: 188,144 e 158.

u * Dentre os anticorpos descritos em (1) a (15), prefere-se o anticorpo descrito em (15).

(IX) Anticorpo descrito em qualquer um das seguintes (1) a (15):

(1) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 191, (2) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a se- ‘ qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 192, (3) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 193, (4) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 194, (5) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 195, (6) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a se- qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 196, (7) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 197, (8) _um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 198, • 15 (9) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 199, (10) um anticorpo tendo uma região variável dé cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 200, (11) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a se20 qüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 201, (12) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 202, (13) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 203, (14) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 204, e (15) um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 205.

Dentre os anticorpos descritos em (1)3 (15), prefere-se o anti30 corpo descrito em (15).

(X) Anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve selecionada dentre o grupo consistindo em regiões variáveis de cadeia leve descritas no : : : ··. : : *: .·* . seguinte (1) a (15):

* (1) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 191, (2) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoáci- dos especificada em SEQ ID NO: 192, (3) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 193, (4) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada êm SEQ ID NO: 194, (5) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 195, <' (6) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 196, (7) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoáci- • 15 dos especificada em SEQ ID NO: 197, (8) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 198, (9) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência dê aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 199, (10) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 200, (11) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 201, (12) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoáci- dos éspecificada em SEQ ID NO: 202, (13) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 203, (14) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 204, e (15) uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 205, e uma região variável de cadeia pesada selecionada dentre o grupo consistindo em regiões variáveis de cadeia

VxSi.

pesada descritas nos seguintes (1) a (7):

’ (1) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 84, (2) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoá- cidos especificada em SEQ ID NO: 85, (3) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 86, (4) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 87, (5) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 88, (6) uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 89, e

Dentre os anticorpos descritos acima, prefere-se o anticorpo • 15 tendo uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 205 e uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO.

90.

(XI) Um anticorpo, em que um ou mais aminoácidos foram substituí20 dos, deletados, adicionados e/ou inseridos na seqüência de aminoácidos descrita em qualquer um dos acima mencionados (I) a (X), e que tem uma atividade equivalente à do anticorpo descrito em qualquer um dentre (I) a

Na presente invenção, a atividade equivalente à do anticorpo descrito em qualquer um dentre (I) a (X) significa que a atividade de ligação a um anticorpo de glipicano 3 humano ou a atividade de citotoxicidade em uma célula que expressa glipicano humano 3 (por exemplo HepG2 ou células CHO recombinantes expressando glipicano 3 humano, etc), e equivalente. a/j

Anticorpo humanizado

Uma modalidade preferida do anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo humanizado que liga a glipicano 3. O anticor37 po humanizado pode ser preparado por uso de um método conhecido.

O anticorpo humanizado é também referido como um anticorpo humano reconformado, que é feito por transplante da região de determinação da complementaridade (CDR) de um anticorpo de um mamífero não humano, por exemplo, um anticorpo de camundongo, no CDR de um anticorpo humano. A tecnologia de DNA recombinante geral para preparação destes anticorpos é também conhecida (ver pedido de patente européia EP 125023 e pedido de patente internacional WO 96/02576).

Especificamente, por exemplo, no caso onde um CDR é derivado de um anticorpo de camundongo, uma seqüência de DNA que foi projetada para ligar os CDRs do anticorpo de camundongo com a região de armação (FR) de um anticorpo humano é sintetizado por método PCR usando vários oligonucleotídeos como iniciadores, que foram preparados de modo a ter posições sobrepondo uma com a outra em ambas as extremidades do CDR e FR (ver o método descrito em pedido de patente internacional WO 98/13388).

Como para a região de armação de um anticorpo humano a ser ligado com o CDR, o que permite que a região de determinação de complementaridade forme um sítio de ligação a antígeno favorável é selecionado. Se necessário, um aminoácido na região de armação de uma região variável do anticorpo pode ser substituído de modo que a região de determinação de complementaridade de um anticorpo humano reconformado possa formar um sítio de ligação a antígeno apropriado (Sato, K. et al., Câncer Res. (1993) 53, 851-856).

A região C de um anticorpo humano pode ser usada como a região C de um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado, por exemplo, Cy1, Cy2, Cy3, e Cy4 pode ser usado na cadeia H, e Ck e CX podem ser , -usados na cadeia L. A região C de um anticorpo humano pode ser também modificada a fim de melhorar a estabilidade do anticorpo ou a produção da mesma. O anticorpo humano a ser usado na humanização pode ser qualquer isotipo de anticorpo humano, por exemplo,, IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, preferivelmente, IgG, mais preferivelmente lgG1 ou lgG3, e particularmente ?·^: · · : ?: : : : X preferivelmente lgG1. Ο lgG1 da presente invenção é eficaz quando um anticorpo é usado como um agente anticâncer em termos de ter uma elevada atividade de citotoxicidade (Chemical immunology, 65: 88 (1997)).

Além disso, após o anticorpo humanizado ser preparado, um aminoácido em uma região variável (por exemplo FR) ou uma região constante pode ser substituído com outro aminoácido.

A origem do CDR em um anticorpo humanizado não é particularmente limitada, e o CDR pode ser derivado de qualquer animal. Por exemplo, é possível usar uma seqüência derivada de um anticorpo de ca10 mundongo, um anticorpo de rato, um anticorpo de coelho, um anticorpo de camelo, ou semelhantes. É preferida uma seqüência de CDR de um anticorpo de camundongo.

Com relação à humanização de um anticorpo, é geralmente difícil humanizar o mesmo enquanto mantendo a atividade de agonista do anti15 corpo original. Na presente invenção, no entanto, um anticorpo humanizado tendo uma atividade de agonista equivalente a do anticorpo de camundongo original foi adquirido com sucesso. Porque a antigenicidade do anticorpo humanizado no corpo humano é reduzida, ele é utilizável na administração do mesmo no humano para um fim terapêutico.

2Q Os exemplos preferidos de anticorpo antiglipicano 3 humanizado na presente invenção incluem, por exemplo, um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada especificada em SEQ ID NO: 84 (GÇ33 VH ver.a), SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), SEQ ID NO: 86 (GC33 VH ver.f), SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i), SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j) ou SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k) ou um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VL ver.a). Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada especificada em SEQ ID NO: 84 (GC33 VH ver.a), SEQ ID NO: 85 (GC33 VH ver.c), SEQ ID NO:

86 (GC33 VH ver.f), SEQ ID NO: 87 (GC33 VH ver.h), SEQ ID NO: 88 (GC33 VH ver.i), SEQ ID NO: 89 (GC33 VH ver.j) ou SEQ ID NO: 90 (GC33 VH ver.k) e uma região variável de cadeia leve especificada em SEQ ID NO: 92 (GC33 VLver.a).

• Além disso, um exemplo preferido do anticorpo humanizado antiglipicano 3 inclui um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 90 e ' 5 uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 205.

A modalidade preferida do anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que se liga ao epítopo ao qual o anticorpo especificado em qualquer um dos seguintes (1) a (8) se liga:

(1) um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 62 e uma região ‘V variável de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácidos especificada em

SEQ ID NO: 73 (GC33), (2) um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada tendo a • 15 seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia leve a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 48 (M11F1), (3) um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 47 (M3B8), (4) um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 60 e uma região variável de cadeia leve a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ

ID NO: 71 (GC199), (5) um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 61 e uma região variável de cadeia leve a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 72 (GC202), (6) um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia leve a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ

ID NO: 74 (GC179), * (7) um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ' 5 ID NO: 75 (GC194 (1)), e (8) um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 64 e uma região variável de cadeia leve a seqüência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 76 (GC194 (2)). Mais preferido é um anticorpo que se liga ao epitopo 10 ao qual o anticorpo descrito em qualquer um dentre (1) a (5) se liga, e particularmente preferido é um anticorpo que se liga ao epitopo ao qual o anticorpo descrito em (1) se liga..

* O anticorpo que se liga ao epitopo aò qual qualquer um dos anticorpos acima mencionados se liga é utilizável porque ele tem uma citotoxici* 15 dade particularmente elevada.

O anticorpo descrito em qualquer um de (1) a (7) se liga a uma região do 524^a aminoácido ao 580^a aminoácido de glipicano 3 humano. Em particular, ele se liga a uma região do 524^a aminoácido ao 563^a aminoácido. O anticorpo descrito em qualquer um de (1) a (5) se liga a uma região do 20 537^a aminoácido ao 563^a aminoácido de glipicano 3 humano. O anticorpo descrito em (1) se liga a uma região do 544^a aminoácido ao 553^a aminoácido de glipicano 3 humano. Em particular, ele se liga a uma região do 546^a aminoácido ao 551^a aminoácido.

Os anticorpos reconhecendo os epítopos acima mencionados 25 tem Uma elevada citotoxicidade, assim eles são utilizáveis no tratamento de uma doença como câncer. Particularmente, o anticorpo que se liga a uma região do 546^a aminoácido ao 551^a aminoácido é utilizável porque ele tem uma citotoxicidade particularmente elevada.

Conseqüentemente, a presente invenção inclui os anticorpos 30 que se ligam a um epitopo na região do 524^a aminoácido ao 580^a aminoácido de glipicano 3 humano, preferivelmente uma região do 524^a aminoácido ao 563^a aminoácido, mais preferivelmente uma região do 537^a aminoácido ao 563^a aminoácido, ainda mais preferivelmente uma região do 544^a aminoácido ao 553^a aminoácido, particularmente preferivelmente uma região do 546^a aminoácido ao 551^a aminoácido.

Outra modalidade preferida de acordo com a presente invenção ‘ 5 é um anticorpo que reconhece uma região do 524^a aminoácido ao 563^a aminoácido de glipicano 3 humano e não reconhece uma região do 537^a aminoácido ao 563^a aminoácido.

Uma outra modalidade preferida de acordo com a presente invenção é um anticorpo que reconhece uma região do 537^a aminoácido no 10 563^a aminoácido de glipicano 3 humano e não reconhece uma região do

550^a aminoácido no 563^a aminoácido.

'V A análise de um epitopo reconhecido por um anticorpo pode ser > realizada por um método conhecido dos versados na técnica, por exemplo, por Western blot descrito nos exemplos abaixo.

• 15 O anticorpo que reconhece as regiões acima mencionadas como um epitopo pode ser obtido por um método conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, ele pode ser obtido preparando-se um peptídeo contendo uma seqüência de aminoácidos de uma região de marcação baseada em uma seqüência de aminoácidos de glipicano 3 humano e preparando um 20 anticorpo com o uso de um peptídeo como um imunogene, ou preparando um anticorpo por um método usual e determinando um epitopo que o antiA corpo obtido reconhece, e então selecionando-se o anticorpo que reconhece o epitopo de marcação.

Y presente ihVençãó é um anticorpo tendo uma atividade elevada de ADCC ou um anticorpo tendo uma atividade elevada de CDC em uma célula que expressa glipicano 3.

a expressão uma atividade elevada de ADCC ou uma atividade elevada de CDC, como usada aqui, significa que o anticorpo da inven30 ção tem uma mais atividade elevada de ADCC ou uma mais atividade elevada de CDC do que a de um anticorpo antiglipicano 3 conhecido. Anticorpos glipicano 3 conhecidos incluem, por exemplo, M3C11 e Μ1E07 descritos no pedido de patente internacional WO 2004/22739.

A atividade de ADCC ou a atividade de CDC pode ser medida por um método conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, ela pode ser medida pelo teste de liberação de cromo. Condições específicas do teste 5 de liberação de cromo para medir a atividade de ADCC não são particularmente limitadas, no entanto, por exemplo, ela pode ser medida usando as condições descritas nos exemplos abaixo.

Exemplos das células que expressam glipicano 3 incluem, por exemplo, uma linhagem de célula de hepatoma como HepG2, uma linhagem 10 de células CHO tendo um gene codificando glipicano 3 incorporado nas mesmas e outros. Para medir a atividade de ADCC, prefere-se usar uma linhagem de células HepG2, e para medir a atividade de CDC, prefere-se usar uma linhagem de células CHO recombinante que expressa GPC3. A linhagem de células CHO recombinante que expressa GPC3 pode ser pre15 parada por qualquer método, no entanto, ela pode ser preparada, por exemplo, pelo método descrito nos exemplos abaixo.

No caso onde o anticorpo antiglipicano 3 é usado como um agente anticâncer, prefere-se que ele tenha uma atividade de ADCC no mesmo nível como a de um anticorpo contendo uma região variável de cadeia 20 pesada tendo a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 62 e uma região variável de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 73 (GC33). No caso onde o anticorpo antiglipicano 3 é usado como um agente anticâncer, prefere-se que ele tenha uma atividade de CDC no mesmo nível como a de um anticorpo contendo uma região vari25 ável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 62 e uma região variável de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 73 (GC33).

,Além disso, a presente invenção inclui um anticorpo tendo uma atividade elevada de ligação a glipicano 3.

3Q Na presente invenção, a atividade de ligação do anticorpo a glipicano 3 pode ser medida usando um método conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, ela pode ser medida utilizando a ressonância de plasmon de superfície com BIAcore. Especificamente, uma proteína glipicano 3 é imobilizada em um chip sensor para reagir com um anticorpo, e a interação entre o anticorpo e glipicano 3 pode ser calculada como uma taxa de reação constante do valor de medição. Além disso, com relação à avaliação 5 da atividade de ligação, um teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA), um imunoteste de enzima (EIA), um radioimunoteste (RIA) ou uma técnica de anticorpo fluorescente pode ser usado. Por exemplo, no caso onde se usa um imunoteste de enzima, uma amostra contendo um anticorpo a ser testado, por exemplo, um sobrenadante de cultura de uma célula produzindo 10 um anticorpo a ser testado ou um anticorpo purificado, é adicionada a uma placa que foi revestida com um antígeno ao qual liga-se o anticorpo a ser testado. Então, um anticorpo secundário rotulado com uma enzima, como uma fosfatase alcalina, é adicionado, e o depósito da placa é incubado e lavado. Então, um substrato enzimático como fosfato de p-nitrofenila é adicio15 nado e a absorbância é medida, assim uma atividade de ligação de antígeno pode ser avaliada. O limite superior da atividade de ligação não é particularmente limitado. No entanto, por exemplo, o limite superior pode ser definido dentro da faixa que é considerada tecnicamente possível pelos versados na técnica. Será notado que a faixa que é tecnicamente possível irá aumentar 20 seguindo o avanço da tecnologia.

Além disso, na presente invenção, um aminoácido a ser desamidado ou um aminoácido adjacente a um aminoácido a ser desamidado pode ser substituído com outro aminoácido para o fim de, por exemplo, suprimir desamidação para aumentar a estabilidade do anticorpo. O aminoácido a ser 25 desamidado inclui asparagina e glutamina, preferivelmente asparagina. Um aminoácido adjacente a asparagina não é particularmente limitado e pode ser qualquer aminoácido. Sabe-se que uma seqüência de asparagina- glicina é particularmente suscetível a desamidação, assim, glicina é preferida como o aminoácido adjacente a asparagina. Um aminoácido usado para 30 substituição não é particularmente limitado e pode ser qualquer aminoácido diferente de asparagina e glutamina. Prefere-se um aminoácido diferente de valina e prolina. Conseqüentemente, na presente invenção, no caso onde o anticorpo é desamidado, prefere-se substituir o aminoácido com um aminoá- * cido diferente de asparagina, glutamina, valina e prolina. A supressão de desamidação por substituição de aminoácido pode ser realizada com referência a, por exemplo, o pedido de patente internacional WO 03/057881. No “ 5 caso onde a substituição de aminoácido é realizada com o fim de supressão de desamidação, prefere-se que a atividade de ligação de antígeno antes da substituição seja mantida.

Uma outra modalidade de estabilização do anticorpo inclui a substituição de ácido glutâmico por um outro aminoácido. Além disso, na 10 presente invenção, verificou-se que, no caso onde o 6^S aminoácido da cadeia pesada de um anticorpo é ácido glutâmico, o anticorpo pode ser signifi< cativamente estabilizado substituindo o ácido glutâmico com glutamina.

Consequentemente, a presente invenção também refere-se a um método para estabilizar um anticorpo substituindo o ácido glutâmico na 6^a posição da 15 cadeia pesada do anticorpo com glutamina. A numeração de aminoácidos do anticorpo é conhecida dos versados da técnica (por exemplo, Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services 1983).

* O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo conjugado em 20 que o anticorpo é conjugado com várias moléculas, como polietilenogllcol (PEG), materiais radioativos e toxina. O anticorpo conjugado pode ser preparado modificando-se quimicamente o anticorpo obtido como acima. Métodos para modificar anticorpos já estão estabelecidos na técnica. O anticorpo da invenção engloba um anticorpo conjugado.

O anticorpo da invenção também pode ser um; anticorpo biespecífico (ver, por exemplo, Joumal of Immunology, 1994, 152, 53685374). O anticorpo bi-específico pode reconhecer glipicano 3 e um outro antígeno, ou pode reconhecer diferentes epitopos em uma molécula de GPC3.

Além disso, o anticorpo da invenção pode conter uma certa pro30 teína fundida ao N- ou C-término do anticorpo (Clinicai Câncer Research, 2004, 10,1274-1281). A proteína a ser fundida ao anticorpo pode ser convenientemente selecionada pelos versados na técnica.

Além disso, o anticorpo da invenção inclui um anticorpo com uma citotoxicidade conhecida. Exemplos do anticorpo com uma citotoxicidade melhorada incluem uma fucose desprovida de anticorpo, um anticorpo tendo N-acetil glucosamina bi-seção (GlcNAc) fixada à sua cadeia de açúcar, 5 e um anticorpo tendo atividade de ligação alterada para o receptor Foy obtido substituindo um ou mais aminoácidos na região Fc. Os anticorpos com uma citotoxicidade melhorada podem ser preparados por um método conhecido na técnica.

Método para preparar anticorpo o anticorpo que se liga a glipicano 3 pode ser preparado por um método conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, um hibridoma produzindo anticorpo monoclonal pode ser preparado como a seguir, usando basicamente uma técnica conhecida. Isto é, o hibridoma pode ser preparado imunizando um mamífero de acordo com um método de imunização usual 15 usando uma proteína glipicano 3 ou uma célula que expressa glipicano 3 como um antígeno de sensibilização. O imunócito assim obtido é fundido com uma célula parental conhecida por um método de fusão de célula usual e, então, seleciona-se uma célula produzindo anticorpo monoclonal por um método de triagem comum.

Especificamente, um anticorpo monoclonal pode ser preparado como a seguir. Primeiramente, uma proteína glipicano 3 é obtida com base na seqüência do gene glipicano 3/ aminoácidos mostrada em SEQ ID Nos. 3 e 4, que é usada como um antígeno de sensibilização para obter um antícor B®pb£^èisí éspecificamente, a seqüência de genes codificando glipicano 3 é 25 irisérida em um sistema de vetor de expressão conhecido, e uma célula hospedeira apropriada é transformada com o vetor, e então uma proteína glipicano 3 humana de marcação é purificada por um método conhecido da célula hospedeira ou do sobrenadante de cultura.

Subseqüentemente, esta proteína glipicano 3 purificada é usada como um antígeno de sensibilização. Altemativamente, um peptídeo parcial dé glipicano 3 pode ser usado como um antígeno de sensibilização. Neste caso, o peptídeo parcial também pode ser obtido por síntese química de a46 ··’ :.: ’·/· ’:J ·.'· cordo com a seqüência de aminoácidos de glipicãno 3 humano.

O epítopo em uma molécula de glipicãno 3 que é reconhecido pelo anticorpo antiglipicano 3 da presente invenção não é limitado a um epitopo particular. O anticorpo anti glipicãno 3 pode reconhecer qualquer epito5 po, contanto que o epítopo esteja presente em uma molécula de glipicãno 3. Conseqüentemente, qualquer fragmento também pode ser usado como um antígeno para produzir o anticorpo anti glipicãno 3 da presente invenção, contanto que ele contenha um epítopo que está presente em uma molécula de glipicãno 3.

Um mamífero a ser imunizado com um antígeno de sensibilização não é particularmente limitado, mas é, preferivelmente, selecionado em vista da compatibilidade com uma célula parental a ser usada para fusão de célula. Por exemplo, roedores como camundongos, ratos e hamsters, coelhos ou macacos são geralmente usados.

A imunização de um animal com um agente de sensibilização é realizada de acordo com um método conhecido. Por exemplo, a imunização é realizada por um método geral em que um mamífero é injetado intraperitonealmente ou subcutaneamente com um agente de sensibilização. Especificamente, o agente de sensibilização é diluído com ou colocado em suspen20 são em uma quantidade apropriada de PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica, ou outros, uma quantidade apropriada de um adjuvante padrão como um adjuvante completo de Freund é misturada com o produto, se necessário, e então a solução é emulsificada e adminis- /.trada a um mamífero várias vezes a cada 4 a 21 dias. Além disso, um veícu25 Io apropriado também pode sér usado quando de imunização com um agente de sensibilização.

Um mamífero é imunizado como descrito acima e, então, um . : v nível aumentado de um anticorpo de marcação no soro é confirmado. Sub- > · ·. , seqüentemente, imunócitos são coletados do mamífero e, então, submetidos a fusão de célula. Um imunócito particularmente preferido é um esplenócito.

Como uma célula parceira parental a ser fundida com o imunócito acima mencionado, uma célula de mieloma de mamífero é usada. ExemAri pios de uma linhagem de células da célula de mieloma que é preferivelmente usada aqui incluem várias linhagens de células conhecidas como P3 (P3x63 Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63 Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and immunology (1978) 81,1-7), NS-1 (Kohler. G e Mils5 tein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) e R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277,131-133).

₁₀ Fusão de célula dos imunócitos acima mencionados com células de mieloma pode ser basicamente realizada de acordo com um método conhecido, por exemplo, o método de Kohler e Milstein et al. (Kohler, G. e Milstein, C„ Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mais especificamente, a fusão de célula acima mencionada é realizada em uma solução de cultura de nutrição normal na presença de, por exemplo, um acelerador de fusão de célula. Como o acelerador de fusão de célula, por exemplo, polietileno glicol (PEG), um vírus hemaglutinante do Japão (HVJ) é usado. Se desejado, um adjuvante como sulfóxido de dimetila pode ser adicionado para ainda melhorar a eficácia de fusão.

A relação de imunócitos para células de mieloma pode ser apropriadamente selecionada. Por exemplo, prefere-se que o número de imunócitos seja 1 a 10 vezes maior do que o de células de mieloma. A solução de cultura a ser usada para a fusão de célula acima mencionada inclui, por exemplo, uma solução de cultura RPMI1640 ou uma solução de cultura de

MEM que é apropriada para o crescimento da linhagem de células de mieloma acima mencionada, ou uma outra solução de cultura normal que é usada para este tipo de cultura de células. Além disso, um suplemento de soro, como soro de .bezerro fetal (FCS), pode ser usado em combinação com a mesma.

A fusão de célula é realizada como a seguir. Quantidades predeterminadas dos imunócitos e células de mieloma acima mencionados são bem misturadas na solução de cultura acima mencionada, uma solução de

PEG (por exemplo, com um peso molecular médio de aproximadamente 1000 a 6000) (como uma concentração geral de 30 a 60% (p/v)), que foi préaquecida em aproximadamente 37 °C, é adicionada e, então, a solução é misturada, assim uma célula de fusão de marcação (hibridoma) é formada.

Subseqüentemente, uma solução de cultura apropriada é sucessiva mente adicionada e, então, uma etapa de remoção do sobrenadante por centrifugação é repetida para remover um reagente para fusão de célula, ou semelhante, que é desfavorável para o crescimento do hibridoma.

O hibridoma assim obtido é selecionado cultivando o hibridoma em uma solução de cultura seletiva padrão como uma solução de cultura de HAT (uma solução de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). O cultivo na solução de cultura de HAT acima mencionada continua durante um período de tempo suficiente para as células (células não fundidas) dife rentes de hibridoma de marcação morrerem (normalmente, vários dias a vá15 rias semanas). Subseqüentemente, um método de diluição limitante padrão é conduzido para triar e monoclonar o hibridoma que produz um anticorpo de marcação.

Além do método de imunizar um animal não humano com um antígeno para obter hibridoma, um anticorpo humano desejado tendo uma 20 atividade de ligação a glipicano 3 também pode ser obtido sensibilizando um linfócito humano com glipicano 3 in vitro, e permitindo que o linfócito sensibilizado funda com uma célula de mieloma derivada de humano tendo um potencial de divisão permanente (ver JP-B-1-59878). Em um outro método, o antígeno de glipicano 3 é administrado a um animal transgênico tendo todo o 25 repertório de genes de anticorpos humanos para obter célülas produzindo anticorpo anti glipicano 3, que são então imortalizadas, e um anticorpo humano para glipicano 3 pode ser obtido das células produzindo anticorpo an tiglipicano 3 imortalizadas (ver. pedidos de patentes internacionais WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 e WO 94/02602).

3₀ o hibridoma assim preparado, que produz um anticorpo monoclonal, pode ser cultivado por passagem em uma solução de cultura padrão, ou pode ser armazenado durante um longo período em nitrogênio líquido.

Um exemplo de um método empregado para obter um anticorpo monoclonal do hibridoma envolve cultivar o hibridoma e obter um anticorpo monoclonal do sobrenadante de cultura de acordo com um método padrão. Um outro método envolve administrar o hibridoma a um mamífero que é 5 compatível com o hibridoma para permitir que ele prolifere, e obter um anticorpo monoclonal a partir dos ascitos. O primeiro método é apropriado para obter um anticorpo de pureza elevada, enquanto o último método é apropriado para a produção em massa de anticorpos.

Também é possível preparar um anticorpo recombinante clonan10 do o gene do anticorpo do hibridoma, incorporando o gene em um vetor apropriado, introduzindo o vetor em um hospedeiro e então permitindo que o hospedeiro produza o anticorpo recombinante por uma técnica de engenharia genética (por exemplo, ver Vandamme, A.M. et ai., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990).

₁₅ Especificamente, mRNA codificando a região (V) variável de um anticorpo antiglipicano 3 é isolado de um hibridoma produzindo o anticorpo antiglipicano 3. O mRNA é isolado por um método conhecido como um método de ultracentrifugação de guanidina (Chirgwin, J.M. et ai., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) ou um método AGPC (Chomczynski, P. et ai., Anal.

Biochem. (1987) 162, 156-159) e RNA total é preparado, e então mRNA de marcação é preparado usando um kit de purificação de mRNA (Pharmacia) ou outros. Além disso, o mRNA também pode ser diretamente preparado usando um kit de purificação de mRNA QuickPrep (Pharmacia).

q cDNA da região V de anticorpo é sintetizado usando transcrip25 tase reversa do mRNA assim obtido. O cDNA pode ser sintetizado usando um kit de síntese de cDNA de primeiro filamento de transcriptase reversa AMV (SEIKAGAKU CORPORATION) ou outros. Além disso, por exemplo, um kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech), o método £'-.RACE usando PCR (Frohman, M.A. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998- 9002, 30 Belyavsky, A. et ai. Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919- 2932) pode ser empregado para sintetizar e amplificar cDNA.

O fragmento de DNA de marcação é purificado do produto PCR assim obtido, e então ligado a um DNA de vetor. Um vetor recombinante é preparado do produto e então o vetor é introduzido em E. coli ou outros, e uma colônia é selecionada, preparando, assim, um vetor recombinante desejado. A seqüência de nucleotídeos do DNA de marcação é então determina' 5 da por um método conhecido como um método de terminação de cadeia de dideoxinucleotídeo.

Após obter o DNA codificar a região V do anticorpo antiglipicano 3, este DNA é incorporado em um vetor de expressão contendo DNA codificando a região constante (região C) do anticorpo de marcação.

Para produzir o anticorpo antiglipicano 3 usado na presente invenção, o gene do anticorpo é incorporado em um vetor de expressão de modo que o gene é expressado sob a regulação da região de controle de expressão do gene incluindo, por exemplo, um melhorador e um promotor. A seguir, uma célula hospedeira é transformada com o vetor de expressão, 15 permitindo assim que o hospedeiro expresse o anticorpo.

Um gene do anticorpo pode ser expressado incorporando um polinucleotídeo codificando a cadeia H ou um polinucleotídeo codificando a cadeia L, separadamente, em um vetor de expressão e, então, simultaneamente transformando uma célula hospedeira com os vetores, ou incorporan20 do polinucleotídeos codificando a cadeia H e a cadeia L em um único vetor de expressão e, então, transformando uma célula hospedeira com o vetor (ver pedido de parente internacional WO 94/11523).

Polinucleotídeo

Em um outro aspecto, a presente invenção provê um polinucleo25 tídeo codificando uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve do anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, o polinucleotídeo da presente invenção tem uma seqüência de nucleotídeos descrita em qualquer uma das SEQ ID Nos: 11-21, 33-43, 55-59, 65-70 e 7783. Além disso, um polinucleotídeo que é hibridizado no polinucleotídeo aci30 ma mencionado em condições estringentes e codifica um anticorpo tendo uma atividade equivalente à do anticorpo da presente invenção também está dentro do escopo da presente invenção.

O polinucleotídeo da presente invenção não é particularmente limitado desde que ele codifique o anticorpo da presente invenção. Ele é um polímero composto de uma pluralidade de nucleotídeos, como ácidos deoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA). Ele pode conter uma - 5 base diferente de uma base de ocorrência natural. O polinucleotídeo da presente invenção pode ser usado para produzir um anticorpo por uma técnica de engenharia genética. Além disso, o polinucleotídeo da presente invenção pode ser usado como uma sonda para triar um anticorpo tendo uma função equivalente à do anticorpo da presente invenção. Isto é, um polinucleotídeo 10 codificando o anticorpo da presente invenção ou um fragmento parcial do mesmo pode ser usado como uma sonda para obter DNA que é hibridizado no polinucleotídeo em condições estringentes e codifica o anticorpo tendo . uma atividade equivalente à do anticorpo da presente invenção por técnicas como uma técnica de hibridização, uma técnica de amplificação de gene (por 15 exemplo, PCR). Este DNA também está incluído no polinucleotídeo da presente invenção.

A técnica de hibridização (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2^a ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) é bem-conhecida dos versados na técnica. Exemplos de condições de hibridização incluem, 20 por exemplo, condições de baixa estringência. As condições de baixa estringência são, por exemplo, as condições de 42°C, 0,1x SSC e 0,1% de SDS, preferivelmente as condições de 50°C, 0,1x SSC e 0,1% de SDS quando a lavagem é realizada após hibridização. Exemplos mais preferidos das condições de hibridização incluem, por exemplo, condições de alta estringência.

As condições de alta estringência são, por exemplo, as condições de 65°C, 5x SSC e 0,1% SDS. Nestas condições, pode-se esperar que um polinucleotídeo tendo uma homologia mais alta pode ser eficientemente obtido em temperatura mais alta. Incidentalmente, existem fatores plurais que afetam a estringência de hibridização, como temperatura e a concentração de sal, e os versados na técnica podem obter uma estringência similar selecionando apropriadamente estes fatores.

Um anticorpo funcionalmente equivalente ao anticorpo da pre52 sente invenção, codificado por um polinucleotídeo obtido por esta técnica de hibridização e uma técnica de amplificação de gene, tem geralmente uma alta homologia com o anticorpo em termos da seqüência de aminoácidos. O anticorpo da presente invenção também inclui um anticorpo que é funcio5 nalmente equivalente ao anticorpo da presente invenção e tem uma alta homologia com a seqüência de aminoácidos do anticorpo. Uma homologia elevada significa geralmente pelo menos 50% de identidade ou mais, preferivelmente 75% de identidade ou mais, mais preferivelmente 85% de identidade ou mais, e, além disso, mais preferivelmente 95% de identidade ou mais 10 ao nível de aminoácidos. Para determinar a homologia de polipeptídeos, o algoritmo descrito na literatura (Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80, 726-730) pode ser empregado.

A presente invenção também provê um vetor contendo o polinucleotídeo da presente invenção. Este vetor pode ser usado para preparar o 15 anticorpo da presente invenção. Como para o vetor da presente invenção, no caso em que E. coli é usado como um hospedeiro, por exemplo, ele não é particularmente limitado contanto que tenha ori” para uso em amplificação em E. coli para produzir e amplificar o vetor em uma grande quantidade em

E. coli (por exemplo, JM109, DH5a, HB101 ou XLIBlue), e tenha um gene 20 marcador para selecionar um E. coli transformado (por exemplo, um gene de resistência a drogas que pode ser identificado por uma droga como ampicilina, tetraciclina, canamicina ou cloranfenicol). Exemplos do vetor incluem vetores da série Ml3, vetores da série pUC, pBR322, pBluescript, pCRScript e outros. Além disso, pGEM-t, pDIRECT e pT7 também podem ser 25 usados para subclonar e extrair cDNA bem como os vetores descritos acima.

Como o vetor da presente invenção, um vetor de expressão é particularmente utilizável. Por exemplo, um vetor de expressão a ser expressado em E. coli deve ter as características acima para ser amplificado em E. coli. Além disso, no caso em que E. coli, como JM109, DH5a, HB101 ou 30 XL1-blue, é usado como uma célula hospedeira, é indispensável que o vetor tenha um promotor, por exemplo, promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better et al.,

Science (1988) 240, 1041-1043), promotor T7, ou outros, que podem expressar eficientemente o produto desejado em E. coli. Exemplos deste vetor incluem Pgex-5x-1 (Pharmacia). sistema QIAexpress (Qiagen), pEGFP, pET (neste caso, o hospedeiro é preferivelmente BL21 que expressa RNA de 5 T7 polimerase) e outros, bem como os vetores descritos acima.

Além disso, o vetor também pode conter uma seqüência de sinal para secreção de polipeptídeo. Como para a seqüência de sinal para secreção de proteína, no caso onde um polipeptídeo é produzido no periplasma de E. còlí, a seqüência de sinal pelB (Lei S.P. et al., J. Bacteriol (1987) 169, 10 4379) pôde ser usada. A introdução do vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada usando, por exemplo, o método de cloreto de cálcio e o método de eletroporação.

Além de E. coli, por exemplo, vetores de expressão derivados de mamíferos (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen) e pEGF-BOS (Nucleic Acids 15 Res. (1990) 18 (17), p5322), pEF e pCDM8), vetores de expressão derivados de células de inseto (por exemplo, sistema de expressão de baculovírus Bac-em-BAC (GIBCO BRL) e pBacPAK8), vetores de expressão derivados de plantas (por exemplo, pMH1 e pMH2), vetores de expressão derivados d© vírus d© animal (por ©xemplo, pHSV, pMV e pAdexLcw), vetores de 20 expressão derivados de retrovírus (por exemplo, pZIPneo), vetores de expressão derivados de levedura (por exemplo, Picha Expression Kit (Invitrogen), pNV11 e SP-Q01) e vetores de expressão derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50) podem ser usados como o vetor da presente invenção.

Com o fim de expressar o vetor em uma célula de animal como uma célula CHO, uma célula COS, uma célula NIH3T3 ou outras, é indispensável para o vetor ter um promotor requerido para expressão em uma célula como promotor SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277,108), promotor MMTV-LTR, promotor EF1a (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990)

18, 5322), promotor CMV ou outros, e mais preferivelmente ter um gene marcador (como um gene de resistência a drogas que pode ser identificado por uma droga como neomicina ou G418) para selecionar transformação dentro da célula. Exemplos do vetor tendo estas características incluem, por exemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13.

Além disso, com o fim de expressar estavelmente um gene e, ao mesmo tempo, amplificar os números de cópia do gene na célula, um vetor 5 (por exemplo, pCHOl, etc.) tendo o gene DHFR é introduzido na célula CHO deficiente na via sintética de ácido nucléico para complementar a deficiência e é amplificado com metotraxato (MTX). Além disso, para a amplificação de números de cópias de gene no sistema da célula hospedeira, o vetor de expressão pode incluir, como um marcador selecionável, o gene aminoglicosí10 deo transferase (ΑΡΗ), o gene timidina cinase (TK), gene xantina guaninofosforibosil transferase de E. coli (Ecogpt), o gene dihidrofolato redutase (dhfr)e outros.

Para preparar o anticorpo da presente invenção, o vetor é introduzido em uma célula hospedeira. A célula hospedeira na qual o vetor é in15 traduzido não é particularmente limitada, mas inclui, por exemplo, E. coli ou qualquer uma de várias células de animais. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser usada como um sistema de produção para a produção ou expressão do anticorpo da presente invenção. Como para o sistema de produção de preparação de polipeptídeos, existe um sistema de produção in vitro 20 e um sistema de produção in vivo. O sistema de produção in vitro inclui um sistema de produção que emprega células eucarióticas e um sistema de produção que emprega células procarióticas.

No caso em que se usa a célula eucariótica, por exemplo, uma célula de animal, uma célula de planta ou uma célula fúngica pode ser usa25 da. Células de animal conhecidas incluem uma célula de mamífero como uma célula CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), uma célula COS, uma célula 3T3, uma célula de mieloma, uma célula de rim de hamster bebê (BHK), uma célula HeLa e uma célula Vero, uma célula de anfíbio como um oócito Xenopus (Valle et al., Nature (1981) 291, 358-340), ou uma célula de inseto 30 como Sf9, Sf21 e Tn5. Na presente invenção, CHO-DG44, CHO-DXB11, uma célula COS7, uma célula BHK são preferivelmente usadas. Dentre as células de animal, com o fim de realizar uma grande quantidade de expres-

são, uma célula CHO é particularmente preferida. A introdução do vetor na célula hospedeira pode ser realizada, por exemplo, pelo método de fosfato de cálcio, o método de DEAE-dextrano, o DOTAP de ribozoma catiônico (Boehringer Mannheim), o método de eletroporação, o método de lipofecção, ou outros.

Como para a célula de planta, por exemplo, uma célula derivada de Nicotiana tabacum é conhecida como um sistema de produção de proteína, qUe pode ser submetido à cultura de calos. Exemplos das células fúngicas incluem levedura como o gênero Saccharomyces, mais especificamente 10 Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pombe, e fungos filamentosos como o gênero Aspergillus, mais especificamente Aspergillus niger.

No caso em que se usa a célula procariótica, o sistema de produção usando uma célula bacteriana pode ser empregado. Exemplos das células bacterianas incluem Escherichia coli (E. coli) como JM109, DH5a e

HB101, e Baccilus subtilis.

Preparação de anticorpo recombinante

O anticorpo da presente invenção pode ser preparado cultivando-se as células acima mencionadas. O anticorpo pode ser obtido cultivando-se in vitro uma célula transformada com um polinucleotídeo desejado. O 20 cultivo pode ser realizado de acordo com um método conhecido. Os meios de cultura para células de animal incluem, por exemplo, DMEM, MEM, RPMI 1640 e IMDM. Um suplemento de soro como FBS ou soro de bezerro fetal (FCS) pode ser usado em combinação, ou meio isento de soro pode ser usado. O pH durante o cultivo é preferivelmente cerca de 6 a 8. O cultivo é 25 geralmente realizado em cerca de 30 a 40°C durante cerca de 15 a 200 horas corrí, como necessário, troca de meio, aeração e agitação.

Por outro lado, sistemas para produzir um polipeptídeo in vivo incluem, por exemplo, um sistema de produção que emprega um animal e um sistema de produção que emprega uma planta. O polinucleotídeo de 30 marcação é introduzido no animal ou em uma planta, e o polipeptídeo é produzido no corpo do animal ou da planta e recuperado. O termo célula hospedeira, como usado aqui, engloba um animal e uma planta.

Quando se usa o animal, sistemas de produção empregando um mamífero ou um inseto estão disponíveis. Como o mamífero, cabras, porcos, ovelhas, camundongos e gado podem ser usados (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Um animal transgênico também pode ser 5 usado como um mamífero.

Por exemplo, o polinucleotídeo de marcação é preparado como um gene de fusão com um gene codificando um polipeptídeo que é inerentemente produzido no leite como β caseína de cabra. Então, o fragmento de DNA contendo este gene de fusão é injetado em um embrião de cabra, e o 10 embrião é transplantado em uma cabra do sexo feminino. O anticorpo de marcação pode ser obtido do leite produzido pela cabra transgênica proveniente da cabra que recebeu o embrião ou a prole descendente da mesma. Para aumentar a quantidade de leite contendo o anticorpo produzido pela cabra transgênica, hormônio pode ser dado à cabra transgênica como ne15 cessário. (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Além disso, como um inseto, por exemplo, um bicho-da-seda pode ser usado. No caso onde se usa um bicho-da-seda, um bicho-da-seda é infectado com um baculovírus em que o polinucleotídeo codificando o anticorpo de marcação é inserido. O anticorpo de marcação pode ser obtido do 20 fluido corporal do bicho-da-seda (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592594).

No caso onde se usa uma planta, por exemplo, tabaco pode ser usado. No caso onde se usa tabaco, um polinucleotídeo codificando o anticorpo de marcação é inserido em um vetor de expressão para uma planta, 25 por exemplo pMON 530, e então o vetor é introduzido em uma bactéria como Agrobacterium tumefaciens. Então, tabaco, como Nicotiana tabacum, é infectado com a bactéria, desse modo o anticorpo de marcação pode ser obtido das folhas do tabaco (Julian, K. -C Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24,131-138).

O anticorpo assim obtido pode ser isolado do interior ou do exterior (meio de cultura, etc.) da célula hospedeira e então pode ser purificado em um anticorpo substancialmente puro e uniforme. Separação e purificação do anticorpo podem ser realizadas por um método de separação e de purificação geralmente usado na purificação de polipeptídeos. Por exemplo, polipeptídeos podem ser separados e purificados por quaisquer métodos incluindo colunas de cromatografia, filtração, ultrafiltração, dessalinização, precipitação com solvente, extração de solvente, destilação, imunoprecipitação, SDS- eletroforese de gel poliacrilamida, focalização isoelétrica, diálise, recristalização, e uma combinação dos mesmos.

Exemplos da cromatografia incluem, por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração de gel, cromatografia de fase reversa, cromatografia de adsorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estas cromatografias podem ser realizadas usando uma cromatografia de fase líquida como HPLC e FPLC. Exemplos de uma coluna a ser usada para cromatografia de afinidade incluem uma coluna de proteína A ou uma coluna de proteína G. Um exemplo da coluna de proteína A é Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia).

Além disso, antes ou após purificação do anticorpo, o anticorpo pode ser modificado ou peptídeos podem ser parcial mente removidos, como necessário, deixando uma enzima de modificação de proteína atuar sobre a mesma. A enzima de modificação de proteína para este fim inclui, por exemplo, tripisina, quimotripsina, lisil endopeptidase, proteína cinase, glucosidase.

Método de Diagnóstico

Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para diagnosticar uma doença como câncer detectando a proteína GPC3 em uma amostra de teste com o uso do anticorpo da presente invenção.

A detecção usada aqui inclui detecção quantitativa e detecção não quantitativa. A detecção não quantitativa inclui, por exemplo, determinação simplesmente de se ou não a proteína GPC3 está presente, determinação de se ou não uma quantidade específica, ou mais, de proteína GPC3 está presente, determinação para comparação da quantidade de proteína GPC3 com a de uma outra amostra (por exemplo, uma amostra de controle).

A detecção quantitativa inclui a determinação da concentração de proteína GPC3, determinação da quantidade de proteína GPC3.

A amostra de teste não é particularmente limitada, desde que ela seja uma amostra que pode possivelmente conter proteína GPC3, no entan5 to, prefere-se uma amostra coletada do corpo de um organismo vivo como um mamífero, e mais preferida é uma amostra coletada de humano. Exemplos específicos da amostra de teste podem incluir, por exemplo, sangue, fluido intersticial, plasma, fluido extravascular, fluido cerebral, fluido das juntas, fluido pleural, soro, fluido linfático, saliva, preferivelmente sangue, soro e 10 plasma. Além disso, uma amostra obtida da amostra de teste como solução de cultura de células coletadas do corpo do organismo vivo também é incluída na amostra de teste da presente invenção.

O câncer a ser diagnosticado não é particularmente limitado, e exemplos específicos podem incluir câncer de fígado, câncer pancreático, 15 câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer mamário, câncer de próstata, leucemia e linfoma, preferivelmente câncer de fígado. GPC3 a ser detectado não é particularmente limitado e pode ser tanto GPC3 de comprimento completo como um fragmento do mesmo. No caso em que um fragmento de GPC3 é detectado, ele pode ser tanto o fragmento N-terminal como o frag20 mento C-terminal, no entanto, o fragmento N-terminal é preferido. Além disso, a proteína GPC3 também pode ser um GPC3 adicionado a sulfato de heparano ou uma proteína de núcleo GPC3.

O método para detectar proteína GPC3 contida em uma amostra de teste não é particularmente limitado, no entanto, a detecção é preferivel25 mente realizada por um método imunológico com o uso de um anticorpo antiGPC3. Exemplos do método imunológico incluem, por exemplo, um radioimunoteste, um imunoteste de enzima, um imunoteste de fluorescência, um imunoteste de luminescência, imunoprecipitação, um imunoteste turbimétrico. Um imunoteste de enzima prefere-se, e particularmente preferido é um 30 teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA) (por exemplo, um ELISA intercalado). O método imunológico acima mencionado como um ELISA pode ser realizado por um método conhecido dos versados na técnica.

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Um método de detecção geral com o uso de um anticorpo antiGPC3 compreende imobilizar um anticorpo antiGPC3 sobre um suporte, adicionar uma amostra de teste ao mesmo, incubar o suporte para permitir que o anticorpo antiGPC3 e proteína GPC3 liguem-se um ao outro, lavar o 5 suporte e detectar a ligação de proteína GPC3 ao suporte via o anticorpo antiGPC3 para detectar proteína GPC3 em uma amostra de teste.

A ligação entre o anticorpo antiGPC3 e a proteína GPC3 é geralmente realizado em um tampão. Os tampões usados na invenção incluem, por exemplo, um tampão de fosfato, um tampão Tris. A incubação é rea10 lizada nas condições geralmente empregadas, por exemplo, em 4°C em temperatura ambiente, durante 1 hora a 24 horas. A lavagem após incubação pode ser realizada por qualquer método, contanto que não iniba a ligação entre a proteína GPC3 e o anticorpo antiGPC3, usando por exemplo um tampão contendo um tensoativo como Tween 20.

No método de detectar proteína GPC3 da presente invenção, uma amostra de controle pode ser provida além de uma amostra de teste a ser testada para proteína GPC3. As amostras de controle incluem uma amostra de controle negativo que não contém proteína GPC3 e uma amostra de controle positivo que contém proteína GPC3. Neste caso, é possível de20 tectar proteína GPC3 na amostra de teste comparando o resultado obtido com a amostra de controle negativo que não contém proteína GPC3 com o resultado obtido com a amostra de controle positivo que contém proteína GPC3. Também é possível detectar quantitativamente proteína GPC3 contida na amostra de teste obtendo os resultados de detecção das amostras de controle e da amostra de teste como valores numéricos, e comparando estes valores numéricos.

Uma modalidade preferida para detectar ligação de proteína GPC3 ao suporte via um anticorpo antiGPC3 é um método usando um anticorpo antiGPC3 rotulado com um rótulo detectável. Por exemplo, proteína 30 GPC3 pode ser detectada contatando a amostra de teste com um anticorpo antiGPC3 imobilizado sobre o suporte, lavando o suporte, e então detectando GPC3 com o uso do anticorpo rotulado que liga-se especificamente à pro60 teína GPC3.

A rotulação do anticorpo antiGPC3 pode ser realizada por um método geralmente conhecido. Exemplos de rótulo detectável conhecido dos versados na técnica incluem um pigmento fluorescente, uma enzima, uma co-enzima, uma substância quimioluminescente ou uma substância radioativa. Exemplos específicos podem incluir radioisótopos (³²P, ¹⁴C, ¹²⁵l, ³H, I e outros), fluoresceína, rodamina, cloreto de dansila, umbeliferona, luciferase, peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactosidase, β-glucosidase, peroxidase de raiz forte, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidase, microperoxidase, biotina, e outros. No caso em que se usa biotina como um rótulo detectável, prefere-se que um anticorpo rotulado com biotina seja adicionado, e então avidina conjugada a uma enzima com fosfatase alcalina é ainda adicionada.

Especificamente, uma solução contendo um anticorpo antiGPC3 é adicionada a um suporte, como uma placa, para permitir que o anticorpo antiGPC3 seja imobilizado. Após lavagem, a placa é bloqueada com, por exemplo, BSA a fim de evitar a ligação não específica de uma proteína. A placa é novamente lavada, e então a amostra de teste é adicionada à placa. Após ser incubada, a placa é lavada, e então o anticorpo antiGPC3 rotulado é adicionado. Após ser incubada apropriadamente, a placa é lavada, e então o anticorpo antiGPC3 rotulado restante na placa é detectado. A detecção da proteína pode ser realizada por um método conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, no caso onde o anticorpo é rotulado com uma substância radioativa, a proteína pode ser detectada por cintilação líquida ou o método RIA. No caso em que o anticorpo é rotulado com uma enzima, a proteína pode ser detectada adicionando um substrato e detectando uma mudança enzimática do substrato com a revelação de cor com uma leitora de absorbância. No caso em que o anticorpo é rotulado com uma substância fluorescente, a proteína pode ser detectada com o uso de um fluorômetro.

Uma modalidade particularmente preferida do método de detectar proteína GPC3 da presente invenção é um método usando um anticorpo antiGPC3 rotulado com biotina e avidina. Especificamente, uma solução contendo um anticorpo antiGPC3 é adicionada a um suporte, como uma placa, para permitir que o anticorpo antiGPC3 seja imobilizado sobre o mesmo. Após lavagem, a placa é bloqueada com, por exemplo, BSA a fim de evitar a ligação não específica de uma proteína. A placa é novamente lavada, e então a amostra de teste é adicionada à placa. Após ser incubada, a placa é lavada, e então o anticorpo antiGPC3 rotulado com biotina é adicionado. Após ser apropriadamente incubada, a placa é lavada, e então avidina conjugada a uma enzima como fosfatase alcalina ou peroxidase é adicionada. Após ser incubada, a placa é lavada, e então um substrato da enzima conjugado a avidina é adicionado. Então, a proteína GPC3 é detectada por meio da mudança enzimática do substrato como um indicador.

Uma outra modalidade do método de detectar a proteína GPC3 da presente invenção é um método usando um anticorpo primário que ligase especificamente à proteína GPC3 e um anticorpo secundário que liga-se especificamente ao anticorpo primário. Por exemplo, a amostra de teste é 15 levada em contato com um anticorpo antÍGPC3 imobilizado sobre o suporte, o suporte é incubado e lavado, e a proteína GPC3 ligada após lavagem é detectada com um anticorpo antiGPC3 primário e um anticorpo secundário que liga-se especificamente ao anticorpo primário. Neste caso, o anticorpo secundário é preferivelmente rotulado com um rótulo detectável.

Especificamente, uma solução contendo um anticorpo antÍGPC3 é adicionada a um suporte, como uma placa, para permitir que o anticorpo antiGPC3 seja imobilizado sobre o mesmo. Após lavagem, a placa é bloqueada com, por exemplo, BSA a fim de evitar ligação não específica de uma proteína. A placa é novamente lavada, e então a amostra de teste é adicio25 nada à placa. Após ser incubada, a placa é lavada, e então um anticorpo antiGPC3 primário é adicionado. Após ser apropriadamente incubada, a placa é lavada, e então um anticorpo secundário que liga-se especificamente ao anticorpo primário é adicionado. Após ser apropriadamente incubada, a placa é lavada, e então o anticorpo secundário restante sobre a placa é de30 tectado. A detecção do anticorpo secundário pode ser realizada pelo método acima mencionado.

Composição farmacêutica ύ Ί ::^:,φ.: : ·^{: :}*· ι :· : s ί · ί ·····.:.. ·.· j · ..... ♦ · ··· ···

Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composi* ção farmacêutica contendo o anticorpo da presente invenção. A composição | farmacêutica contendo o anticorpo da presente invenção é utilizável no tratamento e/ou prevenção de uma doença associada com proliferação de célu* 5 Ias como câncer e, particularmente, é utilizável no tratamento e/ou prevenção de câncer de fígado. No caso em que o anticorpo da presente invenção é usado como uma composição farmacêutica, o anticorpo pode ser formulado em uma forma de dosagem por um método conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser usada parentei 10 ralmente na forma de uma injeção de uma solução estéril ou uma suspensão com água ou uma outra solução farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, ί · o anticorpo pode ser formulado em uma forma de dosagem, misturando aprop ri ada mente o mesmo com um solvente ou veículo farmaceuticamente aceitável, como água estéril, solução salina fisiológica, um óleo de planta, 15 um emulsificador, uma suspensão, um tensoativo, um estabilizador, um aromatizante, um excipiente, um veículo, um conservante, um aglutinante para preparar uma forma de dosagem unitária requerida para implementar drogas geralmente aceita. A quantidade de ingredientes ativos nestas preparações é ι _Λ - selecionada de modo a permitir a administração de uma dosagem apropria20 da dentro da faixa indicada.

Uma composição estéril para injeção pode ser formulada usando um veículo, como água destilada, para injeção de acordo com a implementação geral de drogas.

Exemplos da solução aquosa para injeção incluem, por exemplo, 25 solução salina fisiológica, glucose e outros líquidos isotônicos incluindo adjuvantes, como D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Eles podem ser usados em combinação com um solubilizador apropriado, como um álcool, especificamente etanol, um poliálcool como propileno glicol e polietileno glicol, e um tensoativo não iônico como Polysorbate 80 (TM) e HCO-50.

Óleo de gergelim ou óleo de soja pode ser usado como um líquido oleaginoso e pode ser usado em combinação com benzoato de benzila ι ou álcool benzílico como um solubilizador. Ele pode ser formulado com um tampão como tampão de fosfato ou um tampão de acetato de sódio, um exterminador da dor como cloridrato de procaína, um estabilizador como álcool benzílico ou fenol, ou um antioxidante. A injeção preparada é geralmente carregada em uma ampola apropriada.

O método de administração é preferivelmente parenteral e exemplos específicos do mesmo incluem injeção, administração transnasal, administração transpulmonar, administração transdérmica, e outras. A formulação da injeção pode ser administrada sistemicamente ou topicamente por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção 10 subcutânea, ou outras.

O método de administração pode ser apropriadamente selecionado de acordo com a idade e os sintomas de um paciente. Por exemplo, uma dose da composição farmacêutica contendo o anticorpo ou o polinucleotídeo codificando o anticorpo pode ser selecionada da faixa de 0,0001 mg a 15 1.000 mg por kg do peso do corpo. Altemativamente, preferivelmente, a dose pode ser selecionada da faixa de 0,001 mg a 100.000 mg/ corpo por paciente, apesar de não estar sempre limitada a estes valores numéricos. A dose e o método de administração variam de acordo com o peso do corpo, a idade e os sintomas de um paciente, e são apropriadamente selecionadas pelos 20 versados na técnica.

Todas as patentes e referências citadas neste relatório são incorporadas por referência. Todos os conteúdos descritos nos relatórios e desenhos do pedido de patente japonesa 2004-203637, à qual o pedido reivindica prioridade, são incorporados aqui por referência.

EXEMPLO

A presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos abaixo. No entanto, a presente invenção não está limitada a estes exemplos.

Exemplo 1

Clonagem de cDNA de glipicano 3 humano (GPC3)

Um GPC3 humano codificando um cDNA de comprimento completo foi amplificado por reação PCR com um kit Advantage 2 (CLONTECH) :/ : ; · ··.: : : y * usando cDNA de primeiro filamento preparado por um método usual de uma linhagem de células de câncer de cólon, CaCo2, como um gabarito. Mais especificamente, 50 μΙ de uma mistura de reação contendo 2 μΙ de cDNA derivado de Caco2, 1 μ! de um iniciador sentido (GATATC-ATGGCCGGGAC 5 CGTGCGCACCGCGT: SEQ ID NO: 1), 1 μΙ de um iniciador antisentido (GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC: sid 2), 5 μΙ de Advantage 2 10x tampão PCR, 8 μΙ de mistura de dNTP (1,25 mM) e 1,0 μΙ de mistura de Advantage polimerase foram submetidos a 35 ciclos consistindo em 94°C durante 1 minuto, 63°C durante 30 s e 68 °C durante 3 minutos. O produto 10 amplificado da reação PCR foi inserido em um vetor TA, pGEM-T-Easy, usando o sistema I de vetor pGEM-7 Easy (Promega). A seqüência foi confirmada usando um seqüenciador de DNA ABI 3100. Deste modo, um GPC3 humano de comprimento completo codificando cDNA foi isolado. A seqüência mostrada em SEQ ID NO: 3 indica a seqüência de nucleotídeos de gene 15 GPC3 humano e a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 4 indica a seqüência de aminoácidos de proteína GCP3 humana.

Exemplo 2

Preparação de forma solúvel de GPC3 Como imunoproteína para a geração de um anticorpo antiGPC3, 20 uma forma solúvel de proteína GPC3 foi preparada, em que uma região hidrofóbica no lado C-terminal (aminoácidos 564-580) foi deletada.

Usando o cDNA de GPC3 humano de comprimento completo como um gabarito, uma reação PCR foi realizada usando um iniciador antisentido (ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C: SEQ ID NO: 25 5) e um iniciador sentido, no qual uma seqüência de reconhecimento de EcoRI e uma seqüência Kozak foram adicionadas, (ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C: SEQ ID NO: 6). O fragmento de PCR assim obtido (1711 bp) foi clonado em pCXND2-Flag. O pCXND2-Flag foi projetado para expressar uma proteína etiquetada com Flag, inserindo a região para 30 expressão do gene DHFR de pCHOl (Hirata et al., FEBS Letter 1994; 356;

244-248) no sítio Hindlll de pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108; 193-199) e adicionando uma seqüência etiquetada com Flag a jusante do sítio de múlti65 pias clonagens. O DNA do plasmídeo de expressão construído foi introduzido em uma linhagem de células CHO, DXB11, e uma linhagem de células CHO expressando altamente a forma solúvel de GPC3 foi obtida por seleção com 500 pg/ml de Geneticina. O cultivo em grande escala da linhagem de 5 células CHO expressando altamente a forma solúvel de GPC3 foi realizado usando um frasco giratório de 1700 cm², e o sobrenadante de cultura foi recuperado para a purificação do anticorpo. O sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna DEAE sepharose Fast Flow (Amersham) e, após lavagem, o anticorpo foi eluído com um tampão contendo NaCI 500 mM, e purifi10 cado por afinidade usando gel de afinidade de agarose AntiFlag M2 (SIGMA). A eluição foi realizada com 200 pg/ml de peptídeo FLAG. Após o eluado ser concentrado com Centriprep-10 (Millipore),o peptídeo FLAG foi removido por filtração de gel usando Superdex 200 HR 10/30 (Amersham). Por último, o filtrado foi concentrado usando uma coluna DEAE sepharose Fast Flow e 15 eluído com PBS (contendo NaCI 500 mM) sem Tween 20 para efetuar troca de tampão.

Exemplo 3

Preparação de forma solúvel de proteína de núcleo GPC3_

GPC3 é modificado por sulfato de heparano para tornar-se uma macromolécula. Para eliminar um anticorpo contra sulfato de heparano em uma triagem para um anticorpo antiGPC3, uma forma solúvel de proteína de núcleo GPC3 que tinha uma mutação de ponto no sítio de ligação de sulfato de heparano foi preparada e usada na triagem.

Usando a forma solúvel acima mencionada de GPC3 (1-563) 25 como um gabarito, um cDNA, em que resíduos de Ser na 495^a e 509^a posições foram substituídos com Ala, foi preparado pelo método de montagem PCR, em que iniciadores foram projetados para adicionar a etiqueta His ao C-término. O cDNA obtido foi clonado no vetor pCXND3. O pCXND3 foi construído inserindo a região expressando o gene DHFR de pCHOl no sítio 30 Hindlll de pCXN2. O DNA de plasmídeo de expressão construído foi introduzido na linhagem de células DXB11 e uma linhagem de células CHO expressando altamente uma forma solúvel de proteína de núcleo GPC3 foi obtida por seleção com 500 pg/ml de Geneticina.

O cultivo em grande escala foi realizado usando um frasco giratório de 1700 cm² e o sobrenadante de cultura foi recuperado para purificação de anticorpo. O sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna Q 5 sepharose Fast Flow (Amersham). Após lavagem, o anticorpo foi eluído com um tampão de fosfato contendo NaCI 500 mM, e purificado por afinidade visando uma coluna Chelating sepharose Fast Flow (Amersham). O anticorpo foi eluído com um gradiente de imidazol 10 a 150 mM. Por último, o eluado foi concentrado usando uma coluna Q sepharose Fast Flow e, eluído com 10 um tampão de fosfato contendo NaCI 500 mM.

Eletroforese de gel poliacrilamida DSD em condições redutoras mostrou três bandas de 70 kDa, 40 kDa e 30 kDa. O resultado do seqüencíamento de aminoácidos usando um seqüenciador de proteína ABI491 (Applied Biosystems) indicou que a banda de 30 kDa correspondeu à seqüência 15 de aminoácidos 359^a e sua seqüência a jusante ou a 375^a e sua seqüência a jusante de GPC3, sugerindo que GPC3 foi clivado entre Arg358 e Ser359 ou entre Lys374 e Val375, conseqüentemente, foi separada em 40 kDa do fragmento N-terminal e 30 kDa do fragmento C-terminal.

Exemplo 4

Preparação de linhagem de células CHO expressando GPÇ3 humano de comprimento completo

Para obter uma linhagem de células para avaliar a atividade de ligação usando citometria de fluxo, uma linhagem de células CHO expressando GPC3 de comprimento completo foi estabelecida.

Dez microgramas de um vetor de expressão de gene GPC3 humano de comprimento completo e 60 μΙ de SuperFect (QIAGEN) foram misturados. Após um complexo ser formado, a introdução do gene foi realizada adicionando o mesmo a uma linhagem de células CHO, DXB11. Após um cultivo de 24 horas em um incubador de CO2, a seleção foi iniciada usando 30 aMEM (GIBCO BRL) contendo Geneticina em uma concentração final de 0,5 mg/ml e 10% de FBS. As colônias resistentes a Geneticina resultantes foram coletadas e clonagem de células foi realizada limitando 0 método de diluição.

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Cada clone de célula foi solubilizado e a expressão de GPC3 humano de comprimento completo foi confirmada por Western blotting usando um anticorpo antiGPC3. Deste modo, uma linhagem de células expressando estavelmente foi obtida.

Exemplo 5

Avaliação de atividade de ligação por ELISA

A forma solúvel de proteína de núcleo GPC3 foi diluída em 1 pg/ml com um tampão de revestimento (0,1 mol/l de NaHCO₃ (pH 9,6), 0,02% (p/v) de NaN₃) e adicionada a uma imunoplaca e deixada em 4°C du10 rante a noite para revestir a placa. Após a placa ser bloqueada com um tampão de diluição (50 mmol/l de Tris-HCI (pH 8,1), 1 mmol/l de MgCfe, 150 mmol/l de NaCI, 0,05% (v/v) de Tween 20, 0,02% (p/v) de NaN₃, 1% (p/v) de BSA), um anticorpo antiGPC3 foi adicionado e deixado em temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavar com um tampão de enxágüe (0,05% (v/v) 15 de Tween 20, PBS), um anticorpo IgG anticamundongo (ZYMED) rotulado com fosfatase alcalina foi adicionado e deixado em temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavar com o tampão de enxágüe, SIGMA 104 (SIGMA) diluído em 1 mg/ml com um tampão de substrato (50 mmol/l de NaHCO₃ (pH 9,8), 10 mmol/l de MgCI₂) foi adicionado e deixado em temperatura ambiente 20 durante 1 hora para revelação de cor. Então a absorbância (em 405 nm, comprimento de onda de referência de 655 nm) foi medida usando um Benchmark Plus (BIO-RAD).

Exemplo 6

Imunização com forma solúvel de GPC3 e seleção de hibridoma

Uma vez que GPC3 humano e GPC3 de camundongo demonstram uma homologia elevada de 94% ao nível de aminoácidos, foi considerado difícil obter um anticorpo antiGPC3 se um camundongo normal foi imunizado. Conseqüentemente, um camundongo com doença autoimune, camundongo MRL/MpJUmmCrj-1pr)1pr, (daqui em diante referido como ca30 mundongo MRL/lpr, adquirido de Charles River Japan, Inc.) foi usado como um animal imunizado. A imunização foi iniciada na idade de 7 semanas ou 8 semanas. Para a primeira imunização, uma forma solúvel de GPC3 foi pre68 parada em 100 pg/ por cabeça e emulsificada usando adjuvante completo de Freund (FCA, Becton Dickinson) e administrada subcutaneamente. Duas semanas depois, uma forma solúvel de GPC3 foi preparada em 50 pg/ por cabeça e emulsificada usando adjuvante incompleto de Freund (FIA, Becton 5 Dickinson) e administrada subcutaneamente. Após esta, uma outra imunização foi realizada semana sim semana não durante 5 vezes no total. Para dois dos camundongos imunizados, uma forma solúvel de GPC3 foi diluída com PBS em 50 pg/ por cabeça, e então administrada intravenosamente via a cauda como a imunização final. No quarto dia após a imunização final, o 10 baço foi excisado para obter uma célula de baço, que foi misturada com uma célula de mieloma de camundongos, P3-X63Ag8U1 (P3U1, adquirida de ATCC), em uma relação de 2:1. A fusão de células foi realizada adicionando gradualmente PEG 1500 (Roche Diagnostic). Meio RPMI 1640 (GIBCO BRL) foi cuidadosamente adicionado para diluir PEG 1500 e, após PEG ser remo15 vido por centrifugação, as células foram colocadas em suspensão em meio

RPMI 1640 contendo 10% de FBS e inoculadas em uma placa de cultura de 96 cavidades em 100 μΙ/ cavidade. No dia seguinte, meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1x suplemento de meio HAT (SIGMA) e 0,5x suplemento BM-Condimed H1 Hybridoma (Roche Diagnostic) (daqui em diante referido 20 como meio HAT) foram adicionados em 100 μΙ/ cavidade. Após 2, 3 e 5 dias, metade da solução de cultura foi substituída com o meio HAT. Após 7 dias, a triagem foi realizada usando o sobrenadante de cultura. A triagem foi realizada por um ELISA usando uma imunoplaca revestida com a forma solúvel de proteína dé núcleo GPC3. Um clone positivo foi monoclonado limitando o 25 método de diluição. Como um resultado, 11 clones de anticorpos (M3C11,

M13B3, MIE7, M3B8, M11F1, L9G11, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9 e M10D2), que têm uma forte atividade de ligação contra GPC3, foram obtidos.

Exemplo 7

Determinação de isotipo e purificação de anticorpo antiGPC3

O isotipo foi determinado por uma ELISA dependente de antígeno usando um Immunopure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I (PIERCE). A purificação de anticorpos foi realizada como a seguir. O sobrenadante de cultura de hibridoma cultivado com o meio HAT suplementado com FBS (Ultra low IgG) (GIBCO BRL) foi adsorvido em Hi Trap ProteinG HP (Amersham), e lavado com um tampão de ligação (fosfato de sódio 20 mM (pH 5 7,0)). O anticorpo foi eluído com um tampão de eluição (glicina-HCI 0,1 M (pH 2,7)). O eluado foi imediatamente neutralizado com um tampão de neutralização (Tris-HC11 M (pH 9,0)), e dialisado contra FBS durante dia e noite por troca de tampão.

Exemplo 8

Avaliação da atividade de ligação por ELISA

A fim de avaliar convenientemente a atividade de ligação do anticorpo antiGPC3 assim obtido, ligação do anticorpo dependente de concentração foi detectada contra uma imunoplaca contendo a forma solúvel de proteína de núcleo GPC3 imobilizada na mesma. Uma série de diluição em 3 15 vezes (12 diluições no total) do anticorpo purificado em uma concentração de 10 pg/ml foi adicionada, e um anticorpo IgG anticamundongo foi adicionado como o anticorpo secundário. A revelação de cor foi realizada usando SIGMA 104. Uma vez que o grau de revelação de cor varia dependendo do tempo de revelação de cor, dados medidos precisamente após 1 hora foram 20 analisados. Cada anticorpo mostrou uma revelação de cor dependente de concentração. A correlação entre a concentração de anticorpo e o grau de revelação g© cor foi traçada em gráfico e uma curva aproximada foi obtida usando um software de análise, GraphPad Prism. Seu valor EC50 foi determinado como o índice da atividade de ligação. Valores RC50 para todos os 25 clones são mostrados na figura 16.

Exemplo 9

Avaliação de atividade de ligação por citometria de fluxo

Células foram dissociadas com EDTA 1 mM, pH 8,0 (GIBCO)/PBS e colocadas em suspensão em tampão FACS (1% de FBS/PBS) 30 em 1 x 10⁶ células/ml. A suspensão foi dispensada em uma placa de filtro Multiscreen-HV (Millipore) em 100 μΙ/ cavidade e o sobrenadante removido por centrifugação. Um anticorpo antiGPC3, diluído em uma concentração

4,0 apropriada, foi adicionado e reagido em gelo durante 30 minutos. As células foram lavadas uma vez com tampão FACS, e um anticorpo anticamundongo rotulado com FITC foi adicionado e reagido em gelo durante 30 minutos. Após a reação, as células foram centrifugadas em 500 rpm durante 1 minuto e 5 o sobrenadante foi removido. As células foram colocadas em suspensão em

400 μΙ de tampão FACS e submetidas à citometria de fluxo. EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter) foi usado como um citômetro de fluxo. Uma retenção foi colocada na população de células vivas com o histograma de dispersão dianteira e dispersão lateral. Como mostrado na figura 1, um anticorpo 10 antiGPC3 (M3C11, M11F1) ligou-se fortemente à célula CHO expressando

GPC3 e não se ligou à célula CHO parental, indicando que o anticorpo ligase especificamente a GPC3 apresentado na membrana celular. Além disso, o anticorpo mostrou a atividade de ligação a uma linhagem de células de hepatoma, HepG2 (adquirida de ATCC) e HuH-7 (adquirida de Health Scien15 ce Research Resources Bank), sugerindo que o anticorpo pode reconhecer especificamente hepatoma. A atividade de ligação dos clones derivados do camundongo imunizado com uma forma solúvel de GPC3 medida por citometria de fluxo é mostrada na figura 16, onde os valores X-modo de histograma na concentração de anticorpo de 5 μg/ml são indicados.

Exemplo 10

Classificação de epítopos por ELISA competitivo

Os anticorpos obtidos foram classificados de acordo com os epitopos por um ELISA competitivo. Os anticorpos foram biotilinados usando um kit Biotin Labeling (Roche). A forma solúvel de proteína de núcleo GPC3 25 foi diluída em 1 pg/ml com o tampão de revestimento e adicionada a uma placa em 100 μΙ/ cavidade e armazenada em 4°C durante a noite para revestir a placa. No dia seguinte, 200 μΙ do tampão de substrato foram adicionados para bloqueio. A placa foi deixada em 4°C durante a noite, ou mais, e um anticorpo antiGPC3 foi adicionado à placa em 100 μΙ/ cavidade e reagido em 30 temperatura ambiente durante 1 hora. Após isto, sem lavagem da placa, 10 μΙ de 10 μg/ml de anticorpo antiGPC3 rotulado com biotina foram adicionados e ainda reagidos durante 1 hora. A placa foi lavada com 300 μ!/ cavidade do tampão de enxágue por 3 vezes. O conjugado AP- estreptavidina (ZYMED) foi diluído em 1000 vezes com o tampão de diluição e adicionado a 100 μΙ/ cavidade e reagido em temperatura ambiente durante 1 hora. A placa foi lavada com 300 μΙΖ cavidade do tampão de enxágüe por 5 vezes. SIGMA 5 104 foi diluído em 1 mg/ml com o tampão de substrato e adicionado em 100 μΙ/ cavidade. Após incubar durante 1 hora em temperatura ambiente, a absorbância (em 405 nm, comprimento de onda de referência de 655 nm) foi medida.

Os resultados do ELISA competitivo são mostrados na figura 2.

Como para o anticorpo que Inibiu competitivamente a ligação do anticorpo biotinilado em 50% ou mais, considerou-se que seus epítopos estão localizados quase juntos na conformação tridimensional. Como um resultado de classificação de acordo com o padrão de inibição competitiva de revelação de cor contra a ligação dos 8 tipos de anticorpos biotinilados, os 11 clones 15 derivados do camundongo imunizado com uma forma solúvel de GPC3 foram classificados em 5 grupos (a, b, c, d e e) (figura 16).

Exemplo 11

Classificação de epítopos por Western blotting

A forma solúvel de proteína de núcleo GPC3 foi aplicada a um 20 mini SDS-PAGE a 10% (TEFCO) e eletroforada em condições redutoras. Ela foi transferida para Immobilon-P (Millipore) usando Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD). Após a membrana ser rapidamente lavada com TBS-T (0,05% de Tween 20, TBS), ela foi agitada em TBS-T contendo 5% de leite desnatado, durante 1 hora. A membrana foi agitada em 25 TBS-T durante cerca de 10 minutos, então cada anticorpo antiGPC3 diluído com TBS-T contendo 1% de leite desnatado foi adicionado e a membrana agitada durante 1 hora. A membrana foi lavada com TBS-T e agitada em uma solução de anticorpo IgG anticamundongos HRP (Amersham) diluída com TBS-T contendo 1% de leite desnatado durante 1 hora, e então lavada 30 com TBS-T. A revelação de cor foi realizada usando ECL-Plus (Amersham) e detectada usando Hyperfilm ECL (Amersham).

Como mostrado na figura 3, foi determinado que L9G11 é uma ligação de anticorpo no lado N-terminal porque ele ligou-se à banda de cerca de 40 kDa. Foi determinado que M3C11 é uma ligação de anticorpo no lado C-terminal porque ele ligou-se à banda de cerca de 30 kDa. Todos os anticorpos pertencendo ao grupo c, d ou e basearam-se no ELISA competitivo ligado ao lado N-terminal, e todos os pertencendo aos grupos a ou b ligados ao lado C-terminal (figura 16). L9G11 teve sensibilidade de detecção mais alta em Western blotting do que outros anticorpos que ligam-se ao lado Ntemninal, sugerindo que este anticorpo é um utilizável pará detectar o fragmento N-terminal por Western blotting.

Exemplo 12

Deteccão de forma secretada de GPC3

Uma vez que verificou-se que GPC3 é clivado no 358® resíduo de aminoácido ou no 374® resíduo de aminoácido, os inventores levantaram a hipótese de que uma forma secretada de GPC3 é secretada no sangue de um paciente com câncer de fígado. Assim, um sistema ELISA intercalado com GPC3 foi construído a fim de detectar uma forma secretória de GPC3.

Uma imunoplaca foi revestida com um anticorpo antiGPC3 em 10 pg/ml e bloqueada pelo tampão de substrato. Após a imunoplaca ser armazenada durante várias horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C, o sobrenadante de cultura de HepG2 foi adicionado e incubado durante 1 hora em temperatura ambiente. A imunoplaca foi lavada com 300 μΙ/ cavidade do tampão de enxágüe por 3 vezes, e um anticorpo antiGPC3 rotulado com biotina diluído em 10 pg/ml foi adicionado e incubado durante 1 hora em temperatura ambiente. A imunoplaca foi lavada com 300 μΙ/cavidade do tampão de enxágüe por 3 vezes, e AP- estreptavidina foi adicionado e incubado durante 1 hora em temperatura ambiente. A imunoplaca foi lavada com 300 μΙΖ cavidade do tampão de enxágüe por cinco vezes. A revelação de cor foi realizada usando AMPAK (DAKO) de acordo com o protocolo fixado e a absorbância foi medida usando uma leitora de microplaca. Os anticorpos ligando-se ao lado N-terminal (M6B1, M19B11 e M18D4) e os ligando-se ao lado C-terminal (M3C11, M13B3 e M3B8) foram combinados para construir cinco sistemas ELISA intercalado. Cada uma destas combinações i

mostrou uma sensibilidade equivalente na curva padrão usando a forma secretada de GPC3. Estes sistemas foram avaliados usando o sobrenadante de cultura de HepG2. A forma secretada de GPC3 foi detectada em uma alta concentração de cerca de 1 flg/ml com uma combinação dos anticorpos li5 gando-se ao lado N-terminal (figura 4). A concentração detectada com uma combinação de anticorpos ligando-se ao lado C-terminal foi baixa, sugerindo que o fragmento N-terminal estava dominantemente presente na forma secretada de GPC3.

Subseqüentemente, o sobrenadante de cultura de HepG2 foi ímunoprecipitado usando um anticorpo antiGPC3 para detectar a forma secretada de GPC3. No caso em que foi usado M10D2 que liga-se ao fragmen* to N-terminal, a forma secretada de GPC3 de 40 kDa foi detectada (figura 5).

- Por outro lado, no caso em que foi usado Μ1E7 que liga-se ao fragmento Cterminal, a forma secretada de GPC3 não foi detectada. O teste de imuno15 precipitação foi realizado para todos os anticorpos GPC3 obtidos. Cada antij corpo ligando-se ao fragmento N-terminal detectou fortemente a forma secretada de GPC3, enquanto a forma secretada de GPC3 não foi detectada ou foi fracamente detectada com o uso dos anticorpos ligando-se ao fragmento C-terminál (figura 16). É esperado que o anticorpo que pode detectar a forma secretada de GPC3 por imunoprecipitação seja utilizável como um anticorpo para diagnosticar hepatoma. Além disso, o anticorpo que pode dificilmente detectar a forma secretada de GPC3 é esperado como sendo utilizável no desenvolvimento de um anticorpo terapêutico tendo uma atividade ί de ADCC e uma atividade de CDC, porque este anticorpo pode migrar para !

a lesão de hepatoma sem ser aprisionado na forma secretada de GPC3 presente no sangue.

Exemplo 13

Clonagem de região variável de anticorpo antiGPC3

Uma região variável de anticorpo antiGPC3 foi amplificada pelo método RT-PCR usando o RNA total extraído de um hibridoma produzindo anticorpo antiGPC3. O RNA total foi extraído de 1 x 10⁷ células de hibridoma com o uso de mini-kits RNeasy Plant (QIAGEN). Ao usar 1 μg de RNA total, o fragmento de gene 5'-terminal foi amplificado com o uso de um kit de amplificação cDNA SMART RÀCE (CLONTECH) e qualquer um dos seguintes oligonucleotídeos sintéticos:

um oligonucleotídeo sintético MHC-lgG1 complementar à seqüência de uma região constante de lgG1 de camundongo:

GGG CCA GTG GAT AGACAG ATG (SEQ ID NO: 7);

um oligonucleotídeo sintético MHC-lgG2a complementar à seqüência de uma região constante de lgG2a de camundongo:

CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG (SEQ ID NO: 8);

um oligonucleotídeo sintético MHC-lgG2b complementar à seqüência de uma região constante de lgG2b de camundongo:

CAG GGG CCA GTG GAT AGA CTG ATG (SEQ ID NO: 9); e um oligonucleotídeo sintético kappa complementar à seqüência de uma região constante de cadeia kappa de camundongo:

GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG (SEQ ID NO: 10).

Uma reação de transcrição reversa foi realizada a 42 °C durante e 30 min. A mistura de PCR (50 μΙ_) continha 5 μΙ_ de tampão 10x Advantage 2 PCR, 5 μΙ_ de 10x Universal Primer A Mix, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGIP, dCTP e dTTP), 1 pL de Advantage 2 Polymerase Mix (todos de CLONTE20 CH), 2,5 pL de produto de reação de transcrição reversa e 10 pmol de oligonucleotídeo sintético MHC-lgG1, MHC-lgG2a, MHC-lgG2b ou kappa. PCR foi realizados com 5 ciclos consistindo em 94°C durante 30 segundos, 94°C durante 5 segundos e 72°C durante 3 minutos, 5 ciclos consistindo em 94°C durante 5 segundos, 70°C durante 10 segundos e 72°C durante 3 minutos, e 25 25 ciclos consistindo em 94°C durante 5 segundos, 68°C durante 10 segundos e 72°C durante 3 minutos. Por último o produto de reação foi aquecido a 72 °C durante 7 min. Cada produto de PCR foi purificado do gel agarose usando um kit de extração QIAquick Gel (QIAGEN), clonado em vetor pGEMT Easy (Promega), e a seqüência de nucleotídeos foi determinada.

As seqüências de nucleotídeos das regiões variáveis de cadeia

H de M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, M10D2 e L9G11 são mostradas em SEQ ID NOs: 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, :: .· · « · ········ · · ·

18, 19, 20 e 21, respectivamente, as seqüências de aminoácidos dos mesmos são mostradas em SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 e 32, respectiva mente. As seqüências de nucleotídeos das regiões variáveis de cadeia L são mostradas em SEQ ID NOs: 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42 e 43, respectivamente, e as seqüências de aminoácidos dos mesmos são mostradas em SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 e 54, respectivamente.

Exemplo 14

Classificação de epitooos usando proteína de fusão de GST

Para realizar uma análise detalhada dos epitopos para os anticorpos ligando ao fragmento C-terminal, as proteínas de fusão de peptídeos C-terminaís encurtados com sucesso de GPC3 com GST, ou seja GÇ-1 (de Ser495 a Lys563), GC-2 (de Gly510 a Lys563), GC-3 (de Ala524 a Lys563), GC-4 (de Gly537 a Lys563) e GC-5 (de Ser550 a Lys563) foram preparadas.

A região C-terminal de GPC3 foi clonada em pGEX-4T-3 (Amersham) para construir um DNA plasmídeo em que a região C-terminal de GPC3 é ligada ao lado C-terminal de GST. O DNA plasmídeo foi introduzido em DH5 a, assim um transfomnante foi obtido. Então, IPTG foi adicionado a 1 mM a uma cultura do transfomnante na fase de crescimento logarítmico para induzir a expressão de uma proteína de fusão GST. As células bacterianas foram coletadas após 2 h de cultivo. As células foram homogeneizadas por sonicação, e centrifugadas a 35.000 rpm durante 30 min com ultracentrífuga XL-80 (Beckman, 70.1 rotor Ti). Então, o sobrenadante de cultura foi recuperado e purificado com módulos de purificação de GST (Amersham). As proteínas de fusão de GST assim purificadas foram separadas por SDS-PAGE sob condições redutoras, e Western blotting foi realizado com os anticorpos antiGPC3 (figura 6). M3C11 e M1E7 detectaram GC-1 e GC-2, enquanto que não detectaram GC-3, GC-4 e GC-5, indicando que os epitopos destes anticorpos estão contidos na região de GC-2, e que a região de GC-3 não é suficiente.

M3B8 e M11F1 detectaram GC-1 GC-2, GC-3 e GC-4, enquanto não detectaram GC-5, indicando que os epitopos destes anticorpos estão contidos na região de GC-4, e que a região de GC-5 não é suficiente. A região mínima da proteína de fusão GST ao qual cada anticorpo pode se ligar é listada na coluna Western blotting da figura 16.

Exemplo 15

Preparação de anticorpo quimérico camundongo-humano antiGPC3

As seqüências das regiões variáveis de cadeia H e cadeia L dos anticorpos antiGPC3 foram ligadas às seqüências de regiões constantes de cadeia kappa e lgG1 humano. PCR foi realizada usando um oligonucleotídeo sintético que é complementar à seqüência de nucleotídeos 5* -terminal da região variável de cadeia H de cada anticorpo e tem uma seqüência Kozak, e um oligonucleotídeo sintético, que é complementar à seqüência de nucleotídeo 3'-termínal e tem um sítio Nhel. O produto PCR obtido foi clonado em vetor pB-CH em que uma região constante de lgG1 humano foi inserida em um vetor pBluescript KS(+) (Toyobo). A região variável de cadeia H de camundongo e a região constante de cadeia H humana (cadeia γ1) foram ligadas via o sítio Nhel. O fragmento de gene de cadeia H preparado foi clonado em um vetor de expressão pCXND3. Por outro lado, PCR foi realizada usando um oligonucleotídeo sintético, que é complementar à seqüência de nucleotídeo 5-terminal da região variável de cadeia L de cada anticorpo e tem uma seqüência Kozak, e um oligonucleotídeo sintético que é complementar à seqüência de nucleotídeos 3’-terminal e tem um sítio BsiWI. O produto PCR obtido foi clonado em vetor pB-CL em que a região constante de cadeia kappa humana foi inserida em vetor pBluescript KS(+) (Toyobo). A região variável de cadeia L humana e a região constante são ligadas via o sítio BsiWI. O fragmento de gene de cadeia L preparado foi clonado em um vetor de expressão, pUCAG. Este vetor pUCAG foi obtido por clonagem de um fragmento de 2,6 kbp obtido por digestão de pCXN (Niwa et al., Gene 1991, 108: 193-200) com uma enzima de restrição BamHI no sítio BamHI de vetor pUC19 (Toyobo).

Para preparar um vetor de expressão para um anticorpo quimérico camundongo-humano antiGPC3, um fragmento de gene foi obtido por digestão de vetor pUCAG contendo o fragmento de gene de cadeia L com

:.: : j ; : : : ..· ;

• · ·«······ · · « uma enzima de restrição Hindlll (Takara Shuzo), e clonado no sítio Hindlll de pCXND3 contendo o gene de cadeia H. Este plasmídeo irá expressar um gene de resistência à neomicina, gene DHFR e um anticorpo quimérico camundongo-humano antiGPC3 em uma célula de animal.

Uma linhagem de células CHO (linhagem de células DG44) expressando estavelmente o anticorpo foi preparada como a seguir. O gene foi introduzido nas células pelo método de eletroporação usando pulsador II de genes (Βίο-Rad). Uma mistura obtida por misturação de 25 pg de vetor de expressão para cada anticorpo quimérico camundongo-humano antiGPC3 e 10 0,75 mL de uma solução de células CHO colocadas em suspensão em PBS (1 χ 10⁷ célula/mL) foi resfriada em gelo durante 10 min, e transferida para uma pequena cuba. Então, um pulso foi aplicado a 1,5 kV e uma capacitância de 25 pFD. Após um período de recuperação de 10 min em temperatura ambiente, as células eletroporadas foram colocadas em suspensão em 40 15 mL de meio CHO-S-SFM II (Invitrogen) contendo suplemento 1x HT (Invitrogen). A suspensão foi diluída em 50 vezes com o mesmo meio, e distribuída em uma placa de cultura de 96 cavidades a 100 μι/ cavidade. Após uma cultura de 24 h em um incubador de CO2 (5% CO2), Geneticina (Invitrogen) foi adicionada a 0,5 mg/mL e as células foram cultivadas durante 2 semanas.

O sobrenadante de cultura foi tomado da cavidade tendo uma colônia de células transformadas resistentes à geneticina e a quantidade de IgG foi medida pelo método de determinação da concentração como mostrado abaixo. Uma linhagem de células de elevada produção foi sucessivamente expandida para obter uma linhagem dé células que expressa estavelmente 25 um anticorpo quimérico camundongo-humano antiGPC3. A linhagem de células foi cultivada em uma larga escala e 0 sobrenadante de cultura foi coletado. A purificação de cada anticorpo quimérico camundongo-humano antiGPC3 foi realizada usando um Hi Trap ProtelnG HP (Amersham).

Exemplo 16

Medida de atividade de citotoxicidade dependente de complemento (atividade de CDC)

16.1 - Preparação de tampão veronal de albumina humana

4^ \ ·*; ··. ^:·.

• · ········ · · · · φ *·· · ♦ · · ······ · (HAVB)

Em água milli-Q, 12,75 g de NaCI (tipo superior, Wako Pure Chemicals), 0,5625 g de Na-Barbital (tipo superior, Wako Pure Chemicals) e 0,8625 g de Barbital (tipo superior, Wako Pure Chemicals) foram dissolvidos em um volume final de 200 mL e autoclavados a 121°C durante 20 minutos. Então, 100 mL de água quente autoclavada milli-Q foram adicionados. O pH foi 7,43 (pH recomendado: 7,5). A solução foi usada como um tampão 5x veronal. Em 50 mL de água milli-Q, 0,2205 g de CaCI₂-2H2O (tipo superior, Junsei Chemical) foram dissolvidos em uma concen10 tração final de 0,03 mol/L, que foi usado como uma solução de CaCh. Em 50 mL de água milli-Q, 1,0165 g de MgCl2-6H₂O (tipo superior, Junsei Chemical) foram dissolvidos em uma concentração final de 0,1 mol/L, que foi usado como uma solução de MgCfe. Em água milli-Q, 100 mL do tampão 5x veronal, 4 mL albumina de soro humano (25% Buminate (marca registrada),a concentração de albumina de soro humano : 250 mg/mL, Baxter Healthcare),

2,5 mL da solução de CaCh, 2,5 mL da solução de MgCfe, 0,1 g de KCI (tipo superior, Junsei Chemical) 0,5 g de glicose (D(+)-glicose, glicose anidra, tipo superior, Wako Pure Chemicals) foram dissolvidos em um volume final de 500 mL, que foi usado como HAVB. Após a esterilização em filtro, o HAVB foi armazenado em uma temperatura prefixada de 5°C.

16.2 - Preparação de célula alvo

A célula CHO expressando GPC3 humano de comprimento completo preparado no exemplo 4 foi cultivada em um meio α-MEM contendo ácido nucléico (+) (GIBCO) suplementado com 10% de FBS e 0,5 mg/mL de Geneticina (GIBCO). As células foram dissociadas do disco usando um tampão de dissociação de células (Invitrogen Corp), distribuídas em cada cavidade de uma placa de fundo redondo de 96 cavidades (Falcon) a 1 χ 10⁴células /cavidade e cultivadas durante 3 dias. Após o cultivo, 5,55 MBq de cromo-51 foi adicionado e as células foram cultivadas em um incubador de gás dióxido de carbono a 5% a 37 °C durante 1 h. Estes células foram lavadas com HAVB duas vezes, e 50 pL de HAVB foram adicionados e usados como uma célula alvo.

um se-

16.3 - Teste de liberação de cromo (atividade de CDC)

Cada anticorpo quimérico foi diluído com HAVB para fazer uma solução de anticorpo de 40 pg/mL. À célula alvo, 50 pL de cada solução de anticorpo foram adicionados, e deixados em gelo durante 15 min. Subsequentemente, a cada cavidade, 100 pL de soro humano do sangue periférico de voluntário saudável, que tinha sido diluído com HAVB, foram adicionados a uma concentração final de 25% (a concentração final de anticorpo: 10 pg/mL) e deixados em um incubador de gás dióxido de carbono a 5% a 37 °C durante 90 min. Após a placa ser centrifugada, 100 pL de sobrenadante foram coletados de cada cavidade, a radioatividade foi medida usando contador gama. A taxa de liberação de cromo específica foi obtida pela guinte fórmula.

Taxa de liberação de cromo específica (%) = (A-C) x 100/(B-C)

A representa a radioatividade (cpm) em cada cavidade, representa o valor médio das radioatividades (cpm) nas cavidades em que 100 pL de 2% NP-40 solução aquosa (Nonidet P-40, Código N^fi 252-23, Nacalai Tesque) e 50 pL de HAVB foram adicionados à célula alvo, e C representa o valor médio das radioatividades (cpm) nas cavidades em que 150 pL de HAVB foram adicionados à célula alvo. O teste foi realizado em triplicata e o valor médio e o desvio padrão foram calculados para atividade de CDC (%)·

Os resultados são mostrados em figura 7. Dentre os 9 tipos de anticorpos quiméricos antiGPC3, M3B8 e M11F1, que são um anticorpo reconhecendo o lado C-terminal, mostraram uma forte atividade de CDC contra GPC3 expressando célula CHO, no entanto, a atividade de CDC não foi observada nos outros anticorpos. M3B8 e M11F1 pertencem ao grupo chamado b com base em ELISA competitivo, e um epitopo importante para mostrar uma atividade de CDC forte pode ser encontrado.

Exemplo 17

Medida de atividade de ADCC usando PBMC derivado de sar>

que periférico humano

17.1- Preparação de solução de PBM humano ο¥>

*·* ί'ί ί·* : J 5* ’ί *,5 ··, • · ········ · · ··

Ο sangue periférico heparinizado obtido de um voluntário saudável foi diluído em 2 vezes com PBS (-), e colocado em camadas de topo em placa Ficoll TM PLUS (Amersham). Após centrifugação a 500 x g durante 30 min a 20 °C, a camada do meio, que é a fração de leucócitos mononuclear, foi coletada. As células foram lavadas 3 vezes, colocadas em suspensão em 10% de FBS/ RPMI e usadas como uma solução PBMC humano.

17. 2 Preparação de célula alvo

As células HepG2 cultivadas em 10% de meio FBS/ RPM11640 foram dissociadas do disco usando Tripsina-EDTA (Invitrogen), distribuídas em cada cavidade de placa de fundo em U de 96 cavidades (Fálcon) a 1 x

10⁴ células /cavidade, e cultivadas durante 2 dias. A célula CHO expressando GPC3 humano de comprimento completo preparada no exemplo 4 foi cultivada em meios de ácidos nucléicos a-MEM (+) (GIBCO) suplementado com 10% de FBS e 0,5 mg/mL de geneticina (GIBCO). As células foram dis15 sociadas do disco usando um tampão de dissociação de células (Invitrogen Corp), distribuídas em cada cavidade de uma placa de fundo redondo de 96 cavidades (Falcon) a 1 x 10⁴ células /cavidade e cultivadas durante 3 dias. Cromo 51 (5,55 MBq) foi adicionado a cada célula e as células foram cultivadas em um incubador de gás dióxido de carbono a 5% a 37 °C durante 1

h. Estas células foram lavadas com meio uma vez, e 50 gL de 10% de FBS/ meio RPM11640 foram adicionados e usados como uma célula alvo.

17.3 - Teste de liberação de cromo (atividade de ADCO

À célula alvo, 50 gL de uma solução de anticorpo preparada em diferentes concentrações, foram adicionados, e deixados em gelo durante 15 25 min. Subseqüentemente, 100 μΙ_ de solução de PBMC humano foram adicionados a 5 x 10⁵ células /cavidade, e as células foram cultivadas em um incubador de gás dióxido de carbono a 5% a 37 °C durante 4 horas. Após o cultivo, a placa foi centrifugada, e a radioatividade em 100 μι. de sobrenadante de cultura foi medida usando um contador gama. A taxa de liberação 30 de cromo específica foi obtida pela seguinte fórmula.

Taxa de liberação de cromo específica (%) = (A-C) x 100/(B-C)

A representa o valor médio da radioatividade (cpm) em cada cavidade, B representa o valor médio das radioatividades (cpm) nas cavidades em que 100 pL de 2% de NP-40 solução aquosa (Nonidet P-40, Código N^e 252-23, Nacalai Tesque) e 50 pL de meio 10% de FBS/ RPMl foram adicionados à célula alvo, e C” representa o valor médio das radioatividades 5 (cpm) nas cavidades em que 150 pL de 10% de meio FBS/ RPMl foram adicionados à célula alvo. O teste foi realizado em triplicata e o valor médio e o desvio padrão foram calculados para atividade de ADCC (%). Os resultados são mostrados em figura 8. Dentre 9 tipos de anticorpos quiméricos antiGPC3, os anticorpos reconhecendo o lado Ç-terminal tinham uma tendên10 cia de mostrar uma forte atividade de ADCC.

Exemplo 18

Imunização comm GC-3 e seleção de hibridoma

Dentre os anticorpos antiGPC3 obtidos, somente M11F1 e M3B8 mostraram uma forte atividade de CDC, indicando que a atividade de CDC é 15 dependente de epítopo. Para obter um anticorpo tendo tanto atividade de ADCC como atividade de CDC, uma proteína de fusão de GST contendo o epítopo para M11F1 e M3B8, referido como GC-3, foi usado para imunização. Uma grande quantidade de GC-3 foi purificada pelo método acima mencionado. O tampão foi mudado para PBS por filtração de gel usando 20 Superdex 75 (Amersham). O produto obtido foi üsado como uma imunoproteína. Usando três camundongos Balb/c (adquiridos de Charles River Japan, Inc.) e três camundongos MRL/lpr foram imunizados com GC-3 de acordo com o método acima mencionado. Para a primeira imunização, GC-3 foi preparado a 100 pg/ por cabeça e emulsificado usando FCA, que foi subcu25 taneamente administrado. Duas semanas depois, GC-3 foi preparado a 50 pg/ por cabeça e emulsificado usando FIA, que foi subcutaneamente administrado. Após a quinta imunização, a imunização final (50 pg/ cabeça) foi realizada para todos os camundongos por administração intravenosa da imuno-proteína via a cauda. Após fusão das células, hibridomas foram triados 30 por um ELISA usando uma imunoplaca revestida com a forma solúvel de proteína de núcleo GPC3. Um clone positivo foi monoclonado pelo método de diluição limitativo. Como resultado 5 clones de anticorpos (GC199,

GC202, GC33, GC179 e GC194) que têm uma forte atividade de ligação contra GPC3 foram obtidos.

O anticorpo foi purificado do sobrenadante de cultura do hibridoma usando Hi Trap proteinG HP, e analisado de acordo com o método a5 cima mencionado. O valor de EC50 foi calculado por um ELISA usando uma imunoplaca revestida com a forma solúvel de proteína de núcleo GPC3, e o valor de modo X de histograma a 5 pg/ mL foi medido por citometria de fluxo (figura 17). De acordo com a classificação de epitopos por um ELISA competitivo, os anticorpos foram classificados no grupo b (GC199, GC202 e GC33), 10 é um novo grupo de epitopo f (GC179 e GC194). A classificação de epitopos usando as proteínas de fusão GST indicou que GC199, GC202 e GC33 detectaram GC-1, GC-2, GC-3, e GC-4 mas não detectaram GC-5, sugerindo que os epitopos para estes anticorpos estão contidos na região de GC-4 no mesmo modo què os epitopos para M11F1 e M3B8, e que a região de GC-5 15 não é suficiente. Por outro lado, GC179 e GC194 detectaram GC-1, GC-2 e GC-3, mas não detectaram GC-4 e GC-5, sugerindo que os epitopos para estes anticorpos estão contidos na região de GC-3, e que a região de GC-4 não é suficiente. A região mínima de proteína de fusão GST à qual cada anticorpo pode se ligar é listada na coluna Western blotting da figura 17.

As regiões variáveis de cadeia H e cadeia L de GC199, GC202,

GC33, GC179 e GC194 foram clonadas de acordo com o método acima mencionado, e suas seqüências foram determinadas. Como para a cadeia L de GC194, 2 tipos de seqüências foram clonados. As seqüências de nucleotídeos de regiões variáveis de cadeia H de GC199, GC202, GC33, GC179 e 25 GC194 são mostradas em SEQ ID NOs: 55, 56, 57, 58 e 59, respectivamente, e as seqüências de aminoácidos das mesmas são mostradas em SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63 e 64, respectivamente. AS seqüências de nucleotídeos das regiões variáveis de cadeia L de GC199, GC202, GC33, GC179, GC194(1) e GC194(2) são mostradas em SEQ ID NOs: 65, 66, 67, 68, 69 e 30 70 respectivamente, e as seqüências de aminoácidos das mesmas são mostradas em SEQ ID NOs: 71,72, 73, 74, 75 e 76, respectivamente.

Além disso, estas seqüências de aminoácidos foram examinadas para homologia por comparação com a base de dados das seqüências de aminoácidos de anticorpos conhecidos, pelo que suas regiões de CDR foram determinadas como a seguir.

Anticorpo	CDR	Seqüência de aminoácidos	SEQ ID NO
M13B3(H)	CDR1	NYAMS	103
	CDR2	AINNNGDDTYYLDTVKD	104
	CDR3	QGGAY	105
M3B8(H)	CDR1	TYGMGVG	106
	CDR2	NIWWYDAKYYNSDLKS	107
	CDR3	MGLAWFAY	108
M11F1(H)	CDR1	IYGMGVG	109
	CDR2	NIWWNDDKYYNSALKS	110
	CDR3	IGYFYFDY	111
M5B9(H)	CDR1	______GYWMH	112
	CDR2	AIYPGNSDTNYNQKFKG	113
	CDR3	SGDLTGGLAY	114
M6B1(H)	CDR1	SYAMS	115
	CDR2	AINSNGGTTYYPDTMKD	116
	CDR3	HNGGYENYGWFAY	117
M10D2(H)	CDR1	SYWMH	118
	CDR2	EIDPSDSYTYYNQKFRG	¹¹⁹
	CDR3	SNLGDGHYRFPAFPY	120
L9G11(H)	CDR1	SYWMH	118
	CDR2	TIDPSDSETHYNLQFKD	121
	CDR3	GAFYSSYSYWAWFAY	122
GC33(H)	CDR1	_______DYEMH_______	123
	CDR2	ALDPKTGDTAYSQKFKG	124
	CDR3	_______FYSYTY_______	125
GC179(H)	CDR1	INAMN	126
	CDR2	RIRSESNNYATYYGDSVKD	127
	CDR3	EVTTSFAY	128
GC194(H)	CDR1	_______ASAMN_______	129

• »Ί · ·

Anticorpo	CDR	Seqüência de aminoácidos	SEQ ID NO
	CDR2	RIRSKSNNYAIYYADSVKD	130
	CDR3	DPGYYGNPWFAY	131
GC199(H)	CDR1	DYSMH	132
	CDR2	WINTETGEPTYADDFKG	133
	CDR3	LY	134
GC202(H)	CDR1	TYGMGVG	106
	CDR2	NIWWHDDKYYNSALKS	135
	CDR3	IAPRYNKYEGFFAF	136
M13B3(L)	CDR1	KSSQSLLDSDGKTYLN	137
	CDR2	LVSKLDS	138
	CDR3	WQGTHFPLT	139
M3B8(L)	CDR1	KASQDINNYLS	140
	CDR2	RANRLVD	141
	CDR3	LQCDEFPPWT	142
M11F1(L)	CDR1	RSSQSLVHSNGNTYLH	143
	CDR2	KVSNRFS	144
	CDR3	SQSTHVPWT	145
M5B9(L)	CDR1	RSSKSLLHSNGITYLY	146
	CDR2	QMSNLAS	147
	CDR3	AQNLELPYT	148
M6B1(L)	CDR1	KASQDINKNIl	149
	CDR2	YTSTLQP	150
	CDR3	LQYDNLPRT	151
M10D2(L)	CDR1	RASHSISNFLH	152
	CDR2	YASQSIS	153
	CDR3	______QQSNIWSLT_____	154
L9G11(L)	CDR1	RASESVEYYGTSLMQ	155
	CDR2	GASNVES	156
	CDR3	QQSRKVPYT	157
GC33(L)	CDR1	RSSQSLVHSNGNTYLH	143
	CDR2	KVSNRFS	144
	CDR3	_____SQNTHVPPT	158

Anticorpo	CDR	Seqüência de aminoácidos	SEQ ID NO
GC179(L)	CDR1	KSSKSLLHSNGNTYLN	159
	CDR2	WMSNLAS	160
	CDR3	MQHIEYPFT	161
GC194(L)1	CDR1	RSSKSLLHSYDITYLY	162
	CDR2	QMSNLAS	147
	CDR3	AQNLELPPT	163
GC194(L)2	CDR1	SASSSVSYMY	164
	CDR2	DTSNLAS	165
	CDR3	QQWSSYPLT	166
GC199(L)	CDR1	KSSQSLLHSDGKTFLN	167
	CDR2	LVSRLDS	168
	CDR3	CQGTHFPRT	169
GC202(L)	CDR1	RSSQSIVHSNGNTYLE	170
	CDR2	KVSNRFS	144
	CDR3	FQGSHVPWT	171

Exemplo 19

Medição de atividade ADCC usando célula efetuadora derivada de medula óssea de camundongo

19.1 Preparação de solução de célula efetuadora derivada de 5 medula óssea de camundongo

Células da medula óssea foram coletadas do fêmur de um camundongo SCID (CLEA Jápan, Inc., do sexo masculino, com 10 semanas de idade), e colocadas em suspensão em 10% de meio 1640 FBS/RPMI, em 5 χ 10⁵ células/ml. GM-CSF de camundongo (PeproTech) e IL-2 humano (Pe10 proTech) foram adicionados em 10 ng/ml e 50 ng/ml, respectivamente, e as células foram cultivadas em um incubador de gás dióxido de carbono a 5%, em 37°C, durante 5 dias. Após o cultivo, as células foram raspadas com um raspador e lavadas com o meio uma vez. Então, as células foram colocadas em suspensão em 10% de meio 1640 FBS/RPMI, em 5 χ 10⁶ células/ml, e 15 usadas como uma solução de célula efetuadora derivada de medula óssea de camundongo.

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19.2 Preparação de célula alvo

Uma linhagem de células de hepatoma humano, HuH-7, foi mantida e subcultivada com meio DMEM (SIGMA) contendo 10% de FBS (ThermoTrace). As células foram dissociadas do prato usando tampão de dissoci5 ação de célula (INVITROGEN), dispensadas em cada cavidade de uma placa com fundo em U de 96 cavidades (Falcon) em 1 x 10⁴ células/cavidade, e cultivadas durante 1 dia. Após o cultivo, 5,55 MBq de cromo-51 foram adicionados, e as células foram cultivadas êm um incubador de gás dióxido de carbono a 5%, em 37°C, durante 1 hora. Estas células foram lavadas com o 10 meio uma vez, e 50 μΙ de 10% de meio 1640 FBS/RPMI foram adicionados e usados como uma célula alvo.

19.3 Teste de liberação de cromo (atividade de ADCC)

À célula alvo foram adicionados 50 μΙ de uma solução de anticorpo preparada em diferentes concentrações, e reagidos em gelo durante 15 15 minutos. Subseqüentemente, 100 μΙ da solução de célula efetuadora derivada de medula óssea de camundongo (5 x 10⁵ células/cavidade) foram adicionados e as células foram cultivadas em um incubador de gás dióxido de carbono a 5%, em 37°C, durante 4 horas. Após o cultivo, a placa foi centrifugada, e a radioatividade em 100 μΙ do sobrenadante de cultura foi medi20 da usando um contador gama. A taxa de liberação de cromo específica foi obtida pela seguinte fórmula.

Taxa de liberação de cromo específica (%) = (A-C) x 100/(B-C)

A” representa o valor médio das radioatividades (cpm) em cada cavidade, B representa o valor médio das radioatividades (cpm) nas cavidades em 25 que 100 μΙ de solução aquosa de NP-40 a 2% (Nonidet P-40, código η^Ω 25223, Nacalai Tesque) e 50 μΙ de 10% de meio FBS/RPMI foram adicionados à célula alvo, e C representa o valor médio das radioatividades (cpm) nas cavidades em que 150 μΙ de 10% de meio FBS/RPMI foram adicionados à célula alvo. O teste foi realizado em triplicata e o valor médio e o desvio pa30 drão foram calculados para atividade de ADCC (%).

Os resultados são mostrados na figura 9. Foi revelado que o anticorpo GC33 mostra uma atividade de ADCC quando a concentração de <· ··· · !·· .·. .··«: · *········ ·· · · ··_ « ··« r · · · ··· >·· · anticorpo é 0,1 μρ/ml, ou mais, e mostra atividade mais forte do que o anticorpo GC199.

Exemplo 20

Atividade antitumor de anticorpo GC33 em modelo de camun5 donqo transplantado com hepatoma humano

20.1 Preparação de modelo de camundongo transplantado com hepatoma humano

Uma linhagem de células de hepatoma humano, HuH-7, foi preparada em 5 x 10⁷ células/ml em uma solução contendo meio DMEM e MA10 TRIGEL (BD Bioscience) em uma relação de 1:1. No dia anterior, 100 μΙ de uma solução de anticorpo GM1 antiasialo (Wako Pure Chemicals, um frasco foi dissolvido com 1 ml de água destilada para injeção, depois adicionados 4 ml de solução salina fisiológica) foram administrados intraperitonealmente em um camundongo SCID (sexo masculino, com 5 semanas de idade, CLEA 15 Japan, Inc.). O camundongo foi transplantado com 100 μΙ da suspensão de células acima mencionada (5 x 10⁶ células/ camundongo), subcutaneamente, na área abdominal.

20.2 Preparação e administração de anticorpo

Partindo do dia 20 após o transplante de células, uma solução de anticorpo, preparada no dia de administração em 0,5 mg/ml (grupo de administração de 5 mg/kg) e em 0,1 mg/ml (grupo de administração de 1 mg/kg) com PBS (-) foi administrada ao modelo de camundongo transplantado com células de hepatoma humano em 10 ml/kg via a veia da cauda, uma vez por semana, durante 3 semanas. Como um controle negativo, PBS (-) foi administrado em 10 ml/kg via a veia da cauda, uma vez por semana, durante 3 semanas, de um modo similar. Ambos os grupos consistiam em 6 camundongos cada um.

20.3 Avaliação do efeito antitumor

O efeito antitumor de anticorpo GC33 no modelo de camundon30 go transplantado com células de hepatoma humano foi avaliado com a mudança no volume do tumor com o tempo e peso do tumor em 1 semana após a administração final. O volume do tumor foi calculado pela seguinte fórmula.

Volume do tumor = (eixo maior) x (eixo menor) x (eixo menor) / 2

Como mostrado na figura 10, uma inibição significante de crescimento do tumor foi observada no grupo do anticorpo GC33 com o grupo veículo.

Conseqüentemente, mostrou-se que GC33 tem um efeito antitumor sobre o modelo de camundongo transplantado com células de hepatoma humano.

Exemplo 21

Preparação de anticorpo quimérico camundongo-humano GC33

A cadeia H e a cadeia L de GC33 foram amplificadas por PCR usando um oligonucleotídeo sintético, que é complementar às seqüências de nucleotídeos 5’-terminais e tem uma seqüência Kozak e um sítio Hindlll, e um oligonucleotídeo sintético, que é complementar às seqüências de nucleotídeos 3-terminais e tem um sítio BamHI. Após digestão com Hindlll e Ba15 mHI, o produto PCR obtido foi clonado em um vetor de expressão, HEFgyl, em que a região constante lgG1 humana foi inserida, e um vetor de expressão, HEFgK, em que uma região constante de cadeia kappa humana foi inserida (Sato et al., Mol. Immunol. 1994; 371-381). Os vetores foram introduzidos em uma célula CHO (linhagem de célula DG44) de acordo com o mé20 todo acima mencionado, e uma linhagem de célula expressando estavelmente foi estabelecida. O anticorpo foi purificado do sobrenadante de cultura usando Hi Trap ProteinG HP (Amersham). A concentração de IgG no sobrenadante de cultura foi medida por um ELISA intercalado IgG humano usando IgG antihumano de cabra (BIOSOURCE) e conjugado fosfatase alcalina IgG 25 antihumano de cabra (BIOSOURCE), e a concentração foi determinada pela comparação com um IgG humano comercialmente disponível (Cappel).

Exemplo 22

Medição de atividade de CDC e atividade de ADCC usando anticorpo quimérico camundongo-humano GC3_3

De acordo com os métodos descritos nos exemplos 16 e 17, as atividades de CDC de anticorpos quiméricos camundongo-humano GC33, M3C11 e M1E7 foram medidas. Como para a célula alvo, a célula CHO ex⁸⁹ E^: T :: j j ί*: ί *.·^: • ··· · · · * pressando GPC3 de comprimento completo foi usada para medir a atividade de CDC e HepG2 foi usado para medir a atividade de ADCC. Os resultados são mostrados na figura 11 e figura 12, respectivamente. Foi revelado que em qualquer sistema de teste, GC33 mostra fortes atividade de CDC e ativi5 dade de ADCC comparadas com os outros dois anticorpos.

Exemplo 23

Análise de epitooos para GC33

Para determinar o epítopo para GC33 em detalhes, proteínas de fusão de um outro peptídeo C-terminal mais curto de GPC3 e GST foram 10 preparadas e analisadas por Western blotting. As seqüências de peptídeos derivadas de GPC3 preparadas contidas na proteína de fusão GST são mostradas na figura 13. Uma vez que GC33 pode ligar-se a GC-4 (aa 437-563), mas não pode ligar-se a GÇ-5 (aa 550-563), foi considerado que o epítopo está localizado em uma região contendo pelo menos parte da região de a15 a537-550. Primeiramente, os peptídeos GC-6 (GNSQQATPKDNEIS (SEQ ID NO: 93)), GC-7 (GNSQQATP (SEQ ID NO: 94)), GC-8 (QQAT P K D N (SEQ ID NO: 95)) e GC-9 (T P K D N E I S (SEQ ID NO: 96)) foram preparados. Um DNA oligo dianteiro e um DNA oligo reverso foram preparados, os quais foram projetados de um modo tal que o sítio de divagem da 20 seqüência de reconhecimento de EcoRl é fixado à extremidade 5' e o sítio de divagem da seqüência de reconhecimento de Sall é fixado à extremidade 3', respectivamente. A síntese dos DNAs oligos foi feita por Espec Oligo Service. O DNA foi purificado com cartucho C-18, fosforilado ná extremidade 5' e usado para a análise. Vinte e cinco microlitros do DNA oligo dianteiro (10 25 μΜ) e 25 μΙ do DNA oligo reverso (10 μΜ) foram misturados e reagidos em 94°C durante 5 minutos, em 37°C durante 10 minutos e em temperatura ambiente durante 15 minutos, depois deixados em 4°C durante 10 minutos para recombinar o DNA oligo dianteiro e o DNA oligo reverso. A concentração dos oligos foi determinada pela medição de absorbância na relação molar do 30 inserto no vetor de 3:1. Os oligos foram clonados em pGEX4T-3 digerido com EcoRl e Sall, e a seqüência de nucleotídeos foi confirmada. Uma proteína de fusão GST foi preparada de acordo com o método acima mencionado e purificada usando Gluthatione Sepharose 4B. As proteínas purificadas foram separadas por SDS-PAGE em condições de redução e analisadas por Western blotting usando GC33. Como um resultado, o anticorpo GC33 não pode detectar qualquer proteína de fusão GST fortemente, sugerindo que uma seqüência mais longa no lado C-terminal é necessária para a ligação de GC33 (figura 14). Com base na previsão acima, GC-11 (ATPKDNEIST (SEQ ID NO: 97)), GC-12 (PKDNEISTFH (SEQ ID NO: 98)), GC-13 (D NEISTFHNL (SEQ ID NO: 99)) e GC-14 (EISTF HNLGN (SEQ ID NO: 100)) foram preparados e avaliados do mesmo modo. Como um resul10 tado, GC-11, GC-12 e GC-13 ligaram-se a GC33 mais fortemente, sugerindo que o epitopo para GC33 está localizado na seqüência de 544^a a 553^a (P K D N El S T F H) no C-término de GPC3.

Exemplo 24 Humanizacão de GC33

Dados da seqüência de anticorpo foram obtidos de base de dados Kabat descrita publicamente (ftD://ftD.ebi.ac.uk/Dub/databases/kabat/) e de ImMunoGeneTics Database (IMGT). A região variável de cadeia H e a região variável de cadeia L foram submetidas separadamente à pesquisa de homologia. Como um resultado, verificou-se que a região variável de cadeia

H tem uma alta homologia com DN13 (Smithson et al., Mol Immunol. 1999;

36: 113-124), e verificou-se que a região variável de cadeia L tem uma alta homologia com mRNA IGK de homo sapiens para região VLJ de cadeia leve Kappa de imunoglobulina, cds parcial, clone: K64 do número de acesso de AB064105. A seqüência de sinal do número de acesso de S40357 que tem 25 uma homologia elevada com AB064105 foi usada como uma seqüência de sinal da cadeia L. A região determinante de complementaridade (daqui em diante referida como CDR) de GC33 foi transplantada nas regiões de estrutura (daqui em diante referidas como FR) destes anticorpos humanos para preparar um anticorpo humanizado.

Especificamente, DNAs oligossintéticos de aproximadamente 50 bases foram projetados de modo tal que aproximadamente 20 bases dos mesmos foram hibridizadas e estes DNAs oligossintéticos foram reunidos juntos pelo método de PCR para preparar genes codificando cada uma das regiões variáveis. Eles foram digeridos no sítio HindIII inserido na extremidade do DNA oligossintético 5’-terminal e o sítio BamHI inserido na extremidade do DNA oligossintético 3’-terminal. Os fragmentos foram clonados em um 5 vetor de expressão, HEFgyl, no qual uma região constante IgG humana foi clonada, ou um vetor de expressão, HEFgicl, no qual uma região constante de cadeia kappa humana foi clonada (Sato et al., Mol Immunol., 1994; 371381). A cadeia H e a cadeia L de GC33 humanizado, construídas como acima, foram denominadas ver.a, respectivamente. A atividade de ligação do 10 GC33 humanizado, cujas cadeia H e cadeia L foram ambas ver.a (ver.a/ver.a), foi menor do que a de um anticorpo com regiões variáveis de GC33 de camundongo (camundongo/camundongo). Os anticorpos foram construídos, em que a seqüência de GC33 de camundongo e a seqüência de ver.a foram quimericamente combinadas (camundongo/ver.a, 15 ver.a/camundongo) com respeito à cadeia H e à cadeia L, e suas atividades de ligação foram avaliadas. Como um resultado, um decréscimo na atividade de ligação foi observado em ver.a/camundongo, indicando que o decréscimo na atividade de ligação devido à substituição de aminoácidos foi atribuído à cadeia H (figura 15). Então, cadeias H modificadas, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, 20 ver.j, ver.k foram preparadas. Todos estés GC33 humanizados mostraram atividade de ligação equivalente à de um anticorpo quimérico tendo a região variável de GC33 de camundongo (figura 15). As seqüências de nucleotídeos das regiões variáveis de cadeia H de GC33 humanizado, ver.a, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k foram mostradas em SEQ ID Nos: 77, 78, 79, 80, 25 81, 82 e 83, respectivamente, e as seqüências de aminoácidos dos mesmos foram mostradas em SEQ ID Nos: 84, 85, 86, 87, 88, 89 e 90, respectivamente. A seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos de uma região variável de cadeia L de GC33 humanizado, ver.a, são mostradas em SEQ ID Nos: 91 e 92, respectivamente. Em regiões variáveis de cadeia H de 30 GC33 humanizado ver.i, ver.j e ver.k, o 6® resíduo de ácido glutâmico é substituído com resíduo de glutamina. A estabilidade ao calor destes anticorpos foi significativamente aumentada.

ο

Exemplo 25 * Modificação da cadeia L de GC33 humanizado

Como para a desamidação de proteína, sabe-se que a taxa de reação constante de desamidação é dependente na sequência primária. Sa* 5 be-se também que Asn-Gly é particularmente suscetível de desamidação (Rocinson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2001; 98; 944-949). Como para Asn33 no CDR1 de uma cadeia L de GC33 humanizado ver.a mostrada em SEQ ID NO: 91, a seqüência primária é Asn-Gly, que é prevista ser muito suscetível de desamidação.

Para avaliar o efeito de desamidação de Asn33 na atividade de ligação, um anticorpo modificado foi preparado em qual Asn33 foi substituído por Asp. Uma mutação de ponto foi introduzida usando um kit Quick Change . Site-Directed Mutagenésis (Stratagene). Mais especificamente, 50 μΙ de uma mistura de reação contendo 125 ng de um iniciador de sentido (CTT GTA

CAC AGT GAC GGA AAC ACC TAT: SEQ ID NO: 172), 125 ng de um iniciador antisentido (ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG: SEQ ID NO: 173), 5 μΙ de 10x tampão de reação, 1 μΙ de dNTP mix, 10 ng de HEFgK, em que uma cadeia L de GC33 humanizado ver.a foi clonada e 1 μΙ de Pfu Turbo DNA Polymerase foi submetido a PCR de 12 ciclos consistindo em 95°C, durante 30 s, 55°C durante 1 minuto e 68°C durante 9 minutos. Subseqüentemente, uma enzima de restrição, Dpnl, foi adicionada e a digestão foi realizada em 37°C durante 2 horas, e o produto digerido foi introduzido em célula competente XL1-Blue fixada a um kit, assim um transformante foi obtido. A região variável foi clivada do clone em que cada mutação foi apropriadamén25 te introduzida, e clonada em HEFgK novamente. Ela foi introduzida em uma célula COS7 usando Fugene 6 (Roche) junto com HEFgyl, em que uma cadeia H de GC33 humanizado ver.k foi clonada. O anticorpo transientemente expressado na célula foi recuperado do sobrenadante de cultura. A concentração de anticorpo foi determinada por um ELISA intercalado usando o anti30 corpo IgG antlhumano. A atividade de ligação do anticorpo modificado foi avaliada por um ELISA usando uma imunoplaca revestida com a forma solúvel de proteína de núcleo GPC3. Como mostrado na figura 18, a atividade de ligação foi perdida no anticorpo modificado (N33D), em que Asn33 foi substituído por Asp, sugerindo que o efeito de desamidação de Asn33 na atividade de ligação foi significativo.

Como um método de suprimir desamidação de Asn33, substitui5 ção de Gly34 por um outro aminoácido foi relatada (pedido de patente internacional WO 03057881A1). De acordo com o método acima mencionado, G34 foi substituído por qualquer um de 17 aminoácidos diferentes de Cys e Met usando um kit Quick Change Site-Directed Mutagenesis para preparar uma série de anticorpos modificados, a saber, G34A, G34D, G34E, G34F, 10 G34H G34N, G34P, G34Q, G34I, G34K, G34L, G34V, G34W, G34Y, G34R,

G34S e G34T. Estes anticorpos foram transientemente expressados em células COS7, e a atividade de ligação foi avaliada usando o sobrenadante de cultura. Verificou-se que a atividade de ligação é mantida mesmo se G34 é substituído por um outro aminoácido, exceto para Pro (G34P) e Vai (G34V).

As seqüências de aminoácidos da cadeia leve de CDR1 dos anticorpos acima mencionados são mostradas em SEQ ID NO: 174 (G34A), SEQ ID NO: 175 (G34D), SEQ ID NO: 176 (G34E), SEQ ID NO: 177 (G34F), SEQ ID NO: 178 (G34H), SEQ ID NO: 179 (G34N), SEQ ID NO: 180 (G34T), SEQ ID NO: 181 (G34Q), SEQ ID NO: 182 (G34l), SEQ ID NO: 183 (G34K),

SEQ ID NO: 184 (G34L), SEQ ID NO: 185 (G34S), SEQ ID NO: 186 (G34W), SEQ ID NO: 187 (G34Y), SEQ ID NO: 188 (G34R), SEQ ID NO: 189 (G34V) e SEQ ID NO: 190 (G34P), respectivamente. As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve dos anticorpos acima mencionados são mostradas em SEQ ID NO: 191 (G34A), SEQ ID NO: 192 (G34D), SEQ ID

NO: 193 (G34E), SEQ ID NO: 194 (G34F), SEQ ID NO: 195 (G34H), SEQ ID NO: 196 (G34N), SEQ ID NO: 197 (G34T), SEQ ID NO: 198 (G34Q), SEQ ID NO: 199 (G34I), SEQ ID NO: 200 (G34K), SEQ ID NO; 201 (G34L), SEQ ID NO: 202 (G34S), SEQ ID NO: 203 (G34W), SEQ ID NO: 204 (G34Y), SEQ ID NO: 205 (G34R), SEQ ID NO: 206 (G34V) e SEQ ID NO: 207 (G34P), 30 respectivamente.

O anticorpo da presente invenção pode ser usado como um inibidor de crescimento de células, um agente anticâncer ou um agente para diagnóstico de cânceres.

Exemplo 26

Preparação de linhagem de células de hepatoma humano (SK03) expressando GPC3 humano de comprimento completo

Para obter uma linhagem de célula de modo a avaliar uma atividade biológica dos anticorpos antiGPC3, uma linhagem de células de hepatoma humano expressando GPC3 de comprimento completo foi estabelecida.

Um micrograma de um vetor de expressão de gene GPC3 hu10 mano de comprimento completo tratado com Pvu I foi misturado com 2 μΙ de FuGENE (Roche) para permitir a formação de complexo. O complexo foi adicionado a células SK-HEP-1 (adquiridas de ATCC) para introdução do gene. Após incubação ém incubador de CO2, durante 24 horas, células expressando GPC3 foram selecionadas usando MEM de Dulbecco (D-MEM,

SIGMA) contendo Geneticina, em uma concentração final de 1 mg/ml e 10% de FBS. As colônias resistentes à Geneticina resultantes foram coletadas e a clonagem de célula foi realizada pelo método de diluição limitante. A expressão de GPC3 humano de cada clone de célula foi ensaiada por citometria de fluxo usando o anticorpo quimérico GC33 e anticorpo IgG antihumano de cabra rotulado com FITC (ICN). Deste modo, uma linhagem de células SK03 expressando-se estavelmente foi obtida.

Exemplo 27 Comparação de atividade de CDC e atividade de ADCC de anticorpos guiméricos de camundongo-humano

A fim de comparar diretamente a atividade de CDC e atividade de ADCC dos anticorpos quiméricos de camundongo-humano, GC33, M3C11 e M1E7 descritos no exemplo 22, a atividade de CDC e a atividade de ADCC de três anticorpos foram medidas no mesmo sistema de teste de acordo com o método descrito nos exemplos 16 e 17. Como para a célula de marcação, a célula CHO expressando GPC3 de comprimento completo foi usada para medir a atividade de CDC e SK-03 foi usada para medir a atividade de ADCC. Os resultados são mostrados na figura 19 e figura 20, res₉₅ :W Η’ · · --, ·: ?

: ¾ ·.*·^:.· · · ·:· ’·· ·· pectivamente. Foi revelado que, em qualquer sistema, GC33 mostra atividade de ADCC e atividade de CDC mais fortes comparadas com as de outros

	dois anticorpos. Aplicabilidade Industrial
5	0 anticorpo da presente invenção pode ser usado como um inibidor de crescimento de células, um agente anticâncer e um agente para diagnóstico de cânceres. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
10	<120> Anticorpos anti-glipicano 3 <130> PCG-9009WO <150> JP 2004-203637 <151> 09-07-2004 <160> 173
15	<170> Patentln Versão 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Seqüência Artificial
20	<220> <223> Iniciador PCR <400> 1 gatatcatgg ccgggaccgt gcgcaccgcg t 31 <210> 2
25	<211> 31 <212> DNA <213> Seqüencia Artificial <220> <223> Iniciador PCR
30	<400> 2 gctagçtcag tgcaccagga agaagaagca c 31

<210> 3

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo capaz de se ligar a glipicano 3, caracterizado pelo fato de que é:

(a) um anticorpo que compreende:

(i) uma região variável de cadeia pesada tendo CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 124, e CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 125; e (ii) uma região variável de cadeia leve tendo CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 143, CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 144, e CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 158;

(b) um anticorpo que compreende (i) e que pode inibir competitivamente a ligação do anticorpo de (a) a glipicano 3;

(c) um anticorpo que compreende (ii) e que pode inibir competitivamente a ligação do anticorpo de (a) a glipicano 3;

(d) um anticorpo tendo a mesma atividade de ligação ao glipicano 3 que o anticorpo de qualquer de (a) a (c), em que um resíduo de aminoácido é substituído, deletado ou adicionado e/ou inserido a partir das sequências de aminoácidos definidas em (a);

(e) um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo ao qual o anticorpo de (a) capaz de se ligar, em que o referido anticorpo de (a) compreende ambas as sequências da região variável da cadeia pesada e leve especificadas em (a); ou (f) um anticorpo capaz de se ligar a um peptídeo consistindo na sequência dos resíduos de aminoácidos 546 - 551 de glipicano 3.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre:

(1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ

Petição 870190067438, de 17/07/2019, pág. 9/21

ID NO: 84 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 92;
(2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 92;
(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 86 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 92;
(4) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 87 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 92;
(5) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 88 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 92;
(6) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 89 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 92; ou (7) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 90 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 92.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 (f), caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao peptídeo separado por SDS-PAGE em condições redutoras, é analisado por Western blotting.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre:

(1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia

Petição 870190067438, de 17/07/2019, pág. 10/21 pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 174, 144 e 158, respectivamente;

(2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 175, 144 e 158, respectivamente;

(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 176, 144 e 158, respectivamente;

(4) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 177, 144 e 158, respectivamente;

(5) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 178, 144 e 158, respectivamente;

(6) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 179, 144 e 158, respectivamente;
(7) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região

Petição 870190067438, de 17/07/2019, pág. 11/21 variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 180, 144 e 158, respectivamente;
(8) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 181, 144 e 158, respectivamente;
(9) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 182, 144 e 158, respectivamente;
(10) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 183, 144 e 158, respectivamente;
(11) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124 e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 184, 144 e 158, respectivamente;
(12) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124, e 125, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 185, 144, e 158, respectivamente;
(13) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo CDRs 1, 2 e 3 compreendendo a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 123, 124, e 125, respectivamente, e uma