CN103833852A - 针对磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和t细胞抗原的双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本发明的第一方面涉及一种双特异性抗体，其包含特异性识别磷脂酰肌醇蛋白多糖-3的第一功能域，特异性识别人T细胞抗原CD3的第二功能域，和连接上述功能域的接头。本发明的第二方面涉及编码上述抗体的核苷酸序列。本发明的第二方面涉及包含上述核苷酸序列的载体，包括表达性载体。本发明的第四方面涉及包含上述载体的真核或原核表达系统。本发明的第五方面涉及上述抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

Description

针对磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和T细胞抗原的双特异性抗体

技术领域

本发明涉及肿瘤相关抗体，更具体的，基因工程抗体领域。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3，又称DGSX，GTR2-2，MXR7，OCI-5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70-kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40-kDa左右能够分泌进入血液的可溶性氨基端肽，和30-kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的羧基端肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚依附在细胞膜上。

GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织。但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出GPC3的表达。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等肿瘤中的高表达，GPC3被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。

利用抗GPC3抗体进行肝癌检测和利用抗GPC3抗体的抗体依赖的(ADCC)或补体依赖的(CDC)细胞毒性的研究已有报道，例如CN101186650A(中外制药株式会社)，发明名称为“抗存在于血液中的GPC3的分泌性N-端肽或C-端肽的抗体”；CN102180969A(中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所)，发明名称为“抗肝癌活性单克隆抗体及其应用”，其涉及用GPC3氨基端359-580位氨基酸残基为抗原制备的抗GPC3单克隆抗体；CN101633693A(中国人民解放军第二军医大学)，其涉及针对GPC3的氨基端抗原的单克隆抗体；CN101052878A(株式会社英仙蛋白质科学)，其涉及以使用识别GPC3的N端部位的抗体测定GPC3为特征的监控肝炎重症化的方法；CN1842540A(中外制药株式会社)，其涉及一种据称与传统抗体相比具有较高ADCC活性和CDC活性的抗GPC3单克隆抗体。

此外，表1总结了另外一些自2003年来报道的针对GPC3的单克隆抗体(mAbs)。其中，一种针对GPC3的治疗性mAb最近被报道(Advances in LiverCancer Antibody Therapies：A Focus on Glypican-3 and Mesothelin，BioDrugs.2011 October 1；25(5)：275-284.)，其针对GPC3位于C端524-563位氨基酸残基形成的抗原决定簇。根据该报道单克隆抗体GC33(IgG2a，κ)诱导抗体依赖细胞毒作用(ADCC)并表现出抑制小鼠皮下移植HepG2和HuH-7异种移植物的肿瘤生长，其抗肿瘤作用主要源于自然杀伤细胞。

表1.已知的一些抗GPC3单克隆抗体

然而，仍然有强烈的需要继续探索特异性针对GPC3的治疗性抗体以用于肝癌，黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤的治疗。令人期待的是，这些治疗性抗体需要具有改善的特异性，肿瘤细胞杀伤毒性，HAMA问题，肿瘤杀伤所需的最小剂量等优点。

双特异性抗体(BsAb)技术常被用于改善针对肿瘤的治疗性抗体的功效：将肿瘤相关抗原特异的抗体与具杀伤肿瘤细胞功能的效应细胞的表面触发分子特异的抗体偶联构成的双特异性抗体，可高效地将体内的免疫效应细胞富集于肿瘤细胞周围，激活免疫效应细胞特异性地杀伤肿瘤细胞，从而起到治疗肿瘤的目的。目前双特异性抗体的制备有化学偶联法，杂交瘤法和基因工程法三种。

化学偶联法是先采用还原剂，使不同的两种单克隆抗体或其片段解链，获得单价抗体或抗体片段，再采用异双功能交联剂把两种具有不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联在一起。该方法可快速，大量制备BsAb，但是在交联过程中抗体时有失活，而且难于保证产物的均质性。

杂交瘤法是通过细胞融合的方法，将分泌其中一种单克隆抗体的杂交瘤细胞与经另一种抗原免疫的脾细胞融合，或两种分泌不同单克隆抗体的杂交瘤细胞彼此融合。融合而成的细胞，前者称三体瘤，后者称四体瘤，两者统称二次杂交瘤。杂交瘤方法制备的BsAb生物活性高，但制备繁琐，耗时长，且不易与同时产生的其他没有活性或不需要的抗体分离。此外，人源杂交瘤技术尚未取得突破性进展，该法获得的BsAb在临床应用上面临产生人抗鼠抗体(HAMA)问题和分子量过大的问题，且用该方法制备临床级的BsAb成本很高，难以普及使用。

基因工程法制备BsAb是随着基因工程抗体技术的发展，在小分子抗体的基础上发展起来的，有其明显的优越性，如方法稳定，可大量生产，且成本大大降低，操作简便等。随着基因工程技术的成熟，用不同的方法可将两种不同的单链抗体(ScFv)连接构成小分子的BsAb。根据连接方法不同有三种BsAb的构成形式。(1)微型抗体(Mini-antibody)：利用一个寡聚化的结构域(例如，Fos或Jun亮氨酸拉链)将两个ScFv组装成一个异二聚体的分子。(2)二聚体抗体(Diabodies)：将两个不同抗体的VH和VL用一个短的连接肽(例如，Gly₄Ser)连接成两条不同的单链：VH1-VL2和VH2-VL1，在同一个细胞中共表达，由于短的连接肽使得同一条链的VH和VL难以配对，而仅与另外一条链的、但实际上却是来源相同的V区相匹配，折叠形成一个具有两个抗原结合位点的二聚体分子。(3)单链双功能抗体(single chain bispecific antibody，ScBsAb)：在同一个载体上将两种特异性的scFv用一个域间连接肽(interlinker)相连构成，其中构成两个scFv的链内连接肽(intralinker)常用的是(Gly₄Ser)₃，而连接两个scFv的域间连接肽有两种设计，一种为短的肽链，一般不超过10个氨基酸残基，常用的是Gly₄Ser，这种设计主要目的是防止异源可变区之间的错配。另一种设计方案为长的肽链。域间连接肽设计总的原则是保证抗体可变区结构域发生正确的配对和折叠并保持其生物学活性及稳定性，其次还可根据需要赋予产物一些新的特性，如便于纯化、增强其在体内的半衰期等。

双特异抗体介导的生物免疫导向治疗在肿瘤的生物治疗中有良好的临床应用前景。其特征在于：其一，双特异抗体介导的对肿瘤细胞的杀伤作用是靠激发机体的免疫系统完成的，免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤是高度肿瘤特异性的，且不受MHC的限制。其二，双特异抗体对正常组织是无害的。因此，应用双特异抗体治疗肿瘤是手术，放疗，化疗等传统方法的补充，其真正作用在于消除亚临床病灶，减少乃至消灭肿瘤的复发和转移。表现为既可以根治肿瘤，又可以激发机体产生和维持较长时间的免疫保护作用。

综合小鼠及临床研究结果，制备用于肿瘤治疗的临床级BsAb一般优选需要具备五种特性：①对靶向的肿瘤抗原具有很高的特异性和亲和力；②可单价结合效应细胞表面的细胞毒效应触发分子，并只在遭遇了肿瘤抗原后发生交联，它们不含有Fc段；③可有效地启动高水平的靶向性细胞毒作用以及相应的白细胞群有选择性地在肿瘤局部产生炎症反应；④人源化，降低重复使用后发生的HAMA反应；⑤BsAb应小到足以渗透入肿瘤但又应大到足以在循环中维持足够的时间。

以上述几点为依据，目前，人们开发研究了多种激发不同免疫效应细胞，针对不同肿瘤细胞的双特异性抗体，其中的免疫效应细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞以及LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)和TIL细胞(激活的肿瘤侵润性淋巴细胞)等。T淋巴细胞是特异性细胞免疫应答的主要细胞，是目前研究的最多的效应细胞。CD3分子表达于所有成熟T细胞表面，是所有T细胞表面共同的表面标志。CD3与TCR呈非共价结合，形成完整的TCR-CD3复合物，共同参于对抗原刺激的免疫应答，是目前在双特异性抗体中应用最多且最成功的免疫效应细胞表面的触发分子。

BsAb中的抗CD3抗体与T细胞表面的CD3分子结合后，可产生多种效应功能，实现对肿瘤细胞的杀伤。这些效应功能包括(1)T细胞增殖分化，(2)细胞因子分泌，(3)细胞毒作用。

目前，构建BsAb时所用的抗体一般为Fv片段，这是因为Fv片段是含有完整抗原结合位点的最小单位，分子小(只有完整抗体的1/6)，不含Fc段，免疫原性低，易于穿过血管壁和进入实体瘤，而且还可以用大肠杆菌表达，发酵生产，大大地降低了生产成本，但由于Fv中VH和VL间不能形成共价键，在体内不稳定，很容易解离。为了提高Fv片段的稳定性，在VH和VL间用一条多肽链即连接肽把它们连接起来形成所谓的单链抗体(ScFv)。连接肽通常为一条长15个氨基酸的具有柔韧性的短肽，常用的是(Gly₄Ser)₃。

尽管GPC3分子是肝癌特异的标记物，以及尽管有上述关于涉及CD3的双特异性抗体的记载，但是是否针对任何抗原的抗体与抗CD3抗体组合形成的双功能抗体(包括双功能T细胞介导物，即bispecific T-cell Engager，BiTE)都具有期待的生物学效果从而有效地杀伤肝癌等相关肿瘤细胞是无法预料的。而迄今为止还没有任何关于针对GPC3的双特异抗体的报道，也从一个侧面证明了上述看法。双特异性抗体中，需要两个功能域分别与其结合位点正确结合。而即使每个抗体单独能与其抗原正确结合，也不能保证其在形成双特异性抗体后能保留原来的结合能力，并且由于空间位阻的关系，不能保证形成双特异性抗体后，能顺利地形成协同作用。空间位阻问题可以部分通过柔性接头的设计来解决，但在双特异性抗体的构建的设计不能事先保证解决抗原结合位点的正确折叠和抗原结合能力。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种双特异性抗体，其包含特异性识别磷脂酰肌醇蛋白多糖-3的第一功能域，特异性识别人T细胞抗原CD3的第二功能域，和连接上述功能域的接头。本发明的双特异性抗体具有意想不到的改善的特异性针对肝癌肿瘤细胞的细胞杀伤毒性。

本发明的第二方面涉及编码上述抗体的核苷酸序列。

本发明的第二方面涉及包含上述核苷酸序列的载体，包括表达性载体。

本发明的第四方面涉及包含上述载体的真核或原核表达系统。

本发明的第五方面涉及上述抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

本发明中所使用的术语的含义如下：

“功能域”指的是能够特异性识别和/或结合到表位上的三维结构，例如抗体或抗体片段，包括天然完整抗体，单链抗体(scFV)，Fd片段，Fab片段，F(ab’)₂片段，单结构域抗体片段，分离的CDR片段，及其衍生物。值得注意的是，本发明的功能域的结合位点可以不仅来自于抗体，也可以来自其他与GPC3和/或CD3结合的蛋白质，例如天然存在的表面受体或配体。

“特异性识别”和特异性的程度可以通过经典的免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。

“完整抗体”由两个同样的重链和轻链组成，各条链分别包含一个可变区(V区)和一个或多个恒定区(C区)。可变区负责与抗原结合，而恒定区主要负责结合效应分子。在各可变区有三个具有高度多样性的柔性的环，称作互补决定区(CDR)，其主要负责识别抗原。可变区的其他部分包含刚性的β片层并支持所谓的框架区(FRs)。CDR和FR间隔排列形成三明治结构。

“单链抗体(scFV)片段”指的是通过基因工程构建的抗体片段，其是有通过接头(linker)连接的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联以形成抗原结合位点。ScFV的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一个核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。

“Fd片段”指的是由重链V_H和C_H1组成抗体片段。

“Fab片段”指的是由Fd片段(由重链VH和CH1组成)和整条轻链通过链间二硫键形成的异二聚物。“Fab抗体”的大小是完整抗体的1/3，其只包含一个抗原结合位点。

“F(ab’)₂片段“指的是包含两个相连的Fab片段的二价片段。

“单结构域抗体”由重链可变区或轻链可变区组成。由于该抗体片段只由一个结构域组成，所以得名。该片段的大小是一个完整抗体的1/12。

“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与GPC3或CD3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；Malmborg，免疫学方法杂志183(1995)，7-13)。还包括，例如WO 89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，WO91/10741，WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法。

本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。

本发明使用的抗体或抗体片段可以是人源化的，嵌合的或鼠源的。

“CD3”指的是作为T细胞受体复合物的一部分的表达于T细胞的抗原，其由三个不同的链CD3ε，CD3δ和CD3γ组成。CD3在T细胞上通过例如抗CD3抗体对其的固定作用而产生的集中(clustering)，导致T细胞的活化，与T细胞受体介导的活化类似，但是不依赖于TCR克隆的特异性。绝大多数抗CD3抗体识别CD3ε链。

附图说明

图1(a)：PCR扩增的编码CD3scFv的核苷酸片段凝胶电泳图。右栏为目标扩增产物，左栏为分子量标记分子量标记物(DL2000，购自TAKARA生物技术有限公司)。

图1(b)：PCR扩增的编码GPC3scFv的核苷酸片段凝胶电泳图。左栏为目标扩增产物，右栏为分子量标记分子量标记物(DL2000，购自TAKARA生物技术有限公司)。

图1(c)：PCR扩增的编码GPC3/CD3双特异性抗体的核苷酸片段凝胶电泳图。箭头所指55kD条带是目的扩增产物，右侧为分子量标记物(DL2000，购自TAKARA生物技术有限公司)。

图2：pH-GPC3/CD3表达载体构建示意图。

图3：pH-GPC3/CD3表达载体表达纯化的GPC3/CD双特异性抗体多肽的SDS-PAGE电泳图。左侧条带为纯化的目的抗体多肽，右侧为分子量标记物(SDS-PAGE小分子量标准蛋白质，购自上海升正生物技术有限公司)。

图4A-E：pH-GPC3/CD3表达载体表达纯化的GPC3/CD3双特异抗体与不同细胞系表面结合情况的FACS(荧光激活细胞分类器，或称流式细胞)分析。

图5：不同浓度的GPC3/CD3双特异性抗体针对三种细胞系的细胞毒性靶向裂解效果。纵轴是细胞毒性百分数(根据下文所定义)，横轴为双特异性抗体的浓度(ng/mL)。

具体实施方式

在本发明第一方面的一个具体实施方案中，特异性识别磷脂酰肌醇蛋白多糖-3的第一功能域可以特异性结合GPC3的C末端肽，或者特异性结合于GPC3的N末端肽。例如CN101186650A；CN102180969A；CN101633693A；CN101052878A；CN1842540A中所公开的那些GPC3单克隆抗体和任何目前公开已知的GPC3特异性抗体如GC33，或由单克隆抗体的一个或多个重链可变区和一个或多个轻链可变区形成的单链抗体。本发明双特异性抗体的第一和/或第二功能域可以选自完整抗体，单链抗体(scFV)，Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)₂片段和其衍生物。本发明的第一和/或第二功能域可以是包含一个重链可变区和一个轻链可变区的单链抗体(scFV)。

本发明的特异性识别T细胞表面受体CD3的第二功能域不受具体的限制，只要其能够特异性地识别CD3。例如但不限于在下列专利中提到的CD3抗体：US7,994,289，US6,750,325；US6,706,265；US5,968,509；US8,076,459；US7,728,114；US20100183615。

本发明的连接上述第一和/或第二功能域的接头可以是短的肽链，例如但不限于(Gly₄Ser)_n，其中n从1到5，n为整数。在一个具体实施方案中，n优选为3。

在本发明的一个具体实施方案中，第一功能域的氨基酸序列SEQ ID NO：5，即通过VL_GPC3-(G₄S)₃-VH_GPC3，或与该氨基酸序列相似性为95％及以上的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5

  1 DVVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV HSNANTYLHW YLQKPGQSPQ LLIYKVSNRF

 61 SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQNTHVP PTFGQGTKLE IKRGGGGSGG

121 GGSGGGGSQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTDY EMHWVRQAPG QGLEWMGALD

181 PKTGDTAYSQ KFKGRVTLTA DESTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCTRFYSY TYWGQGTLVT

241 VSS

在本发明的另一个具体实施方案中，第二功能域的氨基酸序列为SEQ ID NO：7，即VH_CD3-VE(GGS)₄GG-VL_CD3，或与该氨基酸序列相似性为95％及以上的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7

  1 DIKLQQSGAE LARPGASVKM SCKTSGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY

 51 INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY

101 DDHYCLDYWG QGTTLTVSSV EGGSGGSGGS GGSGGVDDIQ LTQSPAIMSA

151 SPGEKVTMTC RASSSVSYMN WYQQKSGTSP KRWIYDTSKV ASGVPYRFSG

201 SGSGTSYSLT ISSMEAEDAA TYYCQQWSSN PLTFGAGTKL ELK

在本发明第二方面的一个具体实施方案中，第一功能域的核苷酸序列为SEQID NO：6的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或与该核苷酸序列相似性为95％及以上的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6

  1 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga

 51 gccggcctcc atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg

101 ccaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccagggca gtctccacag

151 ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt tctggggtcc ctgacaggtt

201 cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc agcagagtgg

251 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct

301 cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg

351 ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc

401 agtctggagc tgaggtgaag aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc

451 aaggcttctg gatacacctt caccgactat gaaatgcact gggtgcgaca

501 ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat cctaaaactg

551 gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg

601 gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga

在本发明第二方面的另一个具体实施方案中，第二功能域的核苷酸序列为SEQ ID NO：8的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：7的氨基酸序列，或与该核苷酸序列相似性为95％及以上的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8

  1 gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc

 51 agtgaagatg tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga

101 tgcactgggt aaaacagagg cctggacagg gtctggaatg gattggatac

151 attaatccta gccgtggtta tactaattac aatcagaagt tcaaggacaa

201 ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac atgcaactga

251 gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat

301 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt

351 ctcctcagtc gaaggtggaa gtggaggttc tggtggaagt ggaggttcag

401 gtggagtcga cgacattcag ctgacccagt ctccagcaat catgtctgca

451 tctccagggg agaaggtcac catgacctgc agagccagtt caagtgtaag

501 ttacatgaac tggtaccagc agaagtcagg cacctccccc aaaagatgga

551 tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tcccttatcg cttcagtggc

601 agtgggtctg ggacctcata ctctctcaca atcagcagca tggaggctga

651 agatgctgcc acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt

701 tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa

本发明的第三方面是包含了所述编码本发明的双特异性抗体蛋白的核苷酸序列的基因工程载体。所述载体可以是真核细胞载体或原核细胞载体，只要所述载体满足：(a)其编码序列包含复制起始的序列，使得该载体能够在宿主细胞中得以复制，(b)其包含有编码筛选标记的基因序列，该基因编码的蛋白是该宿主细胞在特定的选择培养基中生存和生长所必需的。在宿主细胞如果没有被转染或转化包含该基因的载体的情况下，宿主细胞不能在特定选择培养基中生存。典型的筛选标记基因编码的蛋白包括具有对抗生素或毒素具有耐受性的蛋白，抗生素或毒素包括例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶呤等；补偿营养缺陷的相关蛋白，供应培养基中不存在的关键营养成分，例如编码D-丙氨酸消旋酶基因。采用抗性筛选的例子包括，通过转染包含新霉素抗性基因的外源载体，使宿主细胞获得在含有药物新霉素或G418的培养基的情况下，继续生存生长。另外一个例子是在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中使用二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选标记，哺乳动物细胞宿主细胞是指DHFR缺陷型的细胞，不含二氢叶酸还原酶基因，不能合成核酸，必须在含有HT的培养基里生长。在利用载体转染宿主细胞时，可以通过上述培养基条件的选择筛选得到同时包含目的基因和DHFR基因的外源载体的阳性克隆。(c)其编码序列包含启动子的序列，(d)表达载体还可能包括其它组成序列，包括信号肽序列、转录终止序列、增强子序列等，优选地，本发明的载体为真核细胞载体。优选地，本发明的载体为来自用于抗体真核表达的的pH载体，其包含了CMV的启动子、内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site，IRES)、DHFR筛选标记等元件。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的抑制剂，可阻碍其作用。当细胞培养基内含有MTX时，DHFR被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带其上下游基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可提高目的蛋白的表达量。

本发明的第四方面涉及包含有上述基因工程载体的表达体系，即涉及包含有所述载体的宿主细胞，用于表达所需的多功能抗体多肽。与使用的载体相适应，本发明的宿主细胞可以是任意的原核宿主细胞或真核宿主细胞。真核宿主细胞，包括酵母、昆虫细胞、植物细胞，哺乳动物细胞等可以是优选的，因为真核细胞存在复杂的目的蛋白的翻译后修饰(例如糖基化)，越来越多的被用于规模化的培养。常用的宿主细胞系包括猴肾细胞(COS-7 ATCC CRL 1651)、人胚胎肾细胞293及其亚克隆细胞系，幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。优选地，本发明的真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

本发明的第五方面涉及上述的GPC3/CD3双特异性抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。所述肿瘤包括但不限于肝癌，黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤。

以下通过具体实施例来具体描述本发明的实质，但需要注意的是下述实施例不应该理解为对本发明范围的限制。

实施例1 GPC3/CD3双特异性抗体的制备

1)构建含有编码GPC3/CD3双特异性抗体的核酸的表达载体

VL_GPC3和VH_GPC3核苷酸片段分别根据专利文献US7919086B2(以下称’086专利)公布的GC33抗体的对应VL部分(’086专利SEQ ID NO：91)和VH部分(’086专利SEQ ID NO：81)的基因序列获得。编码GPC3单链抗体片段的核苷酸的序列通过在VL_GPC3和VH_GPC3核苷酸片段之间引入编码(Gly₄Ser)₃(简写作(G₄S)₃)氨基酸序列接头的核苷酸构成。

VL_CD3和VH_CD3基因片段分别根据专利文献US7112324B1公布的SEQ ID NO：9的第857-1585位核苷酸序列获得，其中该编码CD3单链抗体片段的核苷酸序列通过在VL_CD3和VH_CD3核苷酸片段之间引入编码氨基酸序列VE(GGS)₄GG接头的核苷酸序列构成。

然后分别通过5’GPC3-1/3’GPC3-2引物以GPC3单链抗体的核苷酸片段为模本PCR进行15个循环，以及通过5’CD3-1/3’CD3-2引物以CD3单链抗体的核苷酸片段为模本PCR进行15个循环，收集PCR产物混匀，取适量混合物作为模本，以5’GPC3-1和3’CD3-2引物继续进行第二轮PCR搭桥扩增进行30个循环，其中5’GPC3-1含有NheI酶切位点，3’CD3-2含有BamHI酶切位点，通过3’GPC3-2与5’CD3-1搭桥，同时在搭桥序列中引入Gly₄Ser的接头连接肽。通过PCR扩增，获得编码如下序列，其结构域排列为(VL_GPC3-(G₄S)₃-VH_GPC3-(G₄S)-VH_CD3-VE(GGS)₄GG-VL_CD3)，其序列为SEQ ID NO：9。

引物序列

SEQIDNO：1

5’GPC3-1CCCCGCTAGCTGATGTTGTGATGACTCAGTC

SEQIDNO：2

3’GPC3-2GGAGCCACCACCTCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCT

SEQIDNO：3

5’CD3-1TCCTCAGGAGGTGGTGGCTCCGATATCAAACTGCAGCA

SEQIDNO：4

3’CD3-2GATGGGATCCTAATGATGATGGTGATGATGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCA

扩增得到的序列SEQ ID NO：9用限制性内切酶NheI/NotI-HF同时酶切，按照酶供应商(New England Biolabs，NEB)建议的反应条件在缓冲液2中进行双酶切。表达pH载体(参见WO/2011/035465实施例7和图15)也用限制性内切酶NheI/NotI-HF进行同样的酶切，得到pH/DHFR载体片段。然后按照酶供应商(NEB)建议的反应条件用T4DNA连接酶连接双酶切后SEQ ID NO：9的片段和pH/DHFR载体片段，形成含有编码GPC3/CD3双特异性抗体的核苷酸片段的表达载体pH-GPC3/CD，其详细连接结构如图2所示。

2)GPC3/CD3双特异性抗体的表达和纯化

上述步骤得到的表达载体pH-GPC3/CD3根据FreeStyle MAX Reagent转染试剂(来自Invitrogen)说明书操作步骤转染到中国仓鼠卵巢(CHO-S)细胞中，然后根据OptiCHO^TM蛋白表达试剂盒(来自Invitrogen)筛选稳定的克隆。分别转染有上述表达载体之一的CHO-S细胞的稳定克隆在摇瓶中37℃，130rpm的条件下培养7天，所用培养基为CD OptiCHO(来自Gibco)。通过离心获得培养上清，然后储存于-20℃。

培养上清中的GPC3/CD3蛋白通过固定化金属亲和层析(immobilized metalaffinity chromatography(IMAC))技术富集，采用组氨酸亲和层析柱(His Trap HPcolumn，购自GE Healthcare)进行蛋白纯化。按照层析柱厂商提供的方法步骤，用缓冲液A(20mM磷酸盐pH 7.4，0.4M NaCl)平衡，然后将PBS透析后的细胞培养上清(500mL上清)加入到层析柱上(10mL)，流速为3mL/min。然后用5倍体积的缓冲液A和10倍体积的含有20mM咪唑的缓冲液A清洗柱子，以去除杂蛋白。结合的目的蛋白用添加250mM咪唑的同样缓冲液A进行洗脱。所有的纯化步骤都在4℃下操作。纯化的蛋白经PBS透析后测定280nm波长光谱吸收，以0.53mg/OD的系数计算蛋白浓度。纯化的GPC3/CD3双特异性抗体蛋白经SDS-PAGE电泳分析，如图3所示，其分子量在55kD左右。

实施例2.GPC3/CD3双特异性抗体与靶细胞结合特异性的分析

2.1实验材料：

细胞系	名称	购(获)自
			Huh-7	人肝癌细胞系	日本RIKEN Cell Bank(Tsukuba，Japan)
HepG2	人肝癌细胞系	美国ATCC
			CHO-K1	中国仓鼠卵巢细胞	美国ATCC
PBMC*	人外周血单核细胞	上海市血液中心
			Jurkat细胞	人外周血白血病T细胞	中国科学院细胞库

*用Ficoll(来自Biochrom)密度梯度离心方法，按照标准步骤从健康人供主的血液中分离。PBMC中含T细胞。

2.2实验方法：

通过荧光激活细胞分选仪(FACS，通常又称为流式细胞仪FACScalibur，由BD公司提供)分析双特异性抗体GPC3/CD3的结合能力。

具体方法如下：

1.取对数生长期的如表1所列各肿瘤细胞接种到6cm平皿中，接种细胞密度约为90％，37℃孵箱过夜培养。

2.使用10mM的EDTA消化细胞，200g×5min离心收集细胞。以1×10⁶～1×10⁷/mL的浓度重悬于1％含小牛血清的磷酸盐缓冲液(NBS PBS)中，按100ul/管的量加入流式专用管中。

3.200g×5min离心，弃上清。

4.两个实验组分别加入待测抗体7B3/CD3和806/CD3，同时一个对照组加入抗体NGR/CD3作为阴性对照，另一个对照组为不加抗体的PBS空白对照。各抗体的终浓度均为20μg/ml，每管加入100ul。冰浴，45分钟。

5.每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min离心，共二遍。

6.弃上清，加入1∶50稀释的小鼠抗组氨酸标签抗体(来自上海睿星基因技术有限公司)，每管加入100ul。冰浴，45分钟。

7.每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min离心，共二遍。

8.弃上清，加入1∶50稀释的FITC荧光标记的羊抗小鼠抗体(来自上海康成生物工程有限公司)，每管加入100ul。冰浴，45分钟。

9.每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min离心，共二遍。

10.弃上清，重悬于300ul 1％NBS PBS中，流式细胞仪检测。

11.应用流式细胞仪数据分析软件WinMDI 2.9分析数据。

每个样品至少采用流式细胞分析仪分析10,000个细胞。

2.3实验结果：

如图4A-C所示的流式细胞仪分析结果，本发明的GPC3/CD3双特异抗体可以与表达GPC3的肝癌细胞系Huh7和HepG2结合，而基本不与不表达GPC3的CHO-K1细胞系结合。如图4D和E所示，GPC3/CD3抗体与Jurkat和PBMC细胞有效地结合，显示GPC3/CD3双特异抗体对表面表达有CD3的T细胞的结合特异性。综合以上图4A-E的结果可知，本发明的GPC3/CD3双特异抗体具有同时特异性识别GPC3和CD3的能力。

实施例3.GPC3/CD3双特异性抗体介导的对肿瘤细胞的细胞毒杀伤作用

3.1实验材料：

两种表达GPC3有关的肿瘤细胞(Huh-7和HepG2细胞系)和一种不表达GPC3的对照细胞(CHO-K1细胞系)被用来分别分析GPC3/CD3双特异性介导的T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

3.2实验方法：

外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll(来自Biochrom)密度梯度离心方法，按照标准步骤从健康人供主的血液中分离。离心后，用浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞然后重悬于RPMI 1640完全培养基(Gibco)，将细胞浓度调整到7×10⁵/mL。PBMC用作细胞毒性实验中的效应细胞。不同的肿瘤细胞作为靶细胞(target cells)。用RPMI 1640完全培养基将靶细胞浓度调整到7×10⁴/mL。同样体积的靶细胞和效应细胞混合，使效应细胞：靶细胞(E∶T)比值为10∶1。

将混合后的细胞悬液以75μL/孔的体积加到96孔板中。然后各孔分别添加25μL从1000ng/mL到0.1ng/mL的十倍系列梯度稀释的GPC3/CD3单链双功能抗体。

在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育40小时后，根据生产商的操作说明，用CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒(Non-Radioactive Cytotoxicity Assaykit，来自Promega)检测抗体的细胞毒作用。

CytoTox

非放射性细胞毒性检测是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox

检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与⁵¹Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。

肿瘤细胞的杀伤率(即，细胞毒性％)是根据CytoTox

非放射性细胞毒性检测G1780产品使用说明书提供的下列公式计算的：

其中：

“实验”指的是加入抗体/效应细胞/靶细胞的实验孔所产生的LDH释放值，

“效应细胞自发”指的是只含有效应细胞的对照孔自发产生的LDH释放。本发明中是指效应细胞的对照孔

“靶细胞自发”是指只含有靶细胞的对照孔在靶细胞不受其他因素处理时产生的LDH释放。

“靶细胞最大”是用0.8％Triton X-100处理后靶细胞使其完全裂解对对照孔所产生的LDH释放，

“靶细胞最大-靶细胞自发”代表着靶细胞受外界处理后完全裂解所产生的LDH释放。

3.3实验结果：

GPC3/CD3双特异性抗体在不同浓度下对各肿瘤的细胞毒性结果如下。(建议根据图5提供下表的具体数据)

从图5和上表共同显示的结果可知，不同浓度的GPC3/CD3双特异性抗体对肝癌细胞株Huh-7和HepG2均表现出比非肝癌细胞株(即，CHO-K1)明显强烈的细胞毒杀伤作用。这些结果表明表达GPC3的肝癌细胞系可以被GPC3/CD3双特异抗体再靶向的人T细胞特异性地有效裂解。

据上表和图5的细胞杀伤％数据和所使用的双功能抗体的浓度，采用GraphPadPrism 5软件(GraphPad Software inc.，San Diego，USA)分析程序计算得到双功能抗体针对肿瘤细胞杀伤的EC₅₀值。GPC3/CD3双特异性抗体对HepG2细胞株的EC₅₀值分别是14.22ng/ml，对Huh-7细胞株的为656.7ng/ml。

所有本说明书中列出的出版物的内容都包含在本说明书中。此外，本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书中所述的技术范围和实质内容的情况下，对本发明进行多种不同的修饰和改变是可能的。本发明还包括上述这些修饰和改变。

Claims (13)

1.一种双特异性抗体，其包含：

特异性识别磷脂酰肌醇蛋白多糖-3的第一功能域，

特异性识别人T细胞抗原CD3的第二功能域，和

连接上述功能域的接头。

2.权利要求1所述的抗体，其中第一功能域特异性识别GPC3的C末端肽。

3.权利要求1所述的抗体，其中第一和/或第二功能域选自完整抗体，单链抗体(scFV)，Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)₂片段和其衍生物。

4.权利要求1所述的抗体，其中第一和/或第二功能域各自为包含一个重链可变区和一个轻链可变区的单链抗体。

5.权利要求1的抗体，其中第一功能域的氨基酸序列为，SEQ ID NO：5或与该氨基酸序列相似性为95％及以上的氨基酸序列。

6.权利要求1的抗体，其中第二功能域的氨基酸序列为，SEQ ID NO：7或与该氨基酸序列相似性为95％及以上的氨基酸序列。

7.权利要求1所述的抗体，其中第一和/或第二功能域是人源化的，嵌合的或鼠源的。

8.编码权利要求1-7任一所述的抗体的核苷酸序列。

9.包含有权利要求8所述核苷酸序列的载体。

10.权利要求9的载体，其为pH载体。

11.包含有权利要求9所述的载体的真核宿主细胞或原核宿主细胞。

12.权利要求11的真核宿主细胞，其为中国仓鼠卵巢细胞。

13.权利要求1-7任一所述的抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

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