CN104945512A

CN104945512A - 一种双靶向抗肿瘤重组蛋白及其应用

Info

Publication number: CN104945512A
Application number: CN201510226980.1A
Authority: CN
Inventors: 朱振洪
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明公开了一种双靶向抗肿瘤重组蛋白，包括EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因，通过非极性疏水柔性接头(Gly4ser)₃按顺序将EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因融合成完整的EGFi-RGD-MAP30分子，所述的重组蛋白EGFi-RGD-MAP30的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供上述重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明重组蛋白的抗肿瘤药物具有双靶向作用，可特异性与肿瘤细胞表面高表达EGFR受体和肿瘤新生血管内皮细胞相结合，提高对肿瘤细胞的杀伤力，减少对正常组织细胞的不良作用，具有重要的社会效益和巨大的市场应用价值。

Description

一种双靶向抗肿瘤重组蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双靶向抗肿瘤重组蛋白及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是目前威胁人类健康的最重要的疾病之一，世界上平均每年有超过1000万人被确诊为癌症，占全世界死亡人数的12％。是人类健康和生命的头号杀手，发病率居10种重大疾病的第二位。我国每年死于癌症的患者超过100万，而且发病率依然呈上升趋势。专家预测世界抗癌药物的市场年递增10％以上。目前的抗肿瘤药物大多缺乏对肿瘤细胞的靶向性，因此毒副作用比较大，开发特异性、高效性的抗肿瘤药物是人类的迫切期望。近年来，针对某些受体、基因或关键物质的靶向治疗药物正在成为药物研制的重要方向，分子靶向治疗药物成为近年来肿瘤治疗中的一大热点。靶向治疗药物被认为是未来癌症治疗中最具有前景的研究方向。

MAP30(Momordica anti-HIV protein of 30kD)蛋白是葫芦科植物苦瓜中一种具有抗HIV活性的核糖体失活蛋白，对多种肿瘤均具有较强的抗肿瘤活性，能诱导肿瘤细胞凋亡，是一种很有前景的抗肿瘤候选新药。但MAP30作为抗肿瘤药物而言，存在一个严重问题，即MAP30属于异源蛋白，在人体内多次使用后很有可能会产生免疫原性、毒副作用等，因此如何改造MAP30并提高它的抗肿瘤靶向性，增强其抗癌效果，降低毒副作用，是一个亟待解决的重要课题。同时天然植物中MAP30含量少且提取效率不高，因此利用基因工程方法生产MAP30重组蛋白已成为必然的发展方向。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷，目的在于提供一种双靶向抗肿瘤重组蛋白。

本申请通过将MAP30基因序列与EGF受体干扰序列(EGFRi)和RGD序列融合在一起，中间通过接头(Gly4Ser)₃连接起来，体外构建EGFRi-RGD-MAP30融合基因，并将该融合基因与pET32a(+)表达载体连接起来，并通过体外诱导表达目标蛋白，纯化制备兼具抗血管导向、抗肿瘤导向的双靶向的重组蛋白药物。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种双靶向抗肿瘤重组蛋白，包括EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因，通过非极性疏水柔性接头(Gly4ser)₃按顺序将EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因融合成完整的EGFi-RGD-MAP30分子。

所述的EGFRi肽氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述的RGD肽氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明所述的重组蛋白EGFi-RGD-MAP30的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以本发明提供的上述重组蛋白为活性成分，具有增强药物的抗肿瘤活性，减少毒副作用。

又一方面，本发明还提供上述重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明所述的抗肿瘤药物中还可以含有一种或多种药学上可以接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。本发明的抗肿瘤药物可以制成冻干粉针剂及注射液等形式，各种剂型均可以按药学领域的常规方法制备。

本发明所述的含有上述重组蛋白的抗肿瘤药物具有双靶向作用，所述的双靶向为与肿瘤细胞表面的EGFR受体和肿瘤新生血管内皮细胞相结合。

本发明的有益效果为：本发明双靶向抗肿瘤药物EGFRi-RGD-MAP30重组蛋白，其中EGFi肽是EGFR受体干扰序列，它可以特异性地与肿瘤细胞表面高表达的EGFR结合，但不具有EGF刺激肿瘤细胞增殖的作用。RGD小肽则发挥靶向性地与肿瘤新生血管内皮细胞表面ανβ3、ανβ5整合素相结合，可以将药物导向肿瘤新生血管处富集，一方面提高对肿瘤细胞的杀伤力，另一方面减少对正常组织细胞的不良作用。因此该药物的研制将弥补肿瘤放疗、化疗的不足，为广大肿瘤患者带来福音，将可以延长肿瘤病人的生命、改善肿瘤病人的生活质量，具有十分重要的社会效益和巨大的市场应用价值。

附图说明

图1是本发明pET32a(+)-MAP30双酶切鉴定图；M：DNA Marker(从上至下分别为2000,1000,750,500,250,100bp)；1:双酶切产物(KpnI+EcoRI)；MAP30基因大小为789bp；

图2是MAP30基因(KpnI+EcoRI双酶切回收产物)再经过HpaI酶单切电泳图；M：DNA Marker(从上至下分别为2000,1000,750,500,250,100bp)；1:单酶切产物(HpaI)；

图3是PCR扩增ELRL肽(EGFRi-Linker-RGD-Linker,ELRL)基因的电泳图；M：DNA Marker(从上至下分别为2000,1000,750,500,250,100bp)；1～8：PCR扩增产物；

图4是以连接产物(ELRL+MAP30)为模板扩增全长融合基因ELRL-MAP30的电泳图；M：DNA Marker(从上至下分别为2000,1000,750,500,250,100bp)；1：0.5μl模板扩增产物(无目的条带)；2：1μl模板扩增产物(无目的条带)；3：1.5μl模板扩增产物(目的条带大小与预期一致)；

图5是重组质粒的菌落PCR扩增鉴定；M：DNA Marker(从上至下分别为2000,1000,750,500,250,100bp)；1～11：不同克隆的菌落PCR产物(第8，9泳道符合预期条带大小)；

图6是pTA2/ELRL-MAP30重组质粒的双酶切电泳；M：DNAMarker(从上至下分别为2000,1000,750,500,250,100bp)；1:双酶切产物(KpnI+EcoRI)；

图7是重组pET32a(+)/ELRL-MAP30质粒双酶切电泳鉴定；M：DNA Marker(从上至下分别为2000,1000,750,500,250,100bp)；1：对照组(pTA2/ELRL-MAP30经KpnI+EcoRI双酶切)；2～5：重组质粒酶切鉴定(pET32a(+)/ELRL-MAP30质粒经KpnI+EcoRI双酶切)；

图8是目标菌落的小量表达鉴定；M：Protein Marker(从上至下分别为97,66,43,30,20,14kD)；1：BL21空菌株对照；2：重组工程菌未诱导对照；3：0.02mM IPTG，25℃诱导；4：0.04mM IPTG，25℃诱导；5：0.06mM IPTG，25℃诱导；6：0.1mM IPTG，25℃诱导；

图9是目标菌落的大量表达鉴定；M：Protein Marker(从上至下分别为97,66,43,30,20,14kD)；1：未诱导上清；2：未诱导沉淀；3：0.1mM IPTG，25℃诱导上清；4：0.1mM IPTG，25℃诱导沉淀；5：0.06mM IPTG，25℃诱导上清；6：0.06mM IPTG，25℃诱导沉淀；

图10是上清目标蛋白纯化后的电泳图；M：Protein Marker(从上至下分别为97,66,43,30,20,14kD)；1：诱导上清；2：穿透液；3：20mM咪唑洗脱液；4:：40mM咪唑洗脱液；5：60mM咪唑洗脱液；6：80mM咪唑洗脱液；7：250mM咪唑洗脱液；8：500mM咪唑洗脱液。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

材料与试剂

材料：含MAP30基因的pET32a(+)-MAP30质粒(本实验室之前已构建保存)、E.coli BL21(DE3)、E.coli TG1、pET32a(+)均为本实验室保存。

试剂：SDS、Tris碱、EDTA、冰醋酸、无水乙醇、GoldView、溴酚蓝、考马斯亮(R250)、DNA电泳Mark、SDS-PAGE电泳Marker、尿素；LB培养基：氯化钠、蛋白胨、酵母提取物；

主要设备：

实施例1融合基因ELRL-MAP30的获得

1、pET32a(+)-MAP30用KpnI和EcoRI双酶切(采用分步单切)

Kpn I酶单酶切反应体系：dd H₂O：9μl；10×buffer L：2μl；pET 32a(+)-MAP30：8μl；Kpn I：1μl；总体积20μl，37℃，2h，同时切了5管共计100μl。

上述基因经Kpn I酶单酶切后，经过DNA胶回收试剂盒回收目的DNA片段，为下一步EcoR I酶切作准备。

EcoR I酶单酶切反应体系：ddH₂O：8μl；10×buffer H：2μl；pET 32a(+)-MAP30(经Kpn I单切)：8μl；EcoR I：2μl；总体积为20μl，共计4管37℃，2h。

经过琼脂糖凝胶电泳分别回收PET32a(+)片段和MAP30基因片段，并用胶回收试剂盒进行DNA纯化。如图1所示，酶切后的载体和基因的条带大小(789bp)与预期吻合。

2、对回收后的MAP30基因，再用HpaI酶(TAKARA公司产品)单切

反应体系：ddH₂O：9μl，10×buffer K：2μl，MAP30(经Kpn I和EcoR I切)：8μl，HpaI：1μl；总体积为20μl，同时做了4管，37℃，2h。

经过琼脂糖凝胶电泳回收MAP30大片段，并用胶回收试剂盒进行DNA纯化。

如图2所示，经过琼脂糖凝胶电泳回收核心MAP30大片段，并用胶回收试剂盒进行DNA纯化。

3、设计引物扩增EGFRi-Linker-RGD-Linker肽(以下简称ELRL肽)

人工合成ELRL肽基因：CGCTGCTCCCATGGCTACACTGGTATTCGTTGCCAAGCAGTAGTTCTCGGTGGCGGTGGTTCCGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGCGGATCTTGTGACTGTCGTGGCGATTGTTTCTGTGGCGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGTGGCTCT。

引物设计，ELRL-1：TGGGTACCGACGACGACGACAAGCG；ELRL-2：TTGCAGTGGCAGTCGACAAATCGAAGTT。

注：下划线的是酶切位点KpnI(引物1))引物和ELRL肽基因均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

反应体系：ddH₂O:32μl，KOD 10×PCR buffer：5μl，MgSO4:3μl，2mM dNTP:5μl，引物1:1μl，引物2:1μl，模板：1μl，KOD酶：2μl，Total:50μl。

PCR反应程序：94℃180s；98℃11s，68℃20s，30个循环；68℃10min；16℃10min。

经过PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段。如图3所示，PCR扩增的条带与预期相同，且3号泳道条带较亮。

4、MAP30基因与ELRL肽基因分别用HpaI单切，然经用T4连接酶连接

ELRL肽用HpaI酶单切：ddH₂O:9μl，10×buffer K：2μl，ELRL基因：8μl，HpaI：1μl，共3管，37℃，3h；每管体积20μl。

经过琼脂糖凝胶电泳回收ELRL片段，并用胶回收试剂盒进行DNA纯化。

T4连接酶连接MAP30(用HpaI单切)和ELRL肽(用HpaI单切)：ddH₂O:4μl，10×T4buffer：1.5μl，MAP30片段(经HpaI单切)：4μl，ELRL片段(经HpaI单切)：4μl，T4连接酶：1.5μl，总体积为15μl，16℃，16h。

5、以连接产物为模板扩增全长融合基因ELRL-MAP30

引物设计，ELRL-1：TGGGTACCGACGACGACGACAAGCG；MAP30-2：CGGAATTCTCAATTCACAACAGATTCCCCAAGT。

下划线的是酶切位点KpnI(引物1)、EcoR I(引物2)引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

反应体系：dd H₂O:15μl，KOD 10×PCR buffer：2.5μl，MgSO₄:1.5μl，2.5mM dNTP:2.5μl，引物1：0.5μl，引物2:0.5μl，模板：1.5μl，KOD酶：1μl，总体积为：25μl。

PCR反应程序：94℃180s；98℃11s，68℃60s，2个循环；98℃11s，66℃45s，68℃45s，3个循环；68℃45s，64℃45s，68℃60s，3个循环；98℃11s，62℃45s，68℃60s，28个循环；68℃10min；16℃10min。

经过PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段。如图4所示，使用不同体积的模板进行PCR，结果以1.5μl为模板的体系可以扩增出阳性条带(大小为978bp)，且条带较亮。

实施例2重组表达载体pET32a(+)/ELRL-MAP30的构建与鉴定实验

1、ELRL-MAP30 PCR产物末端加A反应

反应体系：dd H₂O:8.5μl，10×PCR buffer：5μl，MgCl₂:1.5μl，dNTP:2μl，PCR产物2μl，Taq酶：1μl，总体积为：20μl。

反应在PCR仪中进行，70℃，40min。

2、ELRL-MAP30基因与pTA2载体的连接

ELRL-MAP30:6.5μl，pTA2：1μl，Ligation High ver 2：7.5μl，16℃，3h，Total:15μl。

3、连接产物转化TG1大肠杆菌与菌落鉴定

A.TG1感受态的制备

1)从LB平板上挑取TG1单菌落与5mL LB液体培养基中，37℃，180rpm摇菌过夜。

2)以1:100的比例将TG1菌液接种到5mL LB液体培养基中，37℃，180rpm摇至OD600至0.4～1.0(0.6)。

3)取1.5mL菌液5000rpm，3min弃上清，菌体用750μl的75mM CaCl₂悬浮，冰上放置30min。

4)5000rpm离心5min，菌体用200μl的75mM CaCl2悬浮，冰上放置20h。

B.质粒转化

1)将连接产物与200μlTG1感受态细胞混合，冰上放30min。

2)热休克(42℃，90s)，冰水浴4min。

3)加1mL LB液体培养基，37℃水浴1h。

4)4000rpm离心3min，去上清1mL，悬浮菌液。

5)加1M IPTG 4μl，X-gal 40μl，混匀。

6)用涂布棒将菌液均匀涂布在含有Amp抗性的LB平板上，在37℃恒温培养箱中正放培养30min后，倒置培养过夜。

C.菌落PCR鉴定与测序鉴定

挑取转化出的单菌落于10μl无菌水中作为菌落PCR的模板。

反应体系：dd H2O:17.25μl，10×PCR buffer：2.5μl，2.5mMdNTP:2μl，引物1：1μl，引物2：1μl，模板：1μl，r-Taq:0.25μl，Total：25μl。(注：引物1引物2均为pTA2载体的通用引物)

反应温度：94℃180s；94℃60s，62℃45s，72℃45s，32个循环；72℃600s；16℃600s。

如图5所示，电泳图中显示8，9两个条带较为符合，将菌落PCR鉴定正确的菌落(8号，9号)送至测序进一步鉴定。8号质粒基因测序正确，EGFRRi-RGD-MAP30全长基因(957bp)，序列如SEQID NO.3所示。

实施例3pET32a(+)-ELEL-MAP30质粒的构建与鉴定实验

1、pTA2-ELRL-MAP30质粒(已测序鉴定)抽提

1)取pTA2-ELRL-MAP30/TG1菌液1.5mL，12000rpm离心1min，去上清。

2)加入250μl溶液1，悬浮沉淀。

3)加入250μl溶液2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。

4)加入350μl溶液3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10分钟，将上清转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，去除废液，吸附柱重放回收集管中。

5)在吸附柱中加入500μl的去蛋白液W1，12000rpm离心1min，弃废液。

6)在吸附柱中加入700μl的漂洗液W2，12000rpm离心1min，弃废液。

7)在吸附柱中加入500μl的漂洗W2，12000rpm离心1min，弃废液。

8)12000rpm再离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

9)室温放置几分钟后，将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间滴加60μl洗脱液TE，室温放置2min，12000rpm离心1min得质粒。

溶液1，溶液2，溶液3，去蛋白液，漂洗液，洗脱液均由北京庄盟生物基因科技有限公司质粒小量提取试剂盒提供。

2、分步酶切pTA2-ELRL-MAP30质粒得到ELRL-MAP30基因

Kpn I酶单酶切反应体系：dd H₂O:7μl，10×buffer L：2μl，PTA2-ELRL-MAP30：10μl，Kpn I：1μl，共6管37℃，2h，每管20μl。

上述DNA经Kpn I酶单酶切后，经过PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段，为下一步EcoR I酶切作准备。

EcoR I酶单酶切反应体系：dd H₂O:8μl，10×buffer H：2μl，ELRL-MAP30(经Kpn I单切)：8μl，EcoR I：2μl，共4管37℃，2h，每管20μl。

如图6所示，经过琼脂糖凝胶电泳分别回收ELRL-MAP30片段，并用胶回收试剂盒进行DNA纯化。

3、pET32a(+)质粒和ELRL-MAP30基因的连接

反应体系：ELRL-MAP30基因:6.5μl，pET32a(+)/KpnI+EcoRI：1μl，Ligation High ver 2：7.5μl，16℃，3h；Total:15μl。

4、连接产物转化TG1菌

1)将连接产物与200μlTG1感受态细胞混合，冰上放30min。

2)热休克(42℃，90s)，冰水浴4min。

3)加1mL LB液体培养基，37℃水浴1h。

4)4000rpm离心3min，去上清1mL，悬浮菌液。

5)用涂布棒将菌液均匀涂布在含有Amp抗性的LB平板上，在37℃恒温培养箱中正放培养30min后，倒置培养过夜

5、双酶切鉴定

将转化出的单菌落摇瓶培养后，同上面方法抽取质粒，进行双酶切鉴定

双酶切体系：dd H₂O:7μl，10×buffer M：2μl，pET32a(+)-ELRL-MAP30：8μl，Kpn I：2μl，EcoR I：1μl，37℃，4h，Total:20μl。

如图7所示，转化出的单菌落摇瓶培养做质粒抽提并双酶切鉴定，从图中可以看出酶切出的2，3，4，5基因条带与原先PCR的相同，说明质粒转化成功。基因测序后2，5为正确质粒。将双酶切正确的2，3，4，5送至全质粒测序进一步测序验证(2，5号序列正确)

实施例4重组质粒转化表达菌株BL21(DE3)并进行表达

1、转化与小量表达

将5号质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，方法同上。在转化平板中挑取单菌落到LB液体培养基中，摇菌过夜作为表达实验的种子液。

1)种子液：挑取单克隆菌落，在5ml LB培养基中过夜；

2)按照1:100接种，37℃，180rpm振荡培养2h，此时的OD₆₀₀达到0.2-0.6；

3)诱导前留样1.5ml，加入1M IPTG至终浓度分别为0.02mM，0.04mM，0.06mM 0.1mM，1mM，常温(大约25℃)150rpm继续培养18h，另做一个37℃，1mM诱导6h，180rpm；

4)时间到后，收集余菌体，诱导表达结束；

5)配置12％的SDS-PAGE胶；

6)取1.5mL菌液离心取菌体用200μl PBS缓冲液悬浮，取15μl与15μl上样buffer混匀；

7)将样品在沸水中煮5min，上样15ul，15mA恒流跑浓缩胶，130V恒压跑分离胶。

8)取胶，考马斯亮蓝染色60min，脱色液每20min换一次，共三次.；

9)凝胶成像与结果分析。

如图8所示，表达出来的ELRL-MAP30蛋白分子量为48kD(含14kD的载体重组蛋白)，从图中可以看出，与未诱导和没转化的BL21菌株相比，有一定量的表达。

2、摇瓶的大量表达(100ml两瓶)

1)种子液：挑取单克隆菌落，在5mL LB培养基中过夜；

2)按照1:100接种，37℃，180rpm振荡培养2h，此时的OD600分别为0.520和0.480；

3)诱导前留样1.5ml 10000rpm，1min离心收集，200μL 0.01M的PBS溶解，－20保存；，

4)加入IPTG至终浓度分别为0.1mM和0.06mM，常温130rpm培养16h；

5)收集菌体，装入50ml的离心管中，4℃，8000rp，离心10min，离心收集菌体，去上清；

6)用5ml×PBS缓冲液重悬菌体沉淀

7)冰上超生破碎，200W，2S超声，2S间隔，30个循环

8)4℃，12000rpm，离心10min，分别取上清，沉淀；

9)上清，沉淀(用8M尿素裂解)同时跑电泳，观察蛋白是在上清还是沉淀中。

如图9所示，用大摇瓶诱导后，包涵体量变大，但上清中依旧可见有一定量表达，因此可用上清做目标蛋白纯化实验。

实施例5可溶性蛋白的纯化

由于大肠杆菌诱导表达的产物具有较多的可溶性蛋白，所以可用上清纯化的方法纯化目标蛋白。

1)收集全部上清，用0.45μm的有机膜过滤；

2)过滤后与500μl Ni-NTA agrose冰上混合1h，穿透液重复上柱10次，保留全部穿透液。

3)用10mL 20mM咪唑(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑，5％甘油)洗脱，保留全部洗脱液；

4)用10mL 40mM咪唑(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，40mM咪唑，5％甘油)洗脱，保留全部洗脱液；

5)用3mL 60mM咪唑(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，60mM咪唑，5％甘油)洗脱，保留全部洗脱液；

6)用1.5mL 80mM咪唑(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，80mM咪唑，5％甘油)洗脱，保留全部洗脱液；

7)用4mL 250mM咪唑(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，250mM咪唑，5％甘油)洗脱，保留全部洗脱液；

8)用3mL 500mM咪唑(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，500mM咪唑，5％甘油)洗脱，保留全部洗脱液；

9)分别取样跑12％的SDS-PAGE胶，观察在哪一个浓度洗脱下来。

如图10所示，从图中可以看出，目标蛋白与镍柱的结合效果不错，穿透液中几乎没有目标蛋白，用不同浓度的咪唑洗脱可做到初步纯化，为进一步纯化奠定基础。

Claims

1.一种双靶向抗肿瘤重组蛋白，其特征在于：包括EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因，通过非极性疏水柔性接头(Gly4ser)₃按顺序将EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因融合成完整的EGFi-RGD-MAP30分子。

2.根据权利要求1所述的一种双靶向抗肿瘤重组蛋白，其特征在于：所述的EGFRi肽氨基酸序列为SEQ ID NO.1；所述的RGD肽氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的一种双靶向抗肿瘤重组蛋白，其特征在于：所述的重组蛋白EGFi-RGD-MAP30的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种抗肿瘤药物，其特征在于：以权利要求1所述述重组蛋白为活性成分。

5.权利要求1所述的重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物为冻干粉针剂或注射液。