CN102552904A - 人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子 - Google Patents
人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102552904A CN102552904A CN2010106019427A CN201010601942A CN102552904A CN 102552904 A CN102552904 A CN 102552904A CN 2010106019427 A CN2010106019427 A CN 2010106019427A CN 201010601942 A CN201010601942 A CN 201010601942A CN 102552904 A CN102552904 A CN 102552904A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- treg
- short
- fragment
- medicine thing
- chemical medicine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子及其制备方法和应用,属于生物技术领域,该分子由gp120 C2-C4区通过一段柔性连接片段(linker)与人成熟转化生长因子β1(hTGF-β1)片段连接而成。本发明的C2-C4-linker-hTGF-β1能激活和增强外周血静止CD4+CD25+调节性T细胞的功能,并能够选择性作用于CD4+D25-初始T细胞,促使CD4+D25-初始T细胞转化为CD4+CD25+调节性T细胞,增加外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的数量,为临床治疗自身免疫性疾病和移植相关疾病提供新的策略。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种基因重组及表达的促Treg化蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
近年来免疫耐受研究中,CD4+CD25+调控T细胞(Treg)倍受关注。Treg细胞是一种免疫调节细胞,和其他调节细胞一起,在反馈性调节中居核心地位。不少学者研究发现Treg在遏抑自身免疫病、过敏症和诱导移植耐受中发挥重要作用。但并非CD4+CD25+T细胞均为调节性T细胞,Foxp3(forkhead box P3)转录因子阳性者有此功能。Treg细胞在T细胞中所占比例很低,胸腺中占5%左右,外周占5-10%。可喜的是,目前研究发现CD4+CD25-T细胞可在一定条件下诱导转化成Treg细胞。利用转基因技术转入Foxp3基因证明,改变CD4+CD25-naive T细胞Foxp3基因的转录水平,可转化为Treg细胞,并具有天然Treg细胞的功能。还有学者用细胞因子作用于CD4+CD25-naive T细胞,也发生了转化,转化细胞同样具有相应功能。天然Treg细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能,故在先天和后天免疫系统的协同调节中起特殊作用,可抑制性调节CD4+T细胞或CD8+T细胞活化与增殖;抑制初始T细胞和记忆性T细胞的增殖。而现有免疫抑制剂的研制主要集中在如何抑制T细胞的活化与增殖。T细胞在移植排斥中起主导作用,干预T细胞的活化与增殖,可有效控制移植排斥反应。虽然降低了aGVHD的发生率,致移植物和患者的长期与近期存活率都有所提高,但仍存在不容忽视的缺点:(1)长期甚至终生服药;(2)药物作用的低或无特异性。这些药物对静息和活化免疫细胞的作用没有选择性,长期使用势必导致受者机体免疫力降低,无法抵抗移植后感染,也容易导致恶性肿瘤的发生;(3)药物具有明显的毒副作用。长期使用,出现药物的毒性作用,加速移植物失功,影响受者生存质量,移植物长期存活率的显著提高比较困难。因此,利用Treg细胞预防和治疗移植排斥和GVHD是一种更有效、更安全的新型免疫治疗策略。实现这一策略的可能途径之一是构建特异性识别CD4+T细胞同时启动Foxp3的重组分子。
人工构建由不同蛋白质结构域组成的蛋白质机器(Engineered Multi-domain ProteinMachine)是二十一世纪分子生物学领域最激动人心的前沿工作之一。根据抗原与抗体,细胞因子、生长因子和激素与受体等相互识别原理,将对细胞有杀伤作用的分子与抗体或相关因子连接,构建的蛋白质机器具有细胞的选择性清除功能。利用蛋白质机器原理,人工构建的促CD4+CD25-naive T细胞转化为Treg细胞的重组分子由导向片段和功能片段两部分构成,其中间通过一段柔性linker连接。导向片段识别细胞表面分子,重组分子特异性的高低直接取决于被导向片段识别的分子在细胞表面的特异性程度。能够特异性的识别并结合CD4的分子主要有CD4单克隆抗体、CD4单链抗体(Single Chain fragment variable,scFv)、CD4双价单链抗体(disulfide stabilize Fvs,dsFv)、人类免疫缺陷病毒(HIV)的被膜蛋白gp120。单克隆抗体能特异性识别肿瘤相关抗原及细胞表面特异性抗原,因而是应用最广的免疫毒素导向片段,但是完整的抗体(主要是非人源抗体)分子量大,穿透力弱,免疫原性强,又限制了临床应用。理论上单链抗体(Single Chain fragment variable,scFv)和双价单链抗体(disulfide stabilize Fvs,dsFv),这类抗体分子量小,穿透力强,避免了Fc段引起的非特异性细胞毒性及免疫原性,是目前认为最理想的导向片段。但是由于膜分子CD4存在很大变异,制备工艺复杂。而gp120分子也能特异性的识别并结合CD4分子。有研究发现gp120不仅可以特异性识别并结合CD4分子,而且可在体外及体内活化Treg细胞。gp120刺激Treg细胞后可使cAMP在胞浆内聚集。而抑制内源性cAMP合成可阻止gp120活化Treg细胞。gp120的耐受效应依赖于Treg细胞的存在及通过gp120介导的活化使cAMP的上调。在异种移植引起的GVHD模型中,单次剂量的gp120即可抑制致死性GVHD,实验还发现通过刺激CD4受体使T细胞受体依赖的Treg活化通路激活从而诱导体内免疫耐受。但gp120分子较大,存在免疫原性高等缺点。gp120由恒定区和高变区组成:V1~V5区段为高变区,位于gp120表面,C1~C5区为稳定区,主要位于gp120核心区域。gp120的第4恒定区(C4)是gp120与CD4结合的主要区域,V3区对HIV侵入有重要的辅助作用,此外,gp120的第2恒定区(C2),第3恒定区(C3),第4高变区(V4)也有一定的辅助作用。因此选择HIV gp120分子的C2-C4区作为靶向片段,不仅保留了gp120与CD4结合的功能以及在Treg细胞活化中的作用,而且小片段相对容易制备,免疫原性较低。
TGF-β1、IL-2及PGE2等均能诱导CD4+CD25-Treg转化为CD4+CD25+Treg细胞,其中TGF-β受到广泛关注。TGF-β1与Treg对于控制自身免疫反应和维持机体免疫耐受状态有着非常重要的作用。体内外的研究已经证实TGF-β1的表达与Treg细胞的增殖分化密切相关。在胰岛给与短暂的TGF-β1脉冲,能够刺激该处的CD4+CD25+T细胞增殖和阻止CD8+T细胞介导的I型糖尿病的进展。在外周淋巴器官,过表达TGF-β1能够增加外周CD4+CD25+T细胞和Foxp3表达,阻断T细胞TGF-β1信号通路则相反,说明TGF-β1对调节外周CD4+CD25+T细胞池和Foxp3表达有重要作用。Chen等用TGF-β1和TCR共刺激首次在体外成功将初始CD4+CD25-T细胞转化为Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞。初始CD4+CD25-T细胞感染表达Foxp3基因逆转录病毒后转化为CD4+CD25+Treg,可进一步抑制未被感染的CD4+CD25-Treg的增殖。研究发现TGF-β1诱导初始CD4+CD25-T细胞转化iTreg可能是通过其信号通路启动细胞核Foxp3基因的表达,且TGF-β1和IL-2在诱导iTreg产生中扮演关键的角色,为大量获得有功能的Treg提供新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种促Treg化重组蛋白,该重组蛋白主要由靶向片段和功能片两部分构成。靶向片段可以是CD4单克隆抗体、CD4单链抗体(Single Chain fragment variable,scFv)、CD4双价单链抗体(disulfide stabilize Fvs,dsFv)、人类免疫缺陷病毒(HIV)的被膜蛋白gp120,本发明优选可以特异性识别并结合CD4分子的gp120的C2-C4片段。功能片段可以是TGF-β1、IL-2及PGE2,本发明优选hTGF-β1。C2-C4片段可以直接以C末端与hTGF-β1的N末端相连构成融合蛋白,也可以在两者之间增加一个连接肽(linker),以构成融合蛋白C2-C4-linker-hTGF-β1,连接肽长度可为2-100,常用的是10-50个氨基酸,优选的是14-30个氨基酸。连接短肽可以使C2-C4片段和hTGF-β1之间有更大的变化空间并有更好的柔韧性或刚性,或因更大的变化空间使C2-C4片段与受体的结合更容易些。连接肽的结构可为(G4S)3~4。连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性,最优选的是没有连接肽。其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供编码重组蛋白C2-C4-linker-hTGF-β1的核酸序列,优选如SEQ ID NO:2所示
本发明还提供包含C2-C4-linker-hTGF-β1重组蛋白分子核酸序列的载体和宿主菌。
本发明进一步提供制备C2-C4-linker-hTGF-β1重组蛋白分子的方法,包括:制备hmTGF-β1和C2-C4-Linker DNA片段,构建C2-C4-Linker-hmTGF-β1重组分子原核表达载体,表达重组蛋白C2-C4-Linker-hmTGF-β1,纯化重组蛋白C2-C4-Linker-hmTGF-β1。
本发明获得的蛋白可用于:
1)与HIV竞争性结合CD4,预防HIV感染;
2)增加体内Treg细胞数量,增强Treg功能,用于治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介导的相关疾病;
3)抑制肿瘤细胞增殖并可诱导凋亡,用于防治肿瘤。
相对于现有技术,本发明的重组蛋白分子C2-C4-linker-hTGF-β1及其原核表达系统具有以下特点:
1、重细分子由两部分组成:靶向片段和功能片段;
2、gp120 C2-C4区特异性结合CD4分子,具有靶向特异性,提高重组分子的转化效率;
3、人成熟TGF-β1(hTGF-β1)为功能片段,作用于初始CD4+CD25-T细胞促其Treg化;
4、gp12 0C2-C4与CD4结合后,可活化体内静止的CD4+CD25-T细胞,增强其抑制功能,因此,C2-C4又可加强已获Treg化细胞功能,是一个双重作用分子;
5、构建重组分子的原核表达系统,采用了原核表达系统,并融合6个HIS标签,蛋白以包涵体形式表达,具有蛋白表达量高、纯度高、易于纯化回收等优点。
附图说明
图1.C2-C4-Linker PCR结果
M:100bp marker
Lane1:近550bp处见C2-C4-Linker条带
图2.RT-PCR扩增hmTGF-β1
Lane 1-2:350bp处见一较亮hmTGF-β1条带
图3.质粒pCR2.1-hmTGF-β1构建鉴定
M:100bp marker;lane 1:质粒pCR2.1-hmTGF-β1;lane2-3:Apal单酶切鉴定
图4.质粒 pCR2.1-C2-C4-Linker构建鉴定
M:100bp marker;lane 1:质粒pCR2.1-C2-C4-Linker;
Lane 2-3:BamHI和SalI双酶切质粒,约550bp见一条带
图5.重组分子原核表达质粒pET-C2-C4-L-hmTGF-β1构建鉴定
M:100bp marker;lane1:BamHI 酶切鉴定质粒,约700bp处见一条带;lane2:质粒pET-C2-C4-L-hmTGF-β1
图6.western-blot检测特异性表达条带lane 1:诱导6h后;lane 2:诱导6h后离心上清;lane 3:包涵体溶解液
图7.蛋白p C2-C4-L-hmTGF-β1的诱导表达和纯化
M:蛋白marker;lane1:诱导前对照;lane 2:诱导6h后;lane 3:诱导6h后离心上清;lane 4:包涵体溶解液;lane 5:纯化后
图8不同时间点、不同重组蛋白浓度400倍显微镜下细胞状态和细胞数量的变化
图9不同蛋白浓度、不同时间点MTT法比较细胞增值率的变化
具体实施方式
现结合以下实施例更加详细的描述本发明的C2-C4-Linker-hmTGF-β1重组蛋白及其制备方法和应用。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人所著《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中的条件进行操作,或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例一 hmTGF-β1和C2-C4-Linker DNA片段的获取
1.C2-C4-Linker DNA片段
分离中国流行株HIV-1感染患者外周血单个核细胞,Trizol(购自invitrogen)法提取总RNA,用逆转录酶superscript III(购自invitrogen)逆转录获得cDNA,以cDNA模板,特异性引物指导下PCR扩增C2-C4区DNA片段。特异性引物(上海英骏合成):上游引物:5,-CGCAGGATCCTCTGTCAATTTCACGG-3,引入内切酶BamHI位点;下游引物:5,-ACGCGTCGACATACATTGCTTTTCCT-3,引入内切酶SalI位点。反应条件:98℃预变性3min,98℃30s,50℃30s,72℃60s,共30个循环,最后72℃延伸10min。凝胶回收试剂盒(购自上海捷瑞)纯化回收目的基因C2-C4,BamHI和SalI双酶切后亚克隆至原核表达载体pET28a(+)(购自Merck公司),命名pET28a-C2-C4。以pET28a-C2-C4原核质粒为PCR模版,设计特异性引物:上游引物:5’AGGGATCCTCTGCCAATTTCAC 3’(划线部分为引入BamHI 限制性内切酶位点);下游引物:5’AGTCGACCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCATACATTGCTTTTCCTAC 3’(划线部分为引入SalI限制性内切酶位点,框内为引入的Linker片段)。PCR扩增C2-C4-Linker DNA片段,反应条件::94℃预变性3min,以94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸1min为一个循环,共35个循环,72℃延伸10min。1.5%琼脂糖凝胶鉴定和回收PCR产物。结果见图1,说明成功在C2-C4 3’端引入Linker,回收纯化C2-C4-Linker。
2.RT-PCR扩增目的基因hmTGF-β1
设计特异性引物:上游引物:5’AGTCGACGCCCTGGACACCAACTATT 3’(划线部分为引入SalI限制性内切酶位点);下游引物:5’TCTCGAGGCTACACTTGCAGGAGCGC3’(划线部分为引入XhoI限制性内切酶位点)。
取人新鲜外周血10ml,人淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞,按Trizol(英骏公司)说明书步骤提取总RNA,以提取的总RNA为模板,M-MLV试剂盒步骤逆转录获得hmTGF-β1的cDNA。以获得的cDNA为模板,使用phusion高保真DNA聚合酶,特异性引物PCR扩增hmTGF-β1基因,反应条件:98℃预变性3min,以98℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸1min为一个循环,共35个循环,72℃延伸10min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收PCR产物。结果见图2,说明成功扩增hmTGF-β1,回收纯化hmTGF-β1。
实施例二 hmTGF-β1和C2-C4-Linker克隆质粒的构建和鉴定
phusion高保真DNA聚合酶和pfx Tag DNA聚合酶均为平末端克隆,使用普通Tag DNA聚合酶在hmTGF-β1和C2-C4-Linker PCR产物末端加A后,用T4 DNA连接酶连接至pCR2.1-T克隆载体,转化感受态细胞DH5α,经蓝白筛选挑取阳性单克隆菌株于LB培养基(含50mg/ml氨苄青),37℃培养16-18h,小量提取质粒酶切鉴定。构建质粒分别命名为pCR2.1-hmTGF-β1、pCR2.1-C2-C4-Linker。选T载体和hmTGF-β1序列中均有的Apal限制性内切酶位点单酶切鉴定pCR2.1-hmTGF-β1,BamHI和SalI双酶切鉴定pCR2.1-C2-C4-Linker。结果分别见图3和图4,说明载体构建成功,为方便构建重组分子奠定基础。
实施例三 C2-C4-Linker-hmTGF-β1重组分子原核表达载体的构建和鉴定
BamHI和SalI双酶切质粒pCR2.1-C2-C4-Linker,回收目的DNA片段C2-C4-Linker,SalI和XhoI双酶切质粒pCR2.1-hmTGF-β1,回收目的DNA片段hmTGF-β1,BamHl和XhoI双酶切线性化原核表达载体pET-28a,T4 DNA连接酶连接C2-C4-Linker和hmTGF-β1至pET-28a,转化BL21(DE3)感受态细胞,涂布LB同体培养基(含25mg/ml卡那霉素)平板于37℃培养16h,挑取单克隆菌落于LB培养基(含25mg/ml卡那霉素),37℃摇床剧烈摇菌培养16-18h,小量提取质粒,命名为pET-C2-C4-L-hmTGF-β1,BamHI酶切鉴定重组质粒pET-C2-C4-L-hmTGF-β1,1.5%琼脂糖凝胶电泳示在约700bp处见一条带(见图5),与预期结果相符。鉴定正确者进行测序。
实施例四 重组分子蛋白的诱导表达和鉴定
接种保存的测序正确菌种pET-C2-C4-L-hmTGF-β1(BL21(DE3))于10ml LB培养基(含25mg/ml卡那霉素),37℃摇床150rpm过夜震荡培养,次日按1∶100接种于500ml LB培养基(含25mg/ml卡那霉素),37℃摇床剧烈摇菌监测OD600至0.5-0.6时,收集1ml菌液为两导前对照,加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mmol/L,诱导表达6h后收集菌体,按20ml/g菌体加入裂解缓冲液(300mmol NaCl,50mmol Tris-HCL,pH8.0),超声波破碎菌体(6mm变幅杆,400W,工作5S,停5S,8min为一个循环,共4个循环),12000g×20min、4℃离心,收集上清和沉淀,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和用小鼠抗6×His单克隆抗体western-blot鉴定蛋白是否表达及表达形式,将表达蛋白命名为pC2-C4-L-hmTGF-β1。结果见图6。
实施例五 蛋白p C2-C4-L-hmTGF-β1的纯化
pET28a原核表达载体在表达蛋白后融合6×His标签,可通过亲和层析纯化目标蛋白。按上述方法获得包涵体,按20ml/g菌体加入包涵体洗涤液((2M尿素,2%Triton,300mmol NaCl,100nmolPMSF,50mmol Tris-HCL,pH8.0)重悬沉淀洗涤包涵体3-4次,彻底去除菌体残渣和内毒素,12000g×20min、4℃离心去上清,按15ml/g包涵体加入包涵体溶解液(8M尿素,300mmol NaCl,100nmolPMSF,50mmol Tris-HCL,pH8.0),室温震荡溶解4h,12000g×20min、4℃离心去除不溶沉淀。以Ni-NTA(Qiagen)凝胶亲和层析方法纯化蛋白p C2-C4-L-hmTGF-β1:
平衡液1(8M尿素,300mmol NaCl,50mM Tris-HCL,pH8.0)10个柱床体积平衡镍柱
包涵体溶解液等柱床体积过柱,夹闭流出口,室温静置30min,分次纯化全部包涵体溶解液。
洗涤液2(10mmol咪唑,8M尿素,300mmol NaCl,50mM Tris-Hcl,pH8.0)2个柱体积洗涤非特异结合蛋白。
洗脱液3(500mmol咪唑,8M尿素,300mmol NaCl,50mM Tris-Hcl,pH8.0)5个柱体积洗脱目标蛋白。
10个柱床三蒸水洗柱后灌注20%乙醇保存于4度。
SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白纯化效果。结果见图7 lane 5。
实施例七 蛋白p C2-C4-L-hmTGF-β1的复性
纯化后蛋白溶解液用洗脱液3(500mmol咪唑,8M尿素,300mmol NaCl,50mM Tris-Hcl,pH8.0)3倍稀后装入透析袋(pierce公司),配制复性液(2M尿素,1mmol还原型谷胱甘肽,0.1mmol氧化型谷胱甘肽,100mmol苯甲基磺酰氟,10%丙三醇,300mmol NaCl,50mM Tris-Hcl,pH8.0)置4℃冰柜中预冷,将按稀释后蛋白溶解液∶复性液=1∶20配制复性液,透析袋水平放置且全部没入复性液中,置于4℃摇床缓慢摇动,复性过程中,前12h,每4h换一次预冷的复性液,在12-24h过程中,每6h换一次复性液,在24h-72h中,每12h换一次复性液,共复性72h,结束后,按与稀释后蛋白溶解液体积比=1∶1,用预冷磷酸盐缓冲液逐步透析去除尿素,每2h换缓冲液一次,至少换6次,及时离心去除析出蛋白。从复性液取出透析袋,水平置于干净玻璃器皿,用聚乙二醇20000(购自国药集团)于4℃透析浓缩,定时观察,防止析干,透析袋内存留液浓缩至原蛋白溶液体积1/10左右停止浓缩,lowary法测蛋白浓度。0.22μm一次性滤器过滤除菌,4℃保存备用。
实施例八 复性后蛋白p C2-C4-L-hmTGF-β1的功能鉴定
已知TGF-β1能够抑制人舌鳞癌细胞Tca-8113增殖和诱导凋亡,故选择该细胞鉴定复性后蛋白活性。
含10%FBS RPMI-1640培养基(Gibco公司)于5%CO2、37℃培养箱,常规培养人舌鳞癌细胞Tca-8113。接种4×103个细胞于96孔板,10%FBS RPMI-1640培养基培养24h至细胞贴壁,更换含1%FBS RPMI-1640培养基,按以下分组进行实验:
实验分组:PBS空白对照组,蛋白溶解液阴性对照组,蛋白组。
蛋白组按蛋白终浓度分为:0.5μmol/L,1.0μmol/L两组。
每组设三个复孔,于每6h、12h、24h、48h、60h、72h相差显微镜观察细胞形态变化和测OD490 MTT值,以阴性对照组细胞活性100%,计算比较细胞增值率的变化。结果:见图8,通过相差显微镜观察细胞形态变化,作用6h后,对照组和阴性对照组细胞形态良好,贴壁生长良好,成不规则梭型,细胞透明度大,折光性强,轮廓清晰,培养孔内清澈无碎片,细胞数量随时间增多;0.5μmol/L与1.0μmol/L蛋白处理组大部分细胞形态不好,胞间空隙加大,细胞折光性变弱,变得不透明,培养孔内可见大量细胞残片,1.0μmol/L蛋白处理组尤为严重,72h几乎见不到良好状态细胞。图9,MTT法测定不同时间细胞增值率变化,以阴性对照组活性为100%计算,前36h细胞增殖受到抑制,36h可能0.5μmol/L蛋白浓度组蛋白耗尽,细胞活性增加,但高浓度蛋白组仍持续降低。结果说明复性后蛋白能够抑制肿瘤细胞Tca-8113的增殖,成功复性出有功能的重组蛋白pC2-C4-L-hmTGF-β1。
Claims (29)
1.一种重组的促Treg(CD4+CD25+调控T细胞)化药物,其特征为该重组药物主要由靶向片段和功能片段两部分组成,并且可由连接片段连接。
2.如权利要求1所述的促Treg化药物,其靶向片段可以是CD4单克隆抗体、CD4单链抗体、CD4双价单链抗体、人类免疫缺陷病毒的被膜蛋白gp120。
3.如权利要求1所述的促Treg化药物,其靶向片段优选gp120。
4.如权利要求1所述的促Treg化药物,其靶向片段更优选gp120的C2-C4区。
5.如权利要求1所述的促Treg化药物,其功能片段可以是TGF-β1、IL-2及PGE2。
6.如权利要求1所述的促Treg化药物,其功能片段优选TGF-β1。
7.如权利要求1所述的促Treg化药物,其中靶向片段直接以N末端或C末端和功能片段C末端或N末端相连构成融合蛋白。
8.如权利要求1所述的促Treg化药物,其中靶向片段和功能片段通过柔性连接片段(linker)连接。
9.如权利要求1所述的促Treg化药物,其连接片段可以是氨基酸片段或高分子聚合物。
10.如权利要求1所述的的促Treg化药物,其连接片段优选氨基酸片段。
11.如权利要求1所述的的促Treg化药物,其连接片段优选为(G4S)3-4。
12.如权利要求1所述的促Treg化药物,高分子聚合物包括聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、二乙烯基醚与马来酸酐共聚物、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、氧化乙烯和甲醛共聚物、聚环氧化物、乙二酸和丙二酸共聚物以及上述这些物质的衍生物中的一种。
13.如权利要求1所述的促Treg化药物,其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同源性。
14.如权利要求1所述的促Treg化药物,其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95%的序列同源性。
15.如权利要求1所述的促Treg化药物,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
16.一种编码如权利要求书1所述的蛋白质的核酸序列,其核苷酸序列SEQ ID NO:2具有至少90%的序列同源性。
17.一种编码如权利要求书1所述的蛋白质的核酸序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;
18.一种载体质粒,携带有编码如权利要求1所述的促treg化药物的核苷酸序列。
19.一种重组宿主系统,经权利要求18所述的重组载体质粒转化、转染或转导得到,并用于表达如权利要求1所述的促Treg化药物。
20.如权利要求19所述的重组宿主系统可以是脊椎动物、昆虫、植物的细胞、酵母菌、细菌或病毒。
21.如权利要求20所述的重组宿主细胞,其中酵母菌可以是酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母或裂殖酵母。
22.如权利要求20所述的宿主细胞,其中细菌可以是大肠杆菌。
23.生产如权利要求1所述的促Treg化蛋白的方法:
该方法包括下列步骤:
a.制备hmTGF-β1和C2-C4-Linker DNA片段
b.构建C2-C4-Linker-hmTGF-β1重组分子表达载体
c.表达重组蛋白C2-C4-Linker-hmTGF-β1
d.纯化重组蛋白C2-C4-Linker-hmTGF-β1
24.生产如权利要求1所述的促Treg化药物,当连接片段是高分子聚合物时需要先将功能片段和靶向片段表达纯化后获得目标蛋白,然后通过化学反应将功能片段和靶向片段连接组装成具有促Treg化活性的分子。
25.一种药物组合物,其含有如权利要求1所述的促Treg化药物。
26.如权利要求1所述的促Treg化药物,可以加工成冻干粉针或注射液以及其它可以接受的水溶液剂型的制剂,可用于全身给药,如肌注、静脉点滴、静脉推注,或者局部给药,如皮下或病变部位注射。
27.如权利要求1-19所述的促Treg化药物,用于制备预防HIV感染、治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介导的相关疾病、防治肿瘤的药物。
28.如权利要求27所述的自身免疫性疾病包括慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、炎性肠病、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性硬化、急性特发性多神经炎等,系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、银屑病、干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病等。
29.如权利要求27所述的肿瘤包括CD4+的良性和恶性肿瘤,包括淋巴瘤、成人T细胞白血病、NK母细胞白血病等。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010106019427A CN102552904A (zh) | 2010-12-23 | 2010-12-23 | 人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010106019427A CN102552904A (zh) | 2010-12-23 | 2010-12-23 | 人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102552904A true CN102552904A (zh) | 2012-07-11 |
Family
ID=46400356
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010106019427A Pending CN102552904A (zh) | 2010-12-23 | 2010-12-23 | 人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102552904A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110396543A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-11-01 | 广州普世利华科技有限公司 | 一种肿瘤相关基因突变位点筛查方法 |
CN111920802A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-11-13 | 华侨大学 | 穿心莲内酯在制备防治成人t细胞白血病药物的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991015238A1 (en) * | 1990-04-03 | 1991-10-17 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for vaccination against hiv |
CN101095953A (zh) * | 2005-03-14 | 2008-01-02 | 博尔诚(北京)科技有限公司 | 通过吸引效应t细胞和耗损调节性t细胞治疗癌症 |
CN101415415A (zh) * | 2006-01-23 | 2009-04-22 | 约瑟夫·P·埃里科 | 定向药物开发的方法和组合物 |
-
2010
- 2010-12-23 CN CN2010106019427A patent/CN102552904A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991015238A1 (en) * | 1990-04-03 | 1991-10-17 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for vaccination against hiv |
CN101095953A (zh) * | 2005-03-14 | 2008-01-02 | 博尔诚(北京)科技有限公司 | 通过吸引效应t细胞和耗损调节性t细胞治疗癌症 |
CN101415415A (zh) * | 2006-01-23 | 2009-04-22 | 约瑟夫·P·埃里科 | 定向药物开发的方法和组合物 |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
江文正等: "在鸡痘病毒中共表达HIV-1 gp120与IL-2基因", 《细胞与分子免疫学杂志》, no. 05, 30 October 2003 (2003-10-30) * |
王玉红等: "HIV-1 env与hIL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究", 《免疫学杂志》, no. 04, 15 October 1999 (1999-10-15) * |
秦云龙等: "中国流行株HIV-1gag和hIL-2/hIL-6核酸疫苗构建与实验免疫研究", 《免疫学杂志》, no. 01, 25 January 2001 (2001-01-25) * |
蒋春雷: "新型导向药物:基因重组免疫毒素研制的现状", 《国外医学.药学分册》, no. 01, 31 December 1995 (1995-12-31) * |
郭焱等: "EHV-1_(CN)与IL-2基因共表达核酸疫苗诱导产生CTL的观察", 《中国生物制品学杂志》, no. 02, 25 August 2001 (2001-08-25) * |
郭焱等: "共表达HIV-1CN与IL-2基因产物免疫鼠T淋巴细胞亚群的研究", 《武警医学院学报》, no. 04, 30 December 2000 (2000-12-30) * |
郭焱等: "共表达HIV-1的gag-gp120与IL-2的pGPIL-2诱导小鼠产生细胞毒性T细胞的研究", 《中国艾滋病性病》, no. 03, 26 June 2002 (2002-06-26) * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110396543A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-11-01 | 广州普世利华科技有限公司 | 一种肿瘤相关基因突变位点筛查方法 |
CN111920802A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-11-13 | 华侨大学 | 穿心莲内酯在制备防治成人t细胞白血病药物的应用 |
CN111920802B (zh) * | 2020-09-11 | 2024-01-23 | 华侨大学 | 穿心莲内酯在制备防治成人t细胞白血病药物的应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN100582122C (zh) | O型口蹄疫病毒多表位粘膜免疫疫苗及其应用 | |
CN101962413A (zh) | 具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因与应用 | |
CN104231068A (zh) | 人白细胞介素ii突变体及其应用 | |
CN101088559A (zh) | 一种多表位结核基因疫苗及其制备方法 | |
CN108840947A (zh) | 牛白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种牛长效干扰素 | |
CN108707199A (zh) | 靶向tem8的嵌合抗原受体t细胞及其应用 | |
CN102552904A (zh) | 人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子 | |
CN104177502B (zh) | 一种鲎素肽-抗体融合蛋白及制备方法 | |
CN101376887B (zh) | 猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用 | |
CN102766645B (zh) | 一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白tat-gh及制备方法和应用 | |
CN101544693B (zh) | 重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法 | |
CN101985467A (zh) | 镇痛活性肽vgg及其制备与应用 | |
CN110478480A (zh) | 基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮f1l疫苗及其制备方法 | |
CN102731658A (zh) | 一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用 | |
CN101139399B (zh) | 重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白及其制备方法和用途 | |
CN107253994A (zh) | 一种由猪白细胞介素2、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN103232543B (zh) | 具有Tumstatin活性的重组蛋白Tumstatin-CD137L4及其制备和应用 | |
CN101880327A (zh) | 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法 | |
CN103130894A (zh) | 抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv及其编码基因与应用 | |
CN103214584B (zh) | 具有抑制肿瘤微环境血管再生和激活适应性免疫应答双功能的融合蛋白及其基因和应用 | |
CN100371349C (zh) | 重组免疫治疗蛋白及其表达方法与应用 | |
CN101838325A (zh) | 猪用抗原呈递蛋白及其编码基因和应用 | |
CN107253995A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN102675428A (zh) | 肝靶向穿膜抗病毒融合多肽及其编码基因与应用 | |
CN111154742B (zh) | 一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120711 |