CN102675428A - 肝靶向穿膜抗病毒融合多肽及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝靶向穿膜抗病毒融合多肽及其编码基因与应用，该融合肽是由SEQIDNO:1的氨基酸残基序列组成的多肽。本发明还公开了所述肝靶向穿膜肽-天蚕素融合肽的编码基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:2。本发明融合多肽具有以下优点：1)定位准确、高效结合；2)竞争性阻断和胞内靶向杀伤；3)毒副作用小。本发明在医学和生物制药领域，尤其是抗HBV药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

Description

肝靶向穿膜抗病毒融合多肽及其编码基因与应用

技术领域

    本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有肝靶向穿膜作用的抗病毒融合肽及其编码基因与应用。

背景技术

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 为嗜肝病毒，全世界超过3.5 亿人感染HBV，我国是HBV高流行区，根据全国人群乙肝血清流行病学调查，人群HBsAg携带率达7.18%，约9300万人。HBV感染会导致急慢性乙型肝炎的发生，是引起肝硬化、肝细胞癌的重要因素之一，每年死于乙肝相关性疾病高达100万人，WHO已将该病毒感染列为全球十大最常见致死病因之一。大量的临床研究证明，HBV在体内持续存在和不断复制引起肝脏病变的持续活动和发展是导致病情进展的根本原因，因此寻求有效的治疗药物及给药途径最大限度地长期抑制或清除HBV显得尤为重要。尽管目前有核苷类药物和干扰素等抗HBV制剂，但由于HBV主要在肝细胞内寄生和复制，单独使用这类抗病毒药物时，在体内容易扩散降解，导致相对平均的组织分布，未能在肝细胞内形成有效的抗病毒作用浓度，因而存在着给药剂量大，用药次数多、副作用大及产生耐药性等问题，故HBV感染的治疗仍然是目前面临的一道难题。

近年，肝靶向药物制剂的研究为抗HBV药物剂量及副作用的限制问题提供了可期待的解决途径。抗病毒药物的肝靶向制剂具有特异性好、选择性强、能减少药物用量和给药次数，以及降低毒副作用和提高药物疗效等优点。然而，由于受体水平和载体的种类、大小及特异性等多种因素的影响，目前的靶向研究虽具有一定的靶向性，尚存在难以达到细胞水平的精确靶向、易被机体免疫系统清除等不足。

肝靶向穿膜肽（hepatocyte-targeting and penetrating peptide，HTPP）位于恶性疟原虫环子孢子蛋白（circumsporozoite protein, CSP）保守I区上游。CSP在疟原虫子孢子特异性粘附、入侵肝细胞中起着重要作用。通过静脉注射，重组的CSP在几分钟内就能结合并进入肝细胞，表明CSP有高效而特异的肝细胞靶向性。研究发现其中HTPP肽段与人肝癌细胞 HepG 2具有高亲和力（80nM），可特异性结合肝细胞表面的受体---硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (heparan sulfateproteoglycans，HSPG)。HSPG是由核蛋白分子和糖胺聚糖（gly-cosaminoglycan，GAG）通过糖苷键共价结合组成的复合大分子。研究显示肝脏的HSPG具有独特的GAG链，其硫酸化程度显著高于其它组织，尤其是GAG链的 N 和 O 位的硫酸化决定了CSP等对肝脏的特异选择性。同时近年研究表明肝细胞表面的HSPG是HBV的初始黏附受体，在HBV感染第一步的细胞黏附中起着关键性作用。因此，以HSPG为新靶点阻断HBV粘附有助于发展新型药物拮抗病毒。近年研究显示在HTPP中还含有一个PELEX/VTS基序，能够有效穿透肝细胞膜，介导CSP进入肝细胞内部，实现细胞亚定位。基于上述发现，故HTPP成为备受青睐的靶向穿膜部位。

抗菌肽（antimicrobial peptides, AMP）是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽，具有广谱抗菌活性、抗病毒活性和肿瘤细胞杀伤毒性，在低浓度条件下还有免疫调节作用，但对高等动物机体的正常细胞无损伤，且极少产生耐药性。近年，AMP的抗病毒研究逐渐成为热点，其抗病毒机制涉及通过结合细胞表面HSPG，阻断病毒粘附侵入；抑制病毒DNA复制，以及刺激机体免疫反应等。早在1993年我国研究人员以抗菌肽柞蚕素对鸭乙型肝炎病毒感染后的治疗作用表明，给药 10 天后可显著降低血清中鸭肝炎病毒的DNA水平。大连生物技术研究所发现柞蚕素对乙型肝炎病毒DNA复制有明显抑制作用，100例乙型肝炎临床试验结果良好：临床治愈率60% ，HBeAg 转阴率达62%，未发现任何毒副作用。大连水产制药厂肾肝宁（含柞蚕素）治疗肝炎临床试验154例，治愈率29.2%，有效率83.2%，获得了广东省卫生厅新药证书粤卫药准字（1996）第107388号。这些研究表明抗菌肽对HBV病毒的抑制作用是确定的。家蝇有独特的免疫防御机制，从幼虫到成虫均生活在杂菌横生的环境，比一般生物能更有效抵御病原生物的感染。家蝇天蚕素（Musca domestica cecropin, MDC）是本实验室从家蝇中克隆的一种昆虫抗菌肽（Genbank 登录号为EF175878），研究显示家蝇天蚕素具有显著的杀菌作用，并对人肝癌细胞具有明显抑制作用，但对人正常肝细胞和红细胞无毒性。另一方面，家蝇天蚕素治疗组裸鼠脾脏的生发中心面积增大，提示家蝇天蚕素可能对裸鼠的免疫功能有较好的促进作用。更有意义的是将家蝇天蚕素体外作用于HepG 2.2.15细胞，发现其对HepG 2.2.15细胞的HBsAg表达具有抑制作用，并呈现一定的浓度依赖关系。因此，家蝇天蚕素成为非常理想的抗病毒作用部位。

发明内容

本发明的目的在于根据现有抗乙肝病毒药物中存在的上述不足，提供一种新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽，及其编码基因与应用。

本发明通过SOE-PCR方法构建新型融合基因，通过人工合成方法和重组原核表达载体重组表达方法，分别获得了该融合基因所编码的多肽片段，并经实验证明该融合多肽具有靶向穿膜作用和抗病毒作用，为一种新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽。

本发明的新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽，其特征在于，它含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

编码上述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种重组表达载体，它含有编码上述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因。该重组表达载体可以是在原核表达载体pET32a的多克隆位点插入上述编码上述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因而构建的重组表达质粒。

本发明还提供一种重组工程菌，它含有上述的重组表达载体。这可以是将上述的重组表达载体转化大肠杆菌（例如E. coli BL21而得到的）。

本发明经实验证明，上述的新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽，具有靶向穿膜作用和抗病毒作用。因此，该融合多肽可用于制备抗乙型肝炎病毒药物。

本发明的新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽可通过以下方法之一制备：

1、根据所述融合多肽的氨基酸序列，用固相合成法合成多肽。

2、将编码所述融合多肽的核苷酸序列克隆入表达载体，并将重组后的质粒转化宿主细胞，进行重组表达。纯化后获得该融合多肽。

    作为一种优选方案，上述制备方法2中所述构建重组表达载体时所用的表达载体优选但不限于原核表达载体pET32a。

作为一种优选方案，上述制备方法2中所述表达宿主菌优选但不限于大肠杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明将具有肝靶向和肝细胞膜穿透作用的短肽与具有抗病毒作用但不损害正常真核细胞功能的家蝇天蚕素融合，构建的融合多肽与目前研究比较，具有能达到细胞水平的精确主动靶向和不易被机体免疫系统清除等特点，有望成为定位准确、高效结合、竞争性阻断和靶向杀伤的新型生物导弹药物，因而具有非常好的应用前景，将给社会带来一定的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为融合基因重组示意图；

图2为SOE-PCR重组融合基因。其中，M为DNA分子量标准(20bp)；1-2为第一轮 PCR扩增产物； 3为重组的全长融合基因；

图3为重组质粒HTPP-MDC/pMD20-T的菌落PCR和双酶切鉴定。其中，M1/2为DNA分子量标准(DL2000/DL10000)；1为重组质粒HTPP-MDC/pMD20-T的PCR鉴定；2为Kpn I、Hind III双酶切重组质粒HTPP-MDC/pMD20-T；

图4为融合多肽对HepG2.2.15细胞上清液HBV DNA拷贝数的影响；

图5为融合多肽作用HepG 2细胞后的荧光显微图片。其中，A对照组，B为HTPP-MDC作用组（A1、B1为白光拍摄图，A2、B2为荧光拍摄图）；

图6为重组原核表达质粒pET32a/HTPP-MDC的菌落PCR和双酶切鉴定；其中，M1/2为DNA分子量标准(DL 2000/DL10000)；1为重组质粒pET32a/HTPP-MDC的PCR鉴定；2为Kpn I、Hind III双酶切重组质粒pET32a/HTPP-MDC；

图7为融合蛋白的诱导表达分析。其中M为蛋白质分子质量标准；1-2为E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC诱导前和诱导后全菌蛋白；3-4为E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC超声破菌后上清和沉淀；

图8为融合蛋白的Western Blot鉴定。其中，M为蛋白质分子质量标准；1-2分别为E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC诱导前和诱导后全菌蛋白。

具体实施方式

    以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法，可参照本领域常规方法条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的方法和条件，或按照制造产品厂商所建议的条件进行。本发明采用的是常规的商品化的载体和表达宿主菌，本领域可以替代使用的其他原核载体不一一在实施例中赘述，但并不能因此限定本发明范围。

实施例1  SOE-PCR法构建融合基因

1、引物设计 （图1）

用Primer Premier 5.0生物软件设计4条寡核苷酸引物，引物序列如SEQ ID NO:3~6所示。其中H1、M1为与目的基因同向部分的引物，H2、M2为与目的基因互补部分的引物，M1和M2用于从pMD 20-T/MDC质粒中扩增MDC片段。H1与H2、H2与M1之间分别有16 bp的重叠区。上游引物H1中包含Kpn I酶切位点和蛋白酶切位点，下游引物M2中设计了终止密码子和Hind Ⅲ酶切位点，各引物在目的基因中的位置如图1所示。

2、 SOE-PCR法构建含有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的融合基因，将整条序列分成两段（HM1、HM2），各自PCR扩增出这两段序列，然后用一轮PCR进行拼接，最后合成完整的目的基因序列（图2）。具体方案如下：

（1）HM1的扩增方法：

将上述合成的引物H1和H2进行链延伸反应，向0.2 ml Eppendorf管中逐项加入下表所列成分：

5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）	5.0μl
		dNTP Mixture (2.5mmol/L each)	2.0μl
Sterile H2O	13.75μl
		H1 Primer (10 μM/L)	2.0μl
H2 Primer (10 μM/L)	2.0μl
		PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5units/μl)	0. 25μl
Total volume	25.0μl

Eppendorf管置入DNA 扩增仪中，反应条件为：98℃ 10 sec，68℃ 40 sec，循环30 次。采用北京TIANGEN公司的TIANgel Midi Purification Kit纯化PCR 产物。

（1）HM2的扩增方法：

以pMD 20-T/MDC质粒为模板，M1和M2为引物进行PCR反应，向0.2 ml Eppendorf管中逐项加入下表所列成分：

5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）	5.0μl
		dNTP Mixture (2.5mmol/L each)	2.0μl
Sterile H2O	14.75μl
		M1 Primer (10 μM/L)	2.0μl
M2 Primer (10 μM/L)	2.0μl
		pMD 20-T/MDC Plasmid	1.0 μL
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5units/μl)	0. 25μl
		Total volume	25.0μl

Eppendorf管置入DNA 扩增仪中，反应条件为：98℃ 10 sec，68℃ 40 sec，循环30 次。采用北京TIANGEN公司的TIANgel Midi Purification Kit纯化PCR 产物。

（3）全长目的基因的拼接，具体方法如下：第一步以上一轮PCR扩增获得的HM1和HM2为模板进行链延伸反应，由于HM1和HM2片段之间具有部分重叠链，在扩增反应中通过重叠链的延伸从而将两段基因拼接起来，合成全长基因。第二步再以外侧引物H1和M2进行大量扩增。第三步用TaKaRa Taq聚合酶为融合基因加上Poly A尾，以利于下一步的TA克隆。PCR反应体系及条件如下：

向0.2 ml Eppendorf管中逐项加入下表所列成分：

5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）	10.0μl
		dNTP Mixture (2.5mmol/L each)	4.0μl
Sterile H2O	31.5μl
		HM1	1.0μl
HM2	1.0μl
		PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5units/μl)	0. 5μl
Total volume	48.0μl

Eppendorf管置入DNA 扩增仪中，反应条件为：98℃ 10 sec，68℃ 40 sec，循环20 次。取出Eppendorf管加入

H1 Primer (10 μM/L)	1.0μl
		M2 Primer (10 μM/L)	1.0μl

Eppendorf管置入DNA 扩增仪中，反应条件为：98℃ 10 sec，68℃ 40 sec，循环30 次。取出Eppendorf管加入

TaKaRa Taq (5units/μl)

0. 25μl

Eppendorf管置入DNA 扩增仪中，72℃延伸20min。用TIANgel Midi Purification Kit 回收，纯化PCR产物。将目的片段克隆入pMD 20-T载体，得到重组质粒pMD 20-T/HTPP-MDC，转化大肠杆菌DH5α，经过蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定、双酶切鉴定及DNA测序分析后，表明获得融合基因序列、拼接组合的顺序及方向完全正确，说明融合基因重组成功（图3）。

实施例2  融合多肽的固相化学合成、抗HBV效果及肝靶向穿膜作用研究

1、新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的固相化学合成：

   按SEQ ID NO:1的氨基酸残基的序列，委托北京中科亚光有限公司合成多肽，经纯化达到95%的纯度。

2、融合多肽的抗HBV效果研究：以HepG2.2.15细胞为HBV感染细胞模型，用含不同浓度梯度药物的培养液培养HepG 2.2.15细胞，每3天更换含有药物的培养液，分别收集第3、6、9天上清液，-80℃保存。ELISA检测细胞上清液中的HBsAg、HBeAg含量，Real-time PCR测定HBV DNA浓度。结果显示融合多肽能显著抑制HBV DNA的复制（图4）。

3、肝靶向作用研究：分别取正常小鼠心、肝、肾、肺、脾组织冰冻切片，微波修复，PBS洗3次，加10% BSA 37℃封闭l h，加带FITC标记的融合多肽置湿盒4℃过夜(空白对照用PBS)，PBS洗涤，封片，荧光显微镜观察。结果显示融合多肽与小鼠肝组织结合后显示强荧光，而其它组织切片仅见微弱荧光。

4、肝细胞穿膜作用研究：利用FITC标记的HTPP-MDC作用HepG 2细胞10 min后，荧光显微镜观察可见细胞内充满绿色荧光，提示HTPP-MDC已经透过细胞膜进入HepG 2细胞内部（图5）。

实施例3  新型肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的重组表达

本实施例利用Novagen公司的pET表达系统表达融合基因HTPP-MDC，以pET32a(+)质粒为表达载体，宿主细胞为大肠杆菌。

1  融合基因表达载体的构建

将重组质粒pMD 20-T/HTPP-MDC和表达载体pET32a(+)分别用限制性内切酶Kpn I和Hind Ⅲ 进行双酶切，然后用T4连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli BL21，转化菌种涂于含有氨苄青霉素的平板，培养16~18h后，挑取单菌落培养后进行菌液PCR、酶切鉴定及DNA测序验证，结果表明融合基因表达质粒pET32a/HTPP-MDC构建成功（图6）。

将pET32a/HTPP-MDC重组质粒转化已制备好的表达宿主菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经氨苄抗性筛选，挑取pET32a/HTPP-MDC阳性单菌落到5ml LB液体培养基中( 1wt%的蛋白胨，0.5wt%的酵母抽提粉，85 mmol/L 的氯化钠)，37℃、220rpm振摇8~12h，然后将此菌液按1:100比例接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃、220rpm振摇至OD600约0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导4~6h。离心收集菌细胞加入1×SDS-PAGE Buffer（50mM Tris-HCl  pH6.8，100mM DTT，2%SDS，0.1wt%溴酚蓝，10wt%甘油），煮沸5min，离心，取上清加样。制作6体积%的浓缩胶，15体积%的分离胶，电泳电压：浓缩胶80V，分离胶120V。电泳结束后，凝胶进行考马斯亮蓝染色、脱色、扫描分析，因融合多肽理论分子量约为7 KD，而载体pET32a具有Trx标签蛋白，分子量约为18 kDa，因此表达的目的蛋白应是大约25 kDa。SDS-PAGE结果表明：诱导后菌体有明显表达条带与预期相符，目的蛋白为可溶性表达（图7）。由于目的蛋白含有pET32a编码的6×His标签，采用鼠源His单克隆抗体为一抗进行Western Blot，结果显示诱导后的含重组质粒表达菌株在约25 kDa处有一条特异性条带而未诱导的没有，进一步证实了表达的蛋白为带有His标签的目的蛋白（图8）。由于诱导表达的目的蛋白带有6×His标签，能与6×His配体特异性结合因而可利用GE healthcare的HisTrap? HP 和蛋白纯化系统进行亲和层析纯化。离心收集诱导表达的菌体进行超声破菌，4℃ 14 000rpm离心30min，收集上清，过预平衡的HisTrap? HP纯化柱，用Binding buffer洗去柱子上非特异性蛋白之后进行线性洗脱，咪哇浓度范围为0~ 500mM，洗脱总体积为柱床的10倍。经凝胶扫描分析系统分析纯化产物Trx-6His-HTPP-MDC的纯度约为95%。经4℃下进行梯度透析后用重组Enterokinase室温下酶切16 h。酶切后的蛋白混合溶液用Enterokinase Capture Kit去除残留肠激酶，滤液再过HisTrap? HP柱去除N端Trx标签，收集穿透液，用U-Tube concentrator超滤除盐浓缩，-80℃保存备用，获得含SEQ ID NO:1的氨基酸残基的融合多肽。

申请人：广东药学院

发明名称：肝靶向穿膜抗病毒融合多肽及其编码基因与应用

 

SEQ ID NO:1

名称：融合多肽的氨基酸序列

序列：NSRSLGENDDGNNEDNEKLRGWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQTIGVAQQAANVAATLKGN

 

SEQ ID NO:2

名称：融合多肽的核苷酸序列

序列：AATAGTAGATCACTTGGAGAAAATGATGATGGAAATAACGAAGACAACGAGAAATTAAGGggctggttgaaaaaaatcggcaagaaaattgaacgtgttggtcaacatacccgcgatgctacaattcaaactattggtgtggcccagcaggcagctaatgttgccgccacattaaagggtaac

 

SEQ ID NO:3

名称：H1

序列：CGGGGTACCGACGACGACGACAAGAATAGTCGTTCACTTG

 

SEQ ID NO:4

名称：H2

序列：GTAATTTCTCGTTGTCTTCGTTATTTCCATCATCATTTTCTCCAAGTGAACGACTATT

 

SEQ ID NO:5

名称：M1

序列：GACAACGAGAAATTACGTGGATGGTTGAAAAAAAT

 

SEQ ID NO:6

名称：M2

序列：CCCAAGCTTATTAGTTACCCTTTAATGTGGCGGCA

Claims (5)

1.一种肝靶向穿膜抗病毒融合多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于是在原核表达载体pET32a的多克隆位点插入权利要求2所述的肝靶向穿膜抗病毒融合多肽的基因而构建得到。

4.一种重组工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的重组表达载体。

5.权利要求1所述肝靶向穿膜抗病毒融合多肽在制备治疗抗乙型肝炎病毒药物中的应用。

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