CN102174110B

CN102174110B - 狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其应用

Info

Publication number: CN102174110B
Application number: CN2011100256264A
Authority: CN
Inventors: 付爱玲; 徐兴然; 胡昌华; 李晓荣
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2031-01-24
Also published as: CN102174110A

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其应用，该狂犬病毒糖蛋白衍生肽由狂犬病毒糖蛋白第189~214位或第330~357位肽段的羧基端通过连接肽与九聚精氨酸连接而得，可以快速、特异地携带生物活性大分子如蛋白质等穿越血脑屏障，实现脑靶向给药，可用于制备脑靶向给药载体，从而为难以穿越血脑屏障的生物活性大分子及其它活性小分子的脑靶向转运提供一种高效、安全、非侵入性的方法，有助于提高脑部疾病的治疗效果，在脑部疾病的新药研发和临床治疗领域具有良好的开发应用前景。

Description

狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种多肽及其应用，特别涉及一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽（rabies virus glycoprotein-derived peptide, RDP）及其在制药方面的应用。

背景技术

老年性痴呆、脑肿瘤、精神性疾病等脑部疾病愈日俱增，严重威胁人类健康。治疗脑部疾病的瓶颈之一在于血脑屏障，95%以上具有治疗潜力的生物活性大分子如蛋白质、核酸等都因无法穿越血脑屏障进入脑内而不能发挥治疗作用。此外，治疗脑部疾病还需要解决的一个重要问题是如何实现脑部的靶向给药，以减少全身给药带来的极大副作用。

脑靶向给药方法主要有三类：一是侵入损伤性的直接给药，包括高渗休克、颈动脉注射血管活性物质和鞘内或脑室内注射给药，但这种方法容易造成脑部感染以及外科性损伤，对脑有明显的侵害性；二是增加药物透过血脑屏障的能力，但这种方法对药物本身的理化性质要求较高，具有较大的局限性；三是由脑靶向给药载体介导的药物转运，这种方法能够增加药物的脑内靶向摄取，并且极大地降低对脑部的侵入性损伤，但目前尚无理想的能够携带生物活性大分子的脑靶向给药载体。因此，寻找能够携带生物活性大分子穿透血脑屏障实现脑靶向给药的载体是目前治疗脑部疾病药物研究中的重点和难点。

狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein, RVG）由505个氨基酸残基组成，能够携带其它物质向中枢神经系统转运，还能够促进其它病毒转运到脑中。文献报道，由RVG衍生出来的长29个氨基酸的短肽（RVG29）可以携带包裹有DNA的纳米粒子实现脑靶向转运。在RVG29的羧基端添加九聚精氨酸（9R）形成嵌合肽RVG29-9R后，还能够携带小干涉RNA（siRNA）穿越血脑屏障并将其传递给神经元细胞，从而使大脑中特定基因发生沉默，而且，重复进行RVG29-9R结合siRNA的治疗不会诱导产生炎症因子或抗肽抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种RDP，其能够携带生物活性大分子如蛋白质等穿透血脑屏障，实现脑靶向给药。

为达到上述目的，本发明的RDP由RVG第189~214位或第330~357位肽段的羧基端通过连接肽与九聚精氨酸连接而得。

进一步，所述RDP的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。

九聚精氨酸富含正电荷，可以使RVG第189~214位或第330~357位肽段定位并暴露在所携带的生物活性大分子如蛋白质等的表面，从而更好地利用其嗜神经性发挥脑靶向作用。连接肽在物理上将RVG第189~214位或第330~357位肽段与九聚精氨酸分隔开来，有利于RVG第189~214位或第330~357位肽段与九聚精氨酸折叠成相互独立的结构域，消除二者之间可能存在的相互干扰，使二者各自更好地发挥作用。通常情况下，连接肽不会影响或较少影响RVG第189~214位或第330~357位肽段形成正确的折叠和空间构象。在本发明中，RVG第189~214位肽段的羧基端优选通过连接肽GGGG与九聚精氨酸连接（SEQ ID No.2），第330~357位肽段的羧基端优选通过连接肽VNGGG与九聚精氨酸连接（SEQ ID No.1）。

本发明的目的之二在于提供所述RDP在制备脑靶向给药载体中的应用，为难以穿越血脑屏障的生物活性大分子及其它活性小分子的脑靶向转运提供一种高效、安全、非侵入性的方法，提高脑部疾病的治疗效果。

为达到上述目的，本发明分别以难以穿越血脑屏障的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）作为生物活性大分子模板，通过基因工程重组技术利用大肠杆菌表达制备了所述RDP与β-Gal或EGFP的融合蛋白RDP-β-Gal和RDP-EGFP，并考察了这两种融合蛋白在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的跨膜转运情况以及在小鼠体内跨血脑屏障的脑靶向转运情况。结果显示，本发明的RDP能够快速、特异地介导大分子蛋白质β-Gal和EGFP跨血脑屏障的脑靶向转运，可用于制备脑靶向给药载体。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种RDP及其在制备脑靶向给药载体中的应用，为难以穿越血脑屏障的生物活性大分子及其它活性小分子的脑靶向转运提供了一种高效、安全、非侵入性的方法，有助于提高脑部疾病的治疗效果，在脑部疾病的新药研发和临床治疗领域具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal构建图。

图2为双酶切鉴定重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal，其中1泳道为DNA分子量标准，2泳道为重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal，3泳道为双酶切片段。

图3为融合蛋白RDP-β-Gal的SDS-PAGE电泳，其中1泳道为未经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的pET28a(+)-RDP-β-Gal转化菌，2泳道为经IPTG诱导的pET28a(+)- RDP-β-Gal转化菌，3泳道为经IPTG诱导的pET28a(+)-RDP-β-Gal转化菌超声破碎后的离心上清液，4泳道为纯化后的融合蛋白RDP-β-Gal，5泳道为蛋白质分子量标准。

图4为融合蛋白RDP-β-Gal以不同浓度处理SK-N-SH细胞和Hela细胞，其中A为SK-N-SH细胞空白对照，B为用50μg/ml的RDP-β-Gal处理 SK-N-SH细胞，C为用25μg/ml的RDP-β-Gal处理 SK-N-SH 细胞，D为Hela细胞空白对照，E为用50μg/ml的RDP-β-Gal处理 Hela细胞，F为用25μg/ml的RDP-β-Gal处理Hela细胞。

图5为融合蛋白RDP-β-Gal静脉注射后在大脑和延髓中的分布。

图6为融合蛋白RDP-β-Gal静脉注射后在肝、肺、心、脾、肾中的分布。

图7为融合蛋白RDP-EGFP的SDS-PAGE电泳，其中1泳道为蛋白质分子量标准，2泳道为未经IPTG诱导的pET28a(+)转化菌，3泳道为未经IPTG诱导的pET28a(+)-RDP-EGFP 转化菌，4泳道为经IPTG诱导的pET28a(+)-RDP-EGFP转化菌，5泳道为经IPTG诱导的pET28a(+)-RDP-EGFP转化菌超声破碎后的离心上清液，6-7泳道为纯化后的融合蛋白RDP-EGFP。

图8为融合蛋白RDP-EGFP静脉注射后在大脑中的分布。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、RDP介导的β-Gal脑靶向转运

本实施例使用的RDP的氨基酸序列为MGKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGGG- RRRRRRRRR（SEQ ID No.1），由RVG第330~357位肽段（下划线部分）的羧基端通过连接肽VNGGG与九聚精氨酸连接而得，命名为RDP1。

一、融合蛋白RDP-β-Gal的制备

1、重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal的构建

重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal的构建示意图如图1所示。

首先，设计并合成RDP1 cDNA，核苷酸序列如下：ataccatgggcaaaagcgtgcgtacctggaat-gaaattatcccgagcaaaggctgcctgcgtgtgggtggccgttgccatccgcatgtgaatggtggcggtcgtcgccgtcgccgtcgccgtcgccgtgtcgacat（SEQ ID No.3，下划线部分分别为NcoⅠ和SalⅠ酶切位点），将合成的cDNA用限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ双酶切，再与同样经NcoⅠ和SalⅠ双酶切的质粒pET28a(+)在T4 DNA连接酶的作用下连接，获得重组质粒pET28a(+)-RDP。

其次，根据质粒pCMV-β上的Lac Z基因（即β-Gal 基因）序列设计并合成如下引物：上游引物Lac1-2：5’-tataagcttggaggctcagtcgttttacaac-3’（SEQ ID No.5，下划线部位为Hind Ⅲ酶切位点），下游引物Lac2：5’-tcactcgagtttttgacaccagaccaac-3’（SEQ ID No.6，下划线部位为XhoⅠ酶切位点）；以质粒pCMV-β为模板，应用上述引物，PCR扩增两端分别带有Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位点的Lac Z基因片段（总长度为3072bp）；PCR产物经回收纯化后，用限制性内切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切，再与同样经Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切的重组质粒pET28a(+)-RDP在T4 DNA连接酶的作用下连接，即得重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal。

将构建的重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal用Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，从重组质粒中酶切出大小分别约5500bp和3000bp的两个片段，与理论值一致。同时，将构建的重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal送测序公司进行测序，结果显示重组质粒中正确地插入了RDP1基因和β-Gal基因。说明重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal构建成功。

2、融合蛋白RDP-β-Gal的表达与纯化

将含有重组质粒pET28a(+)-RDP-β-Gal的大肠杆菌BL21用LB培养基在温度37℃条件下培养，待生长至OD₆₀₀值为0.6~0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，温度25℃诱导4小时，收集菌体，超声破碎至菌液清澈，离心取上清液，用孔径为0.45μm的滤膜过滤后，用Ni²⁺亲和层析柱（天根生化科技（北京）有限公司）纯化，即得融合蛋白RDP-β-Gal。

分别取经IPTG诱导的pET28a(+)-RDP-β-Gal转化菌、超声破菌后的离心上清液以及纯化后的融合蛋白RDP-β-Gal进行10%的SDS-PAGE电泳，结果如图3所示，与未经IPTG诱导的转化菌相比，经IPTG诱导的转化菌在分子量120KDa附近有明显的新生蛋白条带出现，与融合蛋白RDP-β-Gal的分子量相符；超声破菌后的离心上清液中含有融合蛋白RDP-β-Gal，说明该融合蛋白为可溶性表达。

二、融合蛋白RDP-β-Gal在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的跨膜转运

将融合蛋白RDP-β-Gal分别以终浓度为50μg/ml、25μg/ml加入到体外培养的SK-N-SH细胞中，以Hela细胞为对照细胞，同时设空白对照，孵育5小时后用PBS洗涤细胞4次，分别用质量分数为2%的甲醛溶液和质量分数为0.2%的异戊醇溶液于温度4℃条件下固定10分钟，再用PBS洗涤细胞3次，加入X-gal显色液，温度37℃避光染色，最后将细胞置显微镜下观察及拍照，检测融合蛋白RDP-β-Gal的跨膜转运活性。

结果如图4所示，SK-N-SH细胞空白对照、Hela细胞空白对照以及用不同浓度融合蛋白处理的Hela细胞用X-gal显色液染色后均无蓝染出现，而用不同浓度融合蛋白处理的SK-N-SH细胞用X-gal显色液染色10分钟即出现蓝染，且随着染色时间延长，蓝染程度逐渐加深，2小时后蓝色达到饱和，提示融合蛋白RDP-β-Gal具有强的嗜神经性，能够特异地靶向神经细胞转运；同时，用高浓度融合蛋白处理的SK-N-SH细胞明显较低浓度融合蛋白处理的SK-N-SH细胞的蓝染程度深，说明融合蛋白的浓度越高，跨膜转运到SK-N-SH细胞中的融合蛋白的量越高，即融合蛋白RDP-β-Gal在SK-N-SH细胞中的跨膜转运活性呈一定的浓度依赖性。

三、融合蛋白RDP-β-Gal在小鼠体内跨血脑屏障的脑靶向转运

将昆明小鼠按5mg/kg的剂量尾静脉注射融合蛋白RDP-β-Gal，同时设β-Gal对照组和空白对照组（control），分别于注射后15分钟和5小时处死小鼠，取大脑、延髓、心、肝、脾、肺、肾等组织，置质量分数为0.2%的多聚甲醛溶液中固定，依次用质量分数为20%、30%的蔗糖溶液在温度4℃条件下脱水，用OCT树脂冷冻包埋，40μm冷冻组织切片；将组织切片置六孔板中，用PBS洗涤1次，加入X-gal显色液，温度37℃避光染色过夜，最后将组织切片置显微镜下观察及拍照，检测融合蛋白RDP-β-Gal在小鼠体内的分布。

结果如图5~6所示，小鼠静脉注射融合蛋白RDP-β-Gal 15分钟后，其大脑、延髓灰质区和海马区均出现明显蓝染，而β-Gal对照组和空白对照组未出现明显蓝染，说明RDP能够快速（15分钟以内）携带大分子蛋白质β-Gal穿透血脑屏障进入脑内，广泛分布于大脑和延髓神经元中，并与海马神经元有较强的结合能力；同时，小鼠静脉注射融合蛋白RDP-β-Gal后，与β-Gal对照组和空白对照组相比，其心、肝、脾、肺组织的蓝染程度未出现明显变化，而肾脏在注射15分钟后蓝染程度明显增强，提示RDP能够携带大分子蛋白质β-Gal特异地靶向脑组织，其主要由肾脏代谢出体外。

综合上述实验结果，β-Gal为分子量约116kD的大分子蛋白质，本身不能穿过生物膜。本发明将RDP与β-Gal形成融合蛋白RDP-β-Gal，用该融合蛋白处理SK-N-SH细胞，经X-gal染色后可见胞内有蓝染出现，表明该融合蛋白可穿过SK-N-SH细胞膜，而在对照Hela细胞中，不管融合蛋白处理浓度高低及处理时间长短，经X-gal染色后胞内均无蓝染出现，说明该融合蛋白未进入Hela细胞中，从而初步证实融合蛋白RDP-β-Gal可选择性地进入神经细胞。在体内实验中，小鼠静脉注射融合蛋白RDP-β-Gal后，大脑、延髓神经元和海马神经元经X-gal染色均出现明显的蓝色，肾脏经X-gal染色也出现比对照组更明显的蓝色，而其他外周组织如心、肝、脾、肺等未见明显蓝染出现，说明RDP能够介导β-Gal快速穿越血脑屏障并选择性地进入中枢神经细胞中，与细胞实验结果一致。

实施例2、RDP介导的EGFP脑靶向转运

本实施例使用的RDP的氨基酸序列为MGCDIFTKSRGKRASKGSETCGFVDERGGGG- RRRRRRRRR（SEQ ID No.2），由RVG第189~214位肽段（下划线部分）的羧基端通过连接肽GGGG与九聚精氨酸连接而得，命名为RDP2。

一、融合蛋白RDP-EGFP的制备

1、重组质粒pET28a(+)-RDP-EGFP的构建

首先，设计并合成RDP2 cDNA，核苷酸序列如下：ataccatgggcaaaagcgtgcgtacctggaatgaaattat cccgagcaaaggctgcctgcgtgtgggtggccgttgccatccgcatgtgaatggtggcggtcgtcgccgtcgccgtcgccgtcgccgtgtcgacatt（SEQ ID No.4，下划线部分分别为NcoⅠ和SalⅠ酶切位点），将合成的cDNA用限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ双酶切，再与同样经NcoⅠ和SalⅠ双酶切的质粒pET28a(+)在T4 DNA连接酶的作用下连接，获得重组质粒pET28a(+)-RDP。

其次，将质粒pEGFP上的EGFP基因序列经酶切后，在T4 DNA连接酶的作用下直接连接到重组质粒pET28a(+)-RDP上，即得重组质粒pET28a(+)-RDP-EGFP。将构建的重组质粒pET28a(+)-RDP-EGFP送测序公司进行测序，结果显示重组质粒中正确地插入了RDP2基因和EGFP基因。

2、融合蛋白RDP-EGFP的表达与纯化

将含有重组质粒pET28a(+)-RDP-EGFP的大肠杆菌BL21用LB培养基在温度37℃条件下培养，待生长至OD₆₀₀值为0.6~0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，温度25℃诱导4小时，收集菌体，超声破碎至菌液清澈，离心取上清液，用孔径为0.45μm的滤膜过滤后，用Ni²⁺亲和层析柱（天根生化科技（北京）有限公司）纯化，即得融合蛋白RDP-EGFP。

分别取经IPTG诱导的pET28a(+)-RDP-EGFP转化菌、超声破菌后的离心上清液以及纯化后的融合蛋白RDP-EGFP进行10%的SDS-PAGE电泳，结果如图7所示，与未经IPTG诱导的转化菌相比，经IPTG诱导的转化菌在分子量22KDa附近有明显的新生蛋白条带出现，与融合蛋白RDP-EGFP的分子量相符；超声破菌后的离心上清液中含有融合蛋白RDP-EGFP，说明该融合蛋白为可溶性表达。

二、融合蛋白RDP-EGFP在小鼠体内跨血脑屏障的脑靶向转运

将昆明小鼠按5mg/kg的剂量尾静脉注射融合蛋白RDP-EGFP，同时设空白对照组（control），然后将小鼠麻醉，依次用质量分数为4%的多聚甲醛溶液和生理盐水进行心脏灌注，再分离小鼠大脑，依次用质量分数为10%、20%、30%的蔗糖溶液在温度4℃条件下脱水，用OCT树脂冷冻包埋，40μm冷冻组织切片；将组织放置在载玻片上，荧光封片剂封片。最后将切片置荧光显微镜下观察及拍照，检测融合蛋白RDP-EGFP在小鼠大脑中的分布。

结果如图8所示，小鼠静脉注射融合蛋白RDP-EGFP后，其大脑皮层和海马等脑组织细胞中有大量荧光分布，说明RDP可携带EGFP通过血脑屏障进入小鼠中枢神经细胞。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 西南大学

<120> 狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其应用

<160> 6

<210> 1

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 狂犬病毒糖蛋白衍生肽RDP1

<400> 1

Met Gly Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly

1 5 10 15

Cys Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Gly Gly

20 25 30

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

35 40

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 狂犬病毒糖蛋白衍生肽RDP2

<400> 2

Met Gly Cys Asp Ile Phe Thr Lys Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys

1 5 10 15

Gly Ser Glu Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

35 40

<210> 3

<211> 136

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码狂犬病毒糖蛋白衍生肽RDP1的基因

<400> 3

ataccatggg caaaagcgtg cgtacctgga atgaaattat cccgagcaaa ggctgcctgc 60

gtgtgggtgg ccgttgccat ccgcatgtga atggtggcgg tcgtcgccgt cgccgtcgcc 120

gtcgccgtgt cgacat 136

<210> 4

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码狂犬病毒糖蛋白衍生肽RDP2的基因

<400> 4

ataccatggg ctgtgacatt tttaccaaga gccgtggcaa acgtgcgagc aaaggtagca 60

aaacctgcgg ctttgtggat gaacgcggcg gtggcggtcg tcgccgtcgc cgtcgccgtc 120

gccgtgtcga cat 133

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物Lac1-2

<400> 5

tataagcttg gaggctcagt cgttttacaa c 31

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物Lac2

<400> 6

tcactcgagt ttttgacacc agaccaac 28

Claims

1.狂犬病毒糖蛋白衍生肽，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽在制备蛋白质脑靶向给药载体中的应用。