发明内容
本发明的目的就是把p75NTR-ECD或p75NTR-ECD/Fc应用在制备防治阿尔茨海默病的药物中,用p75NTR-ECD或p75NTR-ECD/Fc制备的药物可以抑制Aβ聚集、促进Aβ纤维的解聚,清除脑内Aβ;同时还能够阻断Aβ的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。
本发明的目的是通过这样的技术方案实现的,它包括有p75NTR受体的胞外段p75NTR-ECD,p75NTR-ECD的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列,p75NTR-ECD的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。
在本发明中,p75NTR-ECD是按照如下的方法进行制备的:
选用pet28a为原核表达载体,克隆位点选用Nde I和XhoI酶切位点,构建pet28a-p75NTR-ECD原核表达载体,步骤如下:设计上游引物:5'-CCGCATATGGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC和下游引物:5'-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3',以人cDNA为模板,PCR克隆p75NTR-ECD基因。胶回收纯化目的产物p75NTR-ECD。再用限制性内切酶Nde I和XhoI酶切pet28a质粒,胶回收大片段。同样酶切处理PCR产物p75NTR-ECD,胶回收纯化酶切产物。用T4 DNA连接酶连接p75NTR-ECD和pet28a酶切产物,得到重组质粒pet28a-p75NTR-ECD, 转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,挑选阳性克隆,并测序验证,确认编码阅读框。
p75NTR-ECD蛋白的诱导表达:将鉴定正确的重组质粒pet28a-p75NTR-ECD转化CaCl2法制备的E.col .BL-21感受态细胞,挑取新鲜转化的单菌落,接种于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中,37°C振荡培养过夜。按1:100比例将过夜菌菌液转接于200ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中,37°C振荡培养至OD600≈0.5~0.6,加IPTG至终浓度为0.1-0.5mmol/L,移至30°C继续培养4小时。离心收集菌体,菌体可进行纯化或冻存于-70°C。将诱导表达的菌体按原菌液1/10的体积重悬于PBS中,后加入50mmol/L PMSF 15μl后超声破碎细胞(6×10秒×40赫兹),再加入终浓度为1%的 Triton X-100,轻轻振荡20min,于4°C,12000r/m离心15分钟,收集上清,0.45微米孔径滤膜过滤,获得p75NTR-ECD蛋白粗制样品。
p75NTR-ECD蛋白的纯化:超声破碎获得的p75NTR-ECD蛋白样品首先经离子交换层析纯化,方法如下:(1)DEAE--纤维素的活化:取IgDEAE32或52,加入蒸馏水浸泡过夜,其间换几次水,每次除去细小颗粒。抽干,改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1小时以上,抽干,用无离子水漂洗,使pH至8左右。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1小时以上,用无离子水洗至pH6左右。(2)装柱:用0.02mol/L,pH6.7,磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE--纤维素,并更换1~2次。然后搅拌均匀,灌入层析柱中。0.02mol/L,pH6.7 磷酸盐缓冲溶液平衡。(3)上样洗脱:缓慢上样后,用0.02mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲溶液洗脱,控制流速为1ml/min,收集洗脱液,在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为p75NTR-ECD蛋白。
将上述离子交换层析得到的p75NTR-ECD蛋白进一步用疏水柱纯化:疏水填料为Phenyl sepharose,纯化时所用缓冲液为Buffer A:50mM PBS,0.6M 硫酸铵,pH7.0;Buffer B: 50mM PBS,pH7.0。使用Buffer A平衡柱子至280nm处的吸收值达到基线位置且保持不变,再用Buffer A稀释样品,后上样;再用Buffer B行一个线性梯度(10倍柱体积)洗脱,流速3ml/min,硫酸铵浓度从0.6M一直到0M。监测并收集蛋白。上述获得的样品再经sephadex G200分子筛层析,首先用pH7.5 PBS平衡sephadex G200分子筛柱子,将约柱体积1%样品加入分子筛柱,后用相同缓冲液洗脱蛋白,流速15ml/min,监测并收集蛋白样品。液测定其蛋白含量、活性和纯度后,脱盐浓缩、分装,即得到p75NTR-ECD蛋白,-20°C低温保存备用。
Aβ在产生过程中因酶切不同,产生具有38-42个氨基酸的不同Aβ类型,其中含42个氨基酸的Aβ42是Aβ的一个重要类型,其聚集特性和神经毒性作用最强,常作为Aβ的代表,因此本发明以Aβ42为实验对象。
经实验证明,p75NTR-ECD具有抑制Aβ42单体形成寡聚体和纤维,并具有促进Aβ42纤维解聚的作用。将制备的p75NTR-ECD蛋白注射到大脑的海马中,1周以后检测,发现p75NTR-ECD蛋白注射部位的Aβ水平减少25%,表明p75NTR-ECD具有清除脑内Aβ的作用。同时,p75NTR-ECD还能拮抗Aβ42的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。将制备的p75NTR-ECD注射到小鼠静脉中,通过ELISA的方法检测其水平,发现p75NTR-ECD血液半衰期为4小时。
本发明也可以是这样的技术方案,它是将所述的p75NTR-ECD基因与人免疫球蛋白Fc段基因相连接,形成编码p75NTR-ECD/Fc的DNA,在以此为模板,形成p75NTR-ECD/Fc蛋白。p75NTR-ECD/Fc的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列,p75NTR-ECD/Fc的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列。
所述的p75NTR-ECD/Fc是按照如下的方法进行制备的:
首先选用pet22-b(+)作为原核表达载体,克隆位点选用Nde I,XhoI酶切位点,构建pet22-b(+)-p75NTR-ECD/Fc融合基因。步骤如下:利用重叠引物PCR方法构建融合基因p75NTR-ECD/Fc。设计引物1:5’-CCGCATATGAAGGAGGCATGCCCCACAGGC,引物2:5’-TGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGTAATCCAACGGCCAGGGATC ;引物3:5’-GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC,和引物4:5’-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3'。其中,引物2和引物3的5’端含有30个互补碱基,为加入的链接序列GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA。以人cDNA为模板,引物1和引物2用于PCR克隆p75NTR-ECD基因片段,胶回收纯化;引物3和引物4用于PCR克隆Fc基因片段,回收纯化;然后将纯化的p75NTR-ECD和Fc基因产物按照1:1混合,加入到不含引物的PCR反应体系中反应:94°C,30秒;68°C,2分钟;反应20个循环,然后以反应液为模板,加入引物1和引物4进行PCR反应,胶回收纯化目的产物p75NTR-ECD/Fc融合基因。再用限制性内切酶Nde I和XhoI 酶切pet22-b(+)质粒,胶回收大片段。同时酶切处理p75NTR-ECD/Fc,胶回收纯化酶切产物。用T4 DNA连接酶连接p75NTR-ECD/Fc和pet22-b(+)酶切产物,得到重组载体pet22b+-p75NTR-ECD/Fc, 转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,挑选阳性克隆,并测序验证序列,确认编码框。
p75NTR-ECD/Fc融合蛋白的诱导表达与纯化:将鉴定正确的重组质粒pet22b+p75NTR-ECD/Fc转化CaCl2法制备的E.col .BL-21感受态细胞,挑取新鲜转化的单菌落,接种于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中,37°C振荡培养过夜。按1:100比例将过夜菌菌液转接于200ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中,37°C振荡培养至OD600≈0.5~0.6,加IPTG至终浓度为0.1-0.5mmol/L,移至30°C继续培养4小时。离心收集菌体,菌体可进行纯化或冻存于-70°C。将诱导表达的菌体按原菌液1/10的体积重悬于PBS中,后加入50mmol/L PMSF 15μl后超声破碎细胞(6×10sec×40hz),再加入终浓度为1%的 Triton X-100,轻轻振荡20分钟,于4°C,12000r/m离心15分钟,收集上清,作为蛋白样品,0.45微米孔径滤膜过滤;将蛋白样品加入 Sepharose-SPA层析柱,以20mM PBS, pH7.4洗脱平衡,流速0.5ml/min。p75NTR-ECD/Fc被柱上的SPA吸附住,其它蛋白质随洗脱液流出;再以pH4.0柠檬酸缓冲液进行洗脱,即为提纯的p75NTR-ECD/Fc;将收集的p75NTR-ECD/Fc液测定其蛋白含量、活性和纯度后,脱盐浓缩、分装、-20℃低温保存备用。
实验证明,p75NTR-ECD/Fc不仅具备前述p75NTR-ECD所具有的作用,而且其在体内的半衰期比p75NTR-ECD更长,在抑制Aβ42聚集、促进Aβ42纤维解聚、清除脑内Aβ沉积和拮抗Aβ神经毒性(包括神经元死亡和神经末梢变性)等方面的作用也比p75NTR-ECD更强。
由于采用了上述技术方案,本发明具有如下的作用:
1. 抑制Aβ聚集成寡聚体和纤维,促进Aβ纤维的解聚,并清除脑内Aβ。
2. 拮抗Aβ的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。
本发明提供了发挥多重作用的AD防治新药物,具有广阔的临床应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明:
它包括有p75NTR-ECD,p75NTR-ECD的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列,p75NTR-ECD的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。
在本发明中,p75NTR-ECD是按照如下的方法进行制备的:
选用pet28a为原核表达载体,克隆位点选用Nde I和XhoI酶切位点,构建pet28a-p75NTR-ECD原核表达载体,步骤如下:设计上游引物:5'-CCGCATATGGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC和下游引物:5'-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3',以人cDNA为模板,PCR克隆p75NTR-ECD基因。胶回收纯化目的产物p75NTR-ECD。再用限制性内切酶Nde I和XhoI酶切pet28a质粒,胶回收大片段。同样酶切处理PCR产物p75NTR-ECD,胶回收纯化酶切产物。用T4 DNA连接酶连接p75NTR-ECD和pet28a酶切产物,得到重组质粒pet28a-p75NTR-ECD, 转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,挑选阳性克隆,并测序验证,确认编码阅读框。
p75NTR-ECD蛋白的诱导表达:将鉴定正确的重组质粒pet28a-p75NTR-ECD转化CaCl2法制备的E.col .BL-21感受态细胞,挑取新鲜转化的单菌落,接种于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中,37°C振荡培养过夜。按1:100比例将过夜菌菌液转接于200ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中,37°C振荡培养至OD600≈0.5~0.6,加IPTG至终浓度为0.1-0.5mmol/L,移至30°C继续培养4小时。离心收集菌体,菌体可进行纯化或冻存于-70°C。将诱导表达的菌体按原菌液1/10的体积重悬于PBS中,后加入50mmol/L PMSF 15μl后超声破碎细胞(6×10秒×40赫兹),再加入终浓度为1%的 Triton X-100,轻轻振荡20min,于4°C,12000r/m离心15分钟,收集上清,0.45微米孔径滤膜过滤,获得p75NTR-ECD蛋白粗制样品。
p75NTR-ECD蛋白的纯化:超声破碎获得的p75NTR-ECD蛋白样品首先经离子交换层析纯化,方法如下:(1)DEAE--纤维素的活化:取IgDEAE32或52,加入蒸馏水浸泡过夜,其间换几次水,每次除去细小颗粒。抽干,改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1小时以上,抽干,用无离子水漂洗,使pH至8左右。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1小时以上,用无离子水洗至pH6左右。(2)装柱:用0.02mol/L,pH6.7,磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE--纤维素,并更换1~2次。然后搅拌均匀,灌入层析柱中。0.02mol/L,pH6.7 磷酸盐缓冲溶液平衡。(3)上样洗脱:缓慢上样后,用0.02mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲溶液洗脱,控制流速为1ml/min,收集洗脱液,在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为p75NTR-ECD蛋白。
将上述离子交换层析得到的p75NTR-ECD蛋白进一步用疏水柱纯化:疏水填料为Phenyl sepharose,纯化时所用缓冲液为Buffer A:50mM PBS,0.6M 硫酸铵,pH7.0;Buffer B: 50mM PBS,pH7.0。使用Buffer A平衡柱子至280nm处的吸收值达到基线位置且保持不变,再用Buffer A稀释样品,后上样;再用Buffer B行一个线性梯度(10倍柱体积)洗脱,流速3ml/min,硫酸铵浓度从0.6M一直到0M。监测并收集蛋白。上述获得的样品再经sephadex G200分子筛层析,首先用pH7.5 PBS平衡sephadex G200分子筛柱子,将约柱体积1%样品加入分子筛柱,后用相同缓冲液洗脱蛋白,流速15ml/min,监测并收集蛋白样品。液测定其蛋白含量、活性和纯度后,脱盐浓缩、分装,即得到p75NTR-ECD蛋白,-20°C低温保存备用。
经实验证明,p75NTR-ECD具有抑制Aβ42单体形成寡聚体和纤维,并具有促进Aβ42纤维解聚的作用。将制备的p75NTR-ECD蛋白注射到大脑的海马中,1周以后检测,发现p75NTR-ECD蛋白注射部位的Aβ水平减少25%,表明p75NTR-ECD具有清除脑内Aβ的作用。同时,p75NTR-ECD还具有拮抗Aβ42的神经毒性作用(包括神经元死亡和神经末梢变性)。将制备的p75NTR-ECD注射到小鼠静脉中,通过ELISA的方法检测其水平,发现p75NTR-ECD血液半衰期为4小时。
本发明也可以是这样的技术方案,它是将所述的p75NTR-ECD基因与人免疫球蛋白Fc段基因相连接,形成编码p75NTR-ECD/Fc的DNA,在以此为模板,形成p75NTR-ECD/Fc蛋白。p75NTR-ECD/Fc的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列,p75NTR-ECD/Fc的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列。
所述的p75NTR-ECD/Fc是按照如下的方法进行制备的:
首先选用pet22-b(+)作为原核表达载体,克隆位点选用Nde I,XhoI酶切位点,构建pet22-b(+)-p75NTR-ECD/Fc融合基因。步骤如下:利用重叠引物PCR方法构建融合基因p75NTR-ECD/Fc。设计引物1:5’-CCGCATATGAAGGAGGCATGCCCCACAGGC和引物2:5’-TGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGTAATCCAACGGCCAGGGATC ; 引物3:5-GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC和引物4:5'-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3'。其中,引物2和引物3的5’端含有30个互补碱基,为加入的链接序列GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA。以人cDNA为模板,引物1和引物2用于PCR克隆p75NTR-ECD基因片段,胶回收纯化;引物3和引物4用于PCR克隆Fc基因片段,回收纯化;然后将纯化的p75NTR-ECD和Fc基因产物按照1:1混合,加入到不含引物的PCR反应体系中反应:94°C,30秒;68°C,2分钟;反应20个循环,然后以反应液为模板,加入引物1和引物4进行PCR反应,胶回收纯化目的产物p75NTR-ECD/Fc融合基因。再用限制性内切酶Nde I和XhoI 酶切pet22-b(+)质粒,胶回收大片段。同时酶切处理p75NTR-ECD/Fc,胶回收纯化酶切产物。用T4 DNA连接酶连接p75NTR-ECD/Fc和pet22-b(+)酶切产物,得到重组载体pet22b+-p75NTR-ECD/Fc, 转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,挑选阳性克隆,并测序验证序列,确认编码框。
p75NTR-ECD/Fc融合蛋白的诱导表达与纯化:将鉴定正确的重组质粒pet22b+p75NTR-ECD/Fc转化CaCl2法制备的E.col .BL-21感受态细胞,挑取新鲜转化的单菌落,接种于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中,37°C振荡培养过夜。按1:100比例将过夜菌菌液转接于200ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中,37°C振荡培养至OD600≈0.5~0.6,加IPTG至终浓度为0.1-0.5mmol/L,移至30°C继续培养4小时。离心收集菌体,菌体可进行纯化或冻存于-70°C。将诱导表达的菌体按原菌液1/10的体积重悬于PBS中,后加入50mmol/L PMSF 15μl后超声破碎细胞(6×10sec×40hz),再加入终浓度为1%的 Triton X-100,轻轻振荡20分钟,于4°C,12000r/m离心15分钟,收集上清,作为蛋白样品,0.45微米孔径滤膜过滤;将蛋白样品加入 Sepharose-SPA层析柱,以20mM PBS, pH7.4洗脱平衡,流速0.5ml/min。p75NTR-ECD/Fc被柱上的SPA吸附住,其它蛋白质随洗脱液流出;再以pH4.0柠檬酸缓冲液进行洗脱,即为提纯的p75NTR-ECD/Fc;将收集的p75NTR-ECD/Fc液测定其蛋白含量、活性和纯度后,脱盐浓缩、分装、-20℃低温保存备用。
实验证明,p75NTR-ECD/Fc不仅具备前述p75NTR-ECD所具有的作用,而且其在体内的半衰期比p75NTR-ECD更长,在抑制Aβ42聚集、促进Aβ42纤维解聚、清除脑内Aβ沉积和拮抗Aβ神经毒性(包括神经元死亡和神经末梢变性)等方面的作用也比p75NTR-ECD更强。
下面结合附图和实验例对发明作进一步说明:
实验例1:p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc抑制Aβ42寡聚体形成
将2.5 μg Aβ42(终浓度为20 mM)分别与p75NTR-ECD/Fc(终浓度为10mM)、p75NTR-ECD(终浓度为10mM)或人IgG(以下简称HuIgG,终浓度为10mM)混合,4 oC 孵育1天。以等量 Aβ42(终浓度为20 mM)不孵育,或等量Aβ42(终浓度为20 mM)单独4 oC孵育为对照。然后行蛋白电泳,采用6E10-biotin抗体作蛋白印记检测,测定Aβ42寡聚体条带的含量。
如图1所示,与Aβ42单独孵育组(Ab)比较(为方便比较,将此组的Aβ42寡聚体含量作为100%),HuIgG与Aβ42共同孵育组(Ab+HuIgG)的Aβ42寡聚体含量为78%,Aβ42和p75NTR-ECD共同孵育组(Ab+p75NTR-ECD)的Aβ42寡聚体含量为36%,Aβ42和p75NTR-ECD/Fc共同孵育组(Ab+p75NTR-ECD/Fc)的Aβ42寡聚体含量为25%。上述结果表明p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc均具有抑制Aβ42单体形成寡聚体的作用,p75NTR-ECD/Fc的作用效果强于p75NTR-ECD。
实验例2: p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc抑制Aβ42纤维形成
将2.5 μg Aβ42(终浓度为20 mM)分别与p75NTR-ECD/Fc(终浓度为10mM)、p75NTR-ECD(终浓度为10mM)或HuIgG(终浓度为10mM)混合,37 oC 孵育4天。以等量Aβ42(终浓度为20 mM)不孵育,或等量Aβ42(终浓度为20 mM)单独37 oC孵育为对照。然后加入Thioflavine T,检测荧光强度(激发波长450nm,发射波长482nm)。荧光强度越高,表明Aβ纤维量越多。
如图2所示,与Aβ单独孵育组(Ab)比较(为方便比较,将此组的荧光强度作为100%),HuIgG与Aβ共同孵育组(Ab+HuIgG)荧光强度为103%,Aβ42与p75NTR-ECD共同孵育组(Ab+p75NTR-ECD)的荧光强度为25%,Aβ42与p75NTR-ECD/Fc共同孵育组(Ab+p75NTR-ECD/Fc)的荧光强度10%。上述结果表明:p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc均具有抑制Aβ42纤维形成的作用,p75NTR-ECD/Fc的作用效果强于p75NTR-ECD。
实验例3:p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc促进Aβ42纤维的解聚
首先将2.5 μg Aβ42溶于DMEM(终浓度20 mM),37 oC孵育4天,形成Aβ42纤维。将形成的Aβ42纤维和p75NTR-ECD(终浓度10μM)、p75NTR-ECD/Fc(终浓度10μM)或HuIgG(终浓度10μM)混合,37 oC孵育3天。然后加入Thioflavine T,检测荧光强度(激发波长450nm,发射波长482nm)。荧光强度越高,表明Aβ纤维量越多。
如图3所示,结果显示,与Aβ纤维单独孵育组(Ab)比较(为方便比较,将此组荧光作为100%),Aβ纤维与p75NTR-ECD共同孵育组(Ab+p75NTR-ECD)荧光强度为56%,Aβ纤维与p75NTR-ECD/Fc共同孵育组(Ab+p75NTR-ECD/Fc)后荧光强度为35%,Aβ纤维与HuIgG共同孵育后(Ab+HuIgG)荧光强度为92%。上述结果表明p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc均具有促进Aβ42纤维解聚的作用,p75NTR-ECD/Fc的作用强于p75NTR-ECD。
4:海马注射p75NTR-ECD/Fc对Aβ的清除作用
采用9月龄Mo/Hu APPswe PS1dE9 AD小鼠。该小鼠为双重转基因小鼠,载有人早老素蛋白-1 DeltaE9突变体和人APP瑞典突变体(APPSwe, KM 593/594 NL)嵌合基因,在脑内产生大量的Aβ沉积,是公认的AD动物模型。将小鼠随机分为4组,每组8只。小鼠麻醉后,在不同组小鼠左侧海马分别注入2μl p75NTR-ECD(1nmol),p75NTR-ECD/Fc(1nmol),HuIgG(1nmol)或PBS,右侧海马注入2 μl PBS。1周后取双侧海马,采用ELISA方法测定左右两侧海马的Aβ含量。左侧海马Aβ相对含量=左侧海马Aβ含量/右侧海马Aβ含量。
如图4所示,与对照组(PBS)比较(为方便比较,该组Aβ含量作为100%),p75NTR-ECD注射组(p75NTR-ECD)海马的Aβ含量为67%,p75NTR-ECD/Fc注射组(p75NTR-ECD/Fc)海马Aβ含量为45%,而HuIgG注射组(HuIgG)海马Aβ含量为98%。上述结果表明p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc具有清除脑内Aβ的作用,p75NTR-ECD/Fc的作用强于p75NTR-ECD。
实验例5:p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc对Aβ致神经细胞死亡的拮抗作用
采用神经细胞株R2L1(表达p75NTR),于96孔板中培养,细胞密度为0.5×104 cells/孔。培养基DMEM中加入20μM Aβ42,然后加入p75NTR-ECD(终浓度10μM)、p75NTR-ECD/Fc(终浓度10μM)或HuIgG(终浓度10μM)。同时设立仅以DMEM培养基培养的细胞作为正常对照。三复孔。在37oC孵育20小时后,然后加入MTT,孵育4小时。在加入溶解液,37oC再孵育12小时,600nm处读取光密度值。光密度值越高,表明细胞存活数越多。
如图5所示,结果表明,与正常对照组比较(为方便比较,将此组的光密度值设为100%),HuIgG组(Ab+HuIgG)的光密度值为32%,p75NTR-ECD 组(Ab+p75NTR-ECD)的光密度值为68%,p75NTR-ECD/Fc组(Ab+p75NTR-ECD/Fc)的光密度值为90%。表明p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc具有拮抗Aβ42神经毒性的作用,p75NTR-ECD/Fc的作用效果强于p75NTR-ECD。
实验例6:p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc对Aβ致神经突起变性的拮抗作用
采用神经细胞株SH-SY5Y,于24孔板中培养,细胞密度为0.5×103 cells/孔,在培养基DMEM中加入10μM all-trans retinoic acid,37 oC培养7天。然后在培养体系中加入Aβ42(终浓度1μM),同时加入p75NTR-ECD(终浓度1μM)、p75NTR-ECD/Fc(终浓度1μM)或HuIgG(终浓度1μM)。同时设立仅以DMEM培养基培养的细胞作为正常对照。三复孔。在37oC孵育5天。去培养基,然后加入4%多聚甲醛固定细胞。用抗Beta-tubulin抗体,行常规免疫组化染色。20倍镜下拍照,测量细胞突起长度。
如图6所示,结果表明,与正常对照组比较(为方便比较,将正常对照组的细胞突起平均长度设为100%),HuIgG组(Ab+HuIgG)的细胞突起长度为35%,p75NTR-ECD 组(Ab+p75NTR-ECD)的细胞突起长度为61%,p75NTR-ECD/Fc组(Ab+p75NTR-ECD/Fc)的细胞突起长度为82%。表明p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc具有拮抗Aβ42引起的神经突起变性作用,p75NTR-ECD/Fc的作用效果强于p75NTR-ECD。
实验例7:p75NTR-ECD和p75NTR-ECD/Fc在体内半衰期的比较
将AD小鼠分两组,每组各5只,通过尾静脉注射,分别注入5nmol的p75NTR-ECD或p75NTR-ECD/Fc。分别与注射后0,1,2,4,8,12,18和24小时取尾静脉血,通过ELISA方法,检测血液中的p75NTR-ECD或p75NTR-ECD/Fc浓度,计算半衰期。结果表明,p75NTR-ECD在体内的半衰期为4小时,而p75NTR-ECD/Fc的半衰期为10小时。
本发明的核苷酸和氨基酸序列表的计算机可读形式
<110>王延江
<120>一种p75NTR-ECD在防治阿尔茨海默病药物中应用
<130>无
<140>2010105612843
<141>2010-10-30
<160>10
<170>Patent In Version 2.1
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