CN102470169A - 自身抗体产生抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可特异性地抑制自身抗体，可有效预防或治疗自身抗体性自身免疫疾病的自身抗体产生抑制剂。本发明提供自身抗体产生抑制剂，其特征在于，含有由下列蛋白质构成的融合蛋白质作为有效成分：蛋白质(X)，其含由成为自身抗体性自身免疫疾病的原因的自身抗体所识别的部位、以及蛋白质(A)，其含发挥抗体重链恒定区的抗体依赖性细胞伤害活性的片段。

Description

自身抗体产生抑制剂
【技术领域】
本发明涉及通过中和自身抗体，并且抑制自身抗体的产生，从而可有效预防-治疗重症肌无力症等的自身抗体性自身免疫疾病的自身抗体产生抑制剂。
【背景技术】
免疫系统原本具有用于识别细菌或病毒等的与自身不同的异物而排除的作用，但有对于自身的正常的细胞或组织也过量地反应而施加攻击的情况。自身免疫疾病是由这样的状态而发生的疾病的总称，此中尤其将自身抗体(将自身的细胞或组织作为抗原而识别的抗体)与自身抗原(自身的细胞或组织)反应而发生的疾病称为自身抗体性自身免疫疾病。作为自身抗体性自身免疫疾病而言，可举例如，重症肌无力症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、以抗TSH抗体作为原因的甲状腺功能亢进症、自身抗体性急性脑炎、桥本脑症、非疱疹性边缘系统脑炎等。
自身抗体性自身免疫疾病的治疗方法而言，以往进行类固醇剂或免疫抑制剂的施用，但这些的药剂由于均不特异性地抑制自身抗体，而是一般地抑制免疫反应，无特异性，算不上是充分有效的治疗方法。
对于作为自身免疫疾病的代表例之一的重症肌无力症而言，也无用于根治其的既存的治疗药，不过是在上述的类固醇剂或免疫抑制剂的之外，主要使用胆碱酯酶抑制药(非专利文献1)。特别是，对于胆碱酯酶抑制药的使用而言，有其用量设定难的问题。另外，也使用血浆交换疗法，但1次的治疗发生100万日元以上的大额的费用。另一方面，由包括医疗制度而，作为重症肌无力症的治疗费而辅助的金额是60万日元左右，在医疗现场的负担也大。而且，血浆交换疗法有效果仅能持续1个月左右的问题。另外，也使用胸腺摘出术，尽管提高一定的效果，但有对摘出术的患者的不安感，或费用面的问题，而且，有不可适用在免疫结构未发达的小儿或在免疫缺陷患者等的问题。
近年、作为重症肌无力症的治疗方法而言，确认了γ球蛋白制剂的有效性，在一部分的制药厂商中也进行临床试验(非专利文献2)。但是，γ球蛋白制剂由于是人血浆来源的生物学制剂，担忧由未知的病毒等的感染风险等。另外，γ球蛋白制剂的施用量是大量，所以即便实现，预想患者或医疗现场的费用的-时间的负担也相当大。
【现有技术文献】
【非专利文献】
非专利文献1：日本临床66卷6号第1155页～第1157页重症肌无力症治验研究动向
非专利文献2：神经治疗Vol.25 o.6第689页～第692页免疫球蛋白大量疗法
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明是鉴于涉及的以往技术的现状而创案的，其目的在于提供可特异性地抑制自身抗体，可有效预防或治疗自身抗体性自身免疫疾病的自身抗体产生抑制剂。
【解决课题的技术方案】
本发明人作为自身抗体性自身免疫疾病的治疗方法，首先想起，将仅与自身抗体反应的抗体在重组蛋白质中制备，将此抗体施用于患者，使患者的体内的自身抗体与此抗体结合而分解。但是，由于自身抗体性自身免疫疾病的自身抗体不是特定的一种抗体，而是由各种的抗体组构成，对于这些的各种的抗体组的全部反应的个体基因型抗体的制备是极其困难的，从而认为此方法的实现可能性低。
从而，本发明人发现，作为自身抗体性自身免疫疾病的治疗方法，不是使用与自身抗体反应的抗体，在重组蛋白质中制备被自身抗体所识别的自身抗原，将此人工自身抗原作为囮(诱饵)而施用于患者，通过使患者的体内的自身抗体与此人工自身抗原结合来中和自身抗体，从而可使自身抗体不与患者自身的自身抗原反应。进而发现，通过将此人工自身抗原与抗体重链恒定区融合而可特异性地抑制自身抗体的产生，从而完成本发明。
即，本发明提供自身抗体产生抑制剂，其特征在于，含有由下列蛋白质构成的融合蛋白质作为有效成分：
蛋白质(X)，其含由成为自身抗体性自身免疫疾病的原因的自身抗体所识别的部位、以及
蛋白质(A)，其含发挥抗体重链恒定区的抗体依赖性细胞伤害活性的片段。
本发明的自身抗体产生抑制剂的优选的实施方式包括以下的(1)～(9)。
(1)蛋白质(A)含抗体重链的铰链区域以下，抗体重链CH1区域、或者它们的一部分。
(2)蛋白质(A)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成。
(3)蛋白质(X)是烟碱性乙酰胆碱受体α1(nAChRα1)亚基或其一部分。
(4)蛋白质(X)是nAChRα1亚基的同种型1和/或同种型2，或者是它们的一部分。
(5)同种型1由SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成。
(6)同种型2由SEQ ID NO：5的氨基酸序列构成。
(7)蛋白质(X)由nAChRα1亚基的同种型1和/或同种型2的N末端细胞外区域的氨基酸序列构成，或者由在此氨基酸序列中有1个或数个氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列构成。
(8)融合蛋白质由SEQ ID NO：3的氨基酸序列构成，或者由在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中有1个或数个氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列构成。
(9)自身抗体产生抑制剂是注射剂或栓剂的形态。
【发明效果】
本发明的自身抗体产生抑制剂通过中和在自身抗体性自身免疫疾病的患者的体内存在的自身抗体，并且抑制自身抗体的产生，可特异性地抑制自身抗体。从而，如果使用本发明的自身抗体产生抑制剂，可有效预防-治疗以重症肌无力症为首的各种的自身抗体性自身免疫疾病。
【附图说明】
【图1】图1是实施例中制成的用于表达融合蛋白质(α1-Fc)的载体pcDNA3.1-AChR-Fc的模式图。
【图2】图2示纯化的融合蛋白质(α1-Fc)的在非还原状态及还原状态的SDS-PAGE后的银染色像(左侧)、及蛋白印记像(右侧)。
【图3】图3示融合蛋白质α1-Fc与杂交瘤Mab35的结合。融合蛋白质α1-Fc添加浓度(μg/mL)是：A是未添加、B是0.1、C是0.36、D是1、E是3.6、F是10、G是36及H是100。
【图4】图4示对杂交瘤Mab35的融合蛋白质α1-Fc的ADCC活性。横轴示对作为靶细胞的杂交瘤Mab35的作为效应子细胞的NK92的比例，纵轴示细胞障碍活性(％)。◆示抗体未添加时的细胞伤害活性，■示融合蛋白质α1-Fc的添加时的细胞伤害活性，▲示阿瓦斯丁的添加时的细胞伤害活性，×示Enbrel的添加时的细胞障碍活性。●示总细胞数。
【实施方式】
作为本发明的自身抗体产生抑制剂的有效成分的融合蛋白质是由下列蛋白质融合而成的：蛋白质(X)，其含由成为自身抗体性自身免疫疾病的原因的自身抗体所识别的部位，以及蛋白质(A)，其含发挥抗体重链恒定区的抗体依赖性细胞伤害活性的片段。蛋白质(X)相当于对于自身抗体的自身抗原、或者其一部分，代替患者的自身抗原而有作为与自身抗体结合的囮(诱饵)的作用。即，如果本发明的融合蛋白质施用于自身抗体性自身免疫疾病的患者，则患者的体内的自身抗体在融合蛋白质之中，将蛋白质(X)的部分作为自身抗原识别而结合于此部分。结合的自身抗体由于不可与在患者的体内原本存在的自身抗原结合，通过此方法可中和自身抗体，可抑制由自身抗体和患者的自身抗原的结合所致的自身免疫疾病的症状的发生。自身抗体不是特定的一种抗体，而是由各种的抗体组构成，但任何的抗体都在有识别自身抗原的功能的点共通。从而，如果使用成为自身抗原的囮的本发明的融合蛋白质，则即便不对于各种的抗体组制成个别的融合蛋白质，可用一种融合蛋白质中和各种的抗体组。
本发明的融合蛋白质除了成为自身抗原的囮的蛋白质(X)之外，还含蛋白质(A)，其含发挥抗体重链恒定区的抗体依赖性细胞伤害活性的片段。此蛋白质(A)有发挥抗体依赖性细胞伤害活性(ADCC活性)的作用。自身抗体在血中的B细胞中产生，但在此B细胞的表面，作为B细胞受体而存在与自身抗体具有相同的抗原结合部位的细胞表面呈递型的抗体。从而，如果本发明的融合蛋白质被施用于患者，则其中的几种与患者的体内的自身抗体如上述一样结合，但几种结合于产生自身抗体的B细胞的表面的抗体(B细胞受体)。本发明的融合蛋白质结合于B细胞受体，则NK细胞等的效应子细胞经该Fc受体而结合于融合蛋白质中的蛋白质(A)的部分，发挥抗体依赖性细胞伤害活性(ADCC活性)，攻击结合于融合蛋白质的B细胞而杀灭。如此，通过本发明，不仅可中和在体内存在的自身抗体而防止自身抗体与自身抗原的结合，还可选择性杀灭作为自身抗体的产生源的特定B细胞。从而，本发明的融合蛋白质通过自身抗体的产生抑制、及产生的自身抗体之中和的两种方法，可预防或治疗自身抗体性自身免疫疾病。
再有，作为与本发明的融合蛋白质同样地使用囮(诱饵)的想法，在由Gershoni、Jonathan M的特表平2-502538号中公开了分子状诱饵剂。此分子状诱饵剂相当于对示不喜好的作用的异物的天然的受体的最小部分片段，要通过外来性抗原与诱饵剂的竞合作用，抑制外来性抗原与活体受体的结合。在特表平2-502538号中，上述异物是病毒、细菌、毒素等的外来性抗原，对于自身抗体无任何记载。另外，特表平2-502538号的分子状诱饵剂单独使用，不与抗体重链恒定区结合。
另外，作为杀灭B细胞的想法，在由Anand Iyer等的特表2008-515926号中，公开了通过将向对B细胞表面抗原的抗体附加细胞毒性物质的复合物施用于自身免疫疾病的患者而杀灭B细胞。此复合物虽然可杀灭B细胞，但不可中和产生的自身抗体，对自身抗体有必要别样施用抗细胞因子剂。
本发明的融合蛋白质中的蛋白质(X)相当于对于成为预防或治疗对象的自身抗体性自身免疫疾病的原因的自身抗体的自身抗原或其一部分，根据预防或治疗对象的自身免疫疾病而决定。例如，重症肌无力症的预防-治疗的情况中，重症肌无力症由于是作为神经传递物质的乙酰胆碱的作为在肌肉侧的受皿的烟碱性乙酰胆碱受体(自身抗原)与抗烟碱性乙酰胆碱受体抗体(自身抗体)结合而通过抑制由乙酰胆碱的神经-肌传递而发生的疾病，从而蛋白质(X)可为自身抗原的烟碱性乙酰胆碱受体。同样地，在自身免疫性溶血性贫血的预防-治疗的情况中，蛋白质(X)可为红细胞表面标记物，在特发性血小板减少性紫癜的预防-治疗的情况中，蛋白质(X)可为血小板表面标记物，在自身免疫性嗜中性粒细胞减少症的预防-治疗的情况中，蛋白质(X)可为嗜中性粒细胞表面标记物，在以抗TSH抗体作为原因的甲状腺功能亢进症的预防-治疗的情况中，蛋白质(X)可为TSH，在原发性甲状腺功能降低症(桥本病)的预防-治疗的情况中，蛋白质(X)可为甲状腺表面标记物，在自身抗体性脑炎-脑症的预防-治疗的情况中，蛋白质(X)可为NMDA受体、AMPA受体等。
蛋白质(X)不必是这些的受体或标记物全体，只要含自身抗体的识别部位，则也可为其一部分。例如，在重症肌无力症的情况中，上述的烟碱性乙酰胆碱受体是由几个亚基构成的多聚体蛋白质，自身抗体的识别部位在其中也存在于α1亚基的同种型1(是仅在骨骼肌中表达的同种型，如SEQ ID NO：4所示)、同种型2(是在骨骼肌、脑、心脏、肾脏、肺脏表达的同种型，如SEQ ID NO：5所示)的N末端细胞外区域。从而，在重症肌无力症的情况中，蛋白质(X)可为烟碱性乙酰胆碱受体α1(nAChRα1)亚基或其一部分，更具体而言，可为nAChRα1亚基的同种型1和/或同种型2、或者它们的一部分，更具体而言，可由nAChRα1亚基的同种型1和/或同种型2的N末端细胞外区域的氨基酸序列构成。
在这些的氨基酸序列中，在其相同性不损害的范围内，1个或数个(例如1～20个、优选1～10个、再者优选1～7个)的氨基酸缺失、添加、和/或取代也可。其范围而言，可举有例如，70％以上、优选80％以上、再者优选90％以上的序列的相同性。氨基酸序列的相同性可使用相同性计算算法NCBI BLAST(National Center for BiotechnologyInformation Basic Local Alignment Search Tool)，在以下的条件(期待值＝10；允许间隔；矩阵＝BLOSUM62；筛选＝OFF)计算。具体而言，导入这样的缺失、添加、和/或取代的氨基酸序列可通过使用例如定点诱变试剂盒(宝生物制)或，QuickChange Site-DirectedMutagenesis Kit(STRATAGENE制)等的市售试剂盒而取代对应的DNA序列而容易地得到。
本发明的融合蛋白质中的蛋白质(A)是含抗体重链恒定区的片段的蛋白质，可为例如抗体重链的铰链区域以下(Fc区域)、抗体重链CH1区域或它们的一部分。作为抗体重链的铰链区域以下(Fc区域)而言，具体而言，可举SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。SEQ ID NO：1，2均为人的Fc区域的序列，SEQ ID NO：1是在亚洲人中多的类型、SEQ ID NO：2是在欧美人中多的类型。
作为本发明的融合蛋白质的具体例而言，可举例如由SEQ ID NO：3的氨基酸序列构成的蛋白质。此融合蛋白质相当于蛋白质(X)是nAChRα1亚基的同种型1的N末端细胞外区域的氨基酸序列(由SEQ ID NO：4的第1位～第210位的氨基酸构成的氨基酸序列)，蛋白质(A)是SEQ ID NO：1的氨基酸序列的情况。此氨基酸序列也如上所述，在其相同性不损害的范围内，1个或数个(例如1～20个、优选1～10个、再者优选1～7个)的氨基酸缺失、添加、或者/及取代也可。
本发明的融合蛋白质可通过以往公知的基因工程学方法制备，例如，可通过将编码蛋白质(X)的DNA及编码蛋白质(A)的DNA根据必要各自扩增，将这些的DNA相互结合，将得到的DNA插入表达载体，将此载体导入宿主细胞而表达融合蛋白质来制备。DNA的扩增可例如通过PCR法进行，扩增的DNA的结合可通过例如Overlapextension PCR法进行。表达载体优选具备用于升高表达效率的CMV或SV40等的启动子，或用于使表达的融合蛋白质的回收容易的抗体重链信号序列、膜蛋白质信号序列、抗体κ链信号序列等的分泌信号序列。宿主细胞而言，可使用例如酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，在其中也优选是动物细胞、特别是CHO细胞、HEK293细胞等。表达的融合蛋白质通过常规方法回收，优选使用Protein A柱等来纯化。
接下来，说明本发明的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，含有本发明的融合蛋白质作为有效成分。涉及的药剂的具体性的制剂形态而言，可举注射剂、栓剂等。注射剂的情况中，向如上述一样得到的本发明的融合蛋白质添加糖类、多元醇、白蛋白、表面活性剂等的稳定化剂、盐类等的等张化剂等，冷冻干燥而保存，使用时溶解于注射用水而施用即可。冷冻干燥品中的本发明的融合蛋白质的含有量不特别限定，但例如是0.01～200mg/g、优选是0.1～100mg/g。另外，溶解的注射剂中的本发明的融合蛋白质的含有量不特别限定，但例如是0.01～200mg/mL、优选是0.1～100mg/mL。注射剂的情况的施用方法而言，可举静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用等。在栓剂的情况中，例如，将本发明的融合蛋白质混合于通常的栓剂用基剂而制剂化，经直肠施用即可。栓剂中的本发明的融合蛋白质的含有量不特别限定，但例如是0.1～300mg/mL、优选是0.5～100mg/mL。本发明的自身抗体产生抑制剂的施用量根据作为目的的治疗效果、施用方法、治疗期间、年龄、体重等而不同，通常成人是每一日10μg/kg～50mg/kg。
将本发明的自身抗体产生抑制剂施用于自身抗体性自身免疫疾病的患者，则自身抗体产生抑制剂中的本发明的融合蛋白质经体液流到分配体内。然后，当融合蛋白质与自身抗体相会，则由于自身抗体结合于融合蛋白质的蛋白质(X)的部分(被自身抗体所识别的部位)，此自身抗体已经变得不能与患者自身的自身抗原反应。另外，当本发明的融合蛋白质遇到产生自身抗体的B细胞，则融合蛋白质结合于此B细胞的表面的抗体(B细胞受体)。一旦此结合发生，则NK细胞等的效应子细胞结合到融合蛋白质的蛋白质(A)的部分(抗体重链恒定区的片段)，发挥抗体依赖性细胞伤害活性(ADCC活性)，攻击结合于融合蛋白质的B细胞而杀灭。如此，通过本发明，不仅中和自身抗体，防止自身抗体与自身抗原的结合，还可选择性杀灭作为自身抗体的产生源的特定B细胞。从而期待，本发明的自身抗体产生抑制剂可作为例如重症肌无力症等的自身抗体性自身免疫疾病的预防-治疗药而发挥效果。
【实施例】
接下来，通过实施例再具体说明本发明，但本发明不受这些的限制。
【(1)融合蛋白质的制备】
将人末梢血淋巴细胞(PBL)的cDNA作为模板，以SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9的DNA序列作为引物，使用东洋纺绩(株)的基因扩增试剂盒“KOD-plus-Ver.2”(货号：KOD-211)，扩增了人抗体重链信号序列(分泌信号序列)的基因。
对于扩增的基因而言，使用Invitrogen社的克隆试剂盒“ZeroBlunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequence”(货号：K2895-20)来进行克隆，进行基因序列的解析。其后，将Invitrogen社的表达载体“pcDNA3.1(+)载体”(货号：V790-20)用NEB社的限制酶NheI(货号：R0131)、EcoRI(货号：R0101)处理，将扩增的抗体重链信号序列(分泌信号序列)插入到表达载体。
接下来，以购自Open Biosystems社的人nAChRα1亚基的cDNA(货号：MHS1011-61598)作为模板，以SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11的DNA序列作为引物，使用东洋纺绩(株)的“KOD-plus-Ver.2”，扩增人nAChRα1亚基的同种型1的N末端细胞外区域的基因。扩增的基因相当于SEQ ID NO：4的氨基酸序列的第1位～第210位。此氨基酸序列示于SEQ ID NO：6。
另一方面，以人末梢血淋巴细胞(PBL)的cDNA作为模板，以SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13的DNA序列作为引物，通过PCR，扩增人抗体重链Fc区域的基因。对于扩增的基因，使用Invitrogen社的“Zero Blunt TOPO Cloning Kit For Sequence”进行克隆，进行基因序列的解析。结果，判明得到编码SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的氨基酸序列的两种人抗体重链Fc区域的基因。
将如此得到的人nAChRα1亚基的同种型1的N末端细胞外区域的基因及人抗体重链Fc区域的基因混合，以SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：13的DNA序列作为引物，通过Overlap extension PCR法扩增基因，制备以单链编码人nAChRα1亚基的同种型1的N末端细胞外区域和人抗体重链Fc区域的基因序列。相当于制备的基因序列的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3及7。SEQ ID NO：3相当于人抗体重链Fc区域是SEQ ID NO：1的氨基酸，SEQ ID NO：7相当于人抗体重链Fc区域是SEQ ID NO：2的氨基酸。
对于制备的基因序列，使用Invitrogen社的“Zero Blunt TOPOCloning Kit for Sequence”进行克隆，进行基因序列的解析。其后，将预先插入分泌信号序列的pcDNA3.1载体用NEB社的限制酶PpuMI(货号：R0506)、PmeI(货号：R0560)处理，插入制备的基因序列，得到用于表达由人nAChRα1亚基的同种型1的N末端细胞外区域和人抗体重链Fc区域构成的融合蛋白质(α1-Fc)的载体。得到的载体的模式图示于图1。
接下来，使用Invitrogen社的表达系统“Free Style MAX 293Expression System”(货号：K9000-10)，将得到的载体导入HEK293细胞而表达融合蛋白质α1-Fc，使用GE HEALTHCARE社的纯化柱“HiTrap Protein A HP Column”(货号：17-0402-01)而纯化，得到融合蛋白质α1-Fc。
融合蛋白质的表达确认是在SDS-PAGE后，通过银染色以及蛋白印记来进行。在蛋白印记中使用HRP标记抗人IgG抗体。结果示于图2。图2中的以箭头示的条带相当于融合蛋白质α1-Fc。
【(2)融合蛋白质的对于自身抗体的反应性的确认】
培养产生作为对大鼠nAChR的自身抗体的抗nAChR自身抗体mAb35的杂交瘤Mab35(ATCC编号：TIB-175)，从其培养上清使用GE HEALTHCARE社的纯化柱“HiTrap Protein G HP column”(货号：17-0404-01)纯化抗nAChR自身抗体mAb35。此抗体是不仅对大鼠，对小鼠及人也示交差反应性的抗体，其由Tzartos等报告(J.Neuroimmunol，1987；15，185-94)。
接下来，将纯化的抗nAChR自身抗体以各种各样的浓度在ELISA板上固相化，进行封闭。其后，使与在(1)制备的融合蛋白质α1-Fc反应，用附属于船越社的ELISA定量试剂盒“IgG(Fc)，Human，ELISA Quantitation Kit”(货号：E80-104)的HRP标记抗人Fc抗体处理，以船越社的底物溶液“TMB Solution”(货号：N301)作为底物而进行反应，用1％硫酸停止反应。其后，测定波长450nm处的吸光度。
结果示于以下的表1。如出表1明了，随着自身抗体的浓度增大而吸光度增大，确认依赖于自身抗体的浓度而融合蛋白质与自身抗体反应。
表1：融合蛋白质的对于自身抗体的反应性的确认
  自身抗体浓度(ng/mL)   吸光度A450nm
  10000   1.233
  2500   1.120
  625   0.871
  156.3   0.659
  39.1   0.557
  9.8   0.505
【(3)融合蛋白质α1-Fc与杂交瘤Mab35的结合的确认】
自身抗体在活体内由B细胞产生，在产生自身抗体的B细胞的细胞表面，与自身抗体相同的抗体作为B细胞受体呈递到细胞膜上。由于(2)中使用的杂交瘤Mab35产生抗nAChR自身抗体，认为在杂交瘤Mab35中也与B细胞同样地在细胞表面上呈递自身抗体。从而确认，融合蛋白质α1-Fc结合到杂交瘤Mab35。
向用HBSS/BSA清洗的1×105个的杂交瘤Mab35，将(1)中制备的融合蛋白质α1-Fc以各种各样的浓度添加。接下来添JacksonImmuno Research LABORATORIES社的PE标记抗人IgG抗体(货号：109-116-170)，用HBSS/BSA清洗，用流式细胞仪测定融合蛋白质和杂交瘤的结合。
结果示于图3。从图3明了，融合蛋白质α1-Fc浓度依赖性地与杂交瘤Mab35结合。此结果示，在重症肌无力症患者的体内，融合蛋白质α1-Fc与抗nAChR自身抗体产生B细胞结合的可能性。
【(4)对杂交瘤Mab35的融合蛋白质α1-Fc的ADCC活性的确认】
将1×106个的杂交瘤Mab35用HBSS/BSA清洗之后，在添加同仁社的荧光染料“Calcein-AM”(货号：C326)至成为10μM的HBSS/BSA中于37℃进行30分钟温育，在杂交瘤细胞内中提取Calcein-AM。接下来，将这些的杂交瘤细胞分注到96孔板至达到10000个/孔，将(1)中制备的融合蛋白质α1-Fc或对照抗体(阿瓦斯丁或Enbrel)，和效应子细胞的NK92细胞(ATCC编号：CRL-2407)以各种各样的浓度添加，于37℃进行4小时温育。温育后，以×300g进行5分钟离心分离而将细胞沉淀，测定上清的荧光(Ex＝485nm、Em＝540nm)。
结果示于图4。如从图4明了，尽管在仅添加NK92细胞的组(未添加抗体等)中也确认极弱的浓度依赖性的细胞障碍活性(天然杀伤，natural killing)，而在融合蛋白质α1-Fc施用组中以NK92细胞数依赖性地确认最大50％的强的细胞障碍活性。另一方面，在对照抗体组中未确认强的细胞障碍活性。
从以上的结果明了，融合蛋白质α1-Fc与杂交瘤Mab35结合，经融合蛋白质α1-Fc中的蛋白质(A)的部分(Fcγ受体)而发挥由效应子细胞的NK92的细胞障碍活性(ADCC活性)。此结果示，在重症肌无力症患者的体内，融合蛋白质α1-Fc与抗nAChR自身抗体产生B细胞结合而由ADCC活性，攻击自身抗体产生B细胞而杀灭的可能性。
【工业实用性】
本发明的自身抗体产生抑制剂可通过自身抗体的产生抑制、及产生的自身抗体的中和的两种方法来预防或治疗自身抗体性自身免疫疾病。从而，本发明的自身抗体产生抑制剂可为了有效预防或治疗以重症肌无力症为首的各种的自身抗体性自身免疫疾病而广泛利用。
SEQ ID NO：8～13是引物的序列。
Figure IDA0000133106210000011
Figure IDA0000133106210000021
Figure IDA0000133106210000031
Figure IDA0000133106210000041
Figure IDA0000133106210000061
Figure IDA0000133106210000071
Figure IDA0000133106210000081
Figure IDA0000133106210000091
Figure IDA0000133106210000101
Figure IDA0000133106210000111

Claims (10)

1.自身抗体产生抑制剂，其特征在于，含有由下列蛋白质构成的融合蛋白质作为有效成分：
蛋白质(X)，其含由成为自身抗体性自身免疫疾病的原因的自身抗体所识别的部位、以及
蛋白质(A)，其含发挥抗体重链恒定区的抗体依赖性细胞伤害活性的片段。
2.权利要求1所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，蛋白质(A)含抗体重链的铰链区域以下，抗体重链CH1区域、或者它们的一部分。
3.权利要求1所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，蛋白质(A)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成。
4.权利要求1所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，蛋白质(X)是烟碱性乙酰胆碱受体α1(nAChRα1)亚基或其一部分。
5.权利要求4所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，蛋白质(X)是nAChRα1亚基的同种型1和/或同种型2，或者是它们的一部分。
6.权利要求5所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，同种型1由SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成。
7.权利要求5所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，同种型2由SEQ ID NO：5的氨基酸序列构成。
8.权利要求5所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，蛋白质(X)由nAChRα1亚基的同种型1和/或同种型2的N末端细胞外区域的氨基酸序列构成，或者由在此氨基酸序列中有1个或数个氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列构成。
9.权利要求4所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，融合蛋白质由SEQ ID NO：3的氨基酸序列构成，或者由在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中有1个或数个氨基酸缺失、添加和/或取代的氨基酸序列构成。
10.权利要求1所述的自身抗体产生抑制剂，其特征在于，自身抗体产生抑制剂是注射剂或栓剂的形态。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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