AT503297A4 - Allergen-spezifische antikörper - Google Patents

Description

  Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper und pharmazeutische Formulierungen für die Behandlung und Prävention von Allergen-induzierten Krankheiten.
Beinahe 100 Millionen Allergiker sind gegen das Birken (Betula verrucosa) -Pollen-Hauptallergen, Bet v 1, ein 17kDa-Protein, sensibilisiert, welches in den Pollen von Bäumen, die zur Gruppe der Fagales gehören, und welches in Europa, Nordamerika, Russland und Australien weit verbreitet ist (Breiteneder et al., 1989) . Die für Bet v 1 codierende cDNA wurde isoliert (Breiteneder et al., 1989), und rekombinantes Bet v 1, welches dem natürlichen Bet v 1-Wildtyp gleich ist, wurde in Escherichia coli exprimiert (Valenta et al., 1991; Ferreira et al., 1993).

   Die Erkennung von Bet v 1 durch IgE-Antikörper von Patienten, die gegen Baumwollpollen und Nahrungsmittel allergisch sind, beträgt durchschnittlich 95%, und beinahe 60% davon sind ausschliesslich gegen Bet v 1 sensibilisiert (Jarolim et al., 1989), wodurch die Erkennung des Allergens von konformationalen Epitopen abhängt und folglich ein gefaltetes Molekül erfordert. Wegen der früheren umfangreichen Charakterisierung in vitro und in vivo wurde häufig vorgeschlagen, dass das rekombinante Bet v 1-Molekül für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden sollte (Valenta et al., 1995, 1996). Kürzlich wurden nicht-anaphylaktische Oberflächen-exponierte Peptide des Birkenpollen-Hauptallergens erzeugt und als Peptide mit einer Grösse (25-32 Aminosäuren) charakterisiert, die ausreicht, um Antikörper-Antworten in vivo (eine aktive Immunisierung) zu induzieren.

   Diesen Peptiden fehlte eine Faltung und die allergene Aktivität. Jedoch induzierte die Peptid-Impfung die Erzeugung von polyklonalem, Bet v 1-spezifischem IgG (Focke et al., 2004).
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel und Methoden zur Behandlung und Prävention allergischer Reaktionen, die durch das Birkenpollen-Allergen Bet v 1 oder Fragmente davon verursacht sind, vorzusehen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers oder eines Derivats davon zur Herstellung eines Medikaments zur passiven Immunisierung eines Individuums zur Prävention und/oder Behandlung von durch eine Einwirkung eines Birkenpollen-Allergens verursachten allergischen Reaktionen bei diesem Individuum, wobei der Antikörper an ein Bet v 1-Fragment bindet, welches die Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder
NACHGEREICHT 
- 2 die Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr.

   2) umfasst.
Es zeigte sich überraschenderweise, dass Antikörper oder Derivate davon, die an die Bet v 1-Fragmente binden, spezifisch an das Birkenpollen-Allergen-Bet v 1 binden können und dass solche Moleküle verwendet werden könnten, um die Bindung von Bet v 1spezifischem IgE an die Birkenpollen-Allergene zu blockieren. Die Bindung der Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung an Epitope in den oder nahe den Haupt-IgE-Bindungsstellen von Bet v 1 und/oder die Modifizierung der Konformation des Allergens, so dass die IgE-Epitope oder nur ein Teil davon nicht länger für IgE zugänglich sind, resultieren in einer verringerten oder sogar vollständigen Reduktion der Bindung von IgE an das Allergen.

   Versuchsdaten zeigen, dass eine Mischung aus zwei Peptid-spezifischen Antikörpern mit unterschiedlicher Epitop-Spezifität keine stärkere Inhibition der IgE-Bindung ergaben als die individuellen Antikörper, was anzeigt, dass ein Antikörper<d>ie Konformation des Allergens ändert, was die Bindung eines zweiten Antikörpers (ebenso IgE) an das Allergen inhibiert.
Für die Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirts-Tiere durch Injektion mit dem Bet v 1-Antigen oder Fragmenten davon immunisiert werden, insbesondere mit Bet v 1-Fragmenten, die aus den Aminosäuren 30 bis 59 (SE<Q>ID Nr. 1<)>oder den Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) bestehen. Solche Wirts-Tiere können beispielsweise Schweine, Kaninchen, Mäuse, Ziegen und Ratten umfassen. Am meisten bevorzugt werden die polyklonalen Antikörper aus einem menschlichen Individuum isoliert.

   Die Verwendung solcher Antikörper verringert das Risiko, dass das Immunsystem auf von einem "Fremd"-Antikörper stammende Antigene reagiert. Die Antikörper können aus den Seren dieser
Tiere isoliert werden.
Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung können zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen und lokalen Verabreichung formuliert werden; Protokolle zum Erhalt solcher Formulierungen sind dem Fachmann bekannt.
Natürlich ist es auch möglich, gegen die Bet v 1-Fragmente gerichtete Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung aus menschlichen Individuen, die dem Bet v 1-Allergen ausgesetzt waren, zu isolieren.

   Die Isolierung von Bet v 1-spezifischen Antikörpern aus menschlichen Individuen kann mittels auf diesem Gebiet bekannter Methoden erreicht werden.
NACHGEREICHT Wie hierin verwendet, bezieht sich "Antikörper" auf intakte Immunglobuline oder Fragmente davon, die beispielsweise durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen oder rekombinant hergestellt wurden. Natürlich sollen auch Moleküle, die die Antigen-bindende Region von Immunglobulinen, die mit anderen Proteinen oder Fragmenten davon fusioniert sind, umfassen, Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung sein. "Die Antigen-bindende Region" bezieht sich auf den Teil eines Immunglobulin-Moleküls, der an der Antigen-Bindung beteiligt ist. Die Antigen-bindende Region ist durch Aminosäure-Reste der N-terminalen variablen Regionen der schweren und leichten Ketten gebildet.

   Daher bezieht sich der Ausdruck "Antikörper" - ohne darauf eingeschränkt zu sein - auf Fab's(z.B. durch Pepsin-Verdau eines Antikörpers unter den Disulfid-Bindungen in der Gelenkregion ("hinge region"<)>oder durch rekombinante Methoden erzeugt), Einzelketten-Antikörper (Antikörper, die als einzelne Polypeptid-Kette vorkommen<)>, mehr bevorzugt, Einzelketten-Fv-Antikörper ("Single chain Fv", scFv<)>, bei welchen eine variable schwere und eine variable leichte Kette(direkt oder durch einen Peptid-Linker) miteinander verbunden sind, um ein kontinuierliches Polypeptid, chimäre Moleküle, humanisierte Moleküle usw. zu bilden.
Die Antikörper der Erfindung umfassen auch Derivate, die chemisch, durch rekombinante DNA-Technologie, enzymatisch usw. modifiziert sind, was z.B.

   zu "technisch modifizierten Antikörpern" führt, wie synthetischen Antikörpern, Chimären oder humanisierten Antikörpern oder Mischungen davon, oder Antikörperfragmenten, welchen die konstante Region teilweise oder vollkommen fehlt, z.B. Fv, Fab, Fab' oder F(ab')2 usw.. Bei diesen technisch modifizierten Antikörpern kann (können<)>z.B. ein Teil oder Teile der leichten und/oder schweren Kette substituiert sein. Solche Moleküle können beispielsweise Antikörper umfassen, die aus einer humanisierten schweren Kette und einer unmodifizierten leichten Kette (oder Chimären leichten Kette<)>, oder umgekehrt, bestehen.

   Die Ausdrücke Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' oder F(ab')2 werden verwendet, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind(Harlow E. und Lane D., in "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). "Derivate" von Antikörpern bezieht sich in diesem Zusammenhang auf proteinhältige Moleküle, die eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten aufweisen, die mit einem Antikörper der gesamten Länge gemäss der
NACHGEREICI
, [iota] vorliegenden Erfindung verbunden sind. So sind die AntikörperDerivate gemäss der vorliegenden Erfindung fähig, an ein Bet v 1Fragment zu binden, das die Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder die Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) aufweist. Die Antikörper der Erfindung inkludieren auch Derivate, die modifiziert sind, d.h. durch die kovalente Bindung jeglicher Art von Molekül am Antikörper.

   Beispielsweise - jedoch nicht als Einschränkung - inkludieren die Antikörper-Derivate Antikörper, die z.B. durch Glykosylierung, Acetylierung, Pegylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung mittels bekannter Schutz/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Bindung an einen zellulären Liganden oder ein anderes Protein usw. modifiziert wurden. Jede von zahlreichen chemischen Modifikationen kann mittels bekannter Techniken durchgeführt werden, einschliesslich - jedoch ohne Einschränkung darauf - spezifische chemische Spaltung, Acetylierung, Formylierung, Stoffwechselsynthese von Tunicamycin usw.. Zusätzlich kann das Derivat eine oder mehrere nicht-klassische Aminosäuren enthalten.

   Die Derivate gemäss der vorliegenden Erfindung können auch Fragmente umfassen, welche noch immer ein Bet v 1-Fragment binden können, welches die Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder die Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) aufweist (z.B. CDR-Region eines Antikörpers gemäss der vorliegenden Erfindung) .
Die Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise monoklonale Antikörper. Solche Antikörper, welche homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen sind, können mittels jeder Technik erhalten werden, welche die Produktion von Antikörper-Molekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorsieht. Zu diesen zählen beispielsweise die Hybridom-Technik von Köhler und Milstein (1975, Nature 256:495497 und U.S. Pat.

   Nr. 4,376,110), die Human-B-Zell-HybridomTechnik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2026-2030) und die EBVHybridom-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96). Solche Antikörper können zu jeder Immunglobulin-Klasse, einschliesslich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, und jeder Unterklasse derselben gehören. Das die mAk dieser Erfindung erzeugende Hybridom kann in vi tro oder in vivo gezüchtet werden. Die Produktion hoher Titer von mAks in vivo macht dies zur derzeit bevorzugten Produktionsmethode. Na-
NACHGEREICHT türlich ist es auch möglich, monoklonale Antikörper mittels rekombinanter Technologien in eukaryontischen, Hefe-, Insekten und Pflanzen-Zellen und in Pflanzen zu erzeugen.

   Diese Expressionssysteme sowie die Methoden zur Isolierung dieser Antikörper aus den Zellen sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Es war sehr überraschend, dass ein gegen die Bet v 1-Fragmente gerichteter monoklonaler Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung eine Inhibition ähnlich der von polyklonalen Antiseren, die durch Expression des gesamten Bet v 1-Allergens in einem Säuger erzeugt wurden, aufweist (cf. z.B. Focke et al., 2004). Insbesondere unter Berücksichtigung der Tatsache, dass polyklonale Antikörper normalerweise auf mehr als ein Epitop gerichtet sind.

   Die Produktion monoklonaler Antikörper führt zu einem Produkt, welches homogener und reiner und folglich reproduzierbarer ist als polyklonale Antikörper, die aus Antiseren erhalten wurden.
Die Auswahl geeigneter Peptide für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die zur Behandlung und/oder Prävention einer allergischen Erkrankung verwendet werden können, welche durch Einwirkung von Bet v 1 verursacht wurde, ist nicht trivial. Lebeque et al . (1997) untersuchten beispielsweise die Auswirkungen verschiedener, gegen Bet v 1 gezogener monoklonaler Antikörper auf die Bindung des IgE von Patienten, die gegen dieses Allergen allergisch sind, an Bet v 1.

   Diese Untersuchungen zeigten - ohne die Spezifität der erzeugten Antikörper für Regionen des Bet v 1-Allergens zu offenbaren - dass bestimmte monoklonale Antikörper die IgE-Bindung an Bet v 1 eher verstärken, anstatt diese Bindung zu verringern. Daher war es überraschend, dass die Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung die IgEBindung an Wildtyp-Bet v 1 stark inhibieren.
Der Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung und eine diesen Antikörper umfassende Vakzin-Formulierung können nicht nur zur Behandlung allergischer Reaktionen, die durch das Birkenpollen-Allergen Bet v 1 verursacht sind, verwendet werden, sondern auch zur Prävention solcher Reaktionen, oder zur Sensibilisierung eines Individuums für das Bet v 1-Allergen.

   Es ist auch möglich, ein Kind oder ein Neugeborenes mit einer Antikörper- oder Vakzin-Formulierung gemäss der vorliegenden Erfindung zu impfen, bevor dieses Kind oder Neugeborene mit Birkenpollen in Kontakt gelangt. Eine solche Vorgangsweise wird die Bildung von Bet v 1-spezifischen IgE-Antikörpern, und somit die Sensibi-
NACHGEREICHT lisierung gegen Bet v 1 in diesen Kind oder Neugeborenen verhindern. Es ist besonders vorteilhaft, die Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung an Kinder im Alter von 1 bis 3 Jahren zu verabreichen, da Kinder in diesem Alter gegen Birkenpollen sensibilisiert werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper ein IgG-Antikörper, insbesondere ein IgG-Antikörper vom IgGl- oder IgG4-Isotyp.
Selige et al. (Clin. Exp.

   Allergy (2005) 35: 774-781) zeigten, dass IgG-Antikörper, die gegen Bet v 1 gerichtet sind, allergische Reaktionen verstärken, indem sie grössere AllergenAggregate bilden, die die meisten Zellen oder basophile Zellen aktivieren. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den in Laffer et al. (J. Immunol. (1996) 157:4953-4962) und Denepoux et al. (FEBS letters (2000) 456:39-46) geoffenbarten Versuchen erhalten. Die Verwendung von gegen Bet v 1-Fragmente gerichteten IgG-Antikörpern gemäss der vorliegenden Erfindung zeigte jedoch diese Wirkungen nicht.

   Daher können gemäss der vorliegenden Erfindung IgGAntikörper verwendet werden.
Mehr bevorzugte Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung sind nicht-Komplement-aktivierende Antikörper, wie humanes IgG4 oder murines IgGl.
Der Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein muriner oder humaner Antikörper.
Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper ein chimärer Antikörper.
Techniken, die für die Herstellung von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad.

   Sei., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) durch Spleissen der Gene eines Maus-Antikörper-Moleküls mit geeigneter Antigen-Spezifität zusammen mit Genen von einem humanen Antikörper-Molekül mit geeigneter biologischer Aktivität, können verwendet werden. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei welchem verschiedene Teile von verschiedenen Tier-Spezies, Immunglobulin-Klassen, Unterklassen (Isotypen), Typen und Subtypen stammen, wie z.B. jene, die eine variable Region haben, die von einem murinen mAk stammt, und eine Human-Immunglobulin-konstante Region. Weiters können chimäre Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung mehr als eine Spezifität aufweisen (z.B. Diabodies
NACHGEREiCi .

   (bispezifische Antikörper) oder Tetrabodies) .
Der Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise humanisiert.
Verfahren zum "Humanisieren" von Antikörpern, oder zur Erzeugung weniger immunogener Fragmente von nicht-humanen Antikörpern sind gut bekannt. Ein humanisierter Antikörper ist ein solcher, bei welchem nur die Antigen-erkannten Stellen, oder Komplementaritäts-bestimmende hypervariable Regionen (CDRs) nicht-humanen Ursprungs sind, während alle Rahmen-Regionen ("framework regions, FR) variabler Domänen Produkte humaner Gene sind.
Nicht-humane Antikörper können mit jedem auf dem Gebiet bekannten Verfahren humanisiert werden. Bei einem Verfahren werden die nicht-humanen CDRs in einen humanen Antikörper oder in eine Consensus-Antikörper-Rahmensequenz insertiert.

   Weitere Änderungen können dann in den Antikörper-Rahmen eingeführt werden, um die Affinität oder Immunogenität zu modulieren. Es folgen Protokolle zur Verbesserung der monoklonalen Antikörper, die gegen Fragmente des Birkenpollen-Allergens Bet v 1 gerichtet sind, als therapeutische Mittel bei Menschen durch "Humanisieren" der monoklonalen Antikörper, um ihre Serum-Halbwertszeit zu verbessern und um sie weniger immunogen in humanen Wirten zu machen (d.h. um eine humane Antikörper-Antwort auf nicht-humane Antikörper zu verhindern) . Die Prinzipien der Humanisierung sind in der Literatur beschrieben und werden durch die modulare Anordnung von Antikörper-Proteinen erleichtert. Um die Möglichkeit der Bindung von Komplement auf ein Minimum zu reduzieren, wird ein humanisierter Antikörper vom IgGl-Isotyp bevorzugt.

   Beispielsweise wird ein Grad an Humanisierung erreicht, indem chimäre Antikörper erzeugt werden, die die variablen Domänen von nicht-humanen Antikörper-Proteinen, an welchen ein Interesse besteht, mit den konstanten Domänen von humanen Antikörper-Molekülen aufweisen (z.B. Morrison et al., Adv. Immunol., 1989, 44, 65-92). Die variablen Domänen von Bet v 1-spezifischen Antikörpern können aus der cDNA kloniert werden, die von mRNA erzeugt wird, welche aus dem Hybridom, an dem ein Interesse besteht, isoliert wurde. Die Gen-Fragmente der variablen Region sind mit Exons verbunden, die für konstante Domänen des humanen Antikörpers codieren, und das resultierende Konstrukt wird in geeigneten Säuger-Wirtszellen exprimiert (z.B. Myelom- oder CHO-Zellen) .

   Um einen noch grosse-
NACHGERE ,[iota] ren Grad der Humanisierung zu erreichen, könnten nur jene Teile der Gen-Fragmente der variablen Region, die für die Antigen-bindenden Komplementaritäts-bestimmenden Regionen ("CDR") der nicht-humanen monoklonalen Antikörper-Gene codieren, in humane Antikörper-Sequenzen kloniert werden (z.B. Jones et al., Nature, 1986, 321, 522-525, Riechmann et al., Nature, 1988, 332, 323-327, Verhoeyen et al., Science, 1988, 239, 1534-36, und Tempest et al., Bio/Technology, 1991, 9, 266-71). Auch das "betasheet framework" ("beta-Faltblatt-Rahmen") des humanen Antikörpers, der die CDR3-Regionen umgibt, kann modifiziert werden, damit er die dreidimensionale Struktur der Antigen-bindenden Domäne des ursprünglichen monoklonalen Antikörpers genauer widerspiegelt (vgl. Kettleborough et al., Protein Engin., 1991, 4, 773-783, und Foote et al., J. Mol.

   Biol., 1992, 224, 487-499). Bei einer alternativen Vorgangsweise wird die Oberfläche eines nicht-humanen monoklonalen Antikörpers, an dem ein Interesse besteht, humanisiert, indem ausgewählte Oberflächenreste des nicht-humanen Antikörpers z.B. durch stellengerichtete Mutagenese, verändert werden, während das gesamte Innere und kontaktierende Reste des nicht-humanen Antikörpers beibehalten werden (Padlan, Molecular Immunol., 1991, 28, 489-98).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper oder ein Fragment desselben, der (das) an ein Fragment von Bet v 1 bindet, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment von Bet v 1 aus den Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder den Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr.

   2) besteht.
Der Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der von einem Hybridom sezerniert wird, welches unter dem Budapester Vertrag bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland) am 9. Mai 2006 hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummern DSM ACC2782, DSM ACC2783, DSM ACC2785, DSM ACC2784 und DSM ACC2786 erhielt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vakzin-Formulierung, welche einen Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können zur Verabreichung an einen Säuger, insbesondere an einen Menschen, in vielerlei Weise formuliert sein. Bei einigen Ausführungsformen sind die Antikörper in einer sterilen wässerigen Lösung oder in
NACHGEF, biologischen Flüssigkeiten, wie Serum.

   Wässerige Lösungen können gepuffert oder ungepuffert sein und haben zusätzliche aktive oder inaktive Komponenten. Zu den zusätzlichen Komponenten zählen Salze zur Modulation der Ionenstärke, Konservierungsmittel einschliesslich - ohne Einschränkung darauf - antimikrobielle Mittel, Antioxidantien, Chelatbildnern u. dgl., und Nährstoffe, einschliesslich Glucose, Dextrose, Vitamine und Mineralstoffe. Alternativ können die Antikörper für eine Verabreichung in fester Form zubereitet sein.

   Die Antikörper können mit einer Reihe inerter Trägermittel oder Exzipienten, einschliesslich - ohne Einschränkung darauf - Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; Exzipienten, wie Stärke oder Lactose; Dispergiermittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; Lubrikantien, wie Magnesiumstearat; Gleitmittel, wie kolloidales Siliziumdioxid; Süssstoffe, wie Saccharose oder Saccharin; oder Geschmacksstoffe, wie Pfefferminz oder Methylsalicylat kombiniert werden. Antikörper oder ihre Formulierungen können an einen Säuger mit jedem Mittel, das zur Abgabe der Antikörper an das Ziel ("target") wirksam ist, verabreicht werden. Zu solchen Mitteln zählen intravenöse, intramuskuläre, subkutane, orale, intranasale, mukosale oder dermale Dosierungsformen.

   Eine lokalisierte Verabreichung der Antikörper oder Vakzin-Formulierungen gemäss der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ist ein bevorzugter Träger für injizierbare Formulierungen und für Formulierungen, die intranasal verabreicht werden können. Die Dosierung von Antikörpern zum Erhalt einer pharmazeutisch wirksamen Menge an therapeutischem Mittel hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Beispielsweise haben das Alter, die Sensitivität, Verträglichkeit und andere Charakteristika des Patienten einen Einfluss auf die Dosismengen. Weiters müssen der Plasmaspiegel und die Halbwertszeit der verwendeten Antikörper und die Affinität für ihre Erkennungsstellen und andere ähnliche Faktoren für eine wirksame Dosierung in Betracht gezogen werden.

   Für die systemische Verabreichung der Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung können Dosen im Bereich von etwa 1 mg/kg Patient/Tag bis etwa 500 mg/kg Patient/Tag, vorzugsweise von etwa 5 mg/kg Patient/Tag bis etwa 250 mg/kg Patient/Tag, mehr bevorzugt von etwa 10 mg/kg Patient/Tag bis etwa 100 mg/kg Patient/Tag verwendet werden, obwohl Dosierungen im unteren Ende des Bereiches einfach deshalb
NACHGEREICHT bevorzugt sind, weil sie leicht zu verabreichen und kostengünstig sind. Die Dosierungen können eingestellt werden, beispielsweise um einen bestimmten Plasmaspiegel eines Antikörpers vorzusehen, beispielsweise im Bereich von etwa 0,05 bis 200 [mu]g/ml, mehr bevorzugt von etwa 0,1 bis 100 [mu]g/ml, und um diesen Spiegel beizubehalten, beispielsweise für eine Zeitdauer oder bis zur Erreichung klinischer Ergebnisse.

   Chimäre und humanisierte Antikörper, von welchen man eine langsamere Clearance annehmen würde, würden geringere Dosierungen zur Aufrechterhaltung eines wirksamen Plasma-Spiegels erfordern. Auch Antikörper mit einer hohen Affinität für Bet v 1-Fragmente werden vorzugsweise weniger häufig oder in geringeren Dosen verabreicht als Antikörper mit geringerer Affinität. Eine therapeutisch wirksame Antikörper-Dosierung kann bestimmt werden, indem im Laufe der Behandlung eine Verringerung allergischer Reaktionen gezeigt wird.

   Vorzugsweise wird die Vakzin-Formulierung und das Medikament gemäss der vorliegenden Erfindung einem Individuum bis eine oder zwei Wochen vor der Pollen-Saison verabreicht.
Die Vakzin-Formulierung ist vorzugsweise zur intramuskulären, subkutanen, intravenösen Verabreichung oder zur Verabreichung über die Schleimhaut ausgelegt.
Die Formulierung gemäss der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, wobei die intramuskuläre, subkutane, intravenöse Verabreichung oder die Verabreichung über die Schleimhaut bevorzugt sind. Die Antikörper, die spezifisch an die Bet v 1-Fragmente binden, welche aus den Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder den Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) bestehen, können einem Individuum zur Behandlung oder Prävention von allergischen, durch das Birkenpollen-Allergen Bet v 1 verursachten Reaktionen verabreicht werden.

   Insbesondere die Verabreichung der Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung über die Schleimhaut hätte eine Reihe von Vorteilen gegenüber traditionellen Immunisierungs-Schemata. Unter diesen sind vor allem eine wirksamere Stimulierung des lokalen mukosalen Immunsystems des Atmungstraktes und die Wahrscheinlichkeit, dass die Vakzin-Aufnahmeraten erhöht würden, weil die mit Injektionen verbundene Angst und Unannehmlichkeiten vermieden würden.

   Die Verwendung von Antikörpern, die an Allergene gemäss der vorliegenden Erfindung binden, könnte dazu beitragen, die allergischen Reaktionen durch Inhibierung der Bindung von IgE an die
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 <EMI ID=11.1> 
' 
2004) .

   In Tabelle 1 sind die Merkmale der nicht-anaphylaktischen, von Bet v 1 stammenden synthetischen Peptide zusammengefasst.
Tabelle 1. Merkmale nicht-anaphylaktischer, von Bet v 1 stammender Peptide
Position AS Sequenz
Anzahl Molekularder AS gewicht
Peptid2 30-59 LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIK ISFC 31 3202,7 Peptid6 75-104 C VDHTNFKYN YSVI EGGP IGDTLE K ISN El K 31 3484,9
Die synthetischen Peptide (Peptid 2, Peptid 6) wurden an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin ("keyhole limpet haemocyanin", KLH: MW 4,5 x 10<5>bis 1,3 x 10<7>; Pierce, USA) gemäss dem Protokoll des Herstellers gekoppelt und unter Verwendung eines Conjugation Kits (Pierce) gereinigt. Balb/c-Mäuse (Charles river, Deutschland) Wurden mit dem mit KLH gekoppelten Peptid (30 [mu]g/ml pro Maus), das an Al(OH)3adsorbiert war (75 [mu]l/Maus) 3 Mal immunisiert (Tabelle 2) .

   Der Allergen-spezifische IgGl-Titer der Seren wurde mittels ELISA bestimmt.
Tabelle 2 . Immunisierungsplan
Tag Tätigkeit Adj uvans Stelle
0 Primär-Immunisierung AI (OH)3s . c .
28 Boost # 1 AI (OH)3s . c .
46 Boost # 2 AI (OH)3s . c .
49
 <EMI ID=12.1> 
Ernten d. Milzzellen u. Fusion AI (OH)3s . c.
Milzzellen wurden 3 Tage nach der letzten Immunisierung geerntet, und die Hybridome wurden mittels herkömmlicher HybridomTechnologie (Köhler und Milstein, 1975) mit geringen Modifikationen gezogen, wobei die HAT-sensitive, nicht-sezernierende Myelom-Zelllinie X63Ag8.653 (Kearney et al., 1979) als Fusionspartner verwendet wurde. Myelome wurden im Hybridom-Wachstumsmedium gezüchtet, bestehend aus RPMI 1640, ergänzt mit L-Glutamin (200 mM) , 10% fötalem Rinderserum, Fungizon (200 E/ml) und Penicillin/Streptomycin (10000 E/ml) .

   Die Milz von Mäusen wurde, wie erwähnt, entfernt, und die Zellen wurden in serumfreiem Hybridom-Wachstumsmedium suspendiert. Nach dem Zentrifugieren bei 1750 U/min (5 min, 4[deg.]C) wurden die roten Blutkörperchen mit
NACHGEREICHT 4-1
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Zur Charakterisierung detaillierter Bindungs-Spezifitäten der erhaltenen monoklonalen IgGl-Antikörper mittels ELISA wurden Mikrotiter-Platten mit rBet v 1, Peptid 2 (AS 30-59), Peptid 6 (AS 75-104), Bet v 1-Trimer, Bet v 1-Fragment 1 (AS 1-74), Bet v 1-Fragment 2 (AS 75-160), KLH und rPhl p 1 in einer Konzentration von 5 [mu]g/ml, verdünnt in PBS, beschichtet. Die Blockierung erfolgte durch Zugabe von 0,5% Gew. /Vol.

   Rinderserumalbumin (BSA) in PBS-T (PBS + 0,05% Tween 20) während 1,5 Stunden bei 37[deg.]C, und danach wurde unverdünnter Hybridom-Überstand 2 Stunden lang bei 37 [deg.]C inkubiert. Die spezifische Bindung von mAks wurde mit Primär-Detektions-Antikörper, gefolgt von Enzymmarkiertem Sekundär-Antikörper wie oben beschrieben nachgewiesen.
Insgesamt wurden 44 Seren von gegen Birkenpollen allergischen Patienten (gesamte IgE-Mengen: 24,1 - >5000 kUA/1; Birkenpollen-spezifisches IgE: 10,7 - >100 kUA/1) wurden gemäss der Anamnese ausgewählt, Serum einer nicht-allergischen Person wurde für Kontrollzwecke inkludiert. Die Gruppe der gegen Birkenpollen allergischen Patienten bestand aus 19 Männern und 25 Frauen mit einem mittleren Alter von 37 Jahren (Bereich von 21 bis 70 Jahre) .

   In Tabelle 3 sind die Merkmale von Seren von ausgewählten, gegen Birkenpollen allergischen Patienten zusammengefasst .
Tabelle 3 : Charakterisierung von allergischen Patienten
Seren von gegen Birkenpollen
Gesamt-IgE Birke RAST-
Patient Geschlecht Alter (kUA/1) (kUA/1) Klasse al 26 24,1 11,5 3 a2 M 57 172 34,6 4 a3 24 149 20,4 4 a4 W 50 28,1 13,2 3 a5 M 57 36,9 26,1 4 a[beta] W 34 84,6 16,4 3 a7 35 141 22 4 a8 W 30 182 27,1 4 a9 W 23 278 54,5 5 alO M 36 128 11,8 3 bl M 28 158 20,5 4 b2 W 34 41,5 21,1 4
 <EMI ID=14.1> 

NACHGERE1CI .

   f b3 W 38 120 42,5 4 b4 M NS >2000 >100 6 b5 W 23 423 63,3 5 b6 56 60,6 12,7 3 b7 38 273 84,6 5 b8 M 44 26,3 10,7 3 b9 M 60 235 49,6 4 blO 32 34,4 12,1 3 bll M 41 >2000 >100 6 bl2 M 26 34,7 18,6 4 bl3 22 >5000 >100 6 bl4 W 22 560 >100 6 bl5 M 70 112 28,4 4 bl6 M 25 512 94,4 5 bl7 M 44 113 26,7 4 bl8 M 41 94 19,8 4 bl9 M 23 205 >100 6 b20 M NS 28,3 13,3 3 b21 M NS NS 32,1 4 b22 M 29 338 16,5 3 b23 M 57 >100 80,1 5 b24 M 37 95,3 41,6 4 b25 M NS 252 41 4 b26 M 36 50 13,7 3 b27 M 52 125 51,3 5 b28 M 23 122 17,6 4 b29 W 24 49,9 27,4 4 b30 M 53 59,7 14,1 3 b31 21 238 21,8 4 b32 W 21 218 28,8 4 b33 M 33 72,1 11,8 3 b34 W 31 60,1 33,1 4
 <EMI ID=15.1> 

Die Individuen sind wie in Tabellen 6-9 nummeriert. Die demographischen Daten geben das Geschlecht und das Alter der für die Inhibierungsversuche verwendeten gegen Birkenpollen allergischen Patienten an.

   Die serologische Charakterisierung zeigt GesamtIgE, Birkenpollen-spezifisches IgE und RAST-Klasse. NS=nicht spezifiziert.
NACHGEREICl .7 ..
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Die ELISA-Platten wurden mit rBet v 1 (1 [mu]g/ml) bei 4[deg.]C über Nacht beschichtet. Nach dem einstündigen Blockieren bei 37 [deg.]C mit 0,5% Gew. /Vol. Rinderserumalbumin (BSA) in PBS-T (PBS + 0,05% Tween 20) wurden die Platten mit unverdünntem einzelnen (Klon 2(DSM ACC2782), 4 (DSM ACC2783) , 10 (DSM ACC2785) , 12 (DSM ACC2784), 13 (DSM ACC2786) ) und gemischtem (Klon 2 und Klon 13<)>IgGl-Antikörper produzierendem Hybrido -Kultur-Überstand über Nacht bei 4[deg.]C vorinkubiert.

   Schliesslich wurden die Platten mit 1:5 verdünnten Seren von 44 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (4[deg.]Cüber Nacht) inkubiert, und gebundene IgE-Antikörper wurden mit einem 1:1000 verdünnten, mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Maus-monoklonalen anti-Human-IgE-Antikörper nachgewiesen. Zwischen den Inkubationsschritten wurden die Platten wiederholt mit PBS-T gewaschen. Der Prozentsatz der Hemmung der IgE-Bindung an rBet v 1 nach der Vorinkubation mit monoklonalem IgGl-Antikörper wurde wie folgt berechnet: % Inhibition = 100(ODp x 100/ODnp) .

   ODp und ODnp stellen die Extinktion nach der Vorinkubation mit Hybridom-Kultur-Überstand (ODp) bzw. ohne denselben (ODnp) dar.
Beispiel 1 . 3 : Ergebnisse
Nach dem Ausplattieren und der Inkubation von fusionierten Milzzellen wurden alle Überstände aus Mikrotiter-Vertiefungen mittels ELISA, wie oben beschrieben, analysiert, um immunreaktive Hybridome zu isolieren. Eine weitere Vermehrung positiver Hybridome führte zur Selektion von 14 stabilen, monoklonalen, Peptid-spezifischen Antikörpern. Jeder gehört zum IgGl-Isotyp und exprimiert die leichte kappa-Kette. Die Tabelle 4 führt die erhaltenen Klone an.

   Die Klone 2, 4, 10, 12 und 13 wurden unter dem Budapester Vertrag an der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, DSMZ) , Braunschweig, Deutschland, unter den Hinterlegungsnummern DSM ACC2782 (Klon 2), DSM ACC2783(Klon 4), DSM ACC2785 (Klon 10), DSM ACC2784 (Klon 12), DSM ACC2786 (Klon 13) am 9. Mai 2006 hinterlegt.
NACHGEREICHT Tobelle 4.

   Beschreibung der Klone
Klon Name Isotyp kappa-leicht.Kette Immunogen DSM-Hinterleg Nr.
1 P2/3D3/12/2E7 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH
2 P2/3D3/10/2D7 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH ACC2782
3 P2/3D3/7/1E6 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH
4 P2/6D5/36/2F11 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH ACC2783
5 P2/ÄD5/34/2F2 IgGl + rBet v 1 AS 30s59-KLH
6 P2/6D5/33/2E7 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH
7 P2/6D5/27/1F7 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH
8 P2/7G6/58/5G2 IgGl + rBet v l AS 30-59-KLH
9 P2 7G6/57/5C3 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH
10 P2/7G6/55/4G3 IgGl + rBet v 1 AS 3059-KLH ACC2785
11 P2 7G6/54/4F3 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH
12 P6/6F6/150/1G7 IgGl + rBet v 1 AS 75-104-KLH ACC2784
13 P6/7B11/180/2G10 IgGl + rBet v 1 AS 75-104-KLH ACC2786
 <EMI ID=17.1> 
14 P[alpha]/7B11/178/2G7 IgGl + rBet v 1 AS 75-104-KLH
Die 14 Peptid-spezifischen Antikörper-produzierenden Klone wurden weiters getestet auf ihre 

  Bindungseigenschaften an rBet v 1, Bet v 1-Peptide und Bet v 1-Derivate, wie das Bet v 1Trimer, bestehend aus drei kovalent verbundenen Kopien von rBet v 1 (Vrtala et al., 2001) und zwei rBet v 1-Fragmente, welche die AS 1-74 (1) und die AS 75-160 (2) von Bet v 1 umfassen (Vrtala et al., 2000). Weiters wurde die Bindung der monoklonalen Antikörper an die negativen Kontrollen, wie KLH und rPhl pl, bestimmt. In Tabelle 5 sind die Bindungseigenschaften der 14 monoklonalen Antikörper zusammengefasst . Keiner der 14 Peptid-spezifischen Antikörper zeigte irgendeine Reaktivität gegenüber KLH oder rPhl p 1, alle davon wiesen eine starke Reaktivität gegenüber rBet v 1 und dem Bet v 1-Trimer auf.

   Gemäss dem Immunogen zeigten die Klone Nummer 1-11, die Peptid-2-spezifische (AS 3059) Antikörper erzeugen, eine Antikörper-Reaktivität gegenüber diesem Peptid (Peptid 2) und reagierten nicht mit dem Peptid 6 (AS 72-104). Peptid-6-spezifische (AS 72-104) Antikörper, die von den Klonen Nummer 12-13 erzeugt wurden, zeigten eine Bindung des Immunogens, hatten jedoch keine Bindung an Peptid 2 (AS 3059) . Eine weitere Untersuchung unter Verwendung von Bet v 1Fragment 1 (AS 1-74) und Fragment 2 (AS 75-106) bestätigte, dass die Peptid-2-spezifischen Antikörper (Klone 1-11) eine Reaktivität gegenüber Fragment 1 (AS 1-74) zeigten, wogegen die Peptid6-spezifischen Antikörper (Klone 12-13) eine Reaktivität gegenüber dem Fragment 2 (AS 75-160) aufwiesen.
NACHGEREICHT Tobelle 5.

   Blndungselgeroch[alpha]fien von monoklonalen IgGl -Antikörpern rBet v 1
Klon rEtetv 1
T
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Trimer Fragment 1 Fragment 2 Peptid 2 Peptid 6 AS 1-74 AS 75-160 AS 30-59 AS 75-104 rPhl p 1
KLH
+ + + +
+ + + + + + + + + + +
Tabelle 6 zeigt, dass die monoklonalen Antikörper auch die Bindung des IgE von allergischen Patienten an mit Bet v 1 kreuzreaktiven Allergenen inhibiert, wie dem Hauptallergen der ErlenPollen, Aln g 1, oder dem Hauptallergen von Apfel, Mal d 1.
Tabelle 6:

   Monoklonale IgGl-Antikörper inhibieren Serum-IgEBindung gegen Birkenpollen allergischer Patienten an Bet v 1-Homologe
% Inhibition [Omicron] Inhibition
Aln g 1 Aln g 1 Aln g 1 Mal d 1 Mal d 1 Mal d 1
Patient Klon 2 Klon 4 Klon 10 Klon 2 Klon 4 Klon 10 al 40,95 28,25 30,79 20,56 11,85 14,63 b3 69,13 52,22 62,37 30,67 5,14 7,51 bl6 52,82 28,32 44,70 41,22 19,35 28,32 b9 74,63 48,34 63,88 36,16 14,37 18,08 bl5 45,14 29,81 39,05 29,91 15,33 24,30 bl4 47,92 20,37 41,42 35,58 22,79 17,22 b20 61,73 39,42 54,23 31,45 20,16 22,98 bl9 44,72 25,04 35,59 32,29 20,38 18,18 b26 9,40 6,04 11,41 9,32 6,21 8,07 b33 1,06 2,13 0,00 41,22 24,90 29,80
Mittel 44,8 28,0 38,3 30,8 16,0 18,9
 <EMI ID=18.1> 

Die mit den IgGl mAks (Klon 2, 4, 10) erhaltenen Prozent Inhibierung der IgE-Bindung an vollständiges rBet v 1 ist für Seren von 10 gegen Birkenpollen allergischen Patienten gezeigt.

   Die Mittelwerte der Prozent Inhibition sind unten in der Tabelle gezeigt.
NACHGEREICHT » Die Kapazität Peptid-spezifischer Antikörper, die Bindung des IgE allergischer Patienten an vollständiges rBet v 1 zu inhibieren, wurde mit ELISA-Kompetitionsversuchen bestimmt (Tabellen 7-9) , wobei Seren von 44 gegen Birkenpollen allergischen Patienten verwendet wurden. Fünf von insgesamt 14 Klonen wurden für eine Vorinkubation mit rBet v 1 ausgewählt, bevor sie dem Patienten-IgE ausgesetzt wurden.

   Die stärkste Hemmung der IgEBindung wurde nach Vorinkubation mit Peptid 6-spezifischen (AS 75-104) Antikörpern (Klon 12: 60,4% - 74,8% durchschnittliche Inhibition; Klon 13: 58,5% bis 72,6% durchschnittliche Inhibition) beobachtet, wogegen die Peptid 2-spezifischen (AS 30-59) Antikörper (Klon 2: 46,2% bis 62,7% durchschnittliche Inhibition; Klon 4: 44,3% und 58,7% durchschnittliche Inhibition und Klon 10: 41,0% und 52,4% durchschnittliche Inhibition) auch die Bindung von Patienten-IgE an rBet v 1 inhibierten, wenn auch in geringerem Ausmass. Interessanterweise wies eine Mischung aus einem Peptid 2-spezifischen monoklonalen Antikörper (Klon 2) und einem Peptid 6-spezifischen monoklonalen Antikörper keine stärkere Inhibition der IgE-Bindung auf als die einzelnen monoklonalen Antikörper alleine (Tabellen 7-9) .
Tobelle 7.

   Monoklon[alpha]le IgGl-Antikörper Inhibieren Serum-lgE-Blndung von Birkenpollen-Allergikern an rBet v 1
OD ohne mA OD mlt m[Lambda]k % Inhibition
Patient klon 2 Klon 4 Klon lö Klon 12 klon 13 klon 2 klon 4 klon lö klon 12 klon 13 al 0,45 Ö.34 Ö.3 Ö.37 0,36 0,36 23 25 17 20 19 a2 0.74 0.34 0.36 0,40 0,21 0,20 54 51 46 72 73 a3 0.93 0.49 0,520,58 0,61 0,66 47 45 38 34 29 a4 0,61 0>23 0,23 0.26 0,15 0,13 62 62 57 76 78 a5 1.19 0,81 0,87 0,86 0,43 0,58 32 27 28 64 52 a& 0.41 0.20 0,22 0,24 0,12 0,13 51 47 42 71 69 a7 0.62 0.33 0.35 0,38 0,19 0,22 48 44 38 70 65 a[beta] 0.63 0,31 0,32 0,33 0,17 0,20 50 49 47 73 69 a? 0.42 0.19 0,19 0,19 0,10 0,09 55 54 54 76 78
 <EMI ID=19.1> 
alO 0.38 0l23 0,23 0.22 0,19 0,18 40 39 43 49 54
Kontrolle 0,06 0,09 0,09 0,09 0,14 0,15 0 0 0 0 0
 <EMI ID=19.2> 
Mittel 4 44,3 41, ö iö,4 5[beta],5
Die mit den IgGl mAks (Klon 2, 4, 10, 12, 13)

   erhaltenen Prozent Hemmung der IgE-Bindung an vollständiges rBet v 1 sind für Seren von 10 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (al-alO) gezeigt, Serum einer nicht-allergischen Person dient als Kontrolle. Die Mittelwerte der Prozent Inhibition sind unten in der Tabelle gezeigt.
NACHGEREICHT Tabelle 8.

   onoklonale IgGl -Antikörper Inhibieren Serum-lgE-Blndung von Birkenpollen-Allergikern an rBet v 1
OD ohne mAk OD mit mAk % Inhibition
Patient lon Klon 4 Klon 10 Klon 12 Klon 13 Klon Klon 4 Klon lü Klon 12 Klon 13
[Epsilon]t 0.35 [delta].[delta] [delta].l[delta] Ö.I3 Ö.Ö6 6,06 75 ?i ü 84<" ">44 b2 0,29 0,09 0,11 0,13 0,07 0,07 70 64 56 77 75 b3 0,52 0,13 0,18 0,23 0,08 0,12 74 66 55 85 77 b4 1,05 0,25 0,24 0,36 0,10 0,12 76 77 66 90 89 b5 0,70 0,26 0.31 0,37 0,09 0,12 62 55 46 87 82 b[omicron] 0.12 0,04 0,06 0.06 0,04 0,04 70 51 45 70 67 b7 0,73 0,29 0,29 0,38 0,13 0,18 61 60 47 82 75 b8 0.13 0.06 0,06 0,07 0,05 0.05 57 56 49 63 65 b9 0.33 0,09 0,10 0,13 0.06 0,06 73 71 61 83 82 blO 0,11 0,06 0,07 0,07 0.06 0,06 47 39 37 47 47

   bl l 1,24 0.28 0,30 0,40 0.08 0.12 78 76 68 94 91 b12 0,17 0,04 0.06 0,06 0,03 0.04 75 66 63 79 78 b!3 0,88 0,16 0,16 0,22 0,08 0,08 82 81 75 91 90 b!4 1,61 0,76 0,77 0,95 0.29 0,46 53 52 41 82 72 bl5 0,30 0,15 0,16 0,18 0,12 0,12 51 48 40 61 60 bl 6 1,52 0,80 0,85 0,89 0,35 0,56 48 44 42 77 63 bl 7 0,25 0,08 0,09 0,11 0,04 0,06 67 63 56 82 75 bl[beta] 0.16 0,09 0,09 0,11 0,07 0.08 45 43 34 59 54 b19 0,51 0,13 0,14 0,17 0.06 0.06 75 72 66 89 88 b20 0,11 0,07 0,08 0.08 0.06 0.06 33 30 29 42 42 b2l 0,54 0,17 0,21 0,24 0.06 0,09 68 62 54 89 83 b22 0,21 0,12 0.12 0,12 0,09 0.09 42 44 40 56 57 b23

   0,52 0,13 0,14 0,17 0.06 0,06 75 73 67 89 89 b24 0,30 0,08 0.09 0,10 0,04 0.04 73 70 65 86 86 b25 0,40 0,15 0,15 0,18 0,10 0,11 63 61 55 74 73 b26 0,16 0,09 0,09 0,09 0,08 0,07 46 44 42 50 55 b27 0.42 0.14 0,15 0,17 0,07 0,07 68 65 59 84 84 b28 0.16 0.06 0,07 0,08 0,05 0.05 61 57 53 70 71 b29 0,31 0.13 0.14 0,17 0,07 0,09 59 55 47 76 71 b30 0,12 0,05 0,07 0,07 0,05 0.06 53 38 37 55 52 b31 0,35 0,15 0.16 0,18 0,11 0.12 55 53 49 68 66 b32 0.25 0.07 0.08 0,09 0,06 0.05 73 70 65 75 79 b33 0,11 0,05 0,05 0.06 0.04 0.04 55 52 48 65 65 b34 0.3V 0,12 0,13 0,16 0,06 0,06 69 67 60 84 85
Kontrolle 0.03 0,03 0,04 0,03 0,04 0,08 4 0 0 0 0
 <EMI ID=20.1> 
Mittel 42,7 58,7 52,4 74,8 714
Die mit den IgGl mAks (Klon 2, 4, 10, 12, 13) erhaltenen Prozent Inhibition der IgE-Bindung an vollständiges rBet v 1 sind für Seren von 34 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (bl-b34) gezeigt,

   Serum einer nicht allergischen Person dient als Kontrolle. Die Mittelwerte der Prozent Inhibition sind unten in der Tabelle gezeigt.
Tabelle 9. Inhibition der Serum-lgE-Blndung von BlrkenpoHen-Allerglkern an rBet v 1.
Vergleich der Inhlbirlonrfählgkeit von zwei einreinen monoklonalen Antikörpern und einer Mischung von diesen
OD ohne mAk OD mit mAk % Inhibition
Patient klon 2 klon 13 klon 2 13 Mx klon 2 klon 13 klon 2713 Mx al ö,3[omicron] Ö.13 Ö.Ö7 Ö.Ö7 56 75 75 a2 0,29 0.11 0,07 0.07 61 76 74 a3 0,19 0.07 0,05 0.04 63 76 78 a4 0,17 0.08 0.05 0.05 56 72 70 a5 0,03 0.03 0,03 0.05 15 6 0 a6 0,14 0.09 0.07 0,09 36 48 37 a7 0,25 0.09 0,06 0.06 64 75 75 a[beta] 0,24 0.10 0,08 0.07 60 68 72 a9 0,18 0,06 0.04 0.04 65 76 77 alO 0.30 0,16 0.11 0,09 47 64 70
 <EMI ID=20.2> 
Mittel 52,4 43,4 42.9
Die mit den einzelnen IgGl mAks (Klon 2, Klon 13)

   erhaltenen Prozent Inhibition der IgE-Bindung an vollständiges rBet v 1 im Vergleich zur Inhibition durch eine Mischung von IgGl mAks (Klon 2/13 Mischung) . Die Inhibition ist für Seren von 10 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (al-alO) gezeigt. Die Mittelwerte der Prozent Inhibition sind unten in der Tabelle gezeigt.
NACHGEREICHTDas Schlüsselereignis der allergischen Reaktion ist die Vernetzung von Effektor-Zellen gebundenen IgE-Antikörpern durch mehrwertige Allergene. Dies führt zu einer Granula-Exocytose und einer Freisetzung von biologischem Mediator (d.h. Histamin, Leukotriene) , was dann eine allergische Entzündung vom Soforttyp und somit eine allergische Rhinitis, Konjuktivitis und Asthma, bewirkt.

   In dieser Hinsicht ist die Allergen-IgE-AntikörperWechselwirkung ein mögliches Ziel für eine Allergen-spezifische passive Immuntherapie mit dem Ziel, die Wechselwirkung zwischen den Allergenen und den IgE-Antikörpern zu inhibieren (Valenta et al., 1998). Aus diesem Grund ist die Definition der IgE-Epitope eine wichtige Vorausetzung für die Entwicklung spezifischer Therapieformen. Im Falle der Hauptallergene, wie Phl p 1, mit kontinuierlichen IgE-Epitopen, ist es möglich, Allergene in IgEbindende Haptene zu teilen, welche Effektor-Zell-gebundenes IgE vor der Einwirkung von Allergen sättigen und dadurch eine Vernetzung und eine Effektor-Zellaktivierung verhindern (Ball et al., 1994) (vgl. auch Kapitel 1: das Hapten-Prinzip) . Im Gegensatz dazu gehören die IgE-Epitope des Birkenpollen-Hauptallergens, Bet v 1, vor allem zum konformationellen (diskontinuierlichen) Typ.

   In diesem Fall kann die Allergen-IgE-AntikörperWechselwirkung blockiert werden mit therapeutischen Allergenspezifischen Antikörpern, welche mit dem Patienten-IgE um die Bindungsstellen am Allergen konkurrieren und dadurch eine Aktivierung von Effektor-Zellen verhindern. Ein solcher therapeutischer Ansatz ist vernünftig, insbesondere wenn Patienten nur gegen einige Hauptallergene sensibilisiert sind.
Im vorliegenden Beispiel wurden 14 monoklonale Bet v 1-Peptid-spezifische Antikörper, die alle zur IgGl-ünterklasse gehören, hinsichtlich ihrer Epitop-spezifischen Bindungseigenschaften sowie hinsichtlich ihrer Kapazität, die Bindung des IgE von Allergikern an das Bet v 1-Allergen zu stören, charakterisiert.
Gemäss ihrer Bindungs-Spezifitäten können die monoklonalen Antikörper in zwei Gruppen unterteilt werden:

   monoklonale Antikörper der Gruppe I (Klone 1-11) erkannten Peptid 2 (AS 30-59) sehr stark, wogegen monoklonale Antikörper der Gruppe II (Klone 12-13) gebundenes Peptid 6 stark erkannten (AS 75-104) . Alle monoklonalen Antikörper banden stark an rBet v 1 und rBet v 1-Trimer und zeigten eine Spezifität, weil sie nicht verwandte Kontroll-Proteine, wie KLH und rPhl p 1, nicht erkannten.
NACHGEREICHT Beim Testen auf eine Störung der Bindung von Patienten-IgE an Bet v 1 inhibierte jeder der monoklonalen Antikörper die IgEBindung in wesentlichem Ausmass, einige bei bestimmten Patienten bis zu 94%. Interessanterweise zeigten diese Ergebnisse, dass ein einziger monoklonaler Antikörper ausreicht, um mit der polyklonalen IgE-Bindung bei Patienten zu konkurrieren.

   Peptid 6spezifische monoklonale Antikörper zeigten im Vergleich zu Peptid 2-spezifischen monoklonalen Antikörpern eine stärkere Inhibition.
Beim Vergleich der Inhibitionsstärke einzelner monoklonaler IgG-Antikörper mit verschiedenen Epitop-Spezifitäten (Klon 2: Peptid 2-spezifisch; Klon 13: Peptid 6-spezifisch) mit einer Mischung von zwei Antikörpern mit verschiedenen Spezifitäten wurde bei der Antikörper-Mischung keine stärkere Inhibition der Bindung von Patienten-IgE beobachtet.
Prinzipiell kommen zwei Erklärungen für die Blockierungsaktivität der Peptid-spezifischen IgGl-Antikörper in Betracht. Erstens kann die Inhibition dadurch erklärt werden, dass die erhaltenen monoklonalen Antikörper Epitope in den oder nahe den Haupt-IgE-Bindungsstellen von Bet v 1 erkennen.

   Zweitens kann die Blockierungsaktivität durch die Modifizierung der Konformation des Allergens bewirkt sein, so dass die IgE-Epitope oder auch nur ein Teil davon nicht mehr für IgE zugänglich sind. Die letztere Erklärung würde auf die Ergebnisse aus dem Inhibitionsversuch passen, der zeigt, dass eine Mischung von zwei Peptidspezifischen monoklonalen Antikörpern mit verschiedener EpitopSpezifität keine stärkere Inhibition der IgE-Bindung ergab als die einzelnen monoklonalen Antikörper.

   Diese Theorie kann durch Strukturanalysen des Allergen-Antikörper-Komplexes bestätigt werden.
Es wurden bereits mehrere monoklonale Human- und Maus-Antikörper mit therapeutischem Potential mittels klassischer Gewebekultur- und kombinatorischer Klonier-Technik unter Verwendung von B-Zellen von allergischen Patienten oder immunisierten Mäusen als Quelle isoliert (Sun et al., 1995; Visco et al., 1996; Lebeque et al., 1997; Flicker et al., 2002). Diese Antikörper konnten die Allergen-IgE-Wechselwirkung inhibieren und eine Allergen-induzierte Degranulation basophiler Zellen verhindern.
Auch Bet v 1-spezifische humane blockierende Antikörper wurden bereits hergestellt durch Erzeugung von Hybridom-Zelllinien
NACHGEREICHT von Patienten, die mittels Immuntherapie behandelt wurden<(>Visco et al., 1996).

   Bet v 1-spezifische monoklonale Maus-Antikörper wurden mittels der klassischen Hybridom-Technologie isoliert(Lebeque et al., 1997). Im Vergleich zu den bereits früher erhaltenen Bet v 1-spezifischen monoklonalen Antikörpern wurden die in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper aus Mäusen isoliert, die mit von Bet v 1 stammenden Peptiden, welche eine bestimmte Aminosäuresequenz hatten, immunisiert wurden, wodurch das spezifische Epitop schon zu Beginn des Vorgangs bestimmt war.
Blockierende Antikörper, wie oben beschrieben, können auch humanisiert oder als rekombinante Antikörper-Fragmente erzeugt werden, um ihre Immunogenität zu verringern.

   Therapeutische Allergen-spezifische Antikörper können lokal in die Zielorgane der Allergie verabreicht werden (z.B. über die Nase oder über die Bronchien-Schleimhaut, Bindehaut) , um eine stabile Verteidigungslinie gegen eindringende Allergene aufzubauen, oder systemisch, wie als passive Vakzine (Valenta et al., 1997<)>.
Schliesslich können die monoklonalen Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung durch eine lokale Therapie oder eine passive Impfung auch zur Verhinderung einer Allergen-induzierten Mediator-Freisetzung in den Zielorganen der Allergie verwendet werden.
Beispiel 2:

  
Ein Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen einer passiven Impfung mit Allergen-spezifischen IgG-Antikörpern in vivo wurde etabliert (Fig. 1)
Mäuse(Charles River, Deutschland) wurden intraperitoneal(i.p.)mit 5 [mu]g rBet v 1 (Biomay, Österreich), dem BirkenpollenHauptallergen, das an AI (OH)3(Alu-Gel-S; Serva, Deutschland<)>adsorbiert war, am Tag 1, 14 und 28 sensibilisiert. Blutproben(Ante-Serum)wurden aus den Schwanzvenen der sensibilisierten Mäuse am Tag 36 entnommen. Die allergische Sensibilisierung gegen Bet v 1 wurde durch Messung von Bet v 1-spezifischen IgE-Antikörpern in diesen Seren bestätigt (Vrtala et al., 1998<)>. Die Bet v 1-spezifischen IgE-Mengen aller acht Seren waren vergleichbar (Tabelle 10, Ante-Serum) .
Die Mäuse wurden dann in zwei Gruppen geteilt: Die Gruppe 1 wurde i.p. mit 0,5 ml Bet v 1-spezifischem IgG behandelt.

   Der Gruppe 2(Kontrollgruppe) wurden 0,5 ml IgG, das gegen ein nicht
NACHGEREICHT 
- 24 verwandtes Allergen, Phl p 5, gerichtet war, injiziert<,>Am Tag verwan[alpha]<i>e<s n>[iota]Dn<:t-- erum) von Mäusen von
37 wurde Blut aus den Schwanzvenen (Post Serum<)>vo beiden Gruppen entnommen, und die IgE-Reaktiv<l>tät auf rBet "^dl mit jenerder Ante-Seren verglichen. Zu diese. Zwec, wurden 5 ug/m rBet v 1 über Nacht auf ELISA-Platten besch<i>chtet, den - [mu]g mBSÄ/TBST (50 mM Tris, 150 M NaCl, die Platten wurden mit 3% B-.<A>/<IB><I I>".".,-.
0 5%Gew./Vol. BSA, 0,05% Vol. Vol. Tween<)>block<i>ert. D<i>e Maus er n wurden 1:10 in TBST verdünnt, über Nacht in.cabi.rt. und
- IgE wurde mit einem ^ ^ [infinity]t -^^ :IgE-Antikerper(BD Phar ingen; USA, bzw. m<i>t ^ ' ^*..

   Werten ziegen-anti-Ratten-Antiserum (Amersham, U.K.<)>nachgew<i>e I Tabelle 9 zeigt die Ergebnisse, die Mittelwerte von plifcat-Besti^ungen darsteilten, wobei die<V>ar<i>a ronen n<i>ger als 10% betrugen. Die Kolonnen 1 und 2 zeigen d<i>e gE B ndung von Mausen an rBet v 1 vor '^ ^ ^ ^ der Behandlung mit IgG. Die Prozent Inhib<i>t<i>on<d>er ganrBet v 1 in Post-Seren(dritte Kolonne, wurden w<i>e folgt be rechnet, Prozent Inhibition - 100-OD" x 100/O<>t,(TM).

   Inhibitionsrate lag im Bereich zwischen 23,4 und 54,6<%>
10).
DieTabelle 10 zeigt die Inhibition der Maus-I^-B n ^rBet yi durch rBet v 1-spezifische IgG-Antikörper D<i>e IgE-B<i>n duno an rBet v 1 ist vor (Ante-Serum; erste Kolonne, und nach ttserum,. zweite Kolonne, Behandlung mit rBet v 1-spez[iota]f<l[not]>eh IgG oder mit Phl p 5-spezifischem I,G geze<i>gt<>^ ^ Hemmung der IgE-Bindung der Post-Seren ist m der dr<i>tten ne gezeigt.
NACHGEREICHT Tabelle 10.

   Inhibition der Maus-IgE-Bindung an rBet v 1 .
Individuum OD^s(TM)
IgE-Bindung an rBet v 1 % Inhibition der
IgE-Bindung an rBet v 1
Ante-Serum Post-Serum
Gruppe 1
1 1,110 0,850
2 0,738 0,335
3 0,417 0,220
4 0,362 0,197
Gruppe 2
5 1,884 1,784
6 0,508 0,503
7 0,200 0,175
 <EMI ID=25.1> 
8 0,468 0,497
23,4 54,6 47,2 45,6
5,3 1,0 12,5 + 6,2
Beinahe keine Inhibition der IgE-Bindung an rBet v 1 wurde bei Mäusen der Gruppe 2 beobachtet, die IgG mit einer Spezifität für Phl p 5 erhalten hatten. Bei einem ähnlichen Versuch, der an gegen Phl p 5 allergischen Mäusen durchgeführt wurde, lagen die Prozent Inhibition der IgE-Bindung, die durch Behandlung mit Phl p 5-spezifischem IgG erreicht wurde, im Bereich von 7,7-58% (Tabelle 11) .
Die Tabelle 11 zeigt die Inhibition der Maus-IgE-Bindung an rPhl p 5 durch rPhl p 5-spezifische IgG-Antikörper.

   Die IgE-Bindung (OD-Mengen) an rPhl p 5 ist vor (Ante-Serum; erste Kolonne) und nach (Post-Serum; zweite Kolonne) Behandlung mit rPhl p 5spezifischem IgG oder rBet v 1-spezifischem IgG gezeigt. Die Prozent Hemmung der IgE-Bindung der Post-Seren sind in der dritten Kolonne gezeigt.
NACHGEREICI . Tabelle 11.

   Inhibition der IgE-Bindung an rPhl p 5,
Individuum OD405nm
IgE-Bindung an rPhl p 5
Ante-Serum Post-Serum
Gruppe 1
1 0,701 0,647
2 0,680 0,387
3 0,802 0,416
4 0,669 0,281
Gruppe 2 5 0,687 0,711
6 0,828 0,773
7 0,944 0,809
 <EMI ID=26.1> 
8 0,828 0,756
% Inhibition der IgE-Bindung an rPhl p 5
7,7 43,1 48,1 58,0
+3,5
6,7
14,4
8,7
Ob Allergen-spezifische IgG Antikörper Allergen-induzierte allergische Reaktionen des unmittelbaren Typs inhibieren können, wurde analysiert, indem der ss-Hexosaminidase-Freisetzungs-Test aus basophilen Leukämiezellen der Ratte ("rat basophil leukemia", RBL) verwendet wurden. RBL-2H3-Zellen (Eccleston et al., 1973) wurden in Gewebekultur-Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert (4 x 10<4>/Vertiefung) und 24 Stunden lang bei 37 [deg.]C in 5% C02gezüchtet.

   Die Zellen wurden zweimal in Tyrode's Buffer (Sigma-Aldrich, Österreich) (137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,4 mM NaH2P04, 5,6 mM D-Glucose, 12 mM NaHC03, 10 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N' -2-ethansulfonsäure (HEPES) und 0,1% Gew. /Vol. Rinderserumalbumin, pH 7,2) gewaschen. Unterschiedliche Allergen-Konzentrationen (0,5 [mu]g/ml; 0,1 [mu]g/ml; 0,02 [mu]g/ml) wurden mit Maus-Ante- bzw. -Post-Seren (1:10 in Tyrode's Buffer verdünnt) inkubiert. Die Allergen/IgE- und Allergen/IgG-Komplexe wurden den RBL-Zellen ausgesetzt und 2 Stunden lang in einer angefeuchteten Atmosphäre bei 37 [deg.]C inkubiert. Die Menge der ss-Hexosaminidase-Freisetzung wurde mittels FluoreszenzSpektroskopie (CYTO FLUOR(TM) 2350, Millipore, USA) gemessen.

   Die Ergebnisse sind als Prozent der gesamten ss-Hexosaminidase-Frei-
NACHGEREICHT Setzung ausgedrückt, die durch Zugabe von 1% Vol. /Vol. Triton X100 erreicht wurde. Fig. 2 und 3 zeigen, dass die ss-Hexosaminidase-Freisetzung von RBL-Zellen im Vergleich zu Allergen plus Ante-Serum niedriger ist, wenn die Zellen mit Allergen plus Post-Serum inkubiert werden.
NACHGEREICHT .
- 28 -
LITERATURSTELLEN:
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1998 ,-116:167-76
NACHGEREICHT

Claims (16)

e - 29 - Patentansprüche :

1. Verwendung eines Antikörpers oder eines Derivats davon zur Herstellung eines Medikaments für die passive Immunisierung eines Individuums zur Prävention und/oder Behandlung von durch Einwirkung eines Birkenpollen-Allergens verursachten allergischen Reaktionen bei diesem Individuum, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper an ein Bet v 1-Fragment bindet, das die Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder die Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) umfasst.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein IgG-Antikörper, insbesondere ein IgG-Antikörper vom Isotyp IgGl oder IgG4 ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein muriner Antikörper ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper humanisiert ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der durch ein Hybridom sezerniert ist, das unter dem Budapester Vertrag bei der DSMZ am 9. Mai 2006 hinterlegt wurde und dem die Hinterlegungsnummern DSM ACC2782, DSM ACC2783, DSM ACC2785, DSM ACC2784 und DSM ACC2786 zugeteilt wurden.

8. Antikörper oder Derivat davon, der (das) an ein Fragment von Bet v 1 bindet, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment von Bet v 1 aus den Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder den Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) besteht.

NACHGEREICHT

9. Antikörper oder Derivat davon nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein IgG-Antikörper, insbesondere ein IgG-Antikörper vom Isotyp IgGl oder IgG4, ist.

10. Antikörper oder Derivat davon nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein muriner Antikörper ist.

11. Antikörper oder Derivat davon nach Anspruch 8 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.

12. Antikörper oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper humanisiert ist.

13. Antikörper oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

14. Antikörper oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der durch ein Hybridom sezerniert ist, das unter dem Budapester Vertrag bei der DSMZ am 9. Mai 2006 hinterlegt wurde und dem die Hinterlegungsnummern DSM ACC2782, DSM ACC2783, DSM ACC2785, DSM ACC2784 und DSM ACC2786 zugeteilt wurden.

15. Vakzin-Formulierung, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 14.

16. Vakzin-Formulierung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung zur intramuskulären, subkutanen, intravenösen oder mucosalen Verabreichung ausgelegt ist.

NACHGEREICHT