WO1994010194A2 - MOLEKÜLFRAGMENTE (PEPTIDE) DER HAUPTALLERGENE DER POLLEN VON BÄUMEN DER ORDNUNG $i(FAGALES) - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to molecular fragments (peptides) of the main allergens of the pollen of trees of the order Fagales, in particular of birch, hazel and alder.
- the invention relates to peptide sequences derived from tree pollen allergens, which in the context of the pathological immune response are responsible for the excessive IgE antibody production of tree pollen allergy sufferers. These peptides can be used both within improved allergy diagnostics and in vitro and in vivo to induce immune tolerance or anergy in allergen-specific T cells.
- IgE antibodies that occupy effector cells (mast cells of the mucous membranes and connective tissue, basophilic granulocytes of the blood) and, when combined with pollen allergens, lead to the release of inflammatory substances (4).
- IgE antibodies are formed by B lymphocytes, which in cooperation with T lymphocytes via their soluble factors or cell contacts be stimulated (5).
- allergen-presenting cells monoocytes, macrophages, dendritic cells, etc.
- MHC main histocompatibility complex
- T cells play a very important role in the IgE response, since they are allergy-specific both through cell contact and through the production of cytokines. Activate activation of the B lymphocytes and initiate the excessive IgE production of the B cells or the plasma cells developing from them.
- This therapy consists of the supply of allergen extracts in the form of injections or oral application in aqueous form as drops or as a nasal spray or eye drops, in increasing doses until a maintenance dose is reached over several years.
- the effects of this immunotherapy are the achievement of a tolerance towards the allergens used, which is clinically manifested in a clear decrease in the listed symptoms of the disease or in complete absence of symptoms (8).
- immunogenic allergen preparations are currently used in this type of treatment, side effects are very common. If allergen-derived but non-anaphylactic peptides are used, higher doses could be given without risk and thus one significant improvement in hyposensitization can be achieved.
- epitopes which on the one hand have the ability to stimulate T lymphocytes and stimulate proliferation (see Table 1, in which an example of T cell clone reactivity for the individual peptides is given) , on the other hand - in high doses - to put these cells in a state of tolerance or non-reactivity (anergy) (9).
- the present invention thus relates to allergen-derived peptide sequences of Bet v 1, the main allergen of birch pollen, which have the ability to influence Bet v I-specific T cells or cell clones of birch pollen allergy sufferers in the manner mentioned above. Due to the high homology of the "major allergens" Bet v I, Cor a I and Aln g I (10), the peptides mentioned are also able in the same way T cells or cell clones of patients who have pollen or alder pollen from other trees of the Order Fagales react in the manner mentioned above (see Table 1, which gives an example of the cross-reactivity of the corresponding T cell clones with respect to the allergens Bet v I, Cor a I and Aln g I). This means that therapy with such cross-reactive peptides due to a homology of over 75% is suitable to create a tolerance in tree pollen allergy sufferers.
- PBMC Mononuclear leukocytes
- 500,000 PBMC were then cultured in 2 ml medium (24-well culture plate) in the presence of Bet v I in optimal concentration (determined in the above-mentioned preliminary test for each individual patient).
- the stimulable T cells (with Bet v I specificity) increasingly expressed interleukin-2 (IL-2) receptors on their surface and began to transform and divide into blasts. This blast transformation was supported after 5 days by the addition of IL-2. After 10-14 days, Bet v I specific cells dominated in the culture.
- IL-2 interleukin-2
- Bet v I specific cells dominated in the culture.
- These were then cloned using a "limiting dilution" method to 0.3 cells per well in the presence of 100,000 irradiated PBMC as "feeder cells” in 96-well plates.
- Growing cultures were expanded, checked for their specificity, phenotyped using flow cytometry (FACScan) and then fed to the planned investigations.
- FACScan flow cytometry
- T cell epitopes of the Bet v I molecule The binding areas of the Bet v I-specific T cell clones on the allergen were determined in proliferation experiments (3H-thymidine incorporation) by adding one peptide each. For this purpose, the reactivity to dodecapeptides that had been synthesized according to the amino acid sequence of Bet v I was tested. These peptides each spanned 10 common amino acids and overlapped with the two following in the sequence. The procedure was as follows: in the first run, 20,000 cells of the Bet v I-specific clone were incubated with autologous irradiated PBMC (antigen-presenting cells) and 1 ⁇ g peptide of the 75 peptides used per well.
- PBMC autologous irradiated PBMC
- Bet v I molecules Purified native and recombinant Bet v I molecules (2 ⁇ g / well) and values for maximum T cell stimulation by the combination of phytohemaglutinin A and IL-2 served as positive controls. Approaches were used as a negative control which were incubated in the wells only with clone cells alone or clone cells with autologous irradiated feeder cells without the addition of antigen or peptide. Those peptides which caused a strong proliferation of the clone were tested in a second attempt at proliferation in triplicate in order to ensure the specificity of the clone for the corresponding amino acid sequence.
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf T Zell Epitope eines 17 kD Proteins, das als Hauptallergen der Baumpollen der Order Fagales, insbesondere Birke, Hasel und Erle in der Natur vorkommt oder auf gentechnologischem Wege als rekombinantes Protein erzeugt wird. Aufgrund der nahen Verwandtschaft der genannten Bäume besteht eine hohe Homologie auch der jeweiligen 17 kD Proteine, die gemäß der internationalen Literatur als Bet v I, Cor a I und Aln g I bezeichnet werden und in disponierten Personen (Allergikern) Baumpollenallergien hervorrufen. Die von den Hauptallergenen (major allergens), insbesondere Bet v I abgeleiteten Peptide eignen sich für die Diagnose der Baumpollenallergie und sind imstande T Zellen der Patienten in vitro wie in vivo allergen-spezifisch zu stimulieren (Proliferation, Zytokinproduktion) oder zu blockieren bzw. zu einer Toleranz der allergenspezifischen T Zellen zu führen.
Description
Molekülfragmente (Peptide) der Hauptallergene der Pollen von Bäumen der
Ordnung FaQales
1. Gegenstand der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Molekülfragmente (Peptide) der Hauptallergene der Pollen von Bäumen der Ordnung Fagales, insbesondere von Birken, Haseln und Erlen. Im speziellen bezieht sich die Erfindung auf von Baumpollen-Allergenen abgeleitete Peptidsequenzen, die im Rahmen der pathologischen Immunantwort für die überschießende IgE Antikörperproduktion der Baumpollenallergiker verantwortlich zu machen sind. Diese Peptide können sowohl innerhalb einer verbesserten Allergiediagnostik als auch in vitro und in vivo zur Induktion einer Immuntoleranz bzw. Anergie von allergenspeziflschen T Zellen Verwendung finden.
2. Umfeld der Erfindung
Epidemiologische Studien zeigen, daß in den westlichen Industrieländern eine ständige Zunahme von Typ I Allergien (allergische Rhinitis, allergische Conjunctivitis, allergisches Asthma) zu beobachten ist (1 ,2). Insbesonders kommt es durch den Pollenflug im Frühling und Frühsommer in den Ländern der nördlichen Hemisphäre zu den genannten IgE-bedingten Erkrankungen. Proteine von Pollen der Bäume der Order Fagales, speziell von Pollen der Birke, der Hasel, der Erle, der Hainbuche, der Eiche und der Edelkastanie können im Frühjahr für das Auftreten der genannten Allergien verantwortlich gemacht werden (3). Wenigstens 30-40% der Pollenallergien sind durch diese Pollenallergene hervorgerufen. Diese Allergien werden durch IgE Antikörper ausgelöst, die Effektorzellen (Mastzellen der Schleimhäute und des Bindegewebes, basophile Granulozyten des Blutes) besetzen und bei Verbindung mit Pollenallergen zu einer Freisetzung von Entzündungsstoffen führen (4). Die Bildung solcher IgE Antikörper erfolgt durch B Lymphozyten, die in Kooperation mit T Lymphozyten über deren lösliche Faktoren bzw. Zellkontakte
stimuliert werden (5). Am Beginn dieser Immunantwort stehen allergenpräsentierende Zellen (Monozyten, Makrophagen, Dendritenzellen etc.), die die Allergene aufnehmen, intrazellulär verarbeiten, um sie dann in Form von hochimmunogenen Peptiden zusammen mit Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) T Lymphozyten darzubieten (6). Demnach spielen T Zellen innerhalb der IgE Antwort eine ganz bedeutende Rolle, da sie in allergenspezifischer Weise sowohl durch Zellkontakt als auch durch die Produktion von Zytokinen zur . Aktivierung der B Lymphozyten führen und die überschießende IgE Produktion der B Zellen, bzw. der sich aus diesen entwickelnden Plasmazellen einleiten.
Unter Verwendung von Pollenextrakten und gereinigten Allergenen sind in den letzten Jahren zahlreiche Teste für die Diagnose IgE bedingter Allergien entwickelt worden. Diese Testsysteme umfassen RIA (Radioimmunassay), IRMA (Immunradiometrische Assay), ELISA (Enzyme-linked immunosorbent Assay) LIA (luminescence immunoassay), Immunoblots, Histamine-release-assay, T Zeil Proliferationsassay und andere. Durch den Einsatz von allergenabgeleiteten gentechnologisch hergestellten oder synthetisierten Peptiden, die T Zeil Erkennungsarealen entsprechen, kann in Zukunft sicherlich eine Verbesserung der genannten Testsysteme erreicht werden. Seit Jahrzehnten werden IgE bedingte Allergien, insbesondere Pollenallergien durch die sogenannte Hyposensibilisierung therapiert (7). Diese Therapie besteht in der Zufuhr von Allergenextrakten in Form von Injektionen oder peroraler Applikation in wässriger Form als Tropfen oder als Nasenspray bzw. Augentropfen, in steigender Dosierung bis zur Erreichung einer Erhaltungsdosis über mehrer Jahre. Effekte dieser Immuntherapie sind das Erreichen einer Toleranz gegenüber den eingesetzten Allergenen, was sich klinisch in einer deutlichen Abnahme der angeführten Krankheitssymptome bzw. in einer vollkommenen Symptomlosigkeit äußert (8). Da derzeit bei dieser Art der Behandlung immunogene Allergenpräparationen eingesetzt werden, sind Nebenwirkungen sehr häufig zu beobachten. Bei Einsatz von allergenabgeleiteten, aber nichtanaphylaktisch wirkenden Peptiden, könnten risikolos höhere Dosen gegeben und damit eine
wesentliche Verbesserung der Hyposensibilisierung erreicht werden. Weiters bestehen aufgrund unserer Untersuchungen deutliche Hinweise für spezielle T Zeil Bindungsareale auf Allergenen, sogenannte Epitope, die einerseits die Fähigkeit besitzen T Lymphozyten zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen (siehe Tabelle 1, in welcher ein Beispiel für T Zellklonreaktivität für die einzelnen Peptide angeführt ist), andererseits - in hohen Dosen - diese Zellen auch in einen Zustand der Toleranz bzw. Nicht-Reaktivität (Anergie) zu versetzen (9).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit allergenabgeleitete Peptidsequenzen von Bet v 1, dem Hauptallergen von Birkenpollen, welche die Fähigkeit haben Bet v I spezifische T Zellen bzw. Zellklone von Birkenpollen-Allergikern in der oben genannten Art zu beeinflußen. Aufgrund der hohen Homologie der "major allergens" Bet v I, Cor a I und Aln g I (10) sind die genannten Peptide weiters in der Lage in gleicher Weise T Zellen bzw. Zellklone von Patienten, die auf Hasel- oder Erlenpollen oder Pollen von anderen Bäumen der Order Fagales reagieren, in der oben genannten Weise zu beeinflußen (siehe Tabelle 1 , welche ein Beispiel für die Kreuzreaktivität der entsprechenden T Zellklone bezüglich der Allergene Bet v I, Cor a I und Aln g I wiedergibt). Das bedeutet, daß eine Therapie mit solchen, aufgrund einer Homologie über 75%, kreuzreaktiven Peptiden geeignet ist eine Toleranz in Baumpollenallergikern zu erzeugen.
Tabelle 1 : Kreuzreaktivität Bet v I-spezifischer Zellklone mit Cor a I und Aln g 1
3. Beispiele
3 1. Primärantwort der T-Lvmphozvten von Birkenpollenallergikern:
Blutabnahme erfolgte bei atopischen Patienten (typische Anamnese für eine Birkenpollenallergie, positiver Hauttest mit Birkenpollenallergenen, RAST-Klasse 3-5 mit Birkenpollenallergenen). Die Gewinnung von mononukleären Leukozyten (PBMC) aus heparinisiertem Blut erfogte mittels Gradientenzentrifugation (Ficoll). Lymphozytenaktivierung wurde fogendermaßen durchgeführt: Ansatz von 100.000 Zellen/Napf in 96-näpfigen Kulturplatten mit verschiedenen Bet v I Konzentrationen (zwischen 50 und 5 ug/ml). 5 Tage später Zugabe von 3H-Thymidin für weitere 12 Stunden, dann Auswertung der Lymphozytentransformation.
3.2. Allgenspezifische T 7ellinien:
500.000 PBMC wurden anschließend in 2 ml Medium (24-näpfige Kulturplatte) in Anwesenheit von Bet v I in optimaler Konzentration (im obengenannten Vorversuch bei jedem einzelnen Patienten ermittelt) kultiviert. Die stimulierbaren T-Zellen (mit Bet v I Spezifität) exprimierten vermehrt Interleukin-2 (IL-2 ) Rezeptoren an ihrer Oberfläche und begannen sich zu Blasten zu transformieren und zu teilen. Diese Blastentransformation wurde nach 5 Tagen durch die Zugabe von IL-2 unterstützt. Nach 10-14 Tagen dominierten Bet v I spezifische Zellen in der Kultur. Diese wurden dann nach einem "limiting dilution" Verfahren auf 0,3 Zellen pro Napf in Anwesenheit von 100.000 bestrahlten PBMC als "feeder-Zellen" in 96-näpfιgen Platten auskloniert. Wachsende Kulturen wurden expandiert, auf ihre Spezifität überprüft, mittels Durchflußzytometrie (FACScan) phänotypisiert und dann den geplanten Untersuchungen zugeführt.
3.3. Charakterisierung von T Zellepitopen des Bet v I Moleküls:
Die Bindungsareale der Bet v I-spezifischen T Zellklone am Allergen wurden in Proliferationsversuchen (3H-ThymidinEinbau) durch die Zugabe von jeweils einem Peptid ermittelt. Zu diesem Zweck wurde die Reaktivität auf Dodekapeptide getestet, die entsprechend der Aminosäurensequenz von Bet v I synthetisiert worden waren. Diese Peptide überspannten jeweils 10 gemeinsame Aminosäuren und überlappten mit den zwei in der Sequenz folgenden. Im einzelnen wurde so vorgegangen: im ersten Durchgang wurden jeweils 20.000 Zellen des Bet v I spezifischen Klons mit autologen bestrahlten PBMC (Antigen-präsentierende Zellen) und jeweils 1 μg Peptid der eingesetzten 75 Peptide pro Napf inkubiert. Als Positivkontrolle dienten gereinigte native und rekombinante Bet v I Moleküle (2 μg/Napf) sowie Werte einer maximalen T Zellstimulation durch die Kombination von Phytohämaglutinin A und IL-2. Als Negativkontrolle wurden Ansätze verwendet, die in den Näpfen nur Klonzellen allein bzw. Klonzellen mit autologen bestrahlten feeder Zellen ohne Zugabe von Antigen bzw. Peptid inkubiert worden waren. Jene Peptide, die eine starke Proliferation des Klons hervorriefen, wurden in einem zweiten Proliferationsversuch in dreifach-Ansätzen getestet, um die Spezifität des Klons für die entsprechende Aminosäuresequenz zu sichern.
Auf diese Weise wurden 30 Bet v I-speziflsche T Lymphozytenklone von 9 Patienten gewonnen, das heißt, daß von jedem Patienten mehrere Klone auf Peptidreaktivität getestet werden konnten. Folgende Peptide führten zu einer Reaktivität der als repräsentative Beispiele genannten T Zellklone (siehe Tabelle 2):
Aminosäuren
Position Bezeichnung in der Bet v I der Klone
Sequenz:
GVFNYETETTSVIPAA 1 - 16 HC26
TTSVIPAARLFKAFIL 9-26 SS6
DNLFPKVAPQAISSVE 29-44 SAZ53/III
PQAISSVENIEGNG 35-48 HC3/III
GFPFKYVKDRVDEVDHTN 61 -76 DF16
DHTNFKYNYSVIEGGP 75-90 HC5
YSVIEGGPIGDTLEKI 84-97 FS5
DTLEKISNEIKIVATPDG 93-1 10 HC2/III
GSILKISNKYHTKGDH 111-126 AS2 7
ETLLRAVESYLLAHSDAYN 141-159 BE15
Tabelle 2: Reaktivität Bet v I-spezifischer Lymphozytenklone. Je ein repräsentatives Experiment mit einem Klon pro Epitop ist angeführt
Werte entsprechen cpm (counts per minute) x 1000 ND: Experiment wurde nicht durchgeführt
Internationaler Ein-Buchstaben-Kode für Aminosäuren: A: Alanin
C: Cystein
D: Asparaginsäure
E: Glutaminsäure
F: Phenylalanin G: Glycin
H: Histidin
I: Isoleucin
K: Lysin
L: Leucin M: Methionin
N: Asparagin
P: Prolin
Q: Glutamin
R: Arginin S: Serin
T: Threonin
V: Valin
W: Tryptophan
Y: Tyrosin
4. Literatur
1. Wüthrich B. Allergy and Clin Immunol News 3, 41 (1991). 2. Miyamoto, T., Advances in Allergology and Clinical Immunology.
Eds. Ph Godard, J. Bousquet, F.B. Michel. EAACI Congress Paris, 10-15 May 1992, The Parthenon Publishing Group, Casterton Hall U.K., New Jersey, U.S.A. p. 343.
3. Jarolim E., Rumpold, H. , Endler, A.T., et al. Allergy 44, 385 (1989). 4. Roitt, I., Essential Immunology. 6th Edition 1991.
5. Parronchi, P. , Macchia, D., Piccini, M.P. , et al. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 88, 4538 (1991). β.Schwartz, R. H. Ann. Rev. Immunol. 3, 237 (1985).
7. Bousquet, J., Becker W.M., Hejjaoudi, A., et al. J Allergy Clin Immunol 88, 43 (1991).
8. Birkner, T., Rumpold H. , Jarolim, E., et al. Allergy 45, 418 (1990).
9. Rothbard .B., Gefter, M.L., Ann Rev Immunol 9, 527 (1991).
10. Valenta, R., Breiteneder H., Pettenburger K., et al. J Allergy Clin Immunol 87,677 (1991).
Claims
1. Molekülfragmente (Peptide) der Hauptallergene der Pollen von Bäumen der
Ordnung Fagales insbesondere von Birken, Haseln und Erlen, dadurch gekennzeichnet, daß sie T Zellklone oder T Zellinien, die von gegen Pollen der Ordnung Fagales allergischen Patienten stammen, allergenspezifisch stimulieren oder blockieren, das heißt zur Toleranz (Anergie) dieser T Zellen führen, und wenigstens eines der aus der folgenden Gruppe ausgewählten Peptide: GVFNYETETTSVIPAA TTSVIPAARLFKAFIL DNLFPKVAPQAISSVE PQAISSVENIEGNG GFPFKYVKDRVDEVDHTN
DHTNFKYNYSVIEGGP YSVIEGGPIGDTLEKI DTLEKISNEIKIVATPDG GSILKISNKYHTKGDH ETLLRAVESYLLAHSDAYN aufweisen, bzw. Peptide, die zu den genannten Peptiden kreuzreaktive Eigenschaften zeigen.
2. Molekül fragmente nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie zu den angeführten Molekülfragmenten eine hohe Homologie, insbesondere über 75% besitzen.
3. Molekülfragmente nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie zu den angeführten Peptiden eine hohe Homologie, insbesondere über 75% , besitzen, in vitro und in vivo zu einer T Zeil Toleranz führen können und sich daher zur Diagnostik und Therapie allergischer Erkrankungen eignen.
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