AT403166B - Rekombinante dna moleküle, die für polypeptide kodieren, die die antigenität der allergene clah8 und clah12 besitzen - Google Patents

Description

AT 403 166 B

Die vorgelegte Patentanmeldung beeinhaltet die vollständigen cDNA Sequenzen Clah8 und Clah12 von Cladosporium herbarum sowie die von diesen Primärsequenzen abgeleiteten Peptidsequenzen, die bei Pilzallergikern zu einer pathologischen Immunantwort mit einem Überschießen von IgE-Antikörpern führen. Rekombinante Allergene bzw. immunogen wirkende Teilpeptide können neben einer verbesserten Diagnostik auch zu einer in vivo oder in vitro Induktion einer Immuntoleranz bzw. Anergie von T-Lymphozyten Verwendung finden.

Immunologische Mechanismen, die zur Abwehr von Antigenen aus der Umwelt im Laufe der Evolution etabliert wurden, können normalerweise zwischen Selbst und nicht-Selbst unterscheiden. Wie es jedoch bei komplexen Kontrollmechanismen oft der Fall ist, unterliegt auch das Immunsystem einer gewissen Fehlerhäufigkeit, und bei Versagen erfolgt ein Angriff auf eigenes Gewebe. Es gibt 4 prinzipielle Situationen, in denen der Körper von seinem eigenen Immunsystem angegriffen wird. Die Situationen unterscheiden sich in der Herkunft der Antigene, die den Angriff auslöse und in dessen Mechanismus und deren Manifestation. Die Antwort kann durch Umweltantigene, durch ein infektiöses Agens (aber auch durch harmlose Substanzen), durch Gewebsantigene, die von einer anderen Person stammen und durch Antigene des Individuums selbst ausgelöst werden. Die Reaktion bezeichnet man als "allergisch".

Ein prinzipielles Merkmal bei Allergien ist, daß eine applizierte Substanz statt einer Protektion eine erhöhte Sensibilität oder Hypersensibilität induziert Einige dieser Substanzen sind Toxine, andere harmlose Proteine.

Heute unterscheidet man 4 Typen der Hypersensibilität: Typ l-IV. Typ l-lll werden durch Antikörper vermittelt, während Typ IV durch T-Lymphozyten vermittelt wird.

Die Typ I Hypersensibilität wird auch als Hypersensibilität vom Soforttyp bezeichnet, weil ihre Wirkung innerhalb von Stunden nach Antigenkontakt auftritt. In der initialen Sensibilisierungsphase dieses Mechanismus gelangt Antigen (Allergen) in den Körper, wird von antigen-präsentierenden allen (APC) aufgenommen und prozessiert. Das prozessierte Antigen wird anschließend zusammen mit MHC II an der Oberfläche der APC den T-Helferzellen (Th) präsentiert. Die Th produzieren Lymphokine, die den B-Lymphozyten helfen, zu antikörper-produzierenden Plasmazellen zu differenzieren. Die B-Lymphozyten erkennen das Allergen über ihre Oberflächenrezeptoren und sezernieren IgE. Sie binden an Rezeptoren von Mastzellen und Basophilen. Die initiale Bindung hat jedoch keinen offensichtlichen Effekt auf die Zellen.

Wenn jedoch das Allergen erneut in den Körper kommt, beginnen die Schwierigkeiten. Das multivalente Allergen bindet an IgE und über andere Epitope an weitere IgE-Moleküle, so daß es zu einer Brückenbildung (Kreuzvernetzung) zwischen den IgE-Molekülen kommt. Die Aggregation immobilisiert den Rezeptor und induziert eine Signaltransduktionskette, die schließlich zur Degranulation der Mastzellen führt. Die Degranulation führt zur Produktion von Prostaglandinen und Leukotrienen. Die freigesetzten Substanzen sind vor allem Histamin und Heparin. Histamin stimuliert glatte Muskelzellen, Gefäßendothelzellen und Nervenendigungen. Heparin übt eine inhibitorische Wirkung auf Thrombozyten aus. Die allergische Antwort wird sowohl in der Akut- als auch in der Spätphase vom Nervensystem beeinflußt. Die Neurotransmitter interagieren mit den korrespondierenden Rezeptoren auf den Effektorzellen und aktivieren diese entweder über cAMP oder über cGMP. Die Zielzellen der Neurotransmitter sind wiederum die Mastzellen, die glatte Muskulatur und die epithelialen und sekretorischen Zellen.

Natur des Defektes

Nicht alle Personen, die dem Allergen ausgesetzt sind, entwickeln eine Allergie. Wieso? Man denkt, daß die primäre Ursache des allergischen Zustandes ein Defekt im Immunsystem ist.

Die neo- und postnatalen Serum-lmmunglobulin-spiegel, besonders IgA, sind sehr niedrig. Allergiker haben oft weniger T-Lymphozyten (CD8 + ). Viele Allergiker hatten bei der Geburt einen erhöhten IgE-Spiegel. Ihre Basophilen degranulieren leichter. Manche haben auch einen Defekt in den Suppressor-T-Zellen (Ts). Der IgE-Spiegel steigt, wenn Ts abnimmt.

Ein starkes Argument gegen einen immunologischen Defekt liegt darin, daß der asthmatische Zustand auch oft ohne Beteiligung des Allergens ausgelöst werden kann. Die Befürworter argumentieren, daß die primäre Ursache der Allergien eher physiologisch als immunologisch ist. Vielleicht sind die Nervenendigungen in der glatten Muskulatur, den sekretorischen Drüsen und den Blutgefäßen der Zielorgane bei allergische Patienten genetisch hyperaktiv.

Anaphylaxie

Sie wird durch charakteristische Veränderungen nach einer Zweitexposition mit dem gleichen Antigen ausgelöst. Die für eine Sensibilisierung erforderliche Antigenmenge schwankt erheblich. Eine zu geringe 2

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Dosis bewirkt keine Antwort, und eine zu große Dosis kann in einer Protektion statt in einer Sensibilisierung enden. Ein desensibilisierter Zustand kann erzeugt werden, wenn man einen Schock-Zustand überstanden hat. Der Spiegel von reaktivem IgE kehrt aber nach wenigen Wochen wieder zurück.

Behandlung allergischer Erkrankungen

Die beste Behandlung ist die Allergenvermeidung. Da die Allergenvermeidung ja kaum hundertprozentig zu erreichen ist, liegen weitere Möglichkeiten im Einsatz von Antihistaminika. Probiert wird heute auch eine sogenannte Immuntherapie. Dabei wird eine Unfähigkeit, auf spezifische Allergene zu antworten, induziert. Zu diesem Zweck wird der Patient wiederholt mit einer Allergenmixtur immunisiert. Man beginnt mit niedrigen Dosen und erhöht langsam, bis der Patient nicht mehr darauf reagiert. Erfolge erzielt man mit der Immuntherapie bei Heuschnupfen, Insektenstichen und allergischem Asthma. Die Behandlung scheint eine Form der partiellen immunologischen Toleranz zu induzieren. Die Desensibilisierung des Patienten ist aber niemals absolut.

Bis zum heutigen Zeitpunkt ist jedoch weder die Diagnose noch die Therapie von allergischen Erkrankungen zufriedenstellend. Die molekulare Charakterisierung der Hauptallergene von Cladosporium herbarum mittels cDNA-Klonierung, Sequenzierung, Sequenzvergleich des allergenen Proteins mit Proteindatenbanken, sowie die Produktion von rekombinanten Allergenen wird mehr Aufschluß über die in vivo Funktion der Proteine geben, die die falschen Immunreaktionen auslösen. Diese Informationen sind aus folgenden Gründen interessant: 1) Hochreine rekombinante Allergene können für eine sorgfältigere Diagnose, besser als es heute mit Rohextrakten möglich ist, herangezogen werden. 2) Die Sequenz der Allergene wird dabei helfen, tolerogene Peptide zu definieren und eventuell auch den "IgE-Class-switch”, der bei der Immunisierung mit dem Allergen passiert, verstehen zu lernen.

Seit Jahrzehnten werden IgE-bedingte Allergien, so z.B. auch Allergien gegen Pilzsporen, durch Hyposensibilisierung therapiert (Bousquet et al. 1991). Diese Therapie besteht in der Zufuhr von Allergenextrakten, in Form von Injektionen oder peroraler Applikation in wässriger Form als Tropfen in steigender Dosierung, bis eine Erhaltungsdosis über mehrere Jahre erreicht ist. Resultat dieser Therapie ist das Erreichen einer Toleranz gegenüber den eingesetzten Allergenen, was sich in einer Abnahme der Krankheitssymptome äußert (Birkner et al. 1990). Das Problem bei dieser Art der Behandlung liegt in der Vielzahl der dadurch auftretenden Nebenwirkungen. Bei der Hyposensibilisierungstherapie sind Fälle von anaphylaktischem Schock während der Behandlung aufgetreten. Das Problem hierbei liegt in der schweren Standardi-sierbarkeit der Pilzprotein-Isoiate. Bei einem Einsatz von Allergenabgeleiteten, aber nicht anaphylaktischwirkenden Peptiden, könnten risikolos höhere Dosen verabreicht werde, und damit kann eine wesentliche Verbesserung der Hyposensibilisierung erreicht werden.

Aus der Literatur weiß man heute, daß Cladosporium herbarum (bzw. die Sporen von Cladosporium herbarum), mit wenigen Ausnahmen, der am häufigsten vorkommende Pilz in der Luft ist (Gravesen 1979). Die sehr trockenen Sporen von Cladosporium herbarum können durch den Wind relativ leicht vertragen werden. In belasteten Zeiten ist es nicht selten, daß man an die 35000 Konidien pro m3 Luft findet. Durch die leichte Verschleppung der Sporen ist an solchen Spitzentagen auch in geschlossenen Räumen eine erhöhte Sporenbelastung meßbar. Die Hauptbelastungszeit liegt zwischen Frühling und Frühherbst. Diese hohe Konidienzahlen lassen sich damit erklären, daß Cladosporium herbarum wegen seiner "genügsamen” Lebensweise nahezu überall zu finden ist. Bevorzugte Lebensräume sind jedoch absterbende Pflanzen, verschiedene Bodentypen, aber auch diverseste Genußmitteln. Nicht gereinigte Kühlschränke, Fensterrahmen, Strohdächer und verschiedene Textilien gehören zu den weiteren Stand- bzw. Lebensorten dieses Pilzes.

Aus diesen Gründen (ein Kontakt mit Cladosporium herbarum Sporen kann praktisch niemals gänzlich ausgeschlossen werden) ist es nicht verwunderlich, daß Cladosporium herbarum zum Gegenstand intensiver Forschung auf dem Allergiesektor geworden ist. Heute liegen epidemiologische Studien praktisch nur aus dem Ausland vor. So zeigen zB. in Finnland 8% von asthmatischen Kindern positive Reaktion auf Cladosporiumkontakt (Foucard et al. 1984).

Die Beschreibung der allergenen Proteine von Cladosporium herbarum erfolgte mittels CIE/CRIE und anderen Techniken. Die vermutete Zahl von Cladosporium herbarum Antigenen liegt bei ca. 60 (Aukrust 1979, 1980). Das in der Literatur beschriebene Hauptallergen Clahl I wurde aus Rohextrakten aufgereinigt. Das Molekulargewicht liegt bei etwa l3kD. Klonierungen von diversen Cladosporium herbarum Allergenen sind bereits (Achatz et al. 1994) vorgenommen worden. Der Vorteil von gentechnologisch hergestellten allergenen Proteinen bzw. deren Teilpeptiden (Voraussetzung dafür ist jedoch eine immunologisch vergleichbare Reaktivität - konnte bei Betula verucosa (Ferreira et al. 1993) und anderen Aflegenen schon 3

AT 403 166 B gezeigt werden) liegt: a) In der Verbesserung der Testsysteme wie RIA (Radioimmunoassay), IRMA (Immunradiometrischer Assay), ELISA (Enzyme-Iinked immunosorbent Assay), LIA (luminescense immunoassay), Immunblots, Histamine-release-assay, T-Zell Proliferationsassay und viele mehr. b) In der Verbesserung der Hyposensibilisierungstherapie: Diese Therapie besteht in der Zufuhr von Allergenextrakten, in Form von Injektionen oder peroraler Applikation in wässriger Form als Tropfen in steigender Dosierung, bis eine Erhaltungsdosis über mehrere Jahre erreicht ist. Resultat dieser Therapie ist das Erreichen einer Toleranz gegenüber den eingesetzten Allergenen, was sich in einer Abnahme der Krankheitssymptome äußert (Birkner et al. 1990). Das Problem bei dieser Art der Behandlung liegt in der Vielzahl der dadurch auftretenden Nebenwirkungen. Bei der Hyposensibilisierungstherapie sind Fälle von anaphylaktischem Schock während der Behandlung aufgetreten. Das Problem hierbei liegt in der schweren Standartisierbarkeit der Pilzprotein-Isolate. Bei einem Einsatz eines von einem Allergen abgeleiteten, aber nicht anaphylaktisch wirkenden Peptids könnten risikolos höhere Dosen verabreicht werden, und damit kann eine wesentliche Verbesserung der Hyposensibilisierung erreicht werden. c) Mit diesen Untersuchungen können aber auch spezifische T- und B-Zell-Epitope definiert werden. Solche Peptide besitzen die Fähigkeit, zB. T-Lymphozyten zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen, aber die Zellen (bei genau definierter Dosis) auch in einen Zustand der Toleranz bzw. Nicht-Reaktivität (Anergie) zu versetzen (Rothbard et al. 1991).

Beispiele: 1. Beschreibung der allergenen Proteine von Cladosporium herbarum mittels Western-Blotting Für die Klonierung der vorliegenden Allergene von Cladosporium herbarum standen 128 Patientensera zur Verfügung. Um die Reaktivität der Patienten mit Pilzproteinextrakt zu testen, wurde Cladosporium herbarum (Sammlung Prof. Windisch Berlin Nummer: 28-0203) auf festem Medium (2% Glukose, 2% Pepton, 1% Hefeextrakt) gezüchtet. Für die Proteinextraktion wurde die Pilzmatte nach 5 Tagen Wachstum bei 23‘C abgezogen und mit flüssigem Stickstoff aufgebrochen. Die Auftrennung der extrahierten Proteine erfolgte auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel, das anschließend geblottet, mit Patientenserum inkubiert und mit 125 l-markiertem anti human IgE detektiert wurde. In Prozentzahlen ausgedrückt reagierten die Patienten auf die allergenen Proteine wie folgt:

Clah8 9% Clah12 22%

Wie aus diesen Zahlen ersichtlich ist, handelt es sich bei beiden hier beschriebenen Allergenen um Nebenallergene. 2. Konstruktion der cDNA Expressionsbank

Gesamt RNA wurde nach der sauren Guanidium-Phenol-Extraktionsmethode aus selbst gezüchtetem Pilzmaterial gewonnen. poly(A)+ Anreicherung erfolgte mit Oligo(dT) Cellulose der Firma Böhringer. Die cDNA Synthese (1. und 2. Strang) wurde durchgeführt, wie im Manual des Lambda ZAP-Systems der Firma Stratagene beschrieben. Die cDNA wurde anschließend (3'- seitig) mit EcoRI und (5'-seitig) mit Xhol Linkern versehen, in vorverdaute Lambda-ZAP-Arme ligiert und verpackt. Der Titer der Primärbank betrug 900000 Klone. 3. Screening der cDNA Genbank mit Patientensera, in vivo Excision, Sequenzierung

Das Screenen der Expressionsbank erfolgte mittels Inkubation der "gelifteten" Phagenplaques mit dem Serum eines Patienten, von dem man durch das Westernblotting wußte, daß er das Spektrum der detektierten Antigene abdeckt. Die Detektion erfolgte wieder mit anti human IgE RAST Antikörpern der Firma Pharmacia. Nach Sekundär- und Tertiärscreening blieben 7 positive Klone übrig. Sie konnten in zwei Gruppen eingeteilt werden. Je ein Klon aus der entsprechenden Gruppe wurde nach der Sangermethode (Sänger 1977) sequenziert. 4

AT 403 166 B 4. Expression der Clah8 und Clahl2 cDNAs als j3-Galaktosidasefusionsprotein

Die jeweiligen rekombinanten Plasmide wurden in den E.coli Stamm XL1-Blue transformiert und mit IPTG (isopropy!-/?-D-thiogalactopyranosid) induziert. Der E.coli Gesamtproteinextrakt wurde anschließend elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulose geblottet. Das Fusionsprotein wurde mittels Serum IgE von Pilzailergikern und einem jodmarkiertem Kaninchen anti human IgE Antikörper (Pharmacia, Uppsala Schweden) detektiert.

Der /3-Galaktosidaseanteil des Fusionsproteins beträgt 36 Aminosäuren, was einem Molekulargewicht von 3800 Dalton gleichkommt. Unter Berücksichtigung dieser "Vergrößerung" zeigt sich genau, daß die rekombinanten Fusionsproteine von Clah8 und Clah12 ebenfalls IgE-Bindung zeigen. 5. Bestimmung von B- und T-Zell Epitopen bei den rekombinanten Allergenen

Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Allergene bietet die Voraussetzung für die Vorhersage von B-und T-Zellepitopen mittels geeigneter Computerprogramme. Mit diesen Untersuchungen können spezifische T- und B-Zell-Epitope definiert werden, die die Fähigkeit besitzen, zB. T-Lymphozyten zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen, aber die Zellen (bei genau definierter Dosis) auch in einen Zustand der Toleranz bzw. Nicht-Reaktivität (Anergie) zu versetzen (Rothbard et al. 1991). Die bestimmten Epitope werden jeweils bei der Beschreibung des rekombinanten Proteins in eigenen Figuren angeführt.

Die Suche nach B-Zellepitopen wurde mit Hilfe des GCG-Programmes (Genetics Computer Group) durchgeführt. Die Bestimmung beruht auf einer Abwägung der Parameter Hydrophilität (Kyte-Doolittle), Sekundärstruktur (Chou-Fasman), Oberflächenlokalisation (Robson-Garnier) und Flexibilität, wodurch die Antigenität von Teilpeptiden errechnet wird.

Das Prinzip der T-Zellepitop-Voraussage erfolgte im Prinzip nach dem Algorithmus von Margalit et al. (1987). Das Prinzip besteht in der Suche nach amphipathischen Helices laut Primärsequenz des zu bestimmenden Proteins, flankiert von hydrophilen Bereichen. Der berechnete Score muß für relevante T-Zellepitope größer als 10 sein. Bei MHC II assoziierten Peptiden kann kein Konsensus, wederder Sequenz noch der Länge des Peptids nach, wie bei HLA-A2 (human leucocyte antigen) (MHC I) assoziierten Peptiden definiert werden. Bei HLA-A2 assoziierten Peptiden beträgt die Länge des Peptids 10 Aminosäuren, wobei die 2. Aminosäure ein Tyrosin und die letzte Aminosäure ein Leucin darstellt (Rammensee et al. 1993). Die berechneten Epitope werden bei der Beschreibung der einzelnen allergenen Sequenzen getrennt angeführt. 5

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Sequenzprotokoll

Im folgenden Kapitel werden nun die cDNA Sequenzen und die mit ihnen durchgeführten Analysen der Reihe nach angeführt. Die Computerauswertung der nachfolgenden Sequenzen wurden auf einer Ultrix-DEC 5000 Workstation unter Zuhilfename des GCG-Softwarepaketes (=Wisconsin Paket: die Algorithmen dieses Paketes wurden von der “University of Wisconsin” entwickelt) durchgeführt. A: Clahl2

Die folgende Sequenz 1 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz von Clahl2 und der von ihr abgeleiteten Aminosäuresequenz. Der offene Leserahmen umfaßt 333bp bzw. 111 Aminosäuren. Das berechnete Molekulargewicht bertägt 11013 Dalton und entspricht somit dem 1 lkD großen allergenen Protein, das im Westemblot von 22% der Patienten erkannt wird.

Sequenz 1: ciahii 11013 oaiton (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:l (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 333 Basenpaare /111 Aminosäurereste (B) ART: Nukleinsäure / Protein (C) STRANGFORM: ds (D) TOPOLOGIE: linear (ü) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (iii) HYPOTHETISCH: nein (iv) ANTISENSE: nein (v) ART DES FRAGMENTS: Gesamtsequenz (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Cladosporium herbarum (Q ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen DNA sequence 333 b.p. ATCTCTGCCGCC ... CTCTTCCACTAA linear

1 / 1 31 / 11 ATC TCT GCC CCC GAG CTC CCT TCC TCC TAC GCC GCT CTC ATC CTG GCC GAT GAG GGT CTC Met Ser Ala Ala Glu Leu Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Leu Ile Leu Ala Asp Glu Gly Leu 61 / 21 91 / 31 GAG ATC ACT GCC GAC AAG CTC CAG Gct CTC ATC TCC GCC GCC AAG GTT CCT GAG ATC GAG Glu Ile Thr Ala Asp Lys Leu Gin Ala Leu Ile Ser Ala Ala Lys Val Pro Glu Ile Glu 121 / 41 151 / 51 CCC ATC lug ACC TCT CTC TTC GCC AAG GCT CTC GAG GGC AAG GAC GTC AAG GAC CTC CTC Pro Ile Trp Thr Ser Leu Phe Ala T-ys Ala Leu Glu Gly Lys Asp Val Lys Asp Leu Leu 181 / 61 211 / 71 CTG AAC GTT GGC TCT GGT GGT GGT GCC GCC CCC GCC GCC GGT GGT GCT GCC GCT GGT GGT 6

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Leu Asn Val Gly Ser Cly Gly Gly Ala Ala Pro Ala > *-» 01 >. H o Gly Ala Ala Ala Gly Gly 241 / 81 271 / 91 cce GCT ccc GTC CTG GAC GCC CCC GCC GAG GAG AAG GCT GAC GAG GAG AAG GAG GAG TCC Ala Ala Ala Val Leu Asp Ala Pro Ala Glu Glu Lys Ala Glu Glu Glu Lys Glu Glu Ser 301 / 101 331 / 111 O > o GAC GAC ATG GGC TTC GGT CTC TTC GAC Asp Asp Asp Met Gly Phe Cly Leu Phe Asp

Homologiesuchen in der SWISSPROT-Proteindatenbank ergaben hier Homologien zu ribosomalen Proteinen. Die beste Übereinstimmung findet man mit dem Protein PI von Sacharomyces cerevisiae, das zu einer Gruppe von sauren ribosomalen Phosphoproteinen gehört. Das allergene Protein Clahl2 ist nicht nur wegen seiner Eigenschaft als Allergen von Cladosporium herbarum interessant. Ribosomale Proteine, hier im speziellen die humanen ribosomalen Proteine PI und P2, sind in der Literatur als Autoantigene beschrieben worden (Francoeur et al. 1985, Rieh et al. 1987 , Hines et el. 1991). 20% der Patienten mit Lupus erythematosus besitzen Autoantikörper (anti-rRNP) gegen Komponenten der Ribosomen, im speziellen Autoantikörper gegen die ribosomalen Proteine PO (38kD), PI (16kD) und P2 (15kD). Die humanen Autoantikörper kreuzreagieren mit ähnlichen Proteinen, was heißt, daß Epitope erkannt werden, die in der Evolution stark konserviert wurden. Die Basis der immunologischen Kreuzreaktivität bildet die 17 Aminosäurereste lange carboxyterminale Region KEESEESD(D/E)DMGFGLFD. Ob eine in der Kindheit und lugend erfolgte Sensibilisierung durch Clahl2 mit einer im Erwachsenenalter auftretenden Autoimmunkrankheit korreliert, bedarf einer genauen Prüfung. Applikationen von ribosomalen Proteinen konnten allerdings in Mäusen keine Autoimmunkrankheit erzeugen (Hines et al. 1991). Andere ribosomale Proteine (Clahl 1 und Altai 1) wurden ebenfalls schon als Allergene identifiziert (Achatz et al. 1994).

Die gezeigten B-Zellepitope in der nächsten Sequenz 2 sind unter Berücksichtigung von Sekundärstruktur, Oberflächenlage, Hydrophilität, Flexibilität etc. berechnet worden. 7

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Sequenz 2: Clahl2: B-Zellepitope (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:2 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS : Peptide (in) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Cladosporium herbaram (C) ENTWICKLUNGS STADIUM: Sporen und vegetative Hyphen

Leu Ala Asp Glu Gly Leu Glu Ile Thr Ala Asp (15-25) Ala Leu Glu Gly Lys As? Val Lys Asp (50- -58’ Ala Pro Ala Glu Glu Lys Ala Glu Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Asp Asp Met Gly (87-105

Sequenz 3: Predicted amphipathatic segments = T-Zellepitope

Flags Midpoints Angles Score K 28:49 80:135 45-3 qalisaakvpeiepiwtslfak P 81:86 90:110 11.0 AAAVLE (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:3 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (in) HYPOTHETISCH: nein 8

AT 403 166 B (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Cladosporium herbarum (Q ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen

Gin Ala Leu Ile Ser Ala Ala Lys Val Pro Glu Ile Glu Pro Ile Trp Thr Ser Leu Phe Ala Lys(28-49)

Ala Ala Ala Val Leu Asp (81-86)

Die T-Zellepitope errechnen sich aus den Aminosäurepositionen der Midpoints, die N-terminal von einem Lysin (K), C-terminal von einem Prolin (P) flankiert werden (-Flags). Es sind nur dann potentielle T-Zellepitope vorhanden, wenn der “Score-Index” größer als 10 ist. A: CIah8

Die folgende Sequenz 4 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz von Clah8 und der von ihr abgeleiteten Aminosäuresequenz. Der offene Leserahmen umfaßt 222bp bzw. 74 Aminosäuren. Das berechnete Molekulargewicht bertägt 8164 Dalton und entspricht somit dem 8kD großen allergenen Protein, das im Westemblot von 9% der Patienten erkannt wird.

Sequenz 4: ciahs eit« Daitoa (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:4 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 222 Basenpaare / 74 Aminosäurereste (B) ART: Nukleinsäure / Protein (C) STRANGFORM: ds (D) TOPOLOGIE: linear (ü) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (iii) HYPOTHETISCH: nein (iv) ANTISENSE: nein (v) ART DES FRAGMENTS: Gesamtsequenz (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Cladosporium herbarum 9

AT 403 166 B (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen DNA sequer.ce 222 b.p. ATGGACGCCTCC. . . TTCCGCAACAAC linear 1/1 31/11

ATC GAC GCC TCC ACC GAA CGC CAG AAC GGC ACC GTC AAG TGG T7C AAC GAC GAG AAG GGA

Met Asp Ala Ser Thr Glu Arg Gin Asn Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp Glu Lys Gly 61 /21 91 / 31

TAC GCC TTC ATC ACC CCC CAG AAC GGC TCC GCT GAC CTC TTG TTC CAC TTC CTC GCC ATT

Tyr Gly Phe Ile Thr Pro Glu Asn Gly Ser Ala Asp Leu Leu Phe His Phe Leu Ala Ile 121 / 41 151 / 51

GAG AAG GAC GGC TTC AAG TCC CTC AAG GAG GGT GAG GCT GTC ACC TTC TTC GCC GAG CAG

Glu Lys Asp Gly Phe Lys Ser Leu Lys Glu Gly Glu Ala Val Thr Phe Phe Ala Glu Gin 181 / 61 211 / 71

GGC CAG AAG GGC ATG CAG CCC TCC AGC TTC CGC AAC AAC

Gly Gin Lys Gly Met Gin Ala Ser Ser Phe Arg Asn Asn

Homologiesuchen in der S WISS-PROT Proteindatenbank ergaben eine signifikante Homologie (55% Identität) zu einer Familie von DNA*bindenden Proteinen. Das zentrale Motiv, das für diese Gruppe charakteristisch ist, bezeichnet man als cold-shock Domäne. Sie ist über das gesamte Organismenreich von den Bakterien bis zum Menschen konserviert In Prokaryonten ermöglichen solche Proteine in ihrer Funktion als Transkriptionsfaktoren eine Anpassung der Zelle an einen Kälte-Schock. In Eukaryonten kennt man sie als Regulatoren der Transkription von Genen, deren Promotoren ein Y-Box Motiv (CTGATTGGCCAA) enthalten. Aus diesen Ergebnissen und der hohen Homologie zu Clah8 kann man auf eine mögliche Funktion dieses Allergens als Transkriptionsfaktor im Zusammenhang mit dem Kälte-Schock schließen.

Sequenz 5: ClahS: B-Zellepitope (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:5 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angeführt (B) ART Protein (ü) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (iü) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Cladosporium herbaruni (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen 10

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Gly Phe II« Thr Pro Glu Asn Gly S«r (22-30)

Ile Glu Lys Asp Gly Phe Lys Ser Leu Lys Glu (40-50)

Phe Ala Glu Gin Gly Gin Lys Gly Met Gin (57-66)

Sequenz 6: Predicted amphipathatic segments = T-Zellepitope

Flags Midpoints Angles score K 44:51 95:135 18.1 GFKSLKEG 62:67 80:135 9.6 CKGMQA (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:6 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: einzeln angefühit (B) ART: Protein (ü) AKT DES MOLEKÜLS : Peptide (in) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Temtinus (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Qadosporium herbarum (O ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen

Gly Phe Lys Ser Leu Lys Glu Gly (44-51) Gin Lys Gly Met Gin Ala (62-67)

Die T-Zellepitope errechnen sich aus den Aminosäurepositionen der Midpoints, die N-tenninal von einem Lysin (K), C-terminal von einem Prolin (P) flankiert werden («Flags). Es sind nur dann potentielle T-Zellepitope vorhanden, wenn der “Score-Index” groß«: als 10 ist

Literatur

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Claims (12)

1. ΑΤ 403 166 Β Evaluation of immunotherapy-induces changes in specific IgE, IgG and IgG subclasses in birch poilen allergic patients by means of immunoblotting. Correlation with clinical response. Allergy 45, 418. Bousquet, J., Becker, W.M., Hejjaoudi, A. (1991). Differences in clinical and immrunologic reactivity of patients allergic to grass pollens and to multiple-pollen species. II. Efficacy of a double blind, phacebo-controlled, specific immunotherapy with standardized extracts. J. Allergy Clin. Immunol. 88, 43. Francoeur, A.M., Peebles, C.L., Heckman, K.J., Lee, J.C., Tan, E.M. (1985). Identification of ribosomal protein autoantigens. J. Immunol. 135, 1767. Hines, J.J., Weissbach, H., Brot, N., Elkon, K. (1991). Anti-P autoantibody production requires P1/P2 as immunogens but is not driven by exogenous self-antigen in mrl mice. J. Immunol.. 146, 3386. Margalit, H., Spogue, J.L., Cornette, J.L., Cease, K.B., Delisi, C., Berzofsky, J.A. (1987). Prediction of immunadominant Helper T cell antigenic sites from the primary sequence. J. Immunol. 138, 2213. Rammensee, H.G., Falk, K., Rötzschke, 0. (1993). MHC molecules as peptide receptors. Current Opinion in Immunol. 5, 35. Rieh, B.E., Steitz, J.A. (1987). Human acidic ribosomal phosphoproteins PO, P1 and P2: analysis of cDNA clones, in vitro synthesis and assembly. Mol. Cell. Biol. 7, 4065. Rothbard, J.B., Gefter, M.L. (1991). Interactions between immunogenic peptides and MHC proteins. Ann. Rev. Immunol. 9, 527. Sänger, F„ Nicklen, S„ Coulson, A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5468 Patentansprüche 1. Rekombinante DNA-Moleküle, die für Polypeptide kodieren, die die Antigenität der Allergene Clah8 und Clah12 besitzen oder für Peptide, die mindestens ein Epitop dieser Allergene aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die mit den Sequenzen 1 bis 6 oder mit Teilbereichen dieser Sequenzen in homologer Weise übereinstimmen, bzw. Nucleinsäuresequenzen, die mit den genannten Nucleinsäuresequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
2. 2. Rekombinante DNA-Moleküle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die durch Degeneration aus den Sequenzen 1 bis 6 ableitbar sind.
3. 3. Rekombinante DNA-Moleküle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die für Polypeptide kodieren, die als Antigene kreuzreaktiv mit den Allergenen Clah8 und Clah12 sind und zu diesen eine hohe Homologie aufweisen.
4. 4. Rekombinante DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß sie funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz zu einem Expressionskonstrukt verbunden sind.
5. 5. Wirtssysteme zur Expression von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem rekom-binanten Expressionskonstrukt nach Anspruch 4 transformiert sind.
6. 6. Aus einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 abgeleitetes rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Antigenität von Clah8 bzw. Clah!2 oder zumindest von einem Epitop dieser Proteine aufweist. 12 AT 403 166 B
7. 7. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder ein Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aminosäuresequenz aufweist, die den gezeigten Sequenzen 1 bis 6 zur Gänze oder teilweise entspricht.
8. 8. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fusionsprodukt darstellt, das die Antigenität der Allergene Clah8 bzw. Clah12 oder zumindest eines Epitops davon aufweist und einen zusätzlichen Polypeptidanteil besitzt, wobei das gesamte Fusionsprodukt von der DNA eines Expressionskonstrukts gemäß Anspruch 4 kodiert wird.
9. 9. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte zusätzliche Polypeptidanteil ß-Galaktosidase oder ein anderes zur Fusion geeignetes Polypeptid ist.
10. 10. Diagnostisches oder therapeutisches Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß es ein synthetisches Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 enthält.
11. 11. Verfahren zum in vitro -Nachweis der Allergie eines Patienten gegen die Allergene Clah8 und Clah12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der igE Antikörper im Serum des Patienten mit einem rekombinanten oder synthetischen Protein oder Polypeptid nach einem der Anprüche 6 bis 9 gemessen wird.
12. 12. Verfahren zum in vitro - Nachweis der zellulären Reaktion auf die Allergene Clah8 und Clah12, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Stimulierung oder Hemmung der zellulären Reaktion eingesetzt wird. 13