AT402505B - Rekombinantes 60 kda pflanzliches panallergen (kofaktor-unabhängige phosphoglyceratmutase; e.c. 5.4.2.1.) - Google Patents
Rekombinantes 60 kda pflanzliches panallergen (kofaktor-unabhängige phosphoglyceratmutase; e.c. 5.4.2.1.) Download PDFInfo
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Description
AT 402 505 B BIP3 ist ein gegen ein Birkenpollenprotein gerichteter monoklonaler Antikörper, der, wie bereits früher gezeigt (1), ein Nebenallergen mit einem Molekulargewicht von 60 kDa erkennt. Eine Birkenpollen-cDNA-Expressionsbank wurde mit BIP3 als Probe gescreent und dabei eine cDNA kodierend für ein Pollenallergen mit dem Molekulargewicht 60 kDa isoliert. Dieses Allergen zeigt hohe Sequenzhomologie mit pflanzlichen Kofaktor-unabhängigen Phosphoglyceratmutasen.
Phosphoglyceratmutasen (PGM) katalysieren in der Glykolyse und Glukoneogenese die Umwandlung von 3-Phosphoglycerat zu 2-Phosphoglycerat. Diese Reaktion findet ubiquitär in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen statt (2). Es gibt zwei Arten von PGM: Kofaktor-abhängige PGM (PGM-d), die 2,3-Bisphosphoglycerat als Kofaktor brauchen, und Kofaktor-unabhängige PGM (PGM-i), die 2,3-Bisphos-phoglycerat nicht benötigen. PGM-d wurden in allen Vertebraten nachgewiesen, während Pflanzen PGM-i verwenden. In Prokaryoten und niederen Eukaryoten ist die Situation wesentlich komplizierter. PGM aus Hefe wurde als PGM-d charakterisiert, während PGM aus Neurospora crassa, die ebenso wie Hefe zu den Pilzen, und damit zu den niederen Eukaryoten zählt, zu der PGM-i Gruppe gehört. PGM von gram-positiven Bakterien (z.B. Bacillus) ist Kofaktor-unabhängig, gram-negative Bakterien (z.B. Escherichia coli) haben Kofaktor-abhängige PGM. PGM von Säugern ist ein Dimer, wobei die Untereinheiten ein Molekulargewicht von 30 kDa haben (2). Das Pflanzenenzym PGM-i ist ein Monomer mit einem Molekulargewicht von etwa 60 kDa (3). Bis jetzt wurden nur PGM-i Sequenzen von Mais (3), Rhizinus und Tabak (4) veröffentlicht. Es wurden keinerlei Sequenzhomologien zwischen PGM-i und PGM-d festgestellt, was den Schluß zuläßt, daß beide Enzyme - obwohl sie die gleiche Reaktion katalysieren - evolutionär unabhängig entstanden sind. Häufig sind atopische Patienten empfindlich gegen verschiedene Allergene unterschiedlicher Herkunft. In früheren klinischen Studien wurde Allergiesyndrome beschrieben, bei denen die Kreuzreaktivität der Patienten gegen Allergene verschiedener Herkunft (Pollenallergene von Bäumen, Gräsern und Unkräutern, sowie Nahrungsmittelallergene) eine charakteristische Rolle spielt (5,6,7).
Einige bestimmte Kombinationen der Allergenkreuzreaktivität scheinen häufiger aufzutreten. Zum Beispiel haben Patienten mit Birkenpollenallergie oft auch eine Intoleranz gegen eine Vielzahl von Früchten und Gemüsen, wie Apfel, Birne, Nüsse, Karotten, Kartoffel, Sellerie und viele andere pflanzliche Nahrungsmittel. Typische Symptome sind lokale Reaktionen der Schleimhäute des oberen respiratorischen bzw. Verdauungstrakts (Jucken, Entzündung, Angioödem), bei vielen Patienten treten aber auch systemische Symptome auf (Urticaria, Asthma, anaphylaktischer Schock).
In den letzten Jahren konnten durch cDNA Klonieren die abgeleiteten Aminosäuresequenzen vieler atopischer Allergene bestimmt werden. Mit Hilfe rekombinanter Allergene konnte in einigen Fällen gezeigt werden, welche allergenen Verbindungen für die Kreuzsensibilisierung verantwortlich sind. In einigen Fällen wurde die Kreuzsensibilisierung durch IgE Antikörper, die homologe Proteine in unterschiedlichen Allergenquellen erkennen, verursacht. Zum Beispiel scheint Bet v 2, das zu der Profilinfamilie gehört und ein Nebenallergen aus Birkenpollen ist (8), in pollenallergischen Patienten eine solche kreuzreaktive Verbindung zu sein. Profiline sind ubiquitäre, aktinbindende Proteine, die in allen eukaryotischen Zellen gefunden werden. Pflanzliche Profiline haben eine hohe Sequenzhomologie, wodurch die hochgradige Kreuzreaktivität mit Patienten-lgE verursacht wird. Als Folge sind Patienten, die gegen Profilin allergisch sind, empfindlich gegen viele pflanzliche Stoffe, wie z.B. Pollen, Früchte, Nüsse, Gemüse etc. Aus diesem Grund wird Profilin als Pfianzen-Panallergen bezeichnet (9). Bet v 1, ein Hauptallergen aus Birkenpollen, ist ein anderes für Kreuzreaktionen verantwortliches Pollenallergen. Bet v 1 gehört zu der Familie der Pflanzen PR (pathogene-sis related) Proteine (10), die in vielen Pflanzen Vorkommen. Mit Bet v 1 homologe Proteine kommen in Pollen von verwandten Bäumen vor (Erle, Hasel, Hainbuche) (11,12,13), was die Kreuzsensibilität von Baumpollen-allergischen Patienten erklärt. Mit Bet v 1 verwandte Proteine wurden auch in Früchten, Gemüse und Nüssen nachgewiesen (14). Das erklärt die klinische Beobachtung, warum pollenallergische Patienten häufig Symptome nach Einnahme bestimmter Früchte und Gemüse zeigen (7). Die Hauptallergene von Graspollen sind in vielen Grasfamilien konserviert (15), aber bis jetzt wurden nur Profiline als kreuzreaktive Moleküle in Graspollen und pflanzlichen Nahrungsmitteln beschrieben (16). Kreuzreaktivitäten zwischen Katze, Hund und anderen tierischen Allergenquellen werden hauptsächlich dem Albumin zugeschrieben (17). Aus diesen Beobachtungen kann allgemein geschlossen werden, daß kreuzreagierende Allergene hochkonservierte Proteine sind. Diese Beobachtungen führen dazu, daß das Konzept der Allergie gegen eine bestimmte Pflanzenspecies erweitert werden muß durch das Konzept der Allergie gegen ein bestimmtes hochkonserviertes Protein, das in vielen Pflanzenspecies vorkommt. Die genaue Identifizierung und Charakterisierung von kreuzreagierenden Allergenen ist von größter Wichtigkeit für die Diagnose und mögliche Therapie von Typ I-Allergien.
Im folgenden wird gezeigt, daß die pflanzlichen Phosphoglyceratmutasen (E.C.5.4.2.1.) hochkonservierte Pflanzenallergene (d.h. ein Panallergen) sind, die zu einer hochgradigen Kreuzreaktivität von Patienten führen, die gegen Baum-, Gras- und Unkrautpollen bzw. pflanzliche Nahrungsmittel, wie Sellerie und Apfel 2
AT 402 505 B allergisch sind.
Beispiele: 1. Herstellung der cDNA Bank:
Gesamt RNA wurde aus Birkenpollen (Allergon AB, Engelholm) mit der Guanidinium-Phenol-Extra-tionsmethode isoliert. Poly(A)+ mRNA wurde mit oligo-dT30 magnetisierbaren Cellulosepartikeln (Sero-tec) nach Angaben des Herstellers isoliert. cDNA Synthese wurde mit dem Lambda-ZAP cDNA Synthese Kit von Stratagene durchgeführt. Die Synthese des ersten Stranges wurde mit einem oligo(dT) Linkerprimer, der eine Xhol Schnittstelle enthielt, geprimt. Nach der Synthese des zweiten Stranges wurden EcoRI Adaptoren an die cDNA ligiert. Die mit Xhol verdaute cDNA wurde dann an die vorverdauten Uni-ZAP XR Vektorarme ligiert und in vitro verpackt. Der Titer der Primärbank war etwa 1,2 x 106 rekombinante Plaques. Der Titer der amplifizierten Bank wurde als 1010 pfu bestimmt. 2. Screening der cDNA Bank mit dem monoklonalen Antikörper BIP 3, in vitro Excision und DNA Sequenzanalyse.
Die cDNA Bank wurde mit dem monoklonalen Antikörper BIP 3 gesereent (1). Positive Plaques wurden auf nachfolgende Art sichtbar gemacht: Inkubation mit Kaninchen Antimaus IgG, dann mit 125 J-Esel Antikaninchen IgG. Abschließend wurde Autoradiographie durchgeführt. Positive Plaques wurden isoliert und durch neuerliches Screening isoliert. Nachfolgend wurden mit den gereinigten Phagen die in vitro Excision wie im Stratagene Handbuch beschrieben durchgeführt, um sie in den pBluescript SK + Vektor (Stratagene) subklonieren zu können. Plasmide mit rekombinanten cDNA Inserts wurden isoliert, und die Inserts wurden nach der Sänger Methode (18) unter Verwendung des T7 Sequenzierkits (Pharmacia) sequenziert. Es wurden beide Stränge sequenziert. 3. Herstellung der Nitrocellulosefilter mit rekombinanten Birkenpollen PGM-i Allergen und IgE Detektion
Rekombinante Lambda ZAP Phagen, die PGM-i Allergen cDNA exprimieren, wurden verwendet, um E. coli, Stamm XL-1 Blue, zu infizieren. Inkubation von E. coli erfolgte in LB Medium mit 10 mM MgSOi. Zur Expression des rekombinanten PGM-i Allergens wurden die Phagen induziert, indem auf die Platten in 10 mM Isopropyl-thiogalaktisid (IPTG) getränkte Nitrozellulosefilter gelegt wurden. Die Nitrozellulosefilter wurden dann in Sektoren geschnitten und mit Sera von Patienten mit allergischen Symptomen gegen Pollen von Birke, Gras, Unkraut oder gegen pflanzliche Nahrung inkubiert. Gebundenes IgE wurde mit 125J-Kaninchen Antihuman IgE (Pharmacia) detektiert.
Ergebnisse
In diesem Teil wird gezeigt, daß es sich bei dem neu klonierten Allergen tatsächlich um ein hochkonserviertes Panallergen handelt und daß es für eine veibesserte Diagnose und Therapie von Patienten mit einer Allergie gegen dieses Protein aus Pollen und pflanzlichen Nahrungsmitteln verwendet werden kann.
Fig. 1 zeigt die cDNA Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von Birkenpollen PGM-i. Wie weiter unten gezeigt, bindet dieses Molekül den monoklonalen Antikörper BIP 3 (Ref.1, Fig. 5A) und IgE von Patienten, die gegen Pollen und pflanzliche Nahrungsmittel empfindlich sind (Fig. 5B, Fig.6).
Fig. 2 zeigt die hohe Sequenzhomologie aller bekannten pflanzlichen PGM-i (81% bis 87% Identität in allen paarweisen Kombinationen). Die drei bis jetzt bekannten pflanzlichen PGM-i wurden von den Autoren nicht als Allergene erkannt (3,4). Da die Sequenzhomologien so hoch sind, konnte aus dem Sequenzvergleich (Fig.2) geschlossen werden, daß in vorliegender Sequenz 29 Aminosäuren (inklusive dem Start-Methionin) fehlen. Allerdings beeinflußt diese kurze N-terminale Deletion nicht die Antikörperbindung (Fig.6).
Die B-Zell Epitope (Fig.3) von Birkenpollen PGM-i wurden mit "PepStructure", einem Teil des GCG Programmpakets berechnet. T-Zell Epitope (Fig.4) von Birkenpollen PGM-i wurden mit einem Programm von Margalit et al. (19) berechnet.
Fig.5A zeigt einen Immunblot mit Pollenextrakten von Birke, Beifuß und Liesehgras sowie Extrakten von Sellerie (Knollen- und Stangensellerie) und Apfel. Gezeigt ist das Autoradiogramm des mit BIP3 inkubierten Blots. Es ist bemerkenswert, daß der monoklonale Antikörper BIP 3 in allen diesen Materialien ein 60 kDa Protein erkennt, was auf eine hohe Konservierung der antigenen Epitope hinweist. Weiters werden (Fig.SB) Immunblots von BIP 3 -immunaffinitätsgereinigtem PGM-i aus Birkenpollen mit Birkenpollenextrakt als Kontrolle gezeigt, geprobt mit zwei Patientensera (HP, HL) und nichtallergischem Normalhumanserum (NHS). Die beiden Patienten sind typische Graspollenallergiker, die das gereinigte Panallergen jedoch im Birkenpollenextrakt ausschließlich PGM-i erkennen. Auch dieses Experiment zeigt die hohe Konservierung 3
AT 402 505 B von pflanzlichem PGM-i Allergen und seine Bedeutung für die Kreuzreaktivität der Patientenseren.
Fig.6 zeigt, daß Plaques, die das rekombinante Fusionsprotein bestehend aus der PGM-i Sequenz (Fig.1) und 36 Aminosäuren der ß-Galaktosidase enthalten, tatsächlich BIP 3 binden. Die gleichen Plaquelifts wurden mit den Seren von 11 ausgewählten Patienten, die allergisch sind gegen Pollen von Bäumen (SS), Gräsern (CM, HL, HP. SE, MR, CF, BG, GP) oder Unkraut (KG.CW) bzw. Apfel (KG,CW) oder Sellerie (KG.CW) sind, inkubiert. Als Kontrolle wurde Serum eines gesunden, nicht allergischen Patienten verwendet (NHS). Fig.5 und Fig.6 zusammen zeigen, daß tatsächlich ein hoch konserviertes Pflanzen Panallergen Kloniert wurde. Es wird angenommen, daß eine solch hohe Konservierung einer allergenen Sequenz bzw. Struktur große Bedeutung für die Diagnose und Therapie hat. Patienten, die dieses Molekül erkennen, sind wahrscheinlich kreuzreaktiv mit vielen Pollen und pflanzlichen Nahrungsmitteln. Sie können aber andererseits durch konventionelle Immuntherapie gut behandelt werden, weil PGM-i aus Pflanzen hochkonserviert sind, jedoch mit humanem oder tierischem PGM nicht verwandt sind.
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AT 402 505 B SEQUENZ 1: Kofaktor-unabhängiger Phosphoglyceratmutase (E.C.5.4.2.1.) ANGABEN ZU SEQ ID NO:l (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 1593 Basenpaare / 531 Aminosäurereste (B) ART: Nukleinsäure / Protein (C) STRANGFORM:ds (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (iii) HYPOTHETISCH: nein (iv) ANTISENSE: nein (v) ART DES FRAGMENTS: Teilsequenz (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: 1 GGG GGC GAG GCC AAG CCC GAT CAG TAC AAC TGC ATC CAT GTG 42
Gly Gly Glu Ala Lys Pro Asp Gin Tyr Asn Cys Ile His Val 43 GCC GAG ACT CCC ACC ATG GAT TCC CTC AAA CAG GGT GCT CCT 84
Ala Glu Thr Pro Thr Met Asp Ser Leu Lys Gin Gly Ala Pro 85 GAG AAG TGG AGG TTG GTT AGG GCT CAT GGT AAG GCC GTA GGC 126
Glu Lys Trp Arg Leu Val Arg Ala His Gly Lys Ala Val Gly 6
AT 402 505 B 127 CTT CCA ACA GAG GAT GAC ATG GGC AAC AGT GAA GTT GGT CAC Leu Pro Thr Glu Asp Asp Met Gly Asn Ser Glu Val Gly His 169 AAT GCA CTT GGA GCT GGT CGC ATC TTT GCC CAA GGT GCA AAG Asn Ala Leu Gly Ala Gly Arg Ile Phe Ala Gin Gly Ala Lys 211 CTT GTT GAC TCT GCT CTT GCC TCT GGA AAA ATT TAT GAA GGA Leu Val Asp Ser Ala Leu Ala Ser Gly Lys Ile Tyr Glu Gly 253 GAA GGT TTT AAG TAC ATA AAG GAA TGT TTT GAA AAT GGC ACA Glu Giy Phe Lys Tyr Ile Lys Glu Cys Phe Glu Asn Gly Thr 295 TTG CAT CTC ATT GGC TTA TTG AGT GAT GGT GGA GTC CAC TCC Leu His Leu Ile Gly Leu Leu Ser Asp Gly Gly Val His Ser 337 AGG CTT GAT CAG TTG CAG TTA TTG CTT AAA GGA GCT AGT GAG Arg Leu Asp Gin Leu Gin Leu Leu Leu Lys Gly Ala Ser Glu 379 CGT GGT GCA AAA AGA ATC CGT GTT CAT ATT CTT ACC GAT GGC Arg Gly Ala Lys Arg Ile Arg Val His Ile Leu Thr Asp Gly 421 CGT GAT GTT TTG GAT GGT TCA AGT GTA GGA TTT GTT GAA ACT Arg Asp Val Leu Asp Gly Ser Ser Val Gly Phe Val Glu Thr 463 CTT GAG AAT GAC CTT GCA AAA CTA CGT GAG AAG GGT GTT GAT Leu Glu Asn Asp Leu Ala Lys Leu Arg Glu Lys Gly Val Asp 505 GCA CAG ATT GCA TCT GGT GGT GGT CGC ATG TAT GTC ACA ATG Ala Gin Ile Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Tyr Val Thr Met 7
AT 402 505 B 547 GAT CGT TAT GAG AAT GAC TGG GAA GTC ATC AAA CGA GGA TGG Asp Arg Tyr Glu Asn Asp Trp Glu Val Ile Lys Arg Gly Trp 589 GAT GCC CAT GTT CTT GGT GAA GCC CCT TAC AAA TTT AAA AGT Asp Ala His Val Leu Gly Glu Ala Pro Tyr Lys Phe Lys Ser 631 GCT GTT GAA GCT GTC AAG AAA CTG AGG GAG GAG CTA AAG GTC Ala Val Glu Ala Val Lys Lys Leu Arg Glu Glu Leu Lys Val 673 AGT GAC CAG TAC TTG CCT CCA TTC GTC ATT GTT GAT GAC AAT Ser Asp Gin Tyr Leu Pro Pro Phe Val Ile Val Asp Asp Asn 715 GGG AAG CCT GTT GGT CCT ATA GTT GAT GGT GAT GCT GTG GTT Gly Lys Pro Val Gly Pro Ile Val Asp Gly Asp Ala Val Val 757 ACA ATC AAC TTC CGA GCA GAT CGT ATG GTT ATG ATT GCT AAG Thr Ile Asn Phe Arg Ala Asp Arg Met Val Met Ile Ala Lys 799 GCA CTT GAA TAT GAA AAT TTT GAC AAG ATT GAT CGA GTT CGA Ala Leu Glu Tyr Glu Asn Phe Asp Lys Ile Asp Arg Val Arg 841 TTC CCT AAA ATC CGT TAT GCT GGA ATG CTT CAA TAT GAT GGC Phe Pro Lys Ile Arg Tyr Ala Gly Met Leu Gin Tyr Asp Gly 883 GAG TTG AAG CTC CCG AGC CAT TAC CTT GTT GAA CCT CCA GAG Glu Leu Lys Leu Pro Ser His Tyr Leu Val Glu Pro Pro Glu 925 ATA GAG AGA ACG TCT GGT GAA TAT CTA GTG CAC AAT GGC GTC Ile Glu Arg Thr Ser Gly Glu Tyr Leu Val His Asn Gly Val 8
AT 402 505 B 967 CGT ACT TTT GCT TGC AGT GAG ACT GTC AAA TTT GGT CAT GTC Arg Thr Phe Ala Cys Ser Glu Thr Val Lys Phe Gly His Val 1009 ACT TTC TTC TGG AAT GGA AAC CGC TCT GGA TAT TTC AAT TCA Thr Phe Phe Trp Asn Gly Asn Arg Ser Gly Tyr Phe Asn Ser 1051 GAA CTG GAG GAA TAC GTG GAA ATT CCA AGT GAT AGT GGA ATT Glu Leu Glu Glu Tyr Val Glu Ile Pro Ser Asp Ser Gly Ile 1093 ACA TTC AAC GTC CAG CCA AAG ATG AAG GCA TTG GAG ATT GCT Thr Phe Asn Val Gin Pro Lys Met Lys Ala Leu Glu Ile Ala 1135 GAA AAA ACG AGA GAT GCT ATA CTT AGC GGA AAA TTT GAC CAG Glu Lys Thr Arg Asp Ala Ile Leu Ser Gly Lys Phe Asp Gin 1177 GTG CGT GTT AAC CTG CCA AAT GGT GAC ATG GTG GGG CAT ACA Val Arg Val Asn Leu Pro Asn Gly Asp Met Val Gly His Thr 1219 GGT GAT ATT GAG GAC ACA GTT GTG GCT TGC AAG GCT GCT GAT Gly Asp Ile Glu Asp Thr Val Val Ala Cys Lys Ala Ala Asp 1261 GAG GCT GAC AAG ATG ATC CTT GAT GCA ATA GAG CAA GTG GGT Glu Ala Asp Lys Met Ile Leu Asp Ala Ile Glu Gin Val Gly 1303 GGA ATT TAT GTT GTT ACT GCG GAT CAT GGG AAT GCT GAG GAC Gly Ile Tyr Val Val Thr Ala Asp His Gly Asn Ala Glu Asp 1345 ATG GTG AAG AGG AAC AAG TCC GTG CAA CCT CTT CTT GAC AAG Met Val Lys Arg Asn Lys Ser Val Gin Pro Leu Leu Asp Lys 9
AT 402 505 B 1387 AAT GGC AAT CTT CAA GTG CTC Asn Gly Asn Leu Gin Val Leu 1429 GTG CCA ATT GCA ATT GGA GC-T Val Pro Ile Ala Ile Gly Gly 1471 AGG TTC TGC AAG GAT CTT CCT Arg Phe Cys Lys Asp Leu Pro 1513 GCT GCA ACT GTG ATC AAT CTA Ala Ala Thr Val Ile Asn Leu 1555 GAC TAT GAG CCA ACC CTC ATT Asp Tyr Glu Pro Thr Leu Ile ACC TCT CAC ACC CTC CAA CCA 1428 Thr Ser His Thr Leu Gin Pro CCT GCA TTG GCA AGT GGT GTC 1470 Pro Ala Leu Ala Ser Gly Val GAT GGT GGG CTT GCC AAT GTT 1512 Asp Gly Gly Leu Ala Asn Val CAT GGG TTT GAG GCT CCT AGT 1554 His Gly Phe Glu Ala Pro Ser GAA CTC GTT GAT AAC TAG 1593 Glu Leu Val Asp Asn * ANGABEN ZU SEQ ID NO:2 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 12 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (in) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 2: 10
AT 402 505 B
Gly Gly Glu Ala Lys Pro Asp Gin Tyr Asn Cys Ile 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:3 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 26 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 3:
Ala Glu Thr Pro Thr Met Asp Ser Leu Lys Gin Gly Ala Pro Glu Lys Trp 1 5 10 15
Arg Leu Val Arg Ala His Gly Lys Ala 20 25 ANGABEN ZU SEQ ID NO:4 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 14 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid 11
AT 402 505 B (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: Ν-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 4:
Leu Pro Thr Glu Asp Asp Met Gly Asn Ser Glu Val Gly His 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:5 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 18 (B) ART: Protein (ü) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iü) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 5:
Gly Lys Ile Tyr Glu Gly Glu Gly Phe Lys Tyr Ile Lys Glu Cys Phe Glu 15 10 15
Asn 12 13
AT 402 505 B ANGABEN ZU SEQ ID NO:6 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 13 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Pepüd (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 6:
Leu Ser Asp Gly Gly Val His Ser Arg Leu Asp Gin Leu 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:7 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 12 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa 13 ΑΤ 402 505 Β (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 7:
Gly Ala Ser Glu Arg Gly Ala Lvs Arg Ile Arg Val 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 13 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 8:
Leu Thr Asp Gly Arg Asp Val Leu Asp Gly Ser Ser Val 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 16 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein 14
AT 402 505 B (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 9:
Glu Thr Leu Glu Asn Asp Leu Ala Lys Leu Arg Glu Lys Gly Val Asp 15 10 15 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 20 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iü) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
Tyr Val Thr Met Asp Arg Tyr Glu Asn Asp Trp Glu Val Ile Lys Arg Gly 15 10 15
Trp Asp Ala 20 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11 15
AT 402 505 B (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 16 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG.’SEQ ID NO: 11:
Val Lys Lys Leu Arg Glu Glu Leu Lys Val Ser Asp Gin Tyr Leu Pro 15 10 15 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 21 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Pepüd (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 12: 16
AT 402 505 B
Ala Leu Glu Tyr Glu Asn ?he Asp Lys Ile Asp Arg Val Arg Phe Pro Lys 15 10 15
Ile Arg Tyr Ala 20 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 35 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 13:
Met Leu Gin Tyr Asp Gly Glu Leu Lys Leu Pro Ser His Tyr Leu Val Glu 15 10 15
Pro Pro Glu Ile Glu Arg Thr Ser Gly Glu Tyr Leu Val His Asn Gly Val 20 25 30
Arg 35 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: 17
AT 402 505 B (A) LÄNGE: 25 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 14:
Trp Asn Gly Asn Arg Ser Gly Tyr ?he Asn Ser Glu Leu Glu Glu Tyr Val 15 10 15
Glu Ile Pro Ser Asp Ser Gly Ile 20 25 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 24 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (üi) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 15: 18
AT 402 505 B
Ser Gly Lys Phe Aso Gin Val Arg Val Asn Leu Pro Asn Gly Asp Met Val 15 10 15
Gly His Thr Gly Asp Ile Glu 20 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 17 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vü) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
Ala Asp His Gly Asn Ala Glu Asp Met Val Lys Arg Asn Lys Ser Val Gin 15 10 15 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 13 (B) ART: Protein 19
AT 402 505 B (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 17:
His Gly Phe Glu Ala Pro Ser Asp Tyr Glu Pro Thr Leu 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 13 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Pepüd (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBES CHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
Tyr Asn Cys Ile His Val Ala Glu Thr Pro Thr Met Asp 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19 20 ΑΤ 402 505 Β (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (Α) LÄNGE: 06 (Β) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 19:
Glu Lys Trp Arg Leu Val 1 5 ANGABEN ZU SEQ ID NO:20 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 10 (B) ART: Protein (ü) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iü) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 20: 21
AT 402 505 B
Phe Ala Gin Gly Ala Lys Leu Val Asp Ser 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:21 (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: II (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 21:
Glu Gly Glu Gly Phe Lys Tyr Ile Lys Glu Cys 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:22 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 04 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus 22
AT 402 505 B (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 22:
Thr Leu Glu Asn 1 4 ANGABEN ZU SEQ ID NO:23 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 11 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 23:
Asn Asp Trp Glu Val Ile Lys Arg Gly Trp Asp 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:24 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 09 (B) ART: Protein 23
AT 402 505 B (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 24:
Vai Glu Ala Val Lys Lys Leu Arg Glu 1 5 ANGABEN ZU SEQ ID NO:25 (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: II (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 25:
Glu Tyr Glu Asn Phe Asp Lys Ile Asp Arg Val 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:26 24
AT 402 505 B (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 10 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (üi) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Termirtus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 26:
Arg Thr Phe Ala Cys Ser Glu Thr Val Lys 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:27 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 11 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 27: 25
AT 402 505 B
Ser Glu Leu Glu Glu Tyr Val Glu Ile Pro Ser 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO:28 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 08 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 28:
His Thr Gly Asp Ile Glu Asp Thr 1 5 ANGABEN ZU SEQ ID NO:29 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 12 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus 26
AT 402 505 B (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 29:
Met Ile Leu Asp Ala Ile Glu Gin Val Gly Gly Ile 15 10 ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 12 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vii) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 30:
Ser Gly Val Arg Phe Cys Lys Asp Leu Pro Asp Gly Gly Leu Ala Asn Val 15 10 15
Ala Ala 18 ANGABEN ZU SEQ ID NO:31 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: 27
Claims (10)
- AT 402 505 B (A) LÄNGE: 09 (B) ART: Protein (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: nein (v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (vi) URSPÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Betula verrucosa (C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Pollen (vü) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO: 31: Asn Leu His Gly Phe Glu Ala Pro Ser 1 5 Patentansprüche 1. Rekombinantes DNA Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die mit der in Fig, 1 dargestellten gesamten Sequenz oder Teilbereichen derselben in homologer Weise übereinstimmt oder die durch Degeneration aus der in Fig. 1 dargestellten Sequenz ableitbar ist und für ein Polypeptid kodiert, das die Antigenität des Allergens "Kofaktor-unabhängige Phosphogly-zeratmutase (E.C. 5.4.2.1.)” des Birkenpollens besitzt, oder für ein Peptid, das mindestens ein Epitop dieses Allergens aufweist, sowie eine Nukleinsäuresequenz, die mit der genannten Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisert, insbesondere für die Kofaktor-unabhängige Phospho-glyzeratmutase (E.C. 5.4.2.1.) des Pollens von Birke, Hasel, Erle, Eiche, Buche, Hainbuche und Olive, von Gräsern, wie Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Secale cereale, von Unkräutern wie Beifuß sowie von pflanzlichen Nahrungsmitteln wie Apfel, Kartoffel, Banane, Kiwi, Sellerie, Karotte, Birne, Kirsche, Pfirsich, Pflaume, Marille, Walnuß, Haselnuß, Erdnuß, Mandel .Pistazien, Pfeffer, Kümmel und Koriander.
- 2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die für ein Polypeptid kodiert, das als Antigen kreuzreaktiv mit der Kofaktorunabhängigen Phosphoglyzeratmutase (E.C. 5.4.2.1.) des Birkenpollens ist, insbesondere mit allen pflanzlichen Kofaktor-unabhängigen Phosphoglyzeratmutasen (E.C. 5.4.2.1.), die zu der in Fig. 1 gezeigten Sequenz eine hohe Homologie aufweisen.
- 3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es funktionell mit einer Expressions-Kontrollsequenz zu einem Expressionskonstrukt verbunden ist.
- 4. Wirtssystem, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem rekombinanten Expressionskonstrukt nach Patentanspruch 3 transformiert ist.
- 5. Aus einem DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 abgeleitetes rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Antigenität von Kofaktor-unabhängiger Phosphoglyzeratmutase (E.C. 5.4.2.1.) des Birkenpollens oder zumindestens eines Epitops davon 28 AT 402 505 B aufweist und eine Aminosäuresequenz besitzt, die der in Fig. 1 gezeigten Sequenz im Ganzen oder in Teilen entspricht.
- 6. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach Patentanspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fusionsprodukt darstellt, das die Antigenität der Kofaktor-unabhängigen Phosphoglyzeratmutase (E.C. 5.4.2.1.) des Birkenpollens oder zumindestens eines Epitops davon aufweist und einen zusätzlichen Polypeptidanteil aufweist, wobei das gesamte Fusionsprodukt von der DNA eines Expressionskonstrukts gemäß Anspruchs 5 kodiert wird.
- 7. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte zusätzliche Polypeptidanteil beta-Galaktosidase, eine Teilsequenz der beta-Galaktosidase oder ein anderes zur Fusion geeignetes Polypeptid ist.
- 8. Diagnostisches oder therapeutisches Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß es ein synthetisches Protein oder Polypeptid gemäß einem der Patentansprüche 5 bis 7 enthält.
- 9. Verfahren zum in vitro Nachweis der Allergie eines Patienten gegen Kofaktor-unabhängige Phosphoglyzeratmutase (E.C. 5.4.21), dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der IgE Antikörper im Serum des Patienten mit einem rekombinanten oder synthetischen Protein oder Polypeptid nach einem der Patentansprüche 5 bis 7 gemessen wird.
- 10. Verfahren zum in vitro Nachweis der zellulären Reaktion auf Kofaktor-unabhängige Phosphoglyzeratmutase (E.C. 5.4.2.1.), dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach einem der Patentansprüche 5 bis 7 zur Stimulierung oder Hemmung der zellulären Reaktion eingesetzt wird. Hiezu 10 Blatt Zeichnungen 29
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