DE60301944T2

DE60301944T2 - Verfahren zur Vorbereitung von hypoallergenen Mosaikproteinen#

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Publication number: DE60301944T2
Application number: DE60301944T
Authority: DE
Inventors: Dr. Nadine Mothes; Dr. Sabine Stumvoll; Dr. Margit Focke; Mag. Birgit Linhart; Dr. Maria-Theresa Krauth; Professor Dr. Peter Valent; Professor Dr. Dietrich Kraft; Professor Dr. Rudolf Valenta
Original assignee: Biomay AG
Current assignee: Biomay AG
Priority date: 2003-01-21
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2023-01-22
Also published as: US20060263391A1; ATE307141T1; CN1742019A; US7491396B2; DK1440979T3; CA2513711C; ES2247433T3; JP2006523436A; AU2003293931A1; WO2004065414A1; CA2513711A1; EP1440979B1; EP1440979A1; AU2003293931B2; US20090148466A1; DE60301944D1; JP4756864B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mosaikantigene, die von natürlich vorkommenden Allergenen stammen, insbesondere Lieschgraspollenallergen Phl p 2. Die Mosaikantigene zeigen eine verminderte allergene Aktivität und sind nützlich als Allergieimpfstoffe zur Behandlung von sensibilisierten allergischen Patienten und zur prophylaktischen Impfung.
Ein großer Prozentanteil der Bevölkerung leidet unter durch IgE vermittelten Allergien. Solche Patienten leiden unter allergischen Reaktionen gegen verschiedene Antigene. Ein hoher Prozentanteil der allergischen Reaktionen wird durch Pflanzenpollen verursacht. Die Symptome der Allergie, wie allergische Rhinoconjunctivitis, Asthma, Dermatitis und sogar anaphylaktischer Schock beruhen auf der IgE-Erkennung von Allergenen. Die IgE-Moleküle sind hauptsächlich verantwortlich für die Symptome von allergischen Reaktionen, wie Heuschnupfen, Asthma und Nesselfieber.
Die IgE-Moleküle binden an ein Allergen, wie z.B. Pflanzenpollen. Die Schwanzregion des IgE-Moleküls, der Fc-Teil, bindet an Fc-Rezeptoren, die hauptsächlich an der Oberfläche von Mastzellen in Geweben und Basophilen im Blut angeordnet sind. Die Antigenbindung bringt die Mastzellen oder Basophilen dazu, eine Vielzahl von Cytokinen und biologisch aktiven Verbindungen auszuscheiden, insbesondere Histamin. Diese Moleküle verursachen, dass sich Blutgefäße erweitern und undicht werden, was wiederum weißen Blutzellen, Antikörpern und Komplementkomponenten hilft, Reaktionsstellen aufzusuchen. Solche Moleküle sind andererseits hauptsächlich verantwortlich für die Symptome der allergischen Reaktionen. Es gibt verschiedene Grade von allergischen Reaktionen, die von einem leichten Jucken der Augen und den Symptomen einer leichten Erkältung über starke Schmerzen bis zu lebensbedrohenden Symptomen, wie dem anaphylaktischen Schock, reichen, der z.B. nach dem Stich einer Biene auftreten kann.
Um diese allergischen Reaktionen zu vermeiden, wurden Allergieimpfstoffe entwickelt, die auf der Anwendung geringer Menge hypoallergener Verbindungen basieren. Es wird angenommen, dass durch Anwendung hypoallergener Impfstoffe IgG-Antikörper erzeugt werden, die mit dem Allergen reagieren, sofort nachdem der/die Einzelne in Kontakt mit dem Allergen gekommen ist. Durch diese so genannten blockierenden Antikörper wird ein Kontakt zwischen dem Allergen und den im Körper des Patienten vorhandenen IgE-Molekülen größtenteils vermieden. Daher wird die Reaktion zwischen dem Allergen und den Mastzellen, die durch IgE-Moleküle vermittelt wird, größtenteils vermieden.
Valenta et al. beschreibt in dem Übersichtsartikel "Recombinant allergen molecules: Tools to study effector cell activation", Immunological Reviews, Bd. 179, Februar 2001, Seiten 119–127, theoretisch den Pathomechanismus, der den sofortigen Symptomen der Allergie zugrunde liegt.
Auf dem Joint Congress of the Britisch Society for Immunology and the Biochemical Society präsentierten Valenta et al. am 10. Dezember 1996 IgE-Epitope des Hauptlieschgraspollenallergens Phl p 2.
Focke et al. offenbaren in FASEB Journal, Bd. 15, Nr. 11, September 2001, Seiten 2042–2044, synthetische Peptide von Phlp1, die für die Allergieimpfung vorgeschlagen wurden.
Auf dem Gebiet der Therapie von allergischen Reaktionen wurden verschiedene Impfstoffe verwendet. Früher wurden kleine Mengen des Allergens für Patienten angewendet. Mit der Entwicklung der Gentechnologie konnten rekombinante Allergene für die Impfung verwendet werden. Ein Hauptnachteil solcher allergenhaltiger Impfstoffe besteht darin, dass die Anwendung solcher Impfstoffe bei dem Patienten unerwünschte Nebenwirkun gen verursacht. Wenn z.B. das Allergen, gegen das der Patient allergisch ist, subcutan dem Patienten verabreicht wird, kann eine unerwünschte Nebenwirkung, wie Jucken, bis hin zum anaphylaktischen Schock auftreten, da die IgE-Antikörper, die im Körper des Patienten vorhanden sind, mit dem Allergen reagieren und die allergische Reaktion verursachen.
Um die unerwünschten Nebenwirkungen zu überwinden, wird ein Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Mosaikantigens, das von einem Allergen abgeleitet ist, offenbart, wobei

a) in einer ersten Stufe das Allergen in mindestens zwei Teile aufgespalten wird und die IgE-Reaktivität jedes Teils bestimmt wird und
b) in einer zweiten Stufe solche Teile des Allergens, die keine nachweisbare IgE-Reaktion aufweisen, zu einem Mosaikantigen kombiniert werden, das die Aminosäuren des Allergens aufweist, wobei aber die Reihenfolge der Aminosäuren des Mosaikantigens verschieden ist von der des natürlich vorkommenden Allergens.

Der Ausdruck "hypoallergenes Mosaikantigen", das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt wird, bedeutet, dass das Antigen im Wesentlichen alle Aminosäuren des natürlich vorkommenden Allergens aufweist. Der Unterschied im Vergleich zu dem natürlich vorkommenden Antigen ist jedoch, dass das Allergen in einer ersten Stufe in verschiedene Teile aufgespalten wird. Wenn die Aminosäuresequenz des Allergens bekannt ist, ist es allgemeines Wissen des Fachmanns auf diesem Gebiet, Peptide verschiedener Länge aus dem Antigen herzustellen. Die Peptide können entweder durch chemische Synthese hergestellt werden, was wohl bekannt ist im Stand der Technik. Alternativ können die Peptide leicht durch Polymerasekettenreaktion hergestellt werden, da geeignete Primer leicht synthetisiert werden können, wenn die Sequenz bekannt ist.
Die Reaktivität jedes Teils des Allergens, das als Peptid oder Polypeptid vorhanden ist, muss bestimmt werden. Dies kann erfolgen, indem das Peptid mit Seren von Patienten umgesetzt wird, die gegen das natürlich vorkommende Allergen allergisch sind. Die IgE-Antikörper, die in solchen Seren vorhanden sind, reagieren mit dem Peptid, wenn ein IgE-Epitop auf dem Peptid vorhanden ist. Wenn jedoch keine linearen IgE-Epitope vorhanden sind oder wenn Konformations-IgE-Epitope dadurch zerstört werden, dass das gesamte natürlich vorkommende Allergen getrennt wird, gibt es keine Bindung von IgE an das Peptid. Die IgE-Antikörper können nachfolgend leicht durch Reaktion mit spezifischen Anti-Antikörpern nachgewiesen werden, die an den IgE-Antikörper binden. Solche Anti-Antikörper werden gewöhnlich zum Nachweis markiert.
Es ist ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung, das Allergen in solche Teile aufzuteilen, die mit IgE-Antikörpern nicht reagieren. Wenn ein Teil des Allergens immer noch mit IgE-Antikörpern in einem erheblichen Ausmaß reagiert, sollten solche Teile des Allergens nicht für die Herstellung des Mosaikantigens verwendet werden. Es ist ratsam, die Teile des natürlich vorkommenden Antigens, das in dem Mosaikantigen verwendet werden soll, mit Seren von verschiedenen allergischen Patienten zu testen, da es Variationen im Hinblick auf die Spezifität und Höhe der IgE-Konzentration in jedem Serum geben kann.
Wenn das Allergen in verschiedene Teile aufgespalten wurde, die keine nachweisbare IgE-Reaktivität zeigen, werden solche Teile neu angeordnet, um das Mosaikantigen zu schaffen. Dass der Teil des Allergens keine wesentliche IgE-Reaktivität aufweist, bedeutet, dass die IgE-Reaktivität des gesamten natürlich vorkommenden Allergens getestet wird, bevorzugt mit mindestens fünf Seren von allergischen Patienten ebenso wie die Teile davon getestet werden. Die Bindung von IgE-Molekülen an das Allergen und die Teile davon wird quantitativ bestimmt und die IgE-Reaktivität des Teils muss auf nicht mehr als 10%, bevorzugt nicht mehr als 5% des Werts reduziert sein, der für das natürlich vorkommende Allergen erhalten wird.
Die Umlagerung der Teile des natürlich vorkommenden Allergens zu dem Mosaikantigen bedeutet im einfachsten Fall, dass das Allergen in zwei Teile aufgespalten wird, nämlich Teil A mit dem N-Ende und das an der Spaltungsstelle endet, und Teil B, das mit der Spaltungsstelle beginnt und mit dem Carboxyende des Polypeptids endet. Die Spaltstelle bedeutet die Position in dem Polypeptid, an der ein Teil endet und ein anderer Teil beginnt. Wenn beide Teile des natürlich vorkommenden Antigens keine wesentliche IgE-Reaktivität aufweisen, werden die beiden Teile in solcher Art und Weise umgelagert, dass nun Teil B das N-Ende bildet und Teil A das C-Ende bildet.
Wenn das natürlich vorkommende Allergen in drei Teile aufgespalten wird mit der natürlich vorkommenden Reihenfolge A, B und C sind verschiedene Mosaikantigene möglich, nämlich z.B. C, B, A; oder A, C, B. Je mehr Teile gebildet werden, desto mehr Möglichkeiten, um Mosaikantigene zu schaffen, werden geliefert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird es vermieden, Teile zu kombinieren, die in benachbarten Positionen im natürlich vorkommenden Allergen angeordnet sind, z.B. C, A, B. Der Grund hierfür ist, dass wieder IgE bindende Epitope auf dem Mosaikantigen gebildet werden könnten. Es ist jedoch wesentlich, dass das Mosaikantigen im Wesentlichen alle Aminosäuren des natürlich vorkommenden Antigens enthält. Natürlich können einige Aminosäuren, die eindeutig keine Funktionen haben, deletiert werden oder einige Aminosäuren können aus Produktionsgründen deletiert werden, aber es sollten so viele Aminosäuren wie möglich erhalten bleiben. Außerdem kann das Mosaikantigen auch Aminosäuren enthalten, die für Produktionszwecke verwendet werden. Bevorzugt sind die Teile in dem natürlich vorkommenden Allergen, die in dem Mosaikantigen reorganisiert werden, so groß wie möglich. Die Spaltstellen werden bevorzugt so ausgewählt, dass sie IgE-Epitope zerstören, wobei die IgE-Epitope so weit wie möglich erhalten bleiben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren mit Allergenen der Gruppe 2 verwendet. Bevorzugte Allergene der Gruppe 2 werden in den folgenden Publikationen beschrieben:
L. R. Freidhoff, E. Ehrlich-Kautzky, J. H. Grant, D. A. Meyers, D. G. Marsh. A study of the human immune response to Lolium perenne (rye) pollen and its components, Lol p I and Lol p II (rye I and rye II). I. Prevalence of reactivity to the allergens and correlations among skin test, IgE antibody, and IgG antibody data. J. Allergy Clin. Immunol. 1986, 78, 1190–1201. L. R. Freidhoff, E. Ehrlich-Kautzky, D. A. Meyers, D. G. Marsh. A study of the human immune response to Lolium perenne (rye) pollen and its components, Lol p I and Lol p II (Rye I and Rye II). II. Longitudinal variation of antibody levels in relation to symptomatology and pollen exposure and correction of seasonally elevated antibody levels to basal values. J. Allergy Clin. Immunol. 1987, 80, 646–655. A. A. Ansari, P. Shenbagamurthi, D. G. Marsh. Complete amino acid sequence of a Lolium perenne (perennial rye grass) pollen allergen, Lol p II, J. Biol. Chem. 1989, 264, 11181–11185. C. Dolecek, S. Vrtala, S. Laffer, P. Steinberger, D. Kraft, O. Scheiner, R. Valenta. Molecular characterization of Phl p II, a major timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen. FEBS Lett. 1993, 335, 299–304.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das für das Mosaikgen verwendete Allergen Lieschgraspollenallergen Phl p 2. Die Sequenz des Lieschgraspollenallergens Phl p 2 wird in WO 94/23035 of fenbart. Eine genauere Beschreibung von Phl p 2 aus Lieschgraspollen wird von De Marino et al., Structure (1999), Bd. 7, Nr. 8, Seiten 943–952, geliefert. Das Phl-p-2-Antigen ist bevorzugt, da es mit Serum-IgE von etwa 70% gegen Graspollen allergischen Personen reagiert und eine Histaminfreisetzung aus basophilen Zellen von sensibilisierten Patienten hervorruft.
Im Verlauf der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass Phl-p-2-Allergen bevorzugt in drei Peptide gespalten wird, nämlich Peptid 1 mit den Aminosäuren 1 bis 33, Peptid 2 mit den Aminosäuren 34 bis 64 und Peptid 3 mit den Aminosäuren 65 bis 96. Indem die Peptide in der Reihenfolge 1, 3 und 2 umgeordnet werden, wird ein Mosaikantigen bereitgestellt, das für die hypoallergene Impfung verwendet werden kann. Das Mosaikantigen hat den Vorteil, dass eine ausreichende Menge an blockierenden IgE-Antikörpern erzeugt wird, aber die unerwünschten Nebenreaktionen, die mit der Impfung verbunden sind, fast vollständig vermieden werden.
Die Aminosäuresequenz des bevorzugten Mosaikallergens hat SEQ ID Nr. 1. Die DNA, die für dieses bevorzugte Mosaikallergen codiert, hat SEQ ID Nr. 2.
Das mit der vorliegenden Offenbarung bereitgestellte Mosaikallergen kann bevorzugt zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung allergischer Reaktionen verwendet werden. Das bevorzugte Phl-p-2-Mosaikantigen kann für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Graspollenallergie verwendet werden. Da Phl p 2 ein Antigen ist, gegen das ein großer Prozentsatz allergischer Patienten IgE-Antikörper gebildet hat, ist das Mosaikantigen sehr nützlich zur Behandlung von Patienten, die unter Heuschnupfen leiden.
Ein Mosaikantigen, wie es mit dem beschriebenen Verfahren hergestellt wird, kann als Arzneimittel zur Behandlung einer allergischen Reaktion formuliert werden. Die Hauptkomponente ist das Mosaikantigen, das bevorzugt zusammen mit einem Adjuvans verabreicht wird. Es gibt verschiedene Adjuvantien, die für die Verabreichung an Menschen geeignet sind, z.B. Aluminiumhydroxidgel. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, das Mosaikantigen direkt durch kovalente Bindung mit einer anderen Komponente zu verbinden, die allgemein die immunologische Reaktion des Körpers verstärkt.
Es ist auch möglich, eine DNA, die ein Mosaikantigen codiert, oder eine dazu komplementäre DNA-Sequenz als DNA-Impfstoff zu verwenden. Für Nucleinsäureimpfstoffe wird eine geeignete Polynucleotidsequenz in die Zielzellen insertiert. Zusätzlich zu der Sequenz, die das Mosaikantigen codiert, kann ein solcher DNA-Impfstoff auch regulatorische Elemente, wie Promotoren, Ribosomenbindungsstellen oder Terminationssequenzen enthalten. Solche DNA-Sequenzen sollten bevorzugt in einen geeigneten Träger eingearbeitet werden, der zulässt, dass die DNA zum Proteinsyntheseapparat der Zellen kommt.
Ein Mosaikantigen, wie es hier im Detail beschrieben wird, ist für die menschliche Anwendung vorgesehen. Es ist jedoch auch möglich, das Mosaikantigen für wertvolle Tiere, wie Haustiere (z.B. Hunde oder Katzen) oder Pferde zu verwenden.
Die Figuren und Tabellen beschreiben bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung:
1: Vergleich der IgE-Reaktivität synthetischer von Phl p 2 abgeleiteter Peptide und des vollständigen rPhl p 2 (rekombinant erzeugtes Wildtypallergen). Nitrocellulosen, die (A) getupfte Phl-p-2-Peptide (P1, P2, P3), Humanserumalbumin (HSA), ein Kontrollpeptid (P) und ein nicht kreuzreaktives Lieschgraspollenallergen (rPhl p 5) und (B) rPhl p 5 und Phl p 2 (rPhl p 2) enthielten, wurden Seren von 35 gegen Graspollen allergischen Patienten (1 bis 35) und dem Serum einer nicht allergischen Person (N) ausgesetzt.
2: Schematische Darstellung von rekombinantem Phl-p-2-Wildtyp mit His-tag und rekombinantem Phl-p-2-Mosaik mit His-tag. Die Position der drei Peptide ist gezeigt.
3: DNA-Sequenz der für die Konstruktion des Phl-p-2-Mosaiks verwendeten Primer und schematische Darstellung des PCR-Ansatzes, der für den Zusammenbau der cDNA verwendet wurde, die für das rPhl-p-2-Mosaik codiert. Die Nde-I- und Eco-R-I-Restriktionsstellen sind in Primer P2/1 bzw. P2/6 unterstrichen. Die Primer entsprechen SEQ ID Nr. 6 bis SEQ ID Nr. 11.
4: cDNA (SEQ ID Nr. 2) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 1) des Phl-p-2-Mosaiks mir His-tag. Die Aminosäuren sind im Einbuchstaben-Code dargestellt, Basenpaare und Aminosäurenummern sind am rechten Rand gezeigt.
5: Reinheit von rPhl-p-2-Mosaik und rPhl p 2. Mit Comassie gefärbtes Gel, das Phl p 2 (Bahn P2), Phl-p-2-Mosaik (Bahn P2M) und einen Molekulargewichtsmarker (Bahn M) enthält.
6: Massenspektroskopische Analyse von gereinigtem rPhl-p-2-Mosaik (A) und rPhl p 2 (B). Das Massen/Ladungsverhältnis ist auf der x-Achse gezeigt und die Signalintensität ist ausgedrückt als Prozentanteil des intensivsten Signals, das in dem untersuchten Massenbereich erhalten wurde.
7: Vergleich der IgE-Bindungskapazität von rPhl p 2 (P2) und dem rPhl-p-2-Mosaik (P2M). Auf Nitrocellulose getupftes rPhl p 2 (P2) und rPhl-p-2-Mosaik (P2M) ebenso wie Humanserumalbumin (HSA) wurden mit Serum von 12 mit Phl p 2 reaktiven auf Graspollen allergischen Patienten (1 bis 12) sondiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit ¹²⁵I-markierten Antihuman-IgE-Antikörpern nachgewiesen und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
8: Reduzierte allergene Aktivität von rPhl-p-2-Mosaik bestimmt durch Histaminfreisetzung aus Basophilen. Basophile von einem auf Graspollen allergischen Patienten wurden sich steigernden Konzentrationen von rPhl p 2 und rPhl-p-2-Mosaik (x-Achse) ausgesetzt. Die Histaminfreisetzung wird ausgedrückt als Prozentanteil der Gesamthistaminfreisetzung auf der y-Achse.
9: Kaninchen-anti-rPhl-p-2-Mosaik-Antikörper erkennen rPhl-p-2-Wildtypallergen. Kaninchenantiseren, die gegen rPhl-p-2-Mosaik (αP2M), KLH-gekuppeltes Mosaik (αP2M-KLH) und rPhl p 2 (αPhl p 2) ebenso wie gegen Puffer (C) gezüchtet worden waren, wurden Dot-Blot-KLH, Humanserumalbumin (HSA), rPhl p 2 (P2) und rPhl-p-2-Mosaik (P2M) ausgesetzt. Gebundene Kaninchenantikörper wurden mit ¹²⁵I-markiertem Esel-Antikaninchen-IgG nachgewiesen und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Tabelle 1: Eigenschaften von von Phl p 2 abgeleiteten synthetischen Peptiden. Sequenz, Anzahl der Aminosäuren, Position auf dem Phl-p-2-Allergen, Molekulargewicht und isoelektrischer Punkt der Peptide sind gezeigt. Peptid 1 entspricht SEQ ID Nr. 3, Peptid 3 entspricht SEQ ID Nr. 4 und Peptid 2 entspricht SEQ ID Nr. 5.
Tabelle 2: Hautreaktionen vom Soforttyp auf komplettes rPhl p 2 und auf Phl-p-2-Mosaik (P2M). Zwei gegen Lieschgraspollen allergische Patienten (Personen 1, 2) wurden auf Hautreaktivität mit P2 und P2M getestet. Die mittleren Quaddeldurchmesser (mm) sind für fünf verschiedene Konzentrationen von rPhl p 2 und Phl-p-2-Mosaik ebenso wie für Lieschgraspollenextrakt und Histamin gezeigt.
Tabelle 3: Hemmung der IgE-Bindung an rPhl p 2 bei gegen Graspollen allergischen Patienten durch Kaninchen-αP2M und Kaninchen-α-P2-Antikörper. Der Prozentanteil Hemmung der IgE-Bindung ist für fünf Patienten gezeigt.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1: Synthetische von Phl p 2 abgeleitete Peptide, denen die allergene Aktivität fehlt
Um Phl-p-2-Fragmente ohne allergische Aktivität zu finden, wurden Peptide, die jeweils etwa ein Drittel des Phl-p-2-Proteins aufwiesen, chemisch synthetisiert (Tabelle 1). Die Peptide hatten eine Länge von 32 bis 34 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von etwa 3,7 kDa und deckten zusammen die vollständige Phl-p-2-Aminosäuresequenz ab.
Die drei Peptide wurden synthetisiert unter Verwendung der Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Strategie mit HBTU-(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat)-Aktivierung (0,1 mmol Zyklen in kleinem Maßstab) auf dem Peptidsyntheseautomaten Modell 433A von Applied Biosystems (Foster City, CA). Vorbeladene PEG-PS-(Polyethylenglycol-Polystyrol)-Harze (0,15 bis 0,2 mmol/g Beladung) (von Septive Biosystems, Wanington, GB) wurden als Festphase verwendet, um die Peptide aufzubauen. Die Chemikalien wurden von Applied Biosystems erworben. Die Kupplung der Aminosäuren wurde bestätigt durch Überwachung der Leitfähigkeit in einem Feedback-Kontrollsystem. Ein Cysteinrest wurde jedem Peptid am N- oder C-Ende zugefügt, um die Kupplung der Peptide an die Träger zu erleichtern. Die Peptide wurden von den Harzen 2 Stunden lang mit einer Mischung aus: 250 μl destilliertem Wasser, 250 μl Triisopropylsilan (Flukan, Buchs, Schweiz), 9,5 ml TFA abgespalten und in tert.-Butylmethylether (Flukan, Buchs, Schweiz) ausgefällt. Die Identität der Peptide wurde mit Massenspektrometrie untersucht und sie wurden auf > 90% Reinheit mit präparativer HPLC gereinigt (PiChem, Graz, Österreich) (M. Focke, V. Mahlen, T. Ball, W. R. Spen, Y. Majlesi, P. Valent, D. Kraft, R. Valenta. Nonanaphylactic synthetic peptides derived from B cell epitopes of the major grass pollen allergen, Phl p 1, for allergy vaccination. FASEB J. 2001, 15: 2042–2044).
Die allergene Aktivität der von Phl p 2 abgeleiteten Peptide wurde ausgewertet, indem die IgE-Reaktivität des vollständigen rPhl p 2 mit den Peptiden durch Dot-Blot-Analyse (1) verglichen wurde. Auf Nitrocellulose getupfte von Phl p 2 abgeleitete Peptide (P1 bis P3), ein immunologisch nicht verwandtes Hauptgraspollenallergen, rPhl p 5 (S. Vrtala, W. R. Sperr, I. Reimitzer, R. van Ree, S. Laffer, W. D. Müller, P. Valent, K. Lechner, H. Rumpold, D. Kraft, O. Scheiner, R. Valenta. cDNA cloning of a major allergen from timothy grass (Phleum pratense) pollen; characterization of the recombinant Phl p V allergen. J. Immunol. 1993, 151: 4773–4781) und für Kontrollzwecke Humanserumalbumin ebenso wie ein Kontrollpeptid wurden den Seren von gegen Graspollen allergischen Patienten ausgesetzt und dem Serum einer nicht allergischen Person.
Gebundene IgE-Antikörper wurden wie früher beschrieben nachgewiesen (R. Valenta, M. Duchène, C. Ebner, P. Valent, C. Sillaber, P. Deviller, F. Ferreira, M. Tejkl, H. Edelmann, D. Kraft, O. Scheiner. Profilins constitute a novel farnily of functional plant pan-allergens. J. Exp. Med. 1992, 175: 377–385). Seren von allen 35 gegen Graspollen allergischen Patienten zeigten IgE-Reaktivität gegen auf Nitrocellulose getupftes rPhl p 2, aber kein Serum reagierte mit irgendeinem der drei von Phl p 2 abgeleiteten Peptide (1). Serum der nicht allergischen Person zeigte keine IgE-Reaktivität gegen irgendeines der Peptide oder Proteine.
Beispiel 2: Charakterisierung des rekombinanten Phl-p-2-Mosaikproteins
Ein rekombinantes Phl-p-2-Mosaikprotein wurde durch Rekombination der drei von Phl p 2 abgeleiteten Peptide in veränderter Sequenz erhalten. Dieses Mosaikprotein wurde erzeugt unter der Annahme, dass die Rekombination von drei nicht allergenen Phl-p-2-Fragmenten in anderer Reihenfolge ein Mosaikprotein mit zerstörter dreidimensionaler Struktur und demzufolge verminderter allergener Aktivität liefert. Außerdem wurde erwartet, dass das Mosaikprotein eine bessere Immunogenizität als die einzelnen kleineren Peptideinheiten aufweisen würde und die gesamte primäre Aminosäuresequenz von Phl p 2 erhalten bliebe, die somit die relevanten T-Zellepitope von Phl p 2 enthielte.
2 zeigt den Aufbau der drei Peptide im natürlichen Phl-p-2-Allergen im Vergleich zum Phl-p-2-Mosaikprotein. Um die zwei Proteine zu vergleichen, wurden ein rekombinantes Phl-p-2, das einen C-terminalen Hexahistidinschwanz aufwies, und ein rekombinantes Phl-p-2-Mosaikprotein, das auch einen C-terminalen Hexahistidinschwanz enthielt, erzeugt (2), damit die Reinigung beider Proteine mit Nickelaffinitätschromatographie möglich war (Quiagen, Hilden, Deutschland).
Das rekombinante Phl-p-2-Mosaik wurde konstruiert mit auf PCR basierender Genamplifikation der cDNAs, die die drei Peptide codierten in der 2 gezeigten Reihenfolge unter Verwendung der in 3 dargestellten Primer und der Phl p 2 codierenden cDNA (C. Dolecek, S. Vrtala, S. Laffer, P. Steinberger, D. Kraft, O. Scheiner, R. Valenta. Molecular characterization of Phl p II, a major timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen. FEBS Lett. 1993, 335: 299–304) als Matrize, wie beschrieben (B. Linhart, B. Jahn-Schmid, P. Verdino, W. Keller, C. Ebner, D. Kraft, R. Valenta. Combination vaccines for the treatment of grass pollen allergy consisting of genetically engineered hybrid molecules with increased immunogenicity. FASEB J. 2002, 16: 1301–1303).
4 zeigt die DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des rekombinanten Phl-p-2-Mosaikproteins. Das Mosaikprotein mit His-tag wird von einer DNA mit 309 bp codiert, die ein Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 11.769 Da codiert, das fast identisch ist mit dem rekombinanten Phl-p-2-Allergen mit Histag (11.784 Da).
Die cDNA, die ein rPhl-p-2-Allergen mit His-tag codiert, wurde mit PCR erhalten unter Verwendung einer Kombination des 5'-Primers P2/1 (SEQ ID Nr. 6) und des 3'-Primers P2/7 (SEQ ID Nr. 12):
und der cDNA, die Phl p 2 codiert, als Matrize.
Die cDNAs, die das Phl-p-2-Mosaik mit His-tag und das Phl-p-2-Allergen mit His-tag codierten, wurden getrennt in mit NdeI/EcoRI geschnittene Plasmide pET17b (Novagen) ligiert. Die DNA-Sequenzen der zwei Plasmidkonstrukte wurden durch Sequenzanalyse bestätigt und die rekombinanten Proteine wurden in Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) durch Induktion mit 0,5 mM Isopropyl-β-thiogalactopyranosid bei einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,4 in Flüssigmedium (LB-Medium enthaltend 100 mg/1 Ampicillin) weitere 4 Stunden lang bei 37°C exprimiert. E.-Coli-Zellen aus einer 500-ml-Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet und zur Reinigung unter nativen (rPhl p 2) oder denaturierenden Bedingungen (rPhl-p-2-Mosaik) nach Anleitung des Herstellers (Quiagen, Hilden, Deutschland) vorbereitet. Die Proteinproben wurden auf Reinheit untersucht mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und durch Proteinfärbung (S. P. Fling, D. S. Gregerson. Peptide and protein molecular weight determination by electrophoresis using a high-molarity Tris buffer system without urea. Anal. Biochem. 1986, 155: 83–88) (4).
5 zeigt die Reinheit der rekombinanten Proteine mit His-tag (rPhl p 2: P2; rPhl-p-2-Mosaik: P2M). Obwohl die zwei Proteine kein vollständig identisches Migrationsverhalten bei der SDS-PAGE zeigten, zeigte eine massenspektroskopische Analyse, die durchgeführt wurde, wie von V. Niederberger, B. Hayek, S. Vrtala, S. Laffer, A. Twardosz, L. Vangelista, W. R. Sperr, P. Valent, H. Rumpold, D. Kraft, K. Ehrenberger, R. Valenta, S. Spitzauer. Calcium-dependent immunoglobulin E recognition of the apo- and calcium-bound form of a cross-reactive two EF-hand timothy grass pollen allergen, Phl p 7. FASEB J. 1999, 13: 843–856 beschrieben, fast identische Molekulargewichte der beiden Proteine (rPhl p 2: 11.755 Da; rPhl-p-2-Mosaik: 11.770 Da), was gut übereinstimmte mit den abgeleiteten Molekulargewichten einschließlich der Methioninreste an ihren N-Enden (6).
Beispiel 3: Fehlende IgE-Reaktivität und allergene Eigenschaften bei rPhl-p-2-Mosaik
Die IgE-Bindungskapazität von gereinigtem Phl-p-2-Mosaik (P2M) wurde mit der von Phl-p-2-Wildtyp verglichen durch Dot-Blot-Versuche, wie für die Peptide beschrieben, unter Verwendung von Seren von 12 gegen Lieschgraspollen allergischen Patienten (7). Seren von allen 12 gegen Graspollen allergischen Patienten enthielten IgE-Antikörper gegen rPhl p 2, aber kein Serum zeigte eine IgE-Reaktivität gegenüber rPhl-p-2-Mosaik oder der negativen Kontrolle, Humanserumalbumin (7). Die stark verminderte allergene Aktivität des rPhl-p-2-Mosaiks wurde weiter gezeigt durch Histaminfreisetzung aus Basophilen und Hauttestversuche. Basophile von einem gegen Graspollen allergischen Patienten wurden durch Dextransedimentation angereichert und steigenden Konzentrationen von gereinigtem rPhl p 2 oder rPhl-p-2-Mosaik ausgesetzt, wie beschrieben (P. Valent, J. Besemer, M. Muhm, O. Majdic, K. Lechner, P. Bettelhei. Interleukin 3 activates human blood basophils via high-affinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86: 5542–5546).
Histamin, das in die freien Zellüberstände freigesetzt wurde, wurde in dreifachen Ansätzen mit Radioimmunoassay bestimmt und ausgedrückt als mittlerer Prozentanteil des Gesamthistamingehalts der Zellen, wie von Valent et al. beschrieben.
8 zeigt, dass das rPhl-p-2-Mosaik (maximale Freisetzung zwischen 1 und 10 μg/ml) eine mehr als 1000-fach reduzierte allergene Aktivität zeigte im Vergleich zu rPhl-p-2-Allergen (maximale Freisetzung 10^–3 μg/ml).
Die stark verminderte allergene Aktivität von rPhl-p-2-Mosaik wurde durch Hauttest bei gegen Graspollen allergischen Patienten bestätigt (Tabelle 2). SPTs (Haut-Prick-Tests) wurden an den Vorderarmen von einzelnen Personen durchgeführt. Aliquots mit jeweils 20 μl, die 5 Konzentrationen von rPhl p 2 und des von Phl p 2 abgeleiteten Mosaiks P2M enthielten (1 μg/ml, 2 μg/ml, 4 μg/ml, 8 μg/ml, 16 μg/ml) wurden aufgebracht. Zusätzlich wurden standardisierte Haut-Prick-Lösungen (Lieschgraspollenextrakt und Histamin) (Allergopharma, Reinbeck, Deutschland) getestet. Die Reaktionen wurden 20 Minuten nach dem SPT durch Fotografie aufgezeichnet und indem der mit Kugelschreiber umrundete Quaddelbereich mit einem Klebestreifen auf Papier übertragen wurde.
Der mittlere Quaddeldurchmesser (Dm) wurde berechnet, indem der maximale Längs- und Querdurchmesser gemessen wurde und ihre Summe durch 2 geteilt wurde, wie von Focke et al., 2001, beschrieben.
rPhl p 2 induzierte starke Quaddelreaktionen schon bei der geringsten getesteten Konzentration, d.h. 1 μg/ml, wohingegen rPhl-p-2-Mosaik nur milde Quaddelreaktionen bei den maximal getesteten Konzentrationen zeigte (d.h. 8 bis 16 μg/ml), was somit die verminderte allergene Aktivität des Mosaikproteins bestätigt.
Beispiel 4: Immunisierung mit rPhl-p-2-Mosaik induziert IgG-Antikörper, die rPhl-p-2-Wildtyp erkennen und die IgE-Bindung an Phl p 2 bei allergischen Patienten hemmen
Um zu testen, ob die Immunisierung mit Phl p 2 und Phl-p-2-Mosaik IgG-Antikörper induziert, die mit natürlichem Phl p 2 reagieren, wurden Kaninchen mit rPhl-p-2-Mosaik, KLH-gekuppeltem rPhl-p-2-Mosaik oder rPhl p 2 unter Verwendung von Freund's Adjuvans immunisiert, wie von Focke et al. beschrieben.
Die Reaktivität der Kaninchen-IgG-Antikörper mit rPhl p 2 wurde mit Dot-Blot-Versuchen untersucht (9). Phl-p-2-Wildtyp (P2) ebenso wie das entsprechende Immunogen Phl-p-2-Mosaik (P2M) wurden auf Nitrocellulosestreifen getupft (1 μg/Tupfen). Die Nitrocellulosen wurden Kaninchen-Präimmun- oder Immunseren (1:500) ausgesetzt und gebundene Kaninchenantikörper wurden mit einem 1:1000 verdünnten ¹²⁵I-markierten Esel-Antikaninchen-Antiserum (Amersham Pharmacia Biotech) nachgewiesen, wie von Valenta et al., 1992, beschrieben.
Das Kaninchen-anti-rPhl-p-2-Mosaikantiserum reagierte stark mit dem Immunogen (rPhl-p-2-Mosaik) ebenso wie mit dem rPhl-p-2-Allergen) (9). Die Antikörperreaktivität war von vergleichbarer Intensität wie die, die mit dem Antiserum erhalten wurde, das durch Immunisierung mit dem KLH-gekuppelten Mosaik erzeugt wurde und stärker als die Reaktivität, die durch Immunisierung mit dem rPhl-p-2-Allergen induziert wurde (9).
Beispiel 6: Messung blockierender Antikörper
Es wurde mit ELISA-Konkurrenztest unter Verwendung von Seren aus 5 gegen Graspollen allergischen Patienten untersucht, ob IgG-Antikörper, die durch Immunisierung mit dem rPhl-p-2-Mosaik induziert wurden, die Bindung von Serum-IgE aus allergischen Patienten an vollständiges rPhl p 2 hemmen (Tabelle 3). ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Rokslide, Dänemark) wurden mit rPhl p 2 (1 μg/ml) beschichtet und entweder mit einer 1:100-Verdünnung jeweils von anti-Phl-p-2-Mosaik und anti-Phl-p-2-Antiserum und für Kontrollzwecke mit den entsprechenden Präimmunseren vorinkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1:3 verdünnten Seren von 5 gegen Phl p 2 sensibilisierten gegen Graspollen allergischen Patienten inkubiert und gebundene IgE-Antikörper wurden mit monoklonalen Ratten-Antihuman-IgE-Antikörpern, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert waren, 1:1000 verdünnt, nachgewiesen (Pharmingen, San Diego, CA),. Der Prozentanteil Hemmung der IgE-Bindung, der durch Vorinkubation mit anti-Phl-p-2-Mosaik und Phl p 2 erreicht wurde, wurde wie folgt berechnet: % Hemmung der IgE-Bindung = 100 – OD_l/OD_p × 100. OD_l und OD_p bedeuten die Extinktionen nach Vorinkubation mit Kaninchen-Immun- bzw. Präimmunserum, wie von Focke et al., 2001, beschrieben.
Die Anti-Phl-p-2-Mosaikantikörper hemmten die Bindung von IgE von gegen Graspollen allergischen Patienten an Phl p 2 (20,93% durchschnittliche Hemmung), wenn auch in geringerem Ausmaß als es durch Präin kubation mit Antikörpern erreicht wurde, die durch Immunisierung mit dem rPhl-p-2-Allergen induziert wurden (54,73% durchschnittliche Hemmung).
Die Ergebnisse der Immunisierungsstudien zeigen somit, dass Antikörper, die gegen das rPhl-p-2-Mosaik gezüchtet werden, das Phl-p-2-Wildtypallergen erkennen und die IgE-Erkennung von Phl p 2 bei allergischen Patienten hemmen.
SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Mosaikantigens, das von einem Allergen abgeleitet ist, wobei a) in einer ersten Stufe das Allergen in mindestens zwei Teile gespalten wird und die IgE-Reaktivität jeden Teils bestimmt wird und b) in einer zweiten Stufe solche Teile des Allergens, die keine nachweisbare IgE-Reaktion zeigen zu einem Mosaikantigen kombiniert werden, das die Aminosäuren des Allergens aufweist, wobei die Reihenfolge der Aminosäuren des Mosaikantigens verschieden ist von der des natürlich vorkommenden Allergens.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in der ersten Stufe mindestens zwei Teile des Allergens durch chemische Synthese oder unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion hergestellt werden und jeder Teil des Allergens getrennt mit Serum reagieren gelassen wird, das von allergischen Personen erhalten wurde und die Reaktivität von IgE-Antikörpern, die in dem Serum enthalten sind, mit jedem Teil des Allergens bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Reihenfolge der Teile des Allergens ohne wesentliche Reaktivität mit IgE-Antikörpern, die von allergischen Personen erhalten wurden, nicht der Reihenfolge dieser Teile in dem natürlich vorkommenden Allergen entspricht, insofern als der Teil, der normalerweise am N-Ende vorkommt und der Teil, der normalerweise am C-Ende vorkommt, gegeneinander ersetzt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Allergen ein Allergen der Gruppe 2 ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Allergen Lieschgraspollenallergen Phl p 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Allergen Phl p 2 in drei Peptide aufgespalten wird, nämlich Peptid 1 mit den Aminosäuren 1 bis 33, Peptid 2 mit den Aminosäuren 34 bis 64 und Peptid 3 mit den Aminosäuren 65 bis 96 der Aminosäuresequenz von natürlich vorkommendem Phl p 2 und das Mosaikantigen erzeugt wird, indem die Peptide in der Reihenfolge Peptid 1, Peptid 3 und Peptid 2 verbunden werden.
Mosaikallergen mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
DNA-Sequenz mit SEQ ID Nr. 2, die das Mosaikallergen von Anspruch 7 codiert.
Verwendung eines Mosaikallergens, das mit einem Verfahren nach Anspruch 6 erhältlich ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer allergischen Reaktion, wobei die allergische Reaktion durch Graspollen verursacht wird.
Verwendung eines Mosaikallergens nach Anspruch 9, wobei die allergische Reaktion durch Lieschgraspollen verursacht wird.
Verwendung eines Mosaikallergens nach Anspruch 10, wobei die allergische Reaktion durch Lieschgraspollen Phl p 2 verursacht wird.
Impfstoff zur Verwendung zur Behandlung von gegen Graspollen allergischen Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Mosaikallergen, das erhältlich ist mit dem Verfahren nach Anspruch 6, oder das Mosaikallergen von Anspruch 7 enthält.
Impfstoff zur Verwendung zur Behandlung von gegen Graspollen allergischen Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass er eine DNA-Sequenz, die ein Mosaikantigen codiert, das erhältlich ist mit dem Verfahren nach Anspruch 6, oder die DNA von Anspruch 8 aufweist.