DE60129528T2

DE60129528T2 - Impfstoffe, die hybride Polypeptide mit mindestens zwei verschiedenen Allergenen enthalten

Info

Publication number: DE60129528T2
Application number: DE60129528T
Authority: DE
Inventors: Birgit Linhart; Dietrich Dr. Kraft; Rudolf Dr. Valenta
Original assignee: Biomay AG
Current assignee: Biomay AG
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2021-12-21
Also published as: US20110150920A1; ES2287067T3; US7862828B2; ATE367826T1; EP1219301A1; US20020173625A1; EP1219301B1; HK1046648A1; HK1046648B; DE60129528D1; PT1219301E; EP1221317A1; DK1219301T3

Description

Typ-I-Allergie ist eine genetisch bestimmte Überempfindlichkeitsstörung, die weltweit nahezu 500 Millionen Menschen betrifft. Unmittelbare Symptome (allergische Rhinokonjunktivitis, Asthma, anaphylaktischer Schock) sowie späte Symptome (atopische Dermatitis, bestimmte Formen von allergischem Asthma bronchiale) basieren auf der Erkennung von Allergenen durch IgE-Antikörper. Die unmittelbaren Symptome resultieren aus der allergen-induzierten Vernetzung von an Effektorzellen gebundenem IgE und der nachfolgenden Freisetzung biologischer Mediatoren (z.B. Histamin, Leukotriene), wohingegen die späten Symptome durch IgE-vermittelte Präsentation von Allergenen an T-Zellen und Aktivierung von Eosinophilen verursacht werden können.
Der einzige Ansatz einer Heiltherapie, eine allergenspezifische Immuntherapie, basiert auf der systemischen Verabreichung von Allergenen an Patienten um eine allergenspezifische „Unempfänglichkeit" zu induzieren. (Noon, Lancet 1911, 1: 1572-1573; Bousquet et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol., 102: 558-562; Durham und Till (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102, 157-164). Unter Verwenden herkömmlicher Technologien war es nicht möglich, reine Allergene für eine spezifische Immuntherapie herzustellen und daher wird eine Impfung mit Allergenextrakten durchgeführt. Diese Extrakte bestehen aus Allergenen und nicht-allergenen Bestandteilen, die schwierig zu standardisieren sind. Patienten können daher nicht entsprechend ihres spezifischen Sensibilisierungsprofils behandelt werden und infolge der Verabreichung von allergenem Material werden oft anaphylaktische Nebenwirkungen beobachtet (Mellerup et al. (2000) Clin. Exp. Allergy 30, 1423-1429).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine vorteilhafte Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von allergischen Erkrankungen bereitzustellen.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass es möglich ist, Hybridallergene, die die Epitope von immunologisch unterschiedlichen Allergenen zusammenfügen, zur Diagnose und Therapie von Typ-I-Allergie zu erzeugen. Die Erfindung betrifft daher ein Hybridpolypeptid, das mindestens zwei verschiedene allergene Proteine oder Fragmente davon umfasst, wobei jedes Fragment aus mindestens acht aufeinander folgenden Aminosäuren des entsprechenden allergenen Proteins besteht, dadurch gekennzeichnet, dass das allergene Protein, von dem das Hybridpolypeptid stammt, aus immunologisch nicht miteinander verwandten Hauptallergenen aus Timotheegraspollen besteht.
In einer Ausführungsform umfasst das Hybridpolypeptid mindestens ein vollständiges allergenes Protein. Es kann auch zwei verschiedene, vollständige allergene Proteine umfassen. Es ist nicht nur möglich, verschiedene Gruppen von allergenen Graspollen, sondern auch allergene Proteine, die von verschiedenen Quellen stammen, zu kombinieren. In einer speziellen Ausführungsform stellen alle Sequenzen des Hybridpolypeptids, die von allergenen Proteinen stammen, vollständige allergene Proteine dar.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Hybridpolypeptid mindestens ein Fragment eines allergenen Proteins, wobei das Fragment aus mindestens acht aufeinander folgenden Aminosäuren des entsprechenden allergenen Proteins besteht. Vorzugsweise besteht das Fragment aus mindestens 12, besonders bevorzugt aus mindestens 20 und ganz besonders bevorzugt aus mindestens 30 aufeinander folgenden Aminosäuren des entsprechenden allergenen Proteins. In einer weiteren Ausführungsform sind alle von allergenen Proteinen stammenden Aminosäuresequenzen Fragmente aus mindestens acht aufeinander folgenden Aminosäuren der entsprechenden allergenen Proteine, von denen sie stammen. Die Länge dieser Fragmente liegt vorzugsweise bei mindestens 12, besonders bevorzugt bei mindestens 20 und ganz besonders bevorzugt bei mindestens 30 aufeinander folgenden Aminosäuren des entsprechenden allergenen Proteins.
Wenn Fragmente allergener Proteine verwendet werden ist es möglich, ein Hybridpolypeptid herzustellen, das nur Fragmente umfasst, deren allergene Aktivität kleiner ist als diejenige der entsprechenden allergenen Proteine, von denen sie stammen. Dieser Effekt kann sich aus der Zerstörung von Epitopen infolge einer im Vergleich zu dem Protein mit vollständiger Länge modifizierten Sekundär- oder Tertiärstruktur des Fragments ergeben. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform besitzt das Hybridpolypeptid eine allergische Aktivität, die kleiner ist als die allergene Aktivität jedes allergenen Proteins, von dem das Hybridpolypeptid stammt. Gewöhnlich beträgt die allergene Aktivität des Hybridpolypeptids weniger als 50 % der Aktivität jedes allergenen Proteins, von dem das Hybridpolypeptid stammt. In einer speziellen Ausführungsform besitzt das Hybridpolypeptid im Wesentlichen keine allergene Aktivität.
Gemäß der Erfindung wird die allergene Aktivität einer Probe durch Bestimmen der IgE-Antikörper, die in einem Testtier bei Anwenden der Probe induziert werden, bestimmt. Die allergene Aktivität wird vorzugsweise in geeigneten in vitro- oder in vivo-Tests definiert. Ein bevorzugter in vitro-Test ist der Basophile Histamin-Freisetzungstest, der bei Vrtala et al., J. Clin. Invest. 1997, 99, S. 1673-1681 beschrieben ist. Alternativ dazu wird die allergene Aktivität in einem Hauttest, wie er bei van Hage-Hamsten et al., J. Allergy Clin. Immunol., 1999, 104, S. 969-977 oder bei Pauli et al., Clin. Exp. Allergy, 2000, 30, S. 1076-1084 beschrieben ist, bestimmt.
In einer Ausführungsform umfasst das Hybridpolypeptid zwei Teile, die von zwei verschiedenen allergenen Proteinen stammen. Das erfindungsgemäße Hybridpolypeptid kann jedoch drei, vier, fünf oder noch mehr Teile, die jeweils von verschiedenen allergenen Proteinen stammen, umfassen.
Das erfindungsgemäße Hybridpolypeptid besteht nicht notwendiger Weise nur aus Aminosäuresequenzen, die von allergenen Proteinen stammen. Es ist möglich, dass künstliche Sequenzen (z.B. Spacer-Sequenzen) zwischen die Einheiten, die die Sequenzen von verschiedenen allergenen Proteinen darstellen, inseriert werden. Es ist auch möglich, dass die Aminosäuresequenzen natürlich vorkommender allergener Proteine, z.B. mittels Genmanipulation modifiziert werden, um Mutationen einzuschleusen, die die allergene Aktivität des Fragments verringern. Das Hybridpolypeptid umfasst vorzugsweise eine „tag"-Sequenz, die die Reinigung des Hybridpolypeptids nach Expression in einer Wirtszelle erleichtert. Ein Beispiel für ein „tag" ist das Hexahistidin-Tag, das eine Reinigung mit Hilfe von Ni² ⁺-Chelatchromatographie ermöglicht. Im Stand der Technik sind weitere Tags bekannt.
Das erfindungsgemäße Hybridpolypeptid kann mit verschiedenen Verfahren hergestellt werden. In einer Ausführungsform wird das Polypeptid durch Exprimieren eines Polynukleotids in einer Wirtszelle hergestellt. Die Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eine eukaryotische Zelle sein. Wenn prokaryotische Zellen verwendet werden, ist der Wirt vorzugsweise E. coli. Bespiele für eukaryotische Zellen sind Hefen, Insektenzellen oder -zelllinien, wie beispielsweise CHO-Zellen. Nach Einschleusen eines geeigneten, für das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden Polynukleotids in eine Wirtszelle, wird die Wirtszelle unter solchen Bedingungen, bei denen das Polypeptid in der Zelle exprimiert wird, kultiviert. Das Polypeptid kann durch die Zelle sekretiert werden oder sich in der Zelle ansammeln. Zur Wiedergewinnung des Hybridpolypeptids aus der Zelle oder dem Kulturmedium können bekannte Reinigungsverfahren verwendet werden.
Die Erfindung umfasst auch die Herstellung des Hybridpolypeptids durch chemische Synthese, wie beispielsweise Festphasensynthese.
Die Erfindung betrifft ferner ein Polynukleotid, das für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes können viele verschiedene Polynukleotidmoleküle für ein einziges Polypeptid codieren. Das erfindungsgemäße Polynukleotid ist vorzugsweise ein Expressionskonstrukt zum Erhalten des Polypeptids nach der Expression in Wirtszellen. Des Weiteren kann das Expressionskonstrukt in der Wissenschaft allgemein bekannte Bestandteile, wie beispielsweise Promotorsequenzen, Gene, die für Resistenzfaktoren gegen Antibiotika codieren, einen Replikationsursprung, usw. umfassen.
Die Erfindung betrifft ferner eine mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid transfizierte oder transformierte Zelle. Die Zelle kann eine eukaryotische Zelle oder eine prokaryotische Zelle sein. Eukaryotische Zellen können mit einem an sich bekannten Verfahren, wie beispielsweise Calciumphosphat-vermittelter Transfektion, Elektroporation, Lipofektion usw. transfiziert werden.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid, ein Polynukleotid oder eine Zelle gemäß der Erfindung enthält. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel, wie beispielsweise einen Puffer oder eine Salzlösung enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung ist vorzugsweise eine Impfstoffzusammensetzung. In einer speziellen Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung ferner einen Hilfsstoff, wie beispielsweise Al(OH)₃.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Hybridpolypeptids. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen eines für ein Hybridpolypeptid codierenden Polynukleotids, das Einschleusen des Polynukleotids in eine Wirtszelle, das Kultivieren der so erhaltenen Wirtszellen unter solchen Bedingungen, bei denen das Hybridpolypeptid exprimiert wird und das Wiedergewinnen des Expressionsprodukts aus der Zelle. Das Polynukleotid kann mit in der Wissenschaft bekannten Verfahren hergestellt werden, wobei die Verwendung von PCR-Technologie zum Herstellen des das Hybridpolypeptid codierenden Polynukleotids bevorzugt wird.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Hybridpolypeptids, eines Polynukleotids oder einer Zelle gemäß der Erfindung zum Herstellen eines Arzneimittels zur Behandlung einer allergischen Störung.
Ein solches Arzneimittel kann aus dem Polynukleotid, das für einen Hybridimpfstoff codiert, der direkt für eine DNA-basierte Impfung gegen Typ-I-Allergie verwendet werden kann, bestehen. Das rekombinante oder synthetische Hybridpolypeptid kann zum Herstellen von Formulierungen für die orale, sublinguale oder parenterale Behandlung von allergischen Störungen des Typs I verwendet werden, da diese derzeit routinemäßig bei einer Immuntherapie eingesetzt werden. Beispiele dafür sind Formulierungen für eine sublinguale Immuntherapie oder an einen Hilfsstoff gebundene Hybridpolypeptide für eine Injektionsimmuntherapie. Mögliche Anwendungen umfassen auch auf Zellen basierende Formen von Immuntherapien, die z.B. auf dendritischen Zellen oder anderen, Antigen präsentierenden Zellen basiert werden können. Solche Zellen werden transformiert und exprimieren das Antigen in vivo. Es werden bevorzugt autologe Zellen, die mit geeigneten Vektoren transformiert sind, verwendet.
Eine Form der Anwendung kann die subcutane Injektion von an einen Hilfsstoff gebundenen Hybridpolypeptiden sein. Eine weitere Möglichkeit ist die orale oder nasale Verabreichung des Hybridpolypeptids, um die immunologische Toleranz oder Anergie gegen die Bestandteile der Hybridpolypeptide zu induzieren. Alle diese möglichen Formulierungen können entsprechend den Vorgaben (Dosierung, Hilfsstoffe, Verabreichungsschemata), die einem Fachmann bekannt sind, zubereitet werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Hybridpolypeptids, eines Polynukleotids oder einer Zelle gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen Impfung oder Toleranzinduktion. Eine prophylaktische Verabreichung der Hybridpolypeptide meint die Verabreichung des Polypeptids an Individuen, vorzugsweise Kinder, die noch nicht an einer Typ-I-Allergie leiden, um einen Zustand immunologischer Toleranz, Anergie oder Nicht-Empfänglichkeit oder eine schützende Immunität gegen die Bestandteile des Hybridimpfstoffs zu induzieren. Dies kann mit Hilfe der verschiedenen Protokolle, die zur Behandlung einer etablierten allergischen Störung vorgestellt wurden, erreicht werden. Die prophylaktische Behandlung kann mit Hybridpolypeptiden, die aus Hybridpolypeptiden oder den Polynukleotiden, die für die Hybridpolypeptide codieren, bestehen, durchgeführt werden, wie oben kurz dargestellt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Hybridpolypeptids zum Nachweis von Antikörpern gegen ein allergenes Protein in einer Probe. Der Antikörper kann ein IgM-, IgE-, IgG- oder IgA-Antikörper sein. Die Konzentration des Antikörpers kann aus einer Probe, die aus einer Körperflüssigkeit erhalten wurde, bestimmt werden. Die Probe kann aus Menschen oder Tieren stammen. Bei entsprechenden Tests können ein auf einer festen Phase immobilisiertes Hybridpolypeptid oder das Hybridpolypeptid in der flüssigen Phase verwendet werden. Beispiele für solche Tests können ELISA-Tests, Western Blot-Tests oder jeder andere Test sein, bei dem das Hybridpolypeptid immobilisiert ist, um an spezifische Antikörper aus der Testprobe zu binden. Alternativ dazu wird das Hybridpolypeptid direkt zu der Antikörper enthaltenden Flüssigkeit gegeben, um spezifische Antikörper zu adsorbieren, wie z.B. bei kompetitiven, immunologischen Assays.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch für zelluläre Tests, wie beispielsweise einen T-Zellproliferationstest, Mediatorfreisetzungstest usw. verwendet werden. Das Hybridpolypeptid kann verschiedenen Typen von Zellen ausgesetzt werden, um messbare Reaktionen auszulösen. Im Fall von allergischen Effektorzellen (z.B. basophilen Mastzellen, Eosinophilen) können solche Reaktionen die Freisetzung von Histamin oder anderen Mediatoren (z.B. Leukotrienen, Serotonin, ECP) umfassen. Bei einem anderen Typ von Assay können die Proliferation oder der Tod (z.B. Apoptose) von Zellen z.B. durch die Aufnahme von ³H-Thymidin oder durch irgendeinen anderen geeigneten Assay gemessen werden. Solche Zellen können T-Zellen sein. Des Weiteren können Hybridpolypeptide dazu verwendet werden, die Freisetzung von Cytokinen oder anderen immunologisch relevanten Substanzen (z.B. aus T-Zellen) zu induzieren, was gemessen werden kann. Zudem können sie in Antigenpräsentationstests verwendet werden. Das erfindungsgemäße Hybridpolypeptid. kann auch zum Zweck eines diagnostischen Screenings verwendet werden. Hybridpolypeptide können auch zum Testen der Provokation in vivo verwendet werden. Entsprechende Tests können Hauttests (z.B. Hautstichtest [Prick-Test] oder Intradermaltest), Nasenprovokationstests, alle Formen eines Tests einer Nahrungsmittelherausforderung oder bronchiale Provokationstests umfassen.
Da Hybridpolypeptide Epitope nicht miteinander verwandter Allergene enthalten können, können sie für diagnostische Screening-Tests (in vitro, in vivo, wie oben kurz dargestellt ist) verwendet werden, um die Sensibilisierung oder Unempfänglichkeit gegen einen der Bestandteile des Hybridpolypeptids nachzuweisen. Dies kann ermöglichen, einem Arzt einen diagnostischen Test, der zum Screenen nach sensibilisierten Patienten in schneller Weise geeignet ist, bereitzustellen. Derzeit bestehen solche Tests (z.B. Phadiatop, Pharmacia, Uppsala, Schweden) aus einer Mischung nicht-kovalent gebundener Allergene, die an einen Träger gekoppelt sind. Die Kopplungsrate der einzelnen Bestandteile ist daher schwer zu steuern, während ein Hybridpolypeptid eine bevorzugte Formulierung für die Zubereitung eines solchen Screening-Tests darstellen würde.
Mehr als 40 % aller allergischen Patienten sind gegen Graspollen von verschiedenen Spezies sensibilisiert. Aufgrund ihrer weltweiten Verbreitung und ihrer starken Pollenproduktion stellen Gräser ebenso bedeutende Quellen für Allergene dar. Sie enthalten eine Vielzahl verschiedener allergener Bestandteile, die als kreuzreaktive Allergene in verschiedenen Monokotyledonen auftreten. Die Erfinder zeigten, dass es durch rekombinante DNA-Technologie möglich ist, Hybridallergene zu erzeugen, die aus immunologisch nicht miteinander verwandten Allergenen und ihren Epitopen bestehen.
In einem ersten Schritt wurden häufige Co-Sensibilisierungen unter Verwenden gereinigter Allergene aus Timotheegraspollen verwendet, um die am häufigsten erkannten Allergenkombinationen für den Hybridallergen-Ansatz zu selektieren. Gemäß diesen Pilotversuchen wurden Hybride, die aus immunologisch nicht miteinander verwandten Hauptallergenen aus Timotheegraspollen bestehen, konstruiert. Diese umfassten Hybride der Hauptallergene der Timotheegraspollen Ph] p 5/Phl p 1, Phl p 2/Phl p 6 und eine Kombination aus allen vier Molekülen. Wie für Phi p 2/Phl p 6 gezeigt wurde, fanden wir keine Hinweise darauf, dass eine bestimmte Reihenfolge bei der Konstruktion der einzelnen Bestandteile die Präsentation der Epitope beeinflussen würde. Sowohl bei dem rPhl p 2/Phl p 6-Hybrid als auch bei dem rPhl p 6/Phl p 2-Hybrid waren die relevanten B- und T-Zellepitope der Bestandteile konserviert. Das Riesenhybrid, das aus allen 4 Allergenen bestand, enthielt ebenso die relevanten Epitope der einzelnen Bestandteile.
Der Hybridallergen-Ansatz wird neue Möglichkeiten für die Diagnose und Behandlung von Typ-I-Allergie eröffnen. Hybride, die aus den am häufigsten erkannten Allergenen mit konservierten Epitopen bestehen, stellen Kandidaten-Moleküle für sowohl in vitro- als auch in vivo-Screeningtests nach Allergien dar. Das Riesenhybrid, das in der vorliegenden Anwendung beschrieben ist, wird wenn es zur Diagnose verwendet wird, wahrscheinlich mehr als 95 % der auf Timotheegraspollen allergischen Patienten identifizieren, da es den meisten der relevanten IgE-Epitope, die in natürlichem Timotheegraspollen-Extrakt vorhanden sind, ähnelt. Moleküle, wie beispielsweise das Riesenhybrid, können auch für andere allergene Systeme (z.B. Milbenallergie) hergestellt werden. Der Vorteil, Hybridallergene zur Diagnose einzusetzen ist, dass sie in einer gut kontrollierten Weise hergestellt werden können. Im Gegensatz zu natürlichen Allergenextrakten, die aus einer schwer zu standardisierenden Mischung aus Allergenen und nicht-allergenen Materialien bestehen, werden Hybridallergene die relevanten Epitope in einen genau definierten Verhältnis enthalten.
Rekombinante Allergene können ebenso für eine Immuntherapie verwendet werden. Sie können entweder aus den biologisch aktiven Bestandteilen oder aus hypoallergenen Allergeneinheiten bestehen. Hybridallergene, die häufige Co-Sensibilisierungsmuster bedecken, können dann zur Behandlung von Allergien auf komplexe Allergenquellen, z.B. eine Allergie auf Graspollen, verwendet werden, da sie den relevanten Epitopen des vollständigen Extrakts ähneln. Da die Hybridallergene aus definierten Bestandteilen bestehen, wird es möglich sein, genau definierte Formulierungen zur Impfstoffbehandlung herzustellen. Hybridallergene die aus hypoallergenen Varianten hergestellt werden, werden in hohen Dosen toleriert werden und können daher wie Impfstoffe verwendet werden, die regelmäßig zur Prophylaxe viraler Infektionen verwendet werden. In dieser Hinsicht wird auch in Betracht gezogen, Hybridallergene, die die Epitope der am meisten relevanten Allergene enthalten, zur prophylaktischen Impfung und Toleranzinduktion sogar in noch nicht sensibilisierten Individuen zu verwenden.
Die Tatsache, dass die Fusion verschiedener antigener Bestandteile in Form eines Hybridmoleküls die Immunogenität der einzelnen Bestandteile erhöhte, hat etliche Folgen für allergenspezifische Immuntherapien und Impfungen allgemein. Allergene oder Antigene gegen die Immunreaktionen gewünscht sind und die von sich aus eine geringe Immunogenität zeigen, können mit Hybriden fusioniert werden, um so ihre Immunogenität zu erhöhen, ohne dabei andere Trägerproteine oder Hilfsstoffe zu verwenden. Dieses Prinzip wird ermöglichen, ein hohes Ausmaß an schützenden Antikörperreaktionen gegen Allergene, Allergenfragmente, Allergenepitope oder deren Nachahmern (Mimicks) zu induzieren. Unter Verwenden dieses Prinzips ist es auch möglich, die Immunreaktion gegen Antigene/Epitope, die von infektiösen Mitteln, Tumoren oder anderen Bestandteilen stammen und gegen die Immunreaktionen nur schwer induziert werden können, zu erhöhen.
Beschreibung der Tabelle und der Figuren:
Tabelle 1 zeigt die Prozent Hemmung der Bindung von IgE an rekombinantes Phl p 2 und Phl p 6, die nach Voradsorption von Seren aus 20 Patienten an die Hybridallergene (rPhl p 2/rPhl p 6, rPhl p 6/rPhl p 2) oder die rekombinanten Allergene (rPhl p 2, rPhl p 6) erreicht wurde.
Tabelle 2 zeigt die Prozent Hemmung der Bindung von IgE an rekombinantes Phl p 1, Phl p 5 und Bet v 1, die nach Voradsorption von Seren aus 20 Patienten an das Hybridallergen (rPhl p 5/rPhl p 1) oder die rekombinanten Allergene (rPhl p 1, rPhl p 5 und rBet v 1) erreicht wurde.
Tabelle 3. Murine Antiseren, die gegen Hybridmoleküle erzeugt wurden, hemmen die Bindung von IgE von auf Graspollen allergischen Patienten an die einzelnen Allergene. An eine ELISA-Platte gebundene Allergene (A:rPhl p 2 und rPhl p 6; B: rPhl p 1 und rPhl p 5) wurden mit murinen Antiseren (murinem anti-rP2-P6, anti-rP6-P2, anti-rPhl p 2, anti-rPhl p 6, anti-rP5-P1, anti-rPhl p 1, anti-rPhl p 5) vorinkubiert. Die Prozent Hemmung der Bindung von IgE, die bei 4 auf Graspollen allergischen Patienten erhalten wurde sind gezeigt.
1 zeigt die Häufigkeit der Co-Sensibilisierung gegen die Timotheegraspollen-Allergene rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6, wie sie in einer Population von 110 auf Graspollen allergischen Patienten bestimmt wurde.
In 2 ist die Konstruktion von Hybrid-Impfstoffen skizziert. Die Fusion der beiden Gene (z.B. Phl p 5, Phl p 1) wird durch eine zweistufige PCR-Reaktion vermittelt, wobei in der ersten PCR-Reaktion überlappende Enden erzeugt werden und anschließend die Amplifikation beider Sequenzen in einem zweiten PCR-Schritt erfolgt.
3 zeigt das Ergebnis aus Beispiel 3. Gereinigte Timotheegraspollen-Allergene (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6) und deren Hybride (rPhl p 5/rPhl p 1, rPhl p 2/rPhl p 6 und rPhl p 6/rPhl p 2) wurden auf ein SDS-Polyacrylamidgel geladen und mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Die Molekulargewichte sind am linken Rand angegeben.
In 4(A) wurden die Dots eines gereinigten rekombinanten Hybrids, das aus Phl p 6/Phl p 2/Phl p 5/Phl p 1 bestand, auf Nitrocellulosefiltern dargestellt. In der Reihe (B) wurden rPhl p 2 (Bahnen 1, 3, 4 und 5) und rPhl p 5 (Bahn 2) immobilisiert. Die Filter wurden mit Kaninchen-Antiseren gegen rPhl p 1 (Bahn 1), rPhl p 2 (Bahn 2), rPhl p 5 (Bahn 3) und rPhl p 6 (Bahn 4) inkubiert. Der Filter in Bahn 5 wurde einem murinen, monoklonalen anti-His-Tag-Antikörper ausgesetzt.
Die 5 bis 7 zeigen, dass rekombinante Hybridmoleküle bei Mäusen stärkere IgG₁-Antikörperreaktionen induzierten als die einzelnen Bestandteile oder Mischungen davon.
5. An eine ELISA-Platte gebundene, gereinigte rekombinante Allergene (A: rPhl p 2; B: rPhl p 6; C: rPhl p 1; D: rPhl p 5) wurden mit Seren von Mäusen (8 Mäuse pro Gruppe), die mit den Hybridmolekülen (rP2-P6, rP6-P2, rP5-P1), den einzelnen rekombinanten Allergenen (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6) oder mit Timotheegraspollen-Extrakt immunisiert worden waren, wie an der x-Achse angegeben ist, inkubiert. Die durchschnittlichen Mengen an IgG₁ aus Seren, die 4 und 8 Wochen nach der Immunisierung gesammelt wurden, entsprechen den OD-Werten, die auf der y-Achse angegeben sind.
6. An eine ELISA-Platte gebundene, gereinigte rekombinante Allergene (rPhl p 1, rPhl p 2, Phl p 5, rPhl p 6) wurden mit Seren von Mäusen (8 Mäuse pro Gruppe), die mit (A) dem Riesenmolekül oder den einzelnen rekombinanten Allergenen rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6 und (B) dem Riesenmolekül oder einer äquimolaren Mischung aus rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6 immunisiert worden waren, wie an der x-Achse angegeben ist, inkubiert. Die durchschnittlichen Mengen an IgG₁ aus Seren, die 4 und 8 Wochen nach der Immunisierung gesammelt wurden, entsprechen den OD-Werten, die auf der y-Achse angegeben sind.
7. An eine ELISA-Platte gebundenes Riesenmolekül (A) und Timotheegraspollen-Extrakt (B) wurden mit Seren von Mäusen (8 Mäuse pro Gruppe), die mit dem Riesenmolekül oder Timotheegraspollen-Extrakt immunisiert worden waren, wie an der x-Achse angegeben ist, inkubiert. Die durchschnittlichen Mengen an IgG₁ aus Seren, die 4 und 8 Wochen nach der Immunisierung gesammelt wurden, entsprechen den OD-Werten, die auf der y-Achse angegeben sind.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter.
Beispiel 1: Bestimmung häufiger Co-Sensibilisierungsmuster
Graspollen enthalten eine Vielzahl immunologisch verschiedener und verwandter Allergene. Diese Bestandteile werden mit verschiedenen Häufigkeiten und Intensitäten erkannt. Die rekombinanten Timotheegraspollen-Allergene, rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6, wurden vorher als die wichtigsten Bestandteile identifiziert, die den meisten IgE-Epitopen von natürlichen Graspollen-Extrakten ähneln (Niederberger et al. (1998), IgE antibodies to recombinant Pollen allergens (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 und Bet v 2) account for a high percentage of grass pollen-specific IgE. J. Allergy Clin. Immunol., 101: 258-264). Die Ergebnisse der Beurteilung der Co-Sensibilisierungen bei 110 auf Graspollen allergischen Patienten gegen Kombinationen der rekombinanten Timotheegraspollen-Allergene sind in 1 dargestellt. ELISA-Tests mit gereinigten rekombinanten Allergenen zeigten, dass 60 % der Patienten gegen rPhl p 1 und rPhl p 5 co-sensibilisiert waren, 30 % IgE-Antikörper gegen rPhl p 2 und rPhl p 6 enthielten und 30 % gleichzeitig auf alle vier rekombinanten Allergene reagierten (1). Vorhergehende kompetitive Untersuchungen hatten gezeigt, dass eine Mischung der obigen vier Allergene die Mehrzahl an IgE-Epitopen, die in 8 verschiedenen Monokotyledonen-Pollen (Gräsern, Weizen) vorhanden waren, enthielt (Laffer et al (1996), Comparison of recombinant timothy grass Pollen allergens with natural extract for diagnosis of grass Pollen alergy in different populations, J. Allergy Clin, Immunol., 98: 652-658).
Patientenseren, Antiseren und rekombinante Allergene:
Seren von 110 allergischen Patienten wurde über ein positives Ergebnis in einem Timotheegraspollen-RAST (Radio-Allergo-Sorbent-Test) und durch Bestimmung der IgE-Antikörper gegen Timotheegraspollen-Extrakt mittels Western Blotting so charakterisiert, wie es beschrieben worden war (Niederberger et al. (1998), J. Allergy Clin. Immunol., 101: 258-264). Die rekombinanten Timotheegraspollen-Allergene rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6 wurden so, wie es vorher beschrieben worden war (Vrtala et al. (1995), J. Allergy Clin. Immunol., 97: 781-787; Vrtala et al. (1999), J. Immunol., 163: 5489-5496) gereinigt. Die Kaninchen-anti-rPhl p 1-, -anti-rPhl p 2-, -anti-rPhl p 5- und -anti-rPhl p 6-Antiseren wurden gegen gereinigtes rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6 unter Verwendung von CFA (Charles River, Kissleg, Deutschland) erzeugt.
Beispiel 2: Konstruktion rekombinanter Hybridallergene
Das Protokoll für die Konstruktion rekombinanter Hybridallergene ist in 2 dargestellt. Wie beispielhaft für ein Hybrid, das aus mit rPhl p 1 verknüpftem rPhl p 5 besteht, gezeigt ist, werden die für die Bestandteile codierenden cDNAs mit geeigneten Primerpaaren (2: Phl p 5 w, x; Phl p 1: y, z) amplifiziert, um überlappende Enden zu erzeugen. in einer nachfolgenden, zweiten PCR-Reaktion wird eine cDNA, die beide cDNAs umfasst, mit Primern, die spezifisch für das 5'-Ende der ersten DNA (Phl p 5: w) und das 3'-Ende der zweiten cDNA (Phl p 1: z) sind, unter Verwenden der beiden PCR-Produkte aus den ersten Reaktionen als Template erzeugt. Unter Verwenden dieser Technologie erzeugten wir rekombinante Hybride, die aus einer Kombination von Phl p 5/Phl p 1, rPhl p 2/rPhl p 6, rPhl p 6/rPhl p 2 und allen vier Allergenen (N-Terminus-rPhl p 6-rPhl p 2-rPhl p 5-rPhl p 1-C-Terminus), wobei das letztere das „Riesenhybrid" ist, bestanden.
Konstruktion der Expressionsplasmide für rPhl p 5/rPhl p 1-, rPhl p 2/rPhl p 6, rPhl p 6/rPhl p 2- und rPhl p 6/rPhl p 2/rPhl p 5/rPhl p 1-Hybridproteine:
Die cDNAs von Phl p 5 und Phl p 1 wurden durch Polymerasekettenreaktion unter Verwenden der Primer 5'-GGA ATT CAT ATG GCC GAT CTC GGT TAC-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-CGG GGT ACC GAC TTT GTA GCC ACC AGT-3' (SEQ ID NO: 2) für Phl p 5 und 5'-CGG GGT ACC ATG ATC CCC AAG GTT CCC-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-CGG GAT CCT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGC TTG GAC TCG TAG CTG GT-3' (SEQ ID NO: 4) für Phl p 1 erhalten. Das Signalpeptid von Phl p 5 wurde gegen eine NdeI-Restriktionsschnittstelle, die das ATG-Startcodon am 5'-Ende des kodierenden Bereichs enthielt, ausgetauscht. Eine KpnI-Restriktionsschnittstelle wurde am 3'-Ende von Phl p 5 eingeschleust, die das Stop-Codon ersetzte. Die Phl p 1-Sequenz, der das Signalpeptid fehlte, begann mit einer KpnI-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende. Am 3'-Ende wurde ein Nukleotid-Stück, das für ein Hexahistidin-Tag codierte, eingeschleust, auf das Stop-Codon und eine BamHI-Restriktionsschnittstelle folgten. Die PCR-Produkte wurden als NdeI/KpnI/BamHI-Fragment in einen pET17b-Expressionsvektor inseriert.
Die Phl p 2/Phl p 6- und Phl p 6/Phl p 2-Sequenzen wurden unter Verwenden eines auf PCR basierenden „gene soeing" (17) konstruiert. In einer ersten PCR-Reaktion wurden die cDNAs von Phl p 2 und Phl p 6 unter Verwenden der Primer 5'-GGA ATT CAT ATG GTG CCG AAG GTG ACG-3' (SEQ ID NO: 5) und 5'-CGT GGC CTT CCC CAT AAG CTT CTC TTC TGG CGC GTA GGT-3' (SEQ ID NO: 6) für Phl p 2 und 5'-AAG CTT ATG GGG AAG GCC ACG ACC-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CGC GCC GGG CTT GAC AGC-3' (SEQ ID NO: 8) für Phl p 6 amplifiziert, um überlappende Enden zu erzeugen. In einer nachfolgenden PCR-Reaktion wurden die beiden auf Agarosegel gereinigten PCR-Produkte (unter Verwenden des QIAGEN Gelreinigungskits) als Template verwendet und unter Verwenden der Primer 5'-GGA ATT CAT ATG GTG CCG AAG GTG ACG-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CGC GCC GGG CTT GAC AGC-3' (SEQ ID NO: 10) amplifiziert. Das Signalpeptid von Phl p 2 wurde durch eine NdeI-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende ausgetauscht und das Stop-Codon am 3'-Ende entfernt. In die Phl p 6-Sequenz, der ebenfalls das Signalpeptid fehlte, wurde ein Hexahistidin-Tag inseriert, dem ein Stop-Codon und eine BamHI-Restriktionsschnittstelle folgten. Das resultierende Phl p 2/Phl p 6-Konstrukt wurde als NdeI/BamHI-Fragment in den pET17b-Expressionsvektor inseriert.
Die Phl p 6/Phl p 2-Sequenz wurde unter Verwenden des gleichen Verfahrens mit den PCR-Primern 5'-GGA ATT CAT ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG-3' (SEQ ID NO: 11) und 5'-CAC CTT CGG CAC CAT AAG CTT CGC GCC GGG CTT GAC AGC-3' (SEQ ID NO: 12) für Phl p 6 und 5'-AAG CTT ATG GTG CCG AAG GTG ACG-3' (SEQ ID NO: 13) und 5'-C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC TTC TGG CGC GTA GGT-3' (SEQ ID NO: 14) für Phl p 2 in der ersten PCR-Reaktion und den Primern 5'-GGA ATT CAT ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG-3' (SEQ ID NO: 15) und 5'-C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC TTC TGG CGC GTA GGT-3' (SEQ ID NO: 16) für die zweite PCR-Reaktion konstruiert. Das resultierende Phl p 6/Phl p 2-Konstrukt wurde als NdeI/BamHI-Fragment in den pET17b-Vektor inseriert.
Für die Konstruktion des Phl p 6/Phl p 2/Phl p 5/Phl p 1-Hybrids („Riesenhybrid") wurde das Phl p 6/Phl p 2-Konstrukt als Templat in einer PCR-Reaktion unter Verwenden der Primer 5'-GGA ATT CAT ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG-3' (SEQ ID NO: 17) und 5'-GGG ATT TCC ATA TGC TCT TCT GGC GCG TAG G-3' (SEQ ID NO: 18), wobei das 3-Hexahistidin-Tag und das Stop-Codon gegen eine NdeI-Restriktionsschnittstelle ausgetauscht wurden, verwendet. Die Sequenz wurde in den pET17b-Vektor, der das Phl p 5/Phl p 1-Konstrukt als NdeI-Fragment enthielt, kloniert. Die richtige Orientierung des Inserts wurde durch einen Restriktionsverdau untersucht.
Beispiel 3: Expression und Reinigung der Hybridallergene
Die rekombinanten Hybridallergene mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag wurden in E. coli BL21 (DE3) exprimiert und mittels Nickelaffinitätschromatographie gereinigt. Das rPhl p 2/rPhl p 6- und das rPhl p 6/rPhl p 2-Hybrid wurden aus der löslichen, Cytoplasmafraktion der E. coli-Extrakte gereinigt, wohingegen das rPhl p 5/rPhl p 1-Hybrid und das „Riesenhybrid" aus der unlöslichen Inclusion-Body-(Einschlusskörperchen-)Fraktion von E. coli in Harnstoff gelöst wurden. 3 zeigt eine mit Coomassie gefärbte SDS-PAGE, die drei der Hybride und die einzelnen rekombinanten Allergene enthält. Die molekulare Masse, die mittels SDS-PAGE bestimmt wurde, entspricht dem Molekulargewicht, das, basierend auf ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenz (rPhl p 5/rPhl p 1: 60 kDa; rPhl p 2/rPhl p 6 und rPhl p 6/rPhl p 2: 22 kDa; „Riesenhybrid": 82 kDa; Daten nicht gezeigt) berechnet wurde.
Versuchsprotokoll:
Alle Konstrukte wurden in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Die Zellen wurden in LB-Medium, das 100 mg/l Ampicillin enthielt, bis zu einer OD₆₀₀ von 0,8 angezüchtet. Die Expression der rekombinanten Proteine wurde durch Zugeben von Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert. Nach 4 Stunden bei 37 °C wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet.
rPhl p 2/rPhl p 6 und rPhl p 6/rPhl p 2 wurden als lösliche Proteine exprimiert. Die Zellen wurden in Lysepuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) resuspendiert und mit einem Ultraturrax (Polytron, Kinematica AG, Schweiz) lysiert. Das Lysat wurde 30 min lang bei 4 °C mit 10.000xg zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pellettieren. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Säule (QIAGEN) geladen, die Proteine wurden mit 250 mM Imidazol eluiert und gegen Wasser dialysiert.
rPhl p 5/rPhl p 1 und rPhl p 6/rPhl p 2/rPhl p 5/rPhl p 1 wurden in der Inclusion-Body-Fraktion exprimiert. Die Zellen wurden in 10 mM Tris, 0,1 % Triton, pH 7,4 resuspendiert und durch Zugeben von Lysozym auf bis zu 1 mg/ml lysiert. Nach 20-minütiger Zentrifugation mit 14.000xg bei 4 °C wurde das Pellet 4x mit 5 mM Tris, pH 8,0, 0,05 M NaCl, 0,25 % Desoxicholat, 0,25 mM β-Mercaptoethanol und einmal mit 10 mM Tris, pH 8,0, 0,3 % Isopropanol gewaschen. Die Inclusion-Bodies wurden mit 8 M Harnstoff, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris, pH 8,0 gelöst. Nach 20-minütiger Zentrifugation mit 14.000xg wurde der Überstand auf eine Ni-NTA-Säule (QIAGEN) geladen. Die Proteine wurden auf einer Säule unter Verwenden eines linearen 6 M-1 M Harnstoff-Gradienten in 500 mM NaCl, 20 % Glycerin, 20 mM Tris, pH 7,4 über einen Zeitraum von 1,5 h (18) renaturiert. Die Proteine wurden durch Zugabe von 250 mM Imidazol eluiert und gegen PBS, pH 7,4 dialysiert.
Beispiel 4: Die Hybridallergene enthalten die relevanten Epitope ihrer Bestandteile
Die rekombinanten Hybridallergene enthielten die vollständigen primären Aminosäuresequenzen ihrer Bestandteile und damit das vollständige Repertoir der T-Zellepitope der einzelnen Allergene. Das Vorhandensein der B-Zellepitope wurde mit Antikörpern vorher definierter Spezifität für die einzelnen Bestandteile und mit immunologisch kompetitiven Versuchen untersucht. 4 zeigt, dass das „Riesenhybrid" von Antiseren, die entsprechend gegen rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6 erzeugt wurden, erkannt wird (4, Reihe A: 1-4). Die korrekte Expression des C-terminalen Hexahistidin-Tags wurde durch die Reaktivität eines murinen, monoklonalen anti-Histag-Antikörpers, das spezifisch das „Riesenhybrid" erkannte (4: Reihe A, 5), jedoch nicht das Hexahistidin-Tag enthaltende rPhl p 2 (4: Reihe B, 5) erkannte gezeigt. Das rekombinante Phl p 2 (Reihe B: 1, 3, 4) und das rPhl p 5 (Reihe B: 2) (Negativkontrollen) reagierten nicht mit den Antiseren (4, Reihe B).
Als nächstes untersuchten wir, ob die Hybridallergene dazu verwendet werden können, die Bindung von IgE-Antikörpern aus gegen Graspollen allergischen Patienten (n = 20) an die einzelnen Bestandteile zu blockieren (Tabelle 1, 2). Tabelle 1 zeigt, dass das rPhl p 2/rPhl p 6- sowie das rPhl p 6/rPhl p 2-Hybrid die Bindung von IgE an beide Bestandteile (rPhl p 2, rPhl p 6) auf mit den einzelnen rekombinanten Allergenen vergleichbare Weise hemmten (annähernd 80 % Hemmung der Bindung von IgE). In ähnlicher Weise haben wir gefunden, dass das rPhl p 5/rPhl p 1-Hybrid die Bindung von IgE bei den 20 Patienten an sowohl rPhl p 1 als auch rPhl p 5 genauso wirksam wie die Bindung an die einzelnen Bestandteile hemmte (durchschnittliche Hemmung 85 %) (Tabelle 2). Es wurde keine Hemmung beobachtet, wenn die Seren an das rPhl p 5/rPhl p 1-Hybrid voradsorbiert wurden und mit einem nicht verwandten Allergen (Hauptallergen der Birkenpolle, Bet v 1) reagieren gelassen wurden, während rBet v 1 eine nahezu vollständige Autoinhibierung (Selbsthemmung) (83 % Hemmung) verursachte (Tabelle 2).
Versuchsprotokoll:
Kompetitive ELISA-Versuche:
Seren von 20 Patienten wurden für die Hemmung mit rPhl p 5/rPhl p 1 1:10 und für die Hemmung mit rPhl p 2/rPhl p 6 und rPhl p 6/rPhl p 2 1:5 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) verdünnt. Die Seren wurden über Nacht bei 4 °C an entweder rekombinantes Phl p 1, Phl p 5, Phl p 5/Phl p 1, Phl p 2, Phl p 6, Phl p 2/Phl p 6, Phl p 6/Phl p 2, Bet v 1 oder BSA (10 μg/ml) voradsorbiert. ELISA-Platten wurden mit rekombinantem Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 und Bet v 1 (5 μg/ml) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Der ELISA wurde so, wie es beschrieben wurde (Niederberger et al. (1998), J. Allergy Clin. Immunol., 101: 258-264), durchgeführt.
Dot-Blots:
Aliquots von annähernd 1 μg gereinigtem rekombinantem Phl p 6/Phl p 2/Phl p 5/Phl p 1 und rPhl p 5 und rPhl p 2 als Negativkontrollen wurden als Dots auf Nitrocellulosemembranen aufgebracht. Die Filter wurden für 1 Stunde mit TBS, 1 % BSA, 0,05 % Tween-20 blockiert und mit Kaninchen-ante-Phl p 1-, -anti-Phl p 5-(1:5.000 verdünnt), -anti-Phl p 2-(1:500 verdünnt), -anti-Phl p 6-(1:2.000 verdünnt) Seren und einem murinen, monoklonalen anti-Hexahistidin-AK (Dianova, Deutschland), der 1:1.000 in TBS, 1 % BSA, 0,05 % Tween-20 verdünnt worden war, inkubiert. Die Filter wurden 3x mit TBS, 0,05 % Tween-20 gewaschen, mit einem sekundären, an alkalische Phosphatase gekoppelten Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Jackson) und für den Nachweis des His-Tags mit einem an alkalische Phosphatase gekoppelten Anti-Maus-IgG-Antikörper (Pharmingen), der 1:1.000 in TBS, 1 % BSA, 0,05 % Tween-20 verdünnt worden war, für 1 Stunde inkubiert und 3x mit TBS, 0,05 % Tween-20 gewaschen. Die Farbreaktion wurde durch Zugeben von NBT/BCIP (300 μg/ml) gestartet und durch Zugabe von Wasser gestoppt.
Beispiel 5: Die Hybridmoleküle induzieren stärkere Immunreaktionen in Mäusen als die einzelnen Bestandteile oder Mischungen davon.
Um zu bestimmen, ob die Immunisierung mit den Hybridallergenen IgG-Antikörper induziert, die die einzelnen allergischen Bestandteile erkennen, wurden Gruppen von jeweils 8 Mäusen mit den Hybriden, den einzelnen Allergenen oder Timotheegraspollen-Extrakt immunisiert. 5 zeigt, dass die durchschnittlichen IgG₁-Reaktionen, die von den Hybridmolekülen zu jedem der einzelnen Allergene (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 oder rPhl p 6) induziert wurden, stärker waren als diejenigen, die bei einer Immunisierung mit den einzelnen allergischen Bestandteile erhalten wurden. Große Mengen an IgG₁-Antikörpern, die von den Hybriden induziert worden waren, waren bereits 4 Wochen nach der ersten Immunisierung nachweisbar und hatten sich nach weiteren 4 Wochen erhöht. Am meisten interessant war vielleicht die Feststellung, dass die Hybridmoleküle größere Mengen an IgG₁ bei den einzelnen Bestandteilen des Allergens induzierten als Timotheegraspollen-Extrakt (5). Letzteres war insbesondere ein Beweis dafür, dass Phl p 2, Phl p 6 und Phl p 1 kaum von durch den Extrakt induzierten Antikörpern erkannt wurden, während die Hybridmoleküle starke anti-Phl p 1-, anti-Phl p 2- und anti-Phl p 6-Antikörperreaktionen induzierten (5).
In gleicher Weise haben wir festgestellt, dass die Immunisierung mit dem Riesenmolekül stärkere Antikörperreaktionen bei jedem der Bestandteile (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6) induzierte als die Immunisierung mit den einzelnen Antigenen (6A) oder mit einer äquimolaren Mischung der Antigene (6B). Die Immunisierung mit dem Riesenhybrid erzielte auch bessere Immunreaktionen als die Immunisierung mit dem Timotheegraspollen-Extrakt. Die IgG-Antikörper, die mit dem Timotheegraspollen-Extrakt induziert worden waren, zeigten eine geringere Reaktivität mit dem Riesenhybrid und dem Extrakt, als diejenigen, die mit dem Riesenhybrid induziert worden waren (7A, B).
Immunisierung von Mäusen und Messen der Mengen an spezifischen Antikörpern
Gruppen von 8 weiblichen BALG/c-Mäusen (Alter: 8 Wochen) (Charles River, Deutschland) wurden subcutan mit rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6, rP2-P6, rP6-P2, rP5-P1, dem Riesenmolekül, Timotheegraspollen-Extrakt oder einer äquimolaren Mischung von rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6 adsorbiert an Al(OH)₃ (Alu-Gel-S, Serva, Ingelheim, Deutschland) immunisiert. Die Tiere wurden in der Tierpflegeabteilung des Instituts für Pathophysiologie der Wiener Universität (Institute of Pathophysiology, University of Vienna) entsprechend den örtlichen Richtlinien zur Tierpflege gepflegt. Die Mäuse wurden in Vier-Wochen-Intervallen immunisiert und Blut von den Schwanzvenen entnommen und die Seren wurden bis zur Analyse bei –20 °C gelagert.
IgG₁-Reaktionen gegen rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6, rP2-P6, rP6-P2, rP5-P1, das Riesenmolekül, eine äquimolare Mischung von rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 und rPhl p 6 und Timotheegraspollen-Extrakt wurden mittels ELISA gemessen. Die Allergene (rekombinante Allergene: 5 μg/ml; Extrakt: 50 μg/ml) wurden auf Nunc Maxisorp-Platten (Roskilde, Dänemark) geschichtet und mit 1:1.000 verdünnten Maus-Seren inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mit einem 1:1.000 verdünnten, monoklonalen Ratte-anti-Maus-IgG₁ (Pharmingen, San Diego, CA, USA) und einem 1:2.000 verdünnten, HRP-markierten Schaf-anti-Ratte-Antiserum (Amersham, Buckinghamshire, UK) nachgewiesen.
Beispiel 6: Die Hybridmoleküle induzieren schützende Antikörperreaktionen, die die Bindung von IgE aus allergischen Patienten an Graspollen-Allergene blockieren
Als nächstes untersuchten wir, ob murine Antikörper, die mit den Hybridmolekülen induziert worden waren, die Bindung von IgE aus auf Graspollen allergischen Patienten an gereinigte Graspollen-Allergene blockieren können (Tabelle 3). Kompetitive ELISA-Versuche, die mit Seren von 4 repräsentativen, auf Graspollen allergischen Patienten durchgeführt worden waren, zeigten, dass Antikörper, die durch die Hybridmoleküle induziert worden waren, die Bindung von IgE an die gereinigten Allergene stark hemmten: Die IgG-Antikörper, die mit dem rP2-P6- und dem rP6-P2-Hybridmolekül induziert worden waren, bewirkten eine 48 %-54 %-ige Hemmung der Bindung von IgE an Phl p 2 und eine 54 %-67 %-ige Hemmung der Bindung von IgE an Phl p 6 (Tabelle 3A). Im Gegensatz dazu war die Hemmung der Reaktivität von IgE, die durch eine Vorinkubation mit Antikörpern erzielt wurde, die mit rPhl p 2 und rPhl p 6 allein induziert worden waren, sehr gering (0-15 %) (Tabelle 3A). Anti-P5-P1-Antikörper bewirkten eine Hemmung der Bindung von IgE an Phl p 5 um mehr als das Doppelte (59,5 % Hemmung), als Antikörper, die gegen Phl p 5 allein erzeugt worden waren (28 %) (Tabelle 3B). Die Hemmung der Bindung an Phl p 1, die mit den Antikörpern erzielt wurde, die gegen das rP5-P1-Hybrid (18,5 % durchschnittliche Hemmung) und Phl p 1 allein (29,5 % durchschnittliche Hemmung) erzeugt worden waren, waren geringer (Tabelle 3B).
Mit dem Riesenmolekül, das IgG-Antikörper induzierte, die die Bindung von IgE aus auf Graspollen allergischen Patienten an Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phi p 6 und Timotheegraspollen-Extrakt wirksam blockierte, wurden ähnliche Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
ELISA zur Bestimmung der Aktivität der Blockierung des Antikörpers
Die Fähigkeit der murinen anti-rP2-P6-, anti-rP6-P2- und anti-rP5-P1-Antikörper, die Bindung von IgE-Antikörper aus auf Graspollen allergischen Patienten an rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 oder rPhl p 6 zu inhibieren, wurde mit Hilfe von kompetitiven ELISA-Versuchen untersucht. Rekombinantes Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 und Phl p 6 (1 μg/ml) wurden über Nacht bei 4 °C auf ELISA-Platten (Nunc) beschichtet, die Platten wurden zweimal mit TEST (Tris-gepufferter Kochsalzlösung, 0,05 % Tween), das mit 200 μl TBST/1 % BSA gesättigt war, gewaschen und mit murinen anti-rP2-P6-, anti-rP6-P2- und anti-rP5-P1-Antiseren oder, zu Kontrollzwecken, mit den entsprechenden Preimmun-Seren, wobei jedes 1:50 in TEST/0,5 % BSA verdünnt worden war, über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach 5-maligen Waschen mit TEST wurden die Platten mit humanen Seren von auf Graspollen allergischen Patienten, die 1:5 in TBST/0,5 % BSA verdünnt worden waren, über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach 5-maligem Waschen mit TBST wurde gebundener humaner IgE mit einem AP-markierten Maus-anti-Mensch-IgE-AK (Pharmingen), der 1:1.000 in TBST/0,5 % BSA verdünnt worden war (1 Stunde bei 37 °C, 1 Stunde bei 4 °C) nachgewiesen. Nach 5-maligem Waschen mit TBST wurde die Farbreaktion durch Zugeben von 100 μl ELISA-Substrat (Sigma Diagnostics, Inc., St. Louis, USA) gestartet. Der Prozentsatz der Verringerung der Bindung von humanem IgE nach der Vorinkubation mit Mäuse-Antiseren wurden gemäß der Formel: % Hemmung der Bindung von IgE = 100-OD_I/OD_P × 100 bestimmt. OD_I und OD_P geben entsprechend die Extinktionen nach der Vorinkubation mit dem Immun-Serum und dem Preimmun-Serum wieder.
Tabelle 1
Tabelle 2
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Hybridallergen, das ein Polypeptid ist und mindestens zwei verschiedene allergene Proteine oder Fragmente davon umfasst, wobei jedes Fragment aus mindestens acht aufeinander folgenden Aminosäuren des entsprechenden allergenen Proteins besteht, dadurch gekennzeichnet, dass das allergene Protein, von dem das Hybridpolypeptid stammt, aus immunologisch nicht miteinander verwandten Hauptallergenen aus Timotheegraspollen besteht.
Hybridallergen nach Anspruch 1, wobei das Hybridpolypeptid nicht miteinander verwandte Hauptallergene aus Timotheegraspollen umfasst, die ausgewählt sind aus Phl p 5/Phl p 1, Phl p 2/Phl p 6 und einer Kombination aus allen vier Molekülen.
Hybridallergen nach Anspruch 1, wobei das Hybridpolypeptid mindestens ein vollständiges allergenes Protein umfasst.
Hybridallergen nach Anspruch 3, wobei das Hybridpolypeptid mindestens zwei vollständige allergene Proteine umfasst.
Hybridallergen nach Anspruch 1, wobei das Hybridpolypeptid mindestens ein Fragment eines allergenen Proteins umfasst und wobei das Fragment eine im Vergleich zu dem allergenen Protein, von dem es stammt, im Wesentlichen reduzierte allergene Aktivität aufweist.
Hybridallergen nach Anspruch 5, wobei das Hybridpolypeptid Fragmente von mindestens zwei verschiedenen allergenen Proteinen umfasst und wobei jedes dieser Fragmente eine im Vergleich zu den entsprechenden allergenen Proteinen, von denen sie stammen, im Wesentlichen reduzierte allergene Aktivität aufweist.
Hybridallergen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens drei verschiedene allergene Proteine oder Fragmente davon umfasst.
Polynukleotid, das für ein Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
Verwendung eines Polynukleotids gemäß Anspruch 8 zur Herstellung eines DNA-Impfstoffs.
Zelle, die mit einem Polynukleotid, das ein Polynukleotid gemäß Anspruch 8 umfasst, transfiziert oder transformiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, ein Polynukleotid gemäß Anspruch 8 oder eine Zelle gemäß Anspruch 10 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, die eine Impfstoffzusammensetzung ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, die ferner einen Hilfsstoff enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Hybridpolypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines für das Hybridpolypeptid codierenden Polynukleotids; b) Einschleusen dieses Polynukleotids in eine Wirtszelle; und c) Kultivieren der in Schritt b) erhaltenen Wirtszelle unter Bedingungen, unter denen das Hybridpolypeptid exprimiert wird; und d) Wiedergewinnen des Expressionsprodukts aus der Zelle.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das für das Hybridpolypeptid codierende Polynukleotid unter Verwenden von PCR-Technologie hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Hybridpolypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid durch chemische Synthese hergestellt wird.
Verwendung eines Hybridpolypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Polynukleotids gemäß Anspruch 8 oder einer Zelle gemäß Anspruch 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer allergischen Erkrankung.
Verwendung eines Hybridpolypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Polynukleotids gemäß Anspruch 8 oder einer Zelle gemäß Anspruch 10 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Impfung oder Toleranzinduktion.
Verwendung eines Hybridpolypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 zum Nachweis von Antikörpern gegen ein allergenes Protein in einer Probe.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Nachweis durch in vitro-Antikörpertests und Tests unter Verwenden von Zellen durchgeführt wird.