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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Allergen, das durch
gentechnische Veränderung des
Hauptallergens (DerfII) von Hausstaubmilben erhalten wird, sowie
ein Verfahren zur Herstellung des modifizierten Allergens. Das mit
Hilfe dieses Herstellungsverfahrens erhaltene modifizierte Allergen
kann als Medikament zur Behandlung allergischer Krankheiten eingesetzt
werden.
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Man
nimmt an, daß viele
allergische Krankheiten auf mehrere Arten von Symptomen zurückgehen,
die sich durch Sensibilisierung mit einem Antigen entwickeln, das
die Erkrankungen verursacht, wobei ein IgE-Antikörper produziert wird, der für das Allergen
im Blutserum und Gewebe spezifisch ist, der Antikörper erneut dem
Antigen ausgesetzt wird und der Antikörper mit dem Antigen im jeweiligen
Gewebe reagiert. Insbesondere wird eine Art Sofortreaktion durch
die Kombination der Antigene mit den IgE-Antikörpern auf den Mastzellen und
Basophilen hervorgerufen, gefolgt von Vernetzung der IgE-Antikörper und
anschließender
Freisetzung mehrerer Arten chemischer Mediatoren aus den Mastzellen
oder Basophilen.
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Es
gibt ein Verfahren zur Steuerung der Bindung zwischen dem Antigen
und dem IgE-Antikörper
als Verfahren zur Behandlung allergischer Erkrankungen. Wird die
Bindung zwischen Antigen und IgE-Antikörper gesteuert, so wird die
Vernetzung unter den IgE-Antikörpern
auf den Mastzellen oder Basophilen und die Freisetzung der chemischen
Mediatoren gesteuert, so daß sich
eine Auswirkung auf die Behandlung ergibt.
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Andererseits
scheint es, daß allergische
Erkrankungen wie Bronchialasthma, Kindheitsasthma, atopische Dermatitis
und dergleichen hauptsächlich
durch Allergene von Milben hervorgerufen werden, die in Hausstaub
leben. Es wurden mehrere Arten von Proteinen der Milben-Hauptallergene
als Milben-Hauptallergene identifiziert (Platts-Mills et al., J.
Allergy Clin. Immunol. 80, 755 (1987)). Des weiteren wurde ein Verfahren
zur Massenherstellung eines gereinigten Milben-Hauptallergens offenbart
(Yuuki et al., Japanese J. Allergology 39, 557 (1990) und japanische
Patentveröffentlichung
Nr. 03254683). Zudem veränderte
das Allergen einen Teil des obigen gereinigten Milben-Hauptallergens,
und es wurde ein Herstellungsverfahren dafür eingereicht (japanische Patentveröffentlichung
Nr. 6253851).
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Bei
den berichteten und identifizierten Proteinen der Hauptallergene
von Milben ergeben sich jedoch Probleme einer allergischen Reaktion,
nämlich
anaphylaktischer Schock bei der Hyposensibilisierungstherapie, da
die Wirksamkeit dieser Allergene hoch ist.
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Wird
andererseits ein modifiziertes Milben-Hauptallergen erhalten, das
niedrigere Bindungswirkung oder niedrigere Allergenwirkung als Wildtyp-Allergene
aufweist und die Bindung des Antigens (DerfII) und des IgE-Antikörpers hemmt,
so kann ein wirksames Medikament zur Behandlung allergischer Krankheiten
bereitgestellt werden. Das Medikament ergibt keinen anaphylaktischen
Schock bei allergischen Reaktionen, die durch die Verabreichung
des Antigens hervorgerufen werden, und es hat keine Auswirkung auf
das übrige
Immunsystem, da das Medikament für
das Antigen spezifisch ist. Modifizierte Milben-Hauptallergene sind
in den japanischen Patentveröffentlichungen
Nr. 06253851 und 07095887 offenbart. Bei der ersteren Anmeldung
bestehen Probleme mit der Aufrechterhaltung und Stabilität der Immunogenität, da die
Molekülstruktur
durch Aminosäure-Substituenten
weitge hend verändert
wurde. Bei der letzteren Anmeldung ist die Minimierung der Strukturveränderung
und die Senkung der Allergenwirkung nicht ausreichend, da die Position
der Modifizierung des Allergens nicht hinreichend angegeben und
lediglich Alanin als Aminosäure-Substituent
verwendet wurde.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß bei Ersetzung
einer Aminosäure
eines bestimmten Teils des bereits offenbarten Milben-Hauptallergens
DerfII durch eine andere ähnliche
Aminosäure zur
Minimierung der Strukturveränderung
die IgE-Bindungswirkung verändert
werden kann. Es zeigt sich, daß es
hinsichtlich der Wirkung, die Bindung des Antigens DerfII an IgE
zu hemmen, keinen Unterschied zwischen den modifizierten Milben-Hauptallergenen
und denen des Wildtyps gibt.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens
zur Massenherstellung des modifizierten Milben-Hauptallergens DerfII,
bei dem Aminosäure-Ersetzungen
mit Hilfe der Gentechnik herbeigeführt werden. Ziel der vorliegenden
Erfindung ist insbesondere die Herstellung eines Materials, das
als Medikament zur Behandlung allergischer Krankheiten nutzbar ist.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist gekennzeichnet durch ein Verfahren, bei
dem ein Hauptallergen (DerfII) der Hausstaubmilbe (Dermatophagoides
farinae) gentechnisch verändert
wird, um Aminosäurereste
durch andere Aminosäurereste
zu ersetzen, wobei Prokaryonten oder Eukaryonten mit einem Replikationsvektor,
der ein für
das modifizierte Milben-Hauptallergen
DerfII codierende Gen enthält,
transformiert und kultiviert werden, und das modifizierte Milben-Hauptallergen aus
der Kultur erhalten wird.
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Es
ist offenbart, daß das
Milben-Hauptallergen sechs Cystein-Reste und drei intramolekulare
Vernetzungen (zwischen dem 8. und 119., zwischen dem 21. und 27.
und zwischen dem 73. und 78. Aminosäurerest) über Disulfid-Bindungen aufweist
(Nishiyama et al., International Archives of Allergy and Immunology
101, 159 (1993)). Weiterhin ist der Effekt der IgE-Bindungswirkung
offenbart durch die Herstellung eines modifizierten DerfII, das
erhalten wird, indem eine dieser Disulfid-Bindungen im Molekül mit Hilfe
der Gentechnik beseitigt wird (japanische Patentveröffentlichung
Nr. 6253851). Nach diesem Bericht ist die Disulfid-Bindung zwischen 8
und 119 von großer
Bedeutung für
die IgE-Bindungswirkung.
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Die
hier beteiligten Erfinder führten
wiederholte Forschungen durch und fanden, daß der Bereich um die Disulfid-Bindung zwischen
Cystein 73 und Cystein 78 Auswirkung auf die IgE-Bindung hat. Überdies
fanden sie, daß es
möglich
ist, die IgE-Bindungsfähigkeit
durch Ersetzen einer Aminosäure
durch eine Aminosäure
mit sehr ähnlichen
Eigenschaften merklich herabzusetzen. Zum Beispiel kann Asparaginsäure 7 durch
Glutaminsäure
oder Asparagin sowie durch das vorstehend erwähnte Alanin ersetzt werden.
Auch bei Ersetzung von Asparaginsäure 19 durch Glutaminsäure ist
keine Änderung
der IgE-Bindungsfähigkeit
zu beobachten. Wird jedoch die Asparaginsäure durch Asparagin ersetzt,
so findet man, daß die
IgE-Bindungsfähigkeit
erheblich verringert wird, und diese Fähigkeit wird durch die elektrische
Ladung am 19. Aminosäurerest
beeinflußt. Wird
zudem beispielsweise Alanin 9 durch Leucin ersetzt, so beträgt die Bindungswirkung
etwa 30% der ursprünglichen
Wirkung. Wird andererseits – wie
bei der vorliegenden Erfindung gezeigt – das Alanin durch Prolin ersetzt,
so findet man, daß die
Bindungswirkung auf 10% oder weniger abgesenkt wird. Unter den Mutanten, bei
denen die Bindungswirkung erheblich verringert ist, findet man effektive
Mutanten mit Hilfe von Tierversu chen an Mäusen, die eine Milbenallergie
entwickeln. Die vorliegende Erfindung wurde also verwirklicht, indem modifizierte
Allergene gefunden wurden, die bei einer Hyposensibilisierungsbehandlung
an Patienten mit Milbenallergie wirksam sind.
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Die
modifizierten Allergene der vorliegenden Erfindung lassen sich herstellen
mit Hilfe irgendeines Verfahrens, das für die Ziele der vorliegenden
Erfindung geeignet ist, vorzugsweise mit Hilfe eines ortsspezifischen
Mutagenesverfahrens. Obwohl viele ortsspezifische Mutagenesverfahren
entwickelt wurden, ist ein PCR-Verfahren praktisch (Ito et al.,
Gene 102, 67 (1991)). Beispielsweise wird nachstehend gezeigt, daß der Asparaginsäure-Rest
7 des DerfII-Proteins mit Hilfe der in Sequenz Nr. 1-a gezeigten
DNA-Kette durch einen Glutaminsäure-Rest
ersetzt wird.
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Das
dem Asparaginsäure-Rest
7 entsprechende Codon ist GAT in SEQ ID Nr. 1. Dieses Codon wird durch
ein Codon ersetzt, das Glutaminsäure
entspricht, zum Beispiel GAG. Das Oligonucleotid, das die gleiche Sequenz
wie die DNA-Sequenz in der Nähe
des Asparaginsäure-Rests
aufweist, wobei nur das Codon (GAT) des Asparaginsäure-Rests
durch das Codon (GAG) des Glutaminsäure-Rests ersetzt ist, wird
synthetisiert (Tabelle 1, F-D7E). Diese Synthese kann mit Hilfe
eines bekannten Verfahrens durchgeführt werden, zweckmäßigerweise
mit einem automatischen Synthesizer (zum Beispiel DNA-Synthesizer
Modell 381, hergestellt von der Firma Applied Biosystems).
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Jedes
DNA-Fragment, das die cDNA des in Sequenz Nr. 1 gezeigten DerfII
enthält,
kann als Matrizen-DNA für
die Amplifikation mit Hilfe eines PCR-Verfahrens verwendet werden.
In diesem Falle wurde pFLT11 (1) als Matrize
verwendet. Das synthetische Oligonucleotid R1 (Tabelle 1) hat die
gleiche Sequenz wie die der Region, die eine Sequenz der HindIII-Erkennungsstelle
stromabwärts
von der DerfII-codierenden Region
am pFLT11 enthält.
Die PCR wurde mit zwei synthetischen Oligonucleotiden – dem obigen
F-D7F und R1 – als
Primer durchgeführt.
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Nach
der PCR können
die Nucleotid-Sequenzen der resultierenden amplifizierten DNA-Fragmente
mit Hilfe der Didesoxy-Methode
(J. Mol. Biol. 162, 729–773
(1982)) und dergleichen bestimmt werden.
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So
wird die modifizierte DNA, von der mit Sicherheit be- kannt ist,
daß eine
Mutation eingeführt
wurde, in eine Klonierungsstelle eines geeigneten Expressionsvektors
inseriert, und es kann ein modifiziertes DerfII exprimiert werden.
Bei dieser Expression kann irgendein Plasmidvektor verwendet werden,
der in E. coli stabil existiert, und zweckmäßigerweise kann zum Beispiel
pGEMEX1 (hergestellt von der Firma Promega) verwendet werden. Bei
diesem Vektor wird ein T7-Promotor als Expressionspromotor verwendet,
und es ist bekannt, daß die
Expression hoch ist und das rekombinante Protein als Einschlußkörper in
E. coli akkumuliert. Es können
viele Methoden in einer Folge aus derartigen Arbeitsgängen angewandt
werden (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
1982).
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Die
DNA kann exprimiert werden mit Hilfe eines geeigneten Vektors wie
etwa YEp13 (Broach et al., Gene 8, 121–133 (1979)) in Hefe. Mit einem
Hefevektor, der eine Expressionskassette aufweist, die mit dem modifizierten
DerfII-Gen einhergeht, das mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung erhalten wird, kann eine geeignete Hefezelle transformiert
werden. Für
die Aufgabe sollte die DNA-Sequenz
der vorliegenden Erfindung nicht durch einen E. coli-Promotor, sondern
durch einen eukaryontischen Promotor gesteuert werden, zum Beispiel
delta PS und dergleichen (Otake et al., Agric. Biol. Chem. 52, 2753–2762 (1988)).
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So
wurden modifizierte Plasmide hergestellt durch Ersetzen der 7. Aminosäure von
der N-terminalen Seite des Milben-Hauptallergens DerfII durch andere Aminosäuren außer Alanin,
und das jeweilige Plasmid wurde transformiert und in E. coli exprimiert.
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Dann
wurde die IgE-Antikörper-bindende
Wirkung des modifizierten DerfII quantitativ bestimmt. Vor der Bestimmung
muß jedes
modifizierte DerfII-Protein gereinigt werden. Kurz umrissen geschieht
dies wie folgt: Die Zellen des Wirts E. coli BL 21, die das obige
Plasmid tragen, wurden nach der Expression geerntet. Die Zellen
wurden mit Ultraschall zerkleinert, und das als Einschlußkörper exprimierte
DerfII-Protein wurde durch
Zentrifugieren gewonnen. Nach Lösen
des Einschlußkörpers mit
6 M Harnstoff wurde die Lösung
zur Abtrennung des Harnstoffs und Umfaltung des Proteins gegen einen
Puffer aus 20 mM Tris-hydrochlorid (pH 8,5) dialysiert. Dann wurde
die DerfII-Fraktion mittels Anionenaustauschchromatographie gereinigt.
Die das umgefaltete Protein enthaltende Fraktion wurde auf einer
Säule mit
DEAE-Toyopearl (hergestellt
von der Firma Tosoh) adsorbiert und mit 80 mM NaCl eluiert, um gereinigtes
DerfII-Protein zu ergeben.
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Mit
dem so erhaltenen reinen modifizierten DerfII wurde die IgE-Bindungswirkung
quantitativ bestimmt. Hierfür
wurde zweckmäßigerweise
ein RAST-EIA-Kit verwendet (hergestellt von der Firma Pharmacia). Zunächst wurde
eine mit Bromcyan aktivierte Filterpapierscheibe in 50 μl einer Lösung des
modifizierten DerfII eingetaucht, die mit einer Pufferlösung aus
0,1 M Borsäure
(pH 8,5) verdünnt
worden war, und über
Nacht stehengelassen, wobei das Protein an das Filterpapier gebunden
wurde. Nach dem Waschen wurde das Filterpapier in 50 μl Serum eines
gegen Milben allergischen Patienten eingetaucht, das mit einer zum
Kit gehörenden
Pufferlösung
vierfach verdünnt
worden war, zwei Stunden bei 37°C stehengelassen,
und das an das Filterpapier gebundene Antigen wurde an die menschlichen
Anti-DerfII-IgE-Antikörper
im Serum gebunden. Dann erfolgte Reaktion gemäß der Reaktionsvorschrift des
Kits. Nach Beendigung aller Reaktionen diente die Extinktion der
Probe bei 420 nm als Index für
die IgE-Bindungswirkung. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Angegeben
sind modifizierte Proteine, die durch Ersetzen von 7 durch Alanin,
Asparagin und Glutaminsäure erhalten
wurden. Was die Asparaginsäure
7 anbetrifft, so wird die IgE-Bindungsfähigkeit im Vergleich zu der von
Wildtyp-DerfII auch
dann erheblich verringert, wenn diese durch irgendeine Aminosäure ersetzt
wird. Notwendige Bedingung ist demnach, daß zur IgE-Bindung die 7. Aminosäure Asparaginsäure ist.
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Mit
den modifizierten DerfII-Proteinen, die im Tierversuch eine verringerte
IgE-Bindungswirkung hatten, wurde die Wirksamkeit bei der Hyposensibilisierung
bestätigt.
10 μg DerfII
und 100 μg
Freundsches Adjuvans wurden männlichen,
sieben Wochen alten A/J-Mäusen
intraperitoneal verabreicht, um mit rDer f zu sensibilisieren. 1
mg/ml der modifizierten Proteine wurde den sensibilisierten Mäusen drei
Wochen lang zweimal pro Woche intranasal verabreicht. Die gleiche
Menge einer physiologischen Salzlösung wurde den Kontrollen verabreicht.
Eine Woche nach der letzten Verabreichung wurden die Mäuse in eine
Kammer für
Kleintiere verbracht, um 30 Minuten lang 5 mg/ml vernebeltes DerfII
zu inhalieren. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse durch Ausbluten getötet, gefolgt
von einer Bronchialalveolarwaschung mit 1 ml PBS. Aus 200 μl der Bronchialalveolarwaschflüssigkeit
(im folgenden als BALF abgekürzt)
wurden Cytospin-Präparate
hergestellt und mit Dif-Quick (eingetragenes Warenzeichen) angefärbt. Die
Proben wurden unter einem Mikroskop mit 400facher Vergrößerung beobachtet,
und die Leukozyten (Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile und Lymphozyten)
innerhalb des Mikroskopbereichs wurden gezählt, um den Grad der Atemwegs entzündung zu
bestimmen. Abgesehen von Makrophagen waren bei nichtsensibilisierten
Mäusen
wenig Leukozyten in der nach der Inhalation des Antigens entnommenen
BALF zu beobachten. Bei immunisierten Mäusen dagegen waren viele Neutrophile
und Lymphozyten zu beobachten, und die Leukozyten-Anzahl war etwa
2,5mal höher
als die in den nichtimmunen Gruppen. Insbesondere bestätigte sich
bei den sensibilisierten Mäusen,
daß die
Atemwegsentzündung
durch die Einatmung des Antigens induziert wurde, Bei sensibilisierten
Mäusen
dagegen, denen entweder Wildtyp-DerfII oder der Ersatz verabreicht
worden war, fiel die Leukozytenzahl deutlich niedriger aus, womit
sich die wirksame Hyposensibilisierung zeigt. Damit ist bewiesen,
daß die
modifizierten DerfII-Proteine sichere und wirksame Mittel zur Behandlung
allergischer Krankheiten sind, da die Möglichkeit eines anaphylaktischen
Schocks bei Absenkung der IgE-bindenden Wirkung gering ist.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
pFLT11, das zur Amplifikation mit Hilfe eines PCR-Verfahrens verwendet
wurde.
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2 ist
eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der in Beispiel
2 bei 420 nm beobachteten Extinktion zeigt, wobei die Werte als
Bindungswirkung der modifizierten DerfII-Proteine und Human-IgE
ausgewertet wurden.
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Beste Art
der Durchführung
der Erfindung
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Die
folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung ausführlicher
erläutern.
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Beispiel 1
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Konstruktion eines Expressionsvektors
einer aminosäuresubstituierten
DerfII-Mutante
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Ein
Vektor zur Entwicklung einer Variante, daß der betreffende Aminosäurerest
von DerfII durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, wurde mit
Hilfe eines ortsspezifischen Mutagenesverfahrens mit PCR hergestellt.
Vor der Durchführung
des PCR-Verfahrens wurden die in Tabelle 1 gezeigten Oligonucleotide
synthetisiert.
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Tabelle
1
Basensequenzen der synthetisierten Oligonucleotide zur Herstellung
der Mutanten
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Bei Änderung
von Asp 7 von der N-terminalen Seite von DerfII in Glu oder Asn
wurde ein synthetisches Oligonucleotid so ausgestaltet, daß es die
gleiche Sequenz wie Wildtyp-DerfII hatte, mit der Ausnahme, daß das Codon
der zu verändernden
Ziel-Aminosäure
in ein Codon für
Glu oder Rsp geändert
und wieder eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym NdeI
in eine Region stromaufwärts
vom Startcodon eingeführt wurde.
Es wurde eine PCR mit dem Expressionsvektor pFLT11 (japanische Patentanmeldung
Nr. 5-139793) durchgeführt,
der die cDNA des Wildtyp-DerfII als Matrize enthielt. Das synthetische
Oligonucleotid R1 mit einer Sequenz, die komplementär ist zu
einer Region, die eine HindIII-Erkennungssequenz stromabwärts von einer
Stelle enthält,
die DerfII an pFLT11 kloniert, und das oben synthetisierte Oligonucleotid
F-D7E oder D7N wurden als Primer verwendet. Die PCR-Lösung wurde
hergestellt durch Zugabe von jeweils 1 μg der beiden Primer F-D7E und
R1 oder F-D7N und R1 zu 1 ng des Plasmids pFLT11 als Matrize; Zugabe
von 10 μl
einer 10×-Reaktionslösung, die
mit der Taq-DNA-Polymerase
(TOYOBO) geliefert wurde, 10 μl
einer 25 mM MgCl2-Lösung; Zugabe von dATP, dCTP,
dGTP und dTTP auf jeweils eine Endkonzentration von 200 μM in 100 μl Reaktionslösung; Zugabe
von destilliertem Wasser, um das Volumen der Reaktionslösung auf
100 μl einzustellen;
und Zugabe von 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase. Nach einminütigem Stehenlassen
der resultierenden Lösung
bei 94°C,
um die doppelsträngige
DNA der Matrize in eine einsträngige
DNA umzuwandeln, wurde zwei Minuten bei 37°C stehengelassen, um den Primer
in eine einsträngige
Matrize zu assoziieren, und dann wurde die Lösung drei Minuten bei 72°C reagieren
lassen, um mit Hilfe der Polymerase eine komplementäre DNA zu
synthetisieren. Die obigen Schritte wurden 25 Zyklen lang wiederholt,
um die gewünschten DNA-Fragmente
zu amplifizieren.
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Nach
dem Verdau der resultierenden DNA-Fragmente durch NdeI und HindIII
wurden die Fragmente in die Nde I/HindIII-Stelle des Plasmids pGEME1-Δ Nde (japanische
Patentanmeldung Nr. 5-139793) inseriert, um Expressionsvektoren
zu erhalten, die die DNAs der Mutanten pFLT11-D7E bzw. D7N enthielten.
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Jeweils
10 ng dieser beiden mit Hilfe der PCR erhaltenen DNA-Fragmente wurden
der Lösung
zugegeben, die durch Entfernen des Primers und der Polymerase aus
der vorhergehenden PCR-Lösung
erhalten wurde, die Mischung wurde 10 Minuten bei 94°C reagieren
lassen, über
einen Zeitraum von 30 Minuten nach und nach auf 37°C abgekühlt und
15 Minuten bei 37°C
gehalten, um diese beiden Fragmente zu assoziieren. Anschließend wurden
2,5 Einheiten Taq-Polymerase zugesetzt, und es wurde drei Minuten
bei 60°C
gehalten, um diese beiden DNA-Fragmente zu verlängern. Dann wurden jeweils
0,5 μg der
beiden obigen Primer R1 und F1 zugesetzt, und es wurden 20 PCR-Zyklen
wiederholt, um diese Fragmente zu amplifizieren. Durch diese Arbeitsgänge wurden
zwei Arten von Fragmenten mit gleicher Länge erhalten. Ein Fragment
hatte eine BglII-Erkennungssequenz und war am betreffenden. Aminosäurerest
verändert,
und das andere Fragment hatte die gleiche Aminosäure-Sequenz wie die des Wildtyps
und war so verändert,
daß es
an der BglII-Erkennungssequenz nicht aufbrechen konnte. Nachdem
diese Fragmente mit BglII und HindIII abgedaut worden waren, wurden
sie an pGEMEX1-Δ NdeI
gebunden, es wurde mit BglII und HindIII behandelt, und es wurden
nur Vektoren erhalten, bei denen die betreffenden Mutationen eingeführt worden
waren.
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Beispiel 2
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Vergleich der IgE-Bindungsfähigkeit
der aminosäuresubstituierten
Mutanten von DerfII mit einem RAST-EIA-Verfahren
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Nachdem
die mit dem jeweiligen Expressionsvektor der in Beispiel 1 konstruierten
DerfII-Mutanten (pFLT11-D7E, pFLT11-D7N und pFLT11-A9P) transformierten
E. coli BL21 auf einem Agar-Medium, enthaltend Ampicillin (1% Bactotrypton,
0,5% Hefeextrakt, 0,6% Natriumchlorid, 1,5% Bactoagar (diese Einheiten
in Gew./Vol.), 50 μg/ml
Ampicillin, pH 7,4), gezogen worden waren, wurden die resultierenden
Kolonien in 6 ml eines Ampicillin enthaltenden flüssigen L-Mediums
eingeimpft (der Agar wurde aus dem Ampicillin enthaltenden L-Agar-Medium entfernt).
Nach Kultivieren der Kolonien unter Schütteln bei 30°C über Nacht
wurde das Medium zu 500 ml eines Ampicillin enthaltenden flüssigen L-Mediums
gegeben, und die Lösung
wurde unter Schütteln
bei 30°C
weiterkultiviert. Sobald die Extinktion der Lösung 0,4 erreicht hatte, wurde
Isopropyl-β-thiogalactopyranosid
(IPTG) auf 0,1 mM zugesetzt, die Lösung wurde weitere fünf Stunden
unter Schütteln
kultiviert, und das gewünschte
Protein wurde exprimiert. Dann wurden die die jeweilige DerfII-Mutante
exprimierenden E. coli BL21-Zellen durch Zentrifugieren geerntet,
die Zellen wurden mit einem Ultraschallmischer aufgebrochen, und
die als Einschlußkörper exprimierten
DerfII-Mutanten
wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Die Einschlußkörper wurden
durch Solubilisieren in einer Harnstoff (6 M Harnstoff, 100 mM Tris-Salzsäure und 10
mM Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA), pH 7,5) enthaltenden Pufferlösung und Dialyse in einer Tris-Pufferlösung (20
mM Tris-Salzsäure,
pH 8,5) umgefaltet. Diese Lösung
wurde auf eine Ionenaustauschersäule
mit DEAE-Toyopearl (TOSOH) gegeben, die in der obigen Tris-Pufferlösung äquilibriert
war, und mit Hilfe eines Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten
(von 0 mM bis 100 mM) eluiert. Mit dem bei etwa 80 mM Salzkonzentration
eluierten Fragment wurde eine SDS-PAGE durchgeführt, und es wurde eine gereinigte
Probe mit einer einzelnen Bande bei einem Molekulargewicht von etwa
14.000 erhalten.
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Die
Human-IgE-bindende Wirkung von Wildtyp-DerfII und der jeweiligen
Mutante wurde mit Hilfe eines von der Firma Pharmacia hergestellten
RAST-EIA-Kits bestimmt. Die Ar beitsweise war wie folgt: Zunächst wurde
ein mit Bromcyan aktiviertes Filterpapier in 50 μl einer Antigenlösung eingetaucht,
die mit einer Pufferlösung
aus 0,1 M Borsäure
(pH 8,5) verdünnt
worden war, und über
Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um das Antigen zu adsorbieren.
Dann wurde die Antigenlösung
entfernt, das Filterpapier wurde in 500 μl einer Lösung von 0,1 M Natriumhydrogencarbonat
gewaschen und in 250 μl
1 M β-Ethanolamin
(pH 9,0) eingetaucht und drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert,
um unspezifische Absorption auf dem Papier durch einen Blockiervorgang
zu verhindern. Die Ethanolamin-Lösung
wurde entfernt, das Papier wurde einmal in 500 μl einer Lösung von 0,1 M Natriumhydrogencarbonat
und dreimal in 500 μl
einer Pufferlösung
von 0,1 M Natriumacetat (pH 4,0) und zweimal in 500 μl der zum
Kit gehörenden
Pufferlösung
gewaschen. Nach Zugabe von 50 μl
Serum eines Allergiepatienten, das mit einer zum Kit gehörenden Pufferlösung vierfach
verdünnt
worden war, wurde das Papier zwei Stunden bei 37°C in der Lösung inkubiert, um das Anti-DerfII-IgE
im Serum und das auf dem Filterpapier adsorbierte Antigen zu kombinieren.
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Nach
der Antigen/Antikörper-Reaktion
wurde das Serum entfernt, das Filterpapier wurde durch zehnminütiges Eintauchen
in 2,5 ml der zum Kit gehörenden
Waschlösung
dreimal gewaschen, 50 μl
einer Lösung von
Kaninchen-IgG gegen menschliches IgE, markiert mit β-Galactosidase
des Kits, wurden zugesetzt, und die resultierende Lösung wurde
16–20
Stunden bei Raumtemperatur belassen, um das adsorbierte IgE mit dem
Antigen zu kombinieren. Nach Entfernen der Lösung des enzymmarkierten Antikörpers wurde
das Filterpapier wie vorstehend beschrieben gewaschen, und es wurden
200 μl des
zum Kit gehörenden
Substrats o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
zugesetzt, um zwei Stunden lang bei 37°C zu reagieren. Nach Zugabe
von 2 ml einer zum Kit gehörenden
Lösung
zum Anhalten der Enzymreaktion wurde die Extinktion der Reaktionslösung bei
420 nm bestimmt, und der Wert wurde als Bindungswirkung von DerfII
und menschlichem IgE bewertet. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Man erkennt, daß die
IgE-bindende Wirkung der jeweiligen DerfII-Mutanten D7E und D7N
im Vergleich zu Wildtyp-DerfII erheblich verringert war. Wurde insbesondere
die Aminosäure
7, Asp, die anhand des Ala-Substitutionsexperiments als wichtig
für die
Bildung eines Human-IgE-Epitops für DerfII erachtet wurde, durch
Asn ersetzt, das im Gegensatz zu Asp keine negative Ladung aufweist,
so wurde gefunden, daß die
IgE-bindende Wirkung wie beim Ala-substituierten DerfII erheblich
verringert wurde. Selbst bei Ersetzung durch Glu – eine Aminosäure, die
wie Asp eine negative Ladung aufweist – wurde die IgE-bindende Wirkung
abgesenkt.
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Beispiel 3
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Test zur Bewertung der
Wirksamkeit der aminosäuresubstituierten
Mutante von DerfII bei der Hyposensibilisierungsbehandlung
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Material und
Methoden
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Immunisierung
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10 μg rekombinantes
DerfII (im folgenden als rDerfII abgekürzt) und 100 μl Freundsches
Adjuvans wurden 24 männlichen,
sieben Wochen alten A/J-Mäusen
dreimal über
jeweils zwei Wochen intraperitoneal verabreicht.
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Testgruppen
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24
immunisierte Mäuse
wurden unterteilt in eine Kontrollgruppe aus sechs Mäusen, eine
Gruppe aus sechs Mäusen,
denen rDerfII verabreicht wurde, und eine Gruppe aus sechs Mäusen, denen
D7N verabreicht wurde. Zudem wurde eine reaktionsnegative Kontrollgruppe
aus drei Mäusen,
die nicht immunisiert waren, als nichtimmune Gruppe bezeichnet.
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Verabreichung von rDerfII
und einer mit Aminosäureresten
substituierten Mutante (D7N)
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Zwei
Wochen nach der letzten Immunisierung wurde der Kontrollgruppe eine
physiologische Salzlösung
mit Phosphorsäure-Puffer
(im folgenden als PBS abgekürzt),
der Gruppe mit rDerfII-Verabreichung 1 mg/ml rDerfII und der Gruppe
mit D7N-Verabreichung 1 mg/ml D7N zu jeweils 20 μl zweimal pro Woche über drei
Wochen intranasal verabreicht. Die nichtimmune Gruppe wurde nicht
behandelt.
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Spätphasen-Atemwegsentzündungsprovokationstest
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Eine
Woche nach der letzten intranasalen Verabreichung wurden die Mäuse in eine
Kammer für
Kleintiere verbracht, um 30 Minuten lang 5 mg/ml vernebeltes DerfII
zu inhalieren. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse durch Ausbluten getötet, gefolgt
von einer Bronchialalveolarwaschung mit 1 ml PBS. Aus 200 μl der Bronchialalveolarwaschflüssigkeit
(im folgenden als BALF abgekürzt)
wurden Cytospin-Präparate
hergestellt und mit Dif-Quick (eingetragenes Warenzeichen) angefärbt, Die
Proben wurden unter einem Mikroskop mit 400facher Vergrößerung beobachtet,
und die Leukozyten (Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile und Lymphozyten)
innerhalb des Mikroskopbereichs wurden gezählt, um den Grad der Atemwegsentzündung zu
bestimmen.
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Ergebnisse
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Leukozytenzahl
in BALF nach Inhalation von rDerfII Abgesehen von Makrophagen waren
bei der nichtimmunen Gruppe wenig Leukozyten in der BALF zu beobachten.
Bei der Kontrollgruppe der immunisierten Mäusen waren dagegen viele Neutrophile
und Lymphozyten zu beobachten. Im Vergleich zu den nichtimmunen
Gruppen war die Leukozyten-Anzahl der Kontrollgruppe etwa 2,5mal
höher.
Insbesondere bestätigte sich
bei der Kontrollgruppe, daß die
Atemwegsentzündung
durch die Einatmung des Antigens provoziert wurde. Dagegen war bei
den Gruppen, denen rDerfII oder D7N mit Substitution des Aminosäurerests
verabreicht worden war, die Anzahl der Neutrophile und aller Leukozyten
im Vergleich zur Kontrollgruppe verringert, so daß man das
Vorliegen einer Hyposensibilisierung gegen rDerfII durch die intranasale
Verabreichung erkennt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle
2
Leukozytenzahl (± Standardfehler)
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Industrielle Anwendbarkeit
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Das
gentechnisch gemäß vorliegender
Erfindung hergestellte modifizierte DerfII kann die Bindungswirkung
des IgE-Antikörpers
bei minimaler Mutation (eine Aminosäure aus 129 Aminosäuren) verringern
und kann zur Behandlung aller Arten durch Milben verursachter allergischer
Erkrankungen mit hoher Sicherheit angewandt werden.
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