DE69123012T2

DE69123012T2 - Rekombinantes Milben-Allergen

Info

Publication number: DE69123012T2
Application number: DE69123012T
Authority: DE
Inventors: Satoru Oka; Kazuhisa Ono; Seiko Shigeta; Takeshi Wada
Original assignee: Fumakilla Ltd; Hiroshima University NUC
Current assignee: Fumakilla Ltd; Hiroshima University NUC
Priority date: 1990-08-27
Filing date: 1991-08-27
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2011-08-28
Also published as: US5405758A; KR0148020B1; DE69123012D1; CA2050058A1; CA2050058C; EP0473111A3; AU8271091A; JP3139777B2; EP0473111A2; AU649704B2; JPH04288100A; EP0473111B1; KR920004572A; US5314991A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Milbenallergen, das eine Allergenaktivität aufweist.
Hausstaubmilben sind wichtige Verursacher von Allergieerkrankungen, wie beispielsweise atopischem Bronchialasthma.
Eine Hyposensibilisierungstherapie unter Verwendung eines eine Allergie verursachenden Stoffes war üblicherweise als die wichtigste Grundtherapie zur Behandlung von Allergieerkrankungen anerkannt, und ihre Wirksamkeit war bei der Behandlung von durch zwangsläufig eingeatmete Allergene verursachte Allergieerkrankungen, beispielsweise Pollenallergie, Hausstauballergie und Pilzallergie, bereits gut eingeführt.
In dieser Hyposensibilisierungstherapie muß jedoch ein sicheres therapeutisches Antigen verabreicht werden, da aufgrund eines sensibilisierenden Antigens ein Anaphylaxierisiko besteht, und dieses sensibilisierende Antigen wird untersucht.
Im Zusammenhang mit Milbenallergieerkrankungen wird von zwei Milbenarten, d. h., Dermatophagoides pteronyssinus und Dermatophagoides farinae, berichtet, daß sie wesentliche Allergenquellen im Hausstaub sind [Allerg. Asthma 10 (1964), 329- 334, und J. Allergy 42 (1968), 14-28]. Von diesen Milbenarten wurden die Hauptallergene der Milben fraktionell getrennt und als Glycoproteine (pI 4,6 bis 7,2) mit einem Molekulargewicht von 24 bis 28 kD und/oder Proteine (pI 5 bis 7,2) mit einem Molekulargewicht von 14,5 bis 20 kD, die beide in Ausscheidungen der Milben und/oder in den Körpern der Milben enthalten sind, identifiziert [J. Immunol. 125 (1980), 587-592, J. Allergy Clin. Immunol. 76 (1985), 753-761, Immunol. 46 (1982), 679-687, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 81 (1986), 214-223, J. Allergy Clin. Immunol. 75 (1985), 686-692, und andere Veröffentlichungen].
Keines der vorhandenen zur Hyposensibilisierungstherapie verwendeten Antigene ist jedoch wirksam und sicher.
Milbenallergengene wurden cloniert. Beispielsweise wurde in bezug auf Der p I (Molekulargewicht 25 371) und Der p II (Molekulargewicht 14 131 und 17 460), die Hauptallergene von Dermatophagoides pteronyssinus, und Der f II (das Molekulargewicht wurde nicht ermittelt, da das Initiationscodon nicht identifiziert wurde), dem Hauptallergen von Dermatophagoides farinae, die Gene aller Hauptallergene cloniert und ihre Nucleotidsequenzen ermittelt [Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 85 (1988), 127-129, J. Exp. Med. 167 (1988), 175-182, J. Exp. Med. 170 (1989), 1457-1462, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91 (1990), 118-123, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91 (1990), 124-129, Jpn. J. Allergol. 39 (1990), 557-561, und Agric. Biol. Chem. 55 (1991), 1233-1238], und es wurden Versuche zur Untersuchung von Milbenallergenen durch genetische Rekombinationsverfahren durchgeführt.
WO 88/10297 offenbart ein synthetisches Polypeptid, das die Antigenität des gesamten oder partiellen Allergens von Hausstaubmilben der Gattung Dermatophagoides aufweist, sowie ein das Polypeptid codierendes Gen.
Keines der vorhandenen Milbenallergene kann jedoch als ein sensibilisierendes Antigen verwendet werden.
Die Diagnose von Milbenallergieerkrankungen beruhte andererseits im wesentlichen auf einer Untersuchung in Kombination mit einem Reaktionstest der Haut unter Verwendung von Hausstaubextrakt und/oder Milbenkörperextrakt, zusammen mit Messungen des IgE-Antikörpertiters im Serum (relativer Wert) unter Verwendung des RAST (Radio-Allergenabsorptionstest)-Verfahrens, eines Inhalationsprovokationstests und eines Nasenschleimhautprovokationstests, die bisher nur selten durchgeführt wurden. Es war deshalb sehr schwer, eine direkte Diagnose von Milbenallergieerkrankungen zu stellen.
Bisher wurde ein Hausstaubextrakt für eine Hyposensibilisierungstherapie bei durch Hausstaubmilben als spezifischem Antigen verursachtem Bronchialasthma verwendet. Er ist jedoch, was die Dosierung betrifft, einer außerordentlichen Beschränkung unterworfen, und seine therapeutische Wirkung ist sehr gering, da seine chemische Zusammensetzung sehr unbestimmt ist und er zahlreiche verunreinigende, Anaphylaxie induzierende Substanzen enthält.
Daher ist, vom Standpunkt der Wirksamkeit und Sicherheit aus betrachtet, die Entwicklung eines nützlichen Antigens für eine Hyposensibilisierungstherapie erwünscht, und dieses für eine Hyposensibilisierungstherapie verwendbare Antigen hoher Qualität sollte ferner in stabilem Zustand bereitgestellt werden.
Es ist jedoch schwierig, solch ein sicheres Milbenallergen durch ein Verfahren, das auf der Extraktion und Reinigung von Milbenallergen aus einer Milbenkultur beruht, in zur Sicherstellung der gewunschten Wirkung ausreichenden Mengen kontinuierlich bereitzustellen, da mit diesem Verfahren keine Massenproduktion möglich ist und es quantitativ begrenzt ist.
Daher beruht die vorliegende Erfindung auf dem technischen Problem der Beseitigung dieser Nachteile durch Bereitstellung eines rekombinanten Milbenallergens, das von Anaphylaxie-erzeugenden Verunreinigungen frei ist und als ein sicheres und wirksames Arzneimittel und Diagnostikum für Milbenallergieerkrankungen dient.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen bereitgestellt.
Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft daher die Bereitstellung eines rekombinanten Milbenallergens, das durch Expression eines aus einem Milbenkörper stammenden Gens erhalten wird.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines Gens, das dieses Milbenallergen codiert.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines Milbenallergenfragments.
Ein weiterer effindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft auch die Bereitstellung eines Polypeptids, das ein im Milbenallergen enthaltenes Epitop aufweist, oder eines Polypeptids, das ein Epitop aufweist, das als immunologisch identisch mit diesem Epitop betrachtet werden kann.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines Gens, das das vorstehend beschriebene, Epitop-enthaltende Polypeptid codiert.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines Expressionsvektors, der das erfindungsgemäße Gen exprimieren kann.
Ein weiterer effindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung einer Transformante, die einen Expressionsvektor trägt, der dieses Gen exprimieren kann.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung dieses rekombinanten Milbenallergens.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines neuen Arzneimittels für Milbenallergieerkrankungen, deren Wirkstoff das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen ist.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines neuen Diagnostikums für Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen ist.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines neuen Arzneimittels für Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das erfindungsgemäße Milbenallergenfragment ist.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines neuen Diagnostikums für Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das erfindungsgemäße Milbenallergenfragment ist.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines neuen Arzneimittels für Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das erfindungsgemäße Epitop-enthaltende Polypeptid ist.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner die Bereitstellung eines neuen Diagnostikums für Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das erfindungsgemäße Epitop-enthaltende Polypeptid ist.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung
(1) ein rekombinantes Milbenallergen, das die nachstehend gezeigte partielle Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 1), die durch Expression eines aus einem Milbenkörper stammenden Gens erhalten wird, enthält
(2) ein rekombinantes Milbenallergen, das die nachstehend gezeigte partielle Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2), die durch Expression eines aus einem Milbenkörper stammenden Gens erhalten wird, enthält
(3) ein aus einem Milbenkörper stammendes Gen, das ein allergenaktives Protein codiert, das die vorstehend in (1) oder (2) beschriebene Aminosäuresequenz enthält.
(4) ein Milbenallergenfragment, das mindestens eine Aminosäuresequenz enthält, die von einer Nucleotidsequenz codiert wird, die in dem Bereich von etwa 170 bp bis etwa 270 bp, etwa 270 bp bis etwa 400 bp oder etwa 170 bp bis etwa 400 bp der in Figur 10 dargestellten Restriktionskarte liegt,
(5) ein Polypeptid, das ein in einem Milbenallergen enthaltenes Epitop aufweist, oder ein Polypeptid, das ein Epitop aufweist, das als zu diesem Epitop immunologisch identisch betrachtet werden kann,
(6) ein Gen, das das vorstehend in (5) beschriebene Polypeptid codiert,
(7) einen Expressionsvektor, der das vorstehend in (3) oder (5) beschriebene Gen exprimieren kann,
(8) eine Bakterium-, Hefe- oder Säugerzelle, die mit dem vorstehend in (7) beschriebenen Expressionsvektor transformiert ist,
(9) ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Milbenallergens durch Züchtung der vorstehend in (8) beschriebenen Bakterium-, Hefe- oder Säugerzelle unter Bedingungen, bei denen sie ihr Gen exprimieren kann, wobei ein rekombinantes Milbenallergen produziert wird, und anschließende Gewinnung dieses rekombinanten Milbenallergens,
(10) ein Arzneimittel zur Behandlung von Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das vorstehend in (1) oder (2) beschriebene rekombinante Milbenallergen ist,
(11) ein Diagnostikum für Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das vorstehend in (1) oder (2) beschriebene rekombinante Milbenallergen ist,
(12) ein Arzneimittel zur Behandlung von Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das vorstehend in (4) beschriebene Milbenallergenfragment ist,
(13) ein Diagnostikum für Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das vorstehend in (4) beschriebene Milbenallergenfragment ist,
(14) ein Arzneimittel zur Behandlung von Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das vorstehend in (5) beschriebene Polypeptid ist, und
(15) ein Diagnostikum für Milbenallergieerkrankungen, dessen Wirkstoff das vorstehend in (5) beschriebene Polypeptid ist.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1: Ergebnisse der Protein- und Immunfärbung des von λgt11 exprimierten, mit Milbenallergen fusionierten Proteins, wobei die Milbenallergen-cDNA in den Wirt E. coli Y1090 insertiert ist, das nach einer SDS-PAGE-Analyse mit anschließender Übertragung auf eine Nitrozellulosemembran erhalten wird, wobei Balm 1 die Ergebnisse für einen Molekülmarker (β-Galactosidase mit einem Molekulargewicht von etwa 130 000), Bahn 2 die Ergebnisse für das Gesamtprotein von E. coli Y1090-Zellen und Bahn 3 die Ergebnisse für die Immunfärbung des rekombinanten Milbenallergens (durch einen Pfeil angezeigt) unter Verwendung eines Kaninchen-anti-Milbenkörperantigen-Serums zeigen.
Figur 2: Ergebnisse der Agarosegelelektrophorese der Milbenallergen-codierenden cDNA.
Figur 3: Konstruktion des rekombinanten Plasmids pAK1.
Figur 4: Restriktionskarte der Milbenallergen-codierenden cDNA.
Figur 5: Konstruktion des rekombinanten Plasmids pAKE1.
Figur 6: Konstruktion des rekombinanten Plasmids pAEX201.
Figur 7: Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse des mit Milbenallergen fusionierten Proteins, das von pAEX201 im Wirt E. coli pop2136 exprimiert wird, wobei Bahn 1 die Ergebnisse für einen Molekülmarker, Bahn 2 die Ergebnisse für das Gesamtprotein von Plasmid pUEX2-tragenden E. coli pop2136-Zellen, Bahn 3 die Ergebnisse für das Gesamtprotein von das Plasmid pAEX201 tragenden E. coli pop2136-Zellen und Bahn 4 die Ergebnisse für das Protein, das in der Membran von Plasmid pAEX201-tragenden E. coli pop2136 liegt, zeigen (das rekombinante Milbenallergen wird durch einen Pfeil angezeigt).
Figur 8: Ergebnisse einer Gelfiltration und Entfernung des mit Milbenallergen fusionierten Proteins mit SDS unter Verwendung einer Kombination von Ultrogel AcA 44- und AG 11A8-Säulen.
Figur 9: Titrationsergebnisse von gewaschenen Blutzellen eines Asthmapatienten, der auf Milben allergisch ist, mit dem mit Milbenallergen fusionierten Protein.
Figur 10: Gegenwart oder Abwesenheit einer Antigenaktivität in den Deletionsmutanten von rekombinantem Milbenallergen, in dem die mit O markierten Fragmente eine Antigenaktivität aufweisen.
Figur 11: Gegenwart oder Abwesenheit einer Antigenaktivität in den Deletionsmutanten von rekombinantem Milbenallergen, in dem die Symbole -, + und +++ den Grad der Antigenaktivität in den Deletionsmutanten a, b, c und d anzeigen.
Das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen wird durch Expression eines aus einem Milbenkörper stammenden Gens erhalten. Obwohl es für die erfindungsgemäß verwendbaren Milbenarten keine Einschränkung gibt, werden Arten der Hausstaubmilbe, beispielsweise Dermatophagoides farinae und Dermatophagoides pteronyssinus verwendet.
Das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen umfaßt ein Protein, das die nachstehend gezeigte partielle Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.1) enthält, und eine Allergenaktivität aufweist.
Ein weiteres erfindungsgemäßes rekombinantes Milbenallergen umfaßt ein Protein, das die nachstehend gezeigte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.2) enthält, die die vorstehend dargestellte partielle Aminosäuresequenz umfaßt und eine Allergenaktivität aufweist.
Das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen kann jede Variante sein, die durch Substitution, Deletion, Addition oder Translokation einer oder mehrerer Aminosäuren in der vorstehend dargestellten Aminosäuresequenz entsteht, sofern sie eine Allergenaktivität aufweist. Diese Variante kann als eine natürlich vorkommende allele Variante oder durch Induzierung einer Mutation an einer spezifischen Stelle der DNA durch DNA-Rekombinationsverfahren erhalten werden.
Das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen kann als Fusionsprotein mit einem anderen Protein exprimiert werden. In der vorliegenden Beschreibung wird ein rekombinantes Milbenallergen, das als Fusionsprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert wird, gelegentlich auch als fusioniertes rekombinantes Milbenallergen bezeichnet. Obwohl es für das andere an der Fusion beteiligte Protein keine Einschränkung gibt, schließen Beispiele davon β-Galactosidase, Glutathion-S-Transferase und Protein A ein.
Das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen kann ein Proteinfragment sein, das nur einen für die Allergenaktivität wesentlichen Bereich umfaßt, und eine für die Allergenaktivität wesentliche Domäne umfassen kann.
In dieser Beschreibung wird ein aktives Fragment mit einer Allergenaktivität als ein Milbenallergenfragment bezeichnet. Beispiele dafür sind Fragmente, die mindestens eine Aminosäuresequenz enthalten, die von einer Nucleotidsequenz codiert wird, die in dem Bereich von etwa 170 bp bis etwa 270 bp, etwa 270 bp bis etwa 400 bp, oder etwa 170 bp bis 400 bp stromabwärts der FcoRI-Stelle enthalten ist, die am 5'-Terminus der in Figur 10 dargestellten Restriktionskarte liegt.
Das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen kann nicht nur durch Expression von Milbenallergenprotein allein, sondern auch durch Eliminierung des anderen Proteins aus einem Fusionsprotein erhalten werden.
Kurz gesagt, das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen ist ein allergenaktives Protein, das im wesentlichen die vorstehend beschriebene Aminosäuresequenz enthält, die durch Expression eines aus einem Milbenkörper-stammenden Gens erhalten wird.
Ein Beispiel für das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen ist das nachstehende mit β-Galactosidase fusionierte rekombinante Milbenallergen, das in E. coli exprimiert wird. Das in E. coli exprimierte fusionierte rekombinante Milbenallergen wird durch Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung von Ultrogel AcA 44 (hergestellt von LKB), Affinitätschromatographie mit einem immobilisierten anti-β- Galactosidaseantikörper und Affinitätschromatographie mit einem immobilisierten anti- Milbenkörper-Antikörper gereinigt und weist die nachstehenden Eigenschaften als rekombinantes Milbenallergen auf.
1) Farbe und Aussehen: weiß.
2) Wasserlöslichkeit: leicht löslich.
3) Molekulargewicht: etwa 40 000, wie durch SDS-PAGE unter Verwendung der nachstehenden Gleichung geschätzt wurde.
Molekulargewicht des Fusionsproteins - Molekulargewicht der β-Galactosidase
4) Enthält die nachstehend gezeigte partielle Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.1)
oder enthält die nachstehend gezeigte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.2), die die vorstehend gezeigte partielle Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.1) enthält.
5) Weist eine Antigenität auf. Ermittelt auf der Basis der Reaktivität im ELISA mit dem spezifischen IgG in einer Ansammlung aus Milbenallergie- Patientenserum, in Kaninchen-anti-Milbenkörperserum und Kaninchen-anti-β-Galactosidaseserum und Reaktivität mit dem vorstehend beschriebenen Antiserum nach der SDS-PAGE des exprimierten Proteins mit anschließender Übertragung auf eine Nitrocellulosemembran.
6) Weist eine Allergenaktivitat auf. Ermittelt durch einen Freisetzungstest von Histamin aus Leukocyten eines Milbenallergiepatienten auf der Basis einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
7) Induziert keine Anaphylaxiereaktion. Meerschweinchen werden mit dem Fusionsprotein oder Milbenallergenprotein durch ein übliches Verfahren immunisiert und nach einer Nachimmunisierung auf eine Anaphylaxiereaktion untersucht.
Das erfindungsgemäße aus einem Milbenkörper stammende Gen wird durch Gewinnung der mRNA aus lebenden Milbenkörpern und Synthese der cDNA durch ein übliches Verfahren unter Verwendung dieser mRNA als Matrize erhalten. Es codiert ein allergenaktives Protein, das die vorstehend im Molekül beschriebene Aminosäuresequenz enthält. Beispiele für die die partielle Aminosäuresequenz codierende DNA schließen die nachstehend gezeigte Sequenz (SEQ ID Nr.1) ein.
Ein Beispiel für die DNA ist ferner die nachstehend gezeigte Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr.2), die die vorstehend dargestellte Nucleotidsequenz enthält.
Diese DNA-Sequenz ist nicht zu irgendeiner der DNA-Sequenzen homolog, die für die Allergene Der p I, Der p II und Der f II beschrieben sind.
Die Gesamtlänge der Nucleotidkette der cDNA des von einem Milbenkörper stammenden erfindungsgemäßen Gens ist etwa 1,2 kb [durch Agarose-Gelelektrophorese ermittelt, die Länge ist ohne Linker 1143 bp (etwa 1,1 kb), die Länge der translatierten Basenkette mit Terminationscodon ist jedoch 1026 bp (etwa 1 kb), da die Expression bei der eigentlichen Expression am Terminationscodon vor dem Linker endet], und sie weist die in Figur 4 dargestellte Restriktionskarte auf.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor wird so konstruiert, daß das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Gen in einer transformierten Bakterien, Hefe- oder Säugerzelle exprimiert werden kann. Die zur Konstruktion des Expressionsvektors verwendete Vektor-DNA ist nicht beschränkt, jede allgemein verfügbare Vektor-DNA kann verwendet werden, einschließlich pUC18, pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo), pUEX2 (hergestellt von Amersham), pKK233-2 (hergestellt von Pharmacia) und pMAM-neo (hergestellt von Clontech).
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor pAK1 kann beispielsweise durch Spaltung der mit KpnI-SacI in den λgt11-Phagen insertierten Milbenallergen-cDNA und Ligierung in die KpnI-SacI-Stelle des Plasmidvektors pUC18 erhalten werden. Ein weiterer Expressionsvektor PAKE1 kann durch Ligierung des durch Spaltung erhaltenen EcoRI-Fragments von pAK1 in die EcoRI-Stelle von pUC18 in der gleichen vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden. Ein weiterer Expressionsvektor pAEX201 kann durch Ligierung des durch Spaltung erhaltenen EcoRI-Fragments von pAKE1 mit pUEX2 (hergestellt von Arnersham), das zuvor durch EcoRI gespalten wurde, erhalten werden.
Die mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Bakterien, Hefe- oder Säugerzelle ist nicht beschränkt, sofern sie das erfindungsgemäße Gen exprimieren kann. Beispiele für diese Bakterien schließen E. coli und Bacillus subtilis ein. Beispiele für diese Hefen sind Saccharomyces cerevisiae. Beispiele für diese Säugerzellen sind Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Affen-COS-Zellen und Mausfibroblasten.
Das Herstellungsverfahren für das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen umfaßt die Züchtung einer Bakterien, Hefe- oder Säugerzelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der das erfindungsgemäße Gen unter für die Expression dieses Gens geeigneten Bedingungen exprimieren kann, wobei das rekombinante Milbenallergen produziert wird, und die anschließende Gewinnung dieses rekombinanten Milbenallergens.
Das Herstellungsverfahren für das rekombinante Milbenallergen unter Verwendung einer E. coli-Transformante, die ein die Milbenallergen-cDNA-Insertion enthaltendes Fusionsprotein-Expressionsplasmid trägt, wird nachstehend erläutert:
Zunächst wird eine E. coli-Transformante, die ein Expressionsplasmid für ein β-Galactosidase-fusioniertes Protein trägt, in das die Milbenallergen-cDNA insertiert ist, durch ein übliches Verfahren unter Schütteln bis zur logarithmischen Phase gezüchtet, und unter Beibehaltung der logarithmischen Wachstumsphase wird das Fusionsprotein nach der Induktion durch Veränderung der Temperatur oder Zugabe eines β- Galactosidaseinduktors synthetisiert. Beispiele für als Wirtszellen verwendete E. coli- Stämme sind E. coli pop2136 (hergestellt von Amersham), und der mit dem Expressionsvektor transformierte Stamm wird als E. coli pop2136 OL-1 (FERM BP-3497) bezeichnet.
Nach Beendigung der Züchtung werden die Zellen geerntet, in einem Serin, Cystein, Asparaginsäure und metallische Proteaseinhibitoren enthaltenden Puffer suspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Das Membran-ständige Protein in den Zelltrümmern wird mit einem Puffer extrahiert, der sowohl Proteaseinhibitoren, beispielsweise Phenylmethansulfonylfluorid, Monoiodessigsäure, Pepstatin A und Ethylendiamintetraessigsäure, als auch ein Detergens, beispielsweise Natriumlaurylsulfat (SDS), Triton X-100 oder Nonidet P40, enthält. Das Milbenallergen-β-Galactosidase- Fusionsprotein, das aus dem Extrakt oder Kulturkonzentrat erhalten wird, wird beispielsweise durch Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung von Ultrogel AcA 44 (hergestellt von LKB), Affinitätschromatographie mit dem immobilisierten anti-β- Galactosidaseantikörper und Affinitätschromatographie mit dem immobilisierten anti- Milbenkörper-Antikörper gereinigt. Der Träger mit dem immobilisierten anti-β-Galactosidaseantikörper wird durch kovalente Bindung eines anti-β-Galactosidaseantikörpers (hergestellt von 5Prime T 3Prime Inc.) an einen aktivierten Tresyl-Träger, beispielsweise Tresyl-GM-Gel (hergestellt von Kurita Water Industries Ltd.), Tresyl- Toyopearl (hergestellt von Tosoh Corporation) oder Tresyl-Sepharose (hergestellt von Pharmacia), hergestellt. Der Träger mit dem immobilisierten anti-Milbenkörper- Antikörper wird durch kovalente Bindung eines Kaninchen-anti-Milbenkörper- Antikörpers an den vorstehend beschriebenen aktivierten Träger hergestellt.
Das gereinigte, rekombinante Milbenallergen-Fusionsprotein wird mit einer Protease gespalten und anschließend durch ein oder mehrere der bekannten Reinigungsverfahren, beispielsweise Gelfiltrations-Chromatographie, Ultrafiltration, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Chromatographie, chromatographische Fokussierung, isoelektrische Fokussierung und Gelelektrophorese, fraktioniert, während der Ablauf der Fraktionierung durch ELISA und einen Histamin- Freisetzungstest der Leukozyten von Milbenallergie-Patienten [Arerugi 37 (1988), 725] überwacht wird. Aus dieser so erhaltenen aktiven Fraktion werden die von der β- Galactosidase stammenden Proteinbestandteile absorbiert und durch eine Affinitätssäule mit einem immobilisierten anti-β-Galactosidaseantikörper entfernt, wonach das rekombinante Milbenallergenfragment unter Verwendung einer Affinitätssäule mit einem immobilisierten anti-Milbenkörper-Antikörper gereinigt wird.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren können ferner einzeln oder kombiniert zur Reinigung des Milbenallergenfragments aus dem Spaltprodukt des Fusionsproteins verwendet werden, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren mit einer Protease, beispielsweise Pronase, Subtilisin, Thermolisin oder Trypsin, gereinigt wurde, oder aus dem durch Behandlung mit einer Chemikalie, beispielsweise Cyanogenbromid, 2-Nitro-5-thiocyanobenzoesäure oder Hydroxylamin erhaltenen Abbauprodukt verwendet werden.
Das Herstellungsverfahren für das erfindungsgemäße rekombinante Milbenallergen schließt nicht nur eine direkte Expression des Milbenallergenproteins ein, sondern auch das Verfahren, in dem ein Fusionsprotein, das als ein durch Fusion von Milbenallergen mit einem anderen Protein über eine intervenierende Sequenz erhaltenes, fusioniertes rekombinantes Milbenallergen exprimiert wird, gewonnen und das fusionierte andere Protein anschließend entfernt wird.
Beispiele für das andere, zu fusionierende Protein sind β-Galactosidase, Glutathion-S-Transferase, Protein A und andere Proteine, die bekanntermaßen üblicherweise ein Fusionsprotein bilden.
Das andere Protein kann auch durch ein bekanntes Verfahren entfernt werden. Wenn beispielsweise das andere Protein β-Galactosidase ist und ein partielles Kollagenoder Fibrinogenprotein zwischen dem anderen Protein und dem Milbenallergenprotein vorhanden ist, wird das Milbenallergenprotein durch ein oder mehrere der vorstehend beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Kollagenase oder Thrombin gereinigt.
Das erfindungsgemäße Milbenallergenfragment kann leicht als ein rekombinantes Milbenallergen erhalten werden, indem ein Expressionsvektor aus der die Aminosäuresequenz dieses Fragments codierenden DNA durch ein übliches Verfahren konstruiert und die DNA in einem geeigneten Wirt exprimiert wird.
Dieses Milbenallergenfragment kann ferner als ein synthetisches Milbenallergen verwendet werden, das durch das übliche Festphasen-Syntheseverfahren einzeln oder konjugiert mit einem geeigneten Träger, beispielsweise das zur intrakutanen Verabreichung als sicher eingestuftes menschliches Serumalbumin oder Seescheiden (sea squirt)-Antigen, synthetisiert wird.
Beispiele für das erfindungsgemäße Polypeptid, das ein Epitop aufweist, das im aus einem Milbenkörper stammenden Milbenallergen enthalten ist, oder für das Polypeptid, das ein Epitop aufweist, das mit diesem Epitop immunologisch identisch ist, schließen Polypeptide mit der nachstehend dargestellten Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.3)
oder der folgenden Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.4) ein.
Beispiele für das diese Polypeptide codierende Gen schließen Polypeptide mit der nachstehend dargestellten DNA-Sequenz (SEQ ID Nr.3)
oder der nachstehend dargestellten DNA-Sequenz (SEQ ID Nr.4) ein.
Das erfindungsgemäße Polypeptid, das ein Epitop aufweist, das im aus dem Milbenkörper stammenden Milbenallergen enthalten ist, oder das Polypeptid, das ein Epitop aufweist, das als zu diesem Epitop als immunologisch identisch betrachtet werden kann, ist vorstehend beschrieben. Obwohl beide als Wirkstoff eines Arzneimittels oder eines Diagnostikums für Milbenallergieerkrankungen verwendet werden können, wird das Polypeptid SEQ ID Nr.4 bevorzugt verwendet, da seine antigene Wirkung stärker ist.
Das Arzneimittel zur Behandlung von erfindungsgemäßen Milbenallergieerkrankungen enthält als Wirkstoff das gereinigte rekombinante Milbenallergen, Milbenallergenfragment oder das vorstehend beschriebene Epitop-enthaltende Polypeptid und wird zur Behandlung von verschiedenen Milbenallergieerkrankungen verwendet. In dieser Beschreibung schließen Milbenallergieerkrankungen alle Allergieerkrankungen ein, die durch das spezifische Milbenantigen verursacht werden, beispielsweise atopisches Bronchialasthma, allergische Rhinitis, allergische Konjunktivitis und allergische Dermatitis.
Das Herstellungsverfahren für das Arzneimittel zur Behandlung von erfindungsgemäßen Milbenallergieerkrankungen ist nicht beschränkt. Das durch das vorstehend beschriebene Verfahren gereinigte rekombinante Milbenallergen oder das Milbenallergenfragment oder Epitop-enthaltende Polypeptid, die gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt werden, wird beispielsweise getrocknet, als Pulver gewonnen und als hyposensibilisierendes Arzneimittel für Milbenallergieerkrankungen verwendet. In der Hyposensibilisierungstherapie kann das erfindungsgemäße Arzneimittel für Milbenallergieerkrankungen allein oder als Formulierung, die sofern es notwendig ist, durch Zugabe eines üblichen Adjuvans oder verschiedener Zusätze, beispielsweise Stabilisator, Excipient, Lösungsverstärker, Emulgator, Puffer, Schmerzmittel, Konservierungsmittel und Farbstoff, durch ein übliches Verfahren hergestellt wird, verwendet werden. Das in Pulverform gereinigte rekombinante Milbenallergen wird beispielsweise in einer Phenol-enthaltenden Kochsalzlösung gelöst, und diese Lösung wird als Stammlösung eines Antigens für eine Hyposensibilisierungstherapie verwendet.
Das so erhaltene erfindungsgemäße Arzneimittel umfaßt als Wirkstoff eine pharmazeutisch wirksame Menge des rekombinanten Milbenallergens und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel für die Milbenallergieerkrankungen kann auf üblichen Wegen, beispielsweise durch perorale, intrakutane, subkutane, intramuskuläre und intraperitoneale Injektion, verabreicht werden. Das Arzneimittel kann ferner durch die Haut oder die Schleimhäute verabreicht werden, beispielsweise als Pastillen, sublinguale Tabletten, Augentropfen, intranasales Spray, Packungen, Cremes und Lotionen.
Die Dosierungs- und Verabreichungshäufigkeit des erfindungsgemäßen Arzneimittels für Milbenallergieerkrankungen werden gemäß dem Verabreichungsweg, den Symptomen und anderen Bedingungen passend gewählt, so daß die Dosierung etwa 20 µg pro Verabreichung für einen Erwachsenen mit einer Verabreichungshäufigkeit von etwa einmal pro Woche nicht übersteigt.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel für die Milbenallergieerkrankungen kann nicht nur als Arzneimittel, sondern auch als präventives Mittel für Milbenallergieerkrankungen verwendet werden. Da das erfindungsgemäße Arzneimittel für Milbenallergieerkrankungen keine Anaphylaxie-induzierende Wirkung zeigt, kann es für Menschen sicher verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Diagnostikum für Milbenallergieerkrankungen wird als Hautreaktionsdiagnostikum für Milbenallergieerkrankungen und als Titrationsmittel zur Diagnose von Milbenallergie verwendet.
Zur Verwendung als Hautreaktionsdiagnostikum wird das erfindungsgemäße Diagnostikum für Milbenallergieerkrankungen durch ein übliches Verfahren aus dem rekombinanten Milbenallergen, das durch die vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt wird, oder dem Milbenallergenfragment oder dem Epitop-enthaltenden Polypeptid, die gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt werden, hergestellt. Das rekombinante Milbenallergen wird beispielsweise als trockenes Pulver hergestellt, das in einer Phenol-enthaltenden Kochsalzlösung gelöst und verdünnt verwendet wird. Das Hautreaktionsdiagnostikum wird gemäß einem üblichen Verfahren verwendet.
In ähnlicher Weise wird das Diagnostikum für Milbenallergieerkrankungen bei einer Verwendung als Titrationsmittel zur Diagnose von Milbenallergie durch ein übliches Verfahren hergestellt. Das rekombinante Milbenallergen wird beispielsweise in Hanks-Lösung ausreichend gelöst und nach einer Verdünnung als Reagens zur Titration der Histaminfreisetzung verwendet. Dieses Verfahren wird normalerweise gemäß den nachstehenden Arbeitsschritten durchgeführt.
Blut eines Milbenallergiepatienten und eine aus diesem Blut durch Zentrifugation erhaltene Blutzellfraktion werden in einem Puffer suspendiert, wobei eine Blutzellsuspension erhalten wird. Eine bestimmte Menge dieser Suspension wird unter Verwendung des rekombinanten Milbenallergens und eines Titrationsmittels titriert und die von den Basophilen (eine Leukocytenart) als Antwort auf eine Allergenstimulierung freigesetzte Menge Histamin durch HPLC ermittelt [Arerugi 37 (1988), 725].
In dieser Titration der Histaminfreisetzung wird die freigesetzte Menge Histamin aus dem Niveau bei 50 % der maximalen Freisetzung (Wendepunkt der Titrationskurve) berechnet. Diese Titration weist zwei Merkmale auf. (1) Die Allergenempfindlichkeit des Patienten wird direkt aus dem Titer der Blutzellsuspension ermittelt. (2) Nach der Vorreaktion von Blutplasma und rekombinantem Milbenallergen ist der Wert, der durch Titration der Blutzellsuspension mit der Reaktionslösung (Wert der Bluttitrationskurve) erhalten wird, üblicherweise höher als der durch Titration der Blutzellsuspension mit dem rekombinanten Milbenallergen erhaltene Wert (Wert der Titrationskurve der Blutzellsuspension). Dies bewirkt ein Allergen-neutralisierender IgG-Antikörper (blockierenden Antikörper) im Blutplasma.
Daher kann der Titer des blockierenden Antikörpers aus dem Grad der Verschiebung der Bluttitrationskurve gegenüber der Titrationskurve der Blutzellsuspension erhalten werden. Auf der Basis der Allergenempfindlichkeit und dieses Titers des blockierenden Antikörpers kann eine genaue Diagnose der Milbenallergie erstellt werden. Dieser Titrationstest der Histaminfreisetzung kann zur Überwachung der Wirkung der Hyposensibilisierungstherapie verwendet werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Extraktion der Gesamt-RNA von Milben

6 g Körpermasse von lebenden Milben, die durch Züchtung von Dermatophagoides farinae durch ein übliches Verfahren erhalten wurden, wurden zusammen mit 10 g Quarzsand in 200 ml einer Lösung von 5,5 M Guanidinisocyanat (hergestellt von Katayama Kagaku) in einem Mörser zermahlen und zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde zur partiellen Spaltung der DNA mit einer 50 ml-Spritze mit einer 18G-Injektionsnadel wiederholt eingesaugt und ausgespritzt. Nach einer weiteren Zentrifugation wurde eine Lösung aus Caesiumtrifluoracetat (hergestellt von Katayama Kagaku) mit dem Überstand in einem Verhältnis von 16 ml Überstand zu 17 ml Lösung überschichtet und einer Dichtegradientenzentrifugation bei 85 000 x g bei 24ºC (15ºC, Hitachi SCP55H swing PRS-27-2) unterzogen, und die Gesamt-RNA-Fraktion, die auf dem Boden des Röhrchens ein Pellet bildete, wurde gewonnen.
Diese Gesamt-RNA-Fraktion wurde in einer Lösung von 4,0 M Guanidinisocyanat gelöst und mit Ethanol ausgefällt, wobei 1 ml einer Lösung von TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) erhalten wurde.

Beispiel 2

Abtrennung der Milbenallergen-poly(A)-mRNA

Die in TE gelöste Gesamt-Milben-RNA wurde 10 Minuten bei 65ºC erhitzt und schnell abgekühlt, wonach eine äquivalente Menge von 1 M NaCl zugesetzt und das Gemisch auf eine Oligo-(dT)-Cellulosesäule (Säulenvolumen 0,5 ml, hergestellt von Boehringer Mannheim) aufgetragen wurde, die mit einer STE-Lösung (10 mM Tris- HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl) voräquilibriert war. Nach der Rückführung des Eluats auf die Säule wurde die Säule mit einem 2,5fachen Volumen einer STE- Lösung gewaschen. Nach dem Waschen der Säule wurde die Poly(A)-mRNA mit TE- Lösung eluiert. Hier wurden 0,2 ml-Fraktionen gesammelt, und die Fraktionen, in denen durch einen Ethidiumbromid-Fleckentest RNA nachgewiesen wurde, wurden vereinigt. Diese Säulenreinigung wurde wiederholt und die RNA durch Ethanolfällung aus der vereinigten Fraktion gewonnen, wobei eine Poly(A)-mRNA-Fraktion erhalten wurde. Als Ausbeute wurden in einem Fleckentest zusammen mit bekannten Konzentrationen von Verdünnungsreihen der RNA-Lösung etwa 20 µg ermittelt.

Beispiel 3

Synthese von Milbenallergen-cDNA

Anschließend wurde in Gegenwart von 5 µg Poly(A)-mRNA als Matrize eine cDNA, die einen 13mer-Linker an beiden Enden aufwies und eine EcoRI-Stelle enthielt, unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits (hergestellt von Pharmacia) gemäß der Bedienungsanleitung synthetisiert.

Beispiel 4

Herstellung einer Milbenallergen-cDNA-Bank

Ein Fünftel der cDNA wurde mit 1 µg EcoRI-gespaltenem λgt11 (hergestellt von Stratagene Cloning System) vermischt. Nach der Konzentrierung mit Ethanol wurde dieses Gemisch mit 200 Einheiten T4-DNA-Ligase 15 Stunden bei 12ºC umgesetzt, wobei die cDNA in die EcoRI-Stelle von λgt11 inseriert wurde. Aus diesem Reaktionsgemisch wurde eine cDNA-Bank unter Verwendung eines in vitro-Verpackungskits (Giga-pack PLUS, hergestellt von Stratagene Cloning System) gemäß der Bedienungsanleitung hergestellt. Nach zwei Zyklen dieses Herstellungsverfahrens der Bank wurden insgesamt 41 000 pfu (Plaque-bildende Einheit) cDNA aus 2 µg Poly(A)-mRNA hergestellt.

Beispiel 5

Clonierung der Milbenallergen-cDNA

Der die cDNA-Insertion enthaltende λgt11-Phage wurde in einer SM-Lösung (1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 10 mM MgSO&sub4;, 2 % Gelatine) suspendiert. Diese Suspension wurde zur Infektion des Wirts mit dem Phagen zusammen mit dem über Nacht inkubierten E. coli Y1090 (hergestellt von Stratagene Cloning System) 30 Minuten bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde auf Platten aus LB-Agarmedium [1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 1,5 % Bacto-Agar (alle hergestellt von Difco Laboratories), 0,5 % Nach verteilt, so daß sich etwa 2 000 Plaques pro Platte bildeten. Nach einer 3-stündigen Züchtung bei 42ºC wurde das Medium mit einer Nitrozellulosemembran (Hibond-C, hergestellt von Amersham) bedeckt, die zuvor in 10 mM Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG) getaucht und anschließend getrocknet wurde, wonach 3 Stunden bei 37ºC weiter gezüchtet und das induktiv-synthetisierte, an β-Galactosidase-fusionierte Protein auf die Nitrozellulosemembran transferiert wurde. Nach einer Blockierung über Nacht in einer 2 % BSA enthaltenden TBS-Lösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 % NaCl) wurde die Nitrozellulosemembran mit einem Kaninchen-anti-Milbenkörper-Antigenserum (100fache Verdünnung in TBS) 1 Stunde und anschließend mit einem Peroxidase-konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (hergestellt von Cappel, 2 000fache Verdünnung in TBS) 1 Stunde umgesetzt, und die Flecken wurden in einer 0,4 mg/ml Diaminobenzidintetrahydrochlorid enthaltenden TBS-Lösung in Gegenwart von 0,01 % Wasserstoffperoxid sichtbar gemacht. Das Kaninchen-anti-Milbenkörper-Antigenserum wurde durch Suspension von Milbenkörpem aus einer Kultur mit vollständigen Milben in einer gesättigten Kochsalzlösung und PBS, Waschen der Milbenkörper mit PBS, Mahlen und Verwendung des Grundproduktes als Immunogen für die Nachimmunisierung von Kaninchen einmal pro Woche über 10 Wochen erhalten. Der Plaque, der der Position des braunen Fleckens entsprach, wurde gestochen, in SM suspendiert und als positiver Clon aufbewahrt.

Beispiel 6

Expression von fusioniertem Protein unter Verwendung des λgt11-Phagenvektors

Der durch Immundurchmusterung in Beispiel 5 erhaltene positive Clon wurde zusammen mit 50 µg von über Nacht in einer Nährlösung gezüchteten E. coli Y1090 in 3 ml eines 100 µg 100 mM IPTG enthaltenden LB-Flüssigmediums 8 Stunden bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet und der erhaltene Kulturüberstand gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei eine Probe für einen Western-Blot erhalten wurde.
Die SDS-PAGE wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli et al. [Nature 227 (1970), 680-685] durchgeführt. Mit 2 mg einer Probe wurden unter den Bedingungen einer Polyacrylamidgelkonzentration von 5 % und einer konstanten elektrischen Stromstärke von 15 mA eine Elektrophorese durchgeführt. Anschließend wurde die Probe durch 2-stündige Elektrophorese in einem in SDS-mobilen Puffer (192 mM Glycin, 25 mM Tris, pH 8,3, 0,1 % SDS, 20 % Methanol) bei 8 bis 10 V/cm vom Acrylamidgel auf eine Immobilon-Membran (Porengröße 0,45 µm, hergestellt von Millipore) transferiert. Diese Immobilon-Membran wurde einer Proteinfärbung mit "Auro Dye" (hergestellt von Janssen Life Sciences Products) und einer Immunfärbung mit einem Sammelserum eines Milbenallergiepatienten Kaninchen-anti-Milbenkörper- Antigenserum und Kaninchen-anti-β-Galactosidaseantikörper (hergestellt von 5Prime T 3Prime Inc.) unterzogen, und das mit Milbenallergen fusionierte Protein wurde nachgewiesen (Figur 1).

Beispiel 7

Konstruktion des rekombinanten Plasmids

Nach der Gewinnung aus dem λgt11-Phagendon mit der cDNA-Insertion, die das mit Milbenallergen-β-Galactosidase fusionierte, mit diesen Antiseren reagierende Protein codierte, wurde die DNA mit EcoRI gespalten. Dieses Spaltprodukt wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und die Länge der cDNA-Kette wurde als etwa 1,2 kb (einschließlich des Linkers) (durch einen Pfeil in Figur 2 angezeigt) ermittelt. Anschließend wurde die diese cDNA enthaltende λgt11-Phagen-DNA mit KpnI-SacI gespalten. Das erhaltene Fragment (etwa 3,3 kb) wurde in die KpnI-SacI-Stelle des Plasmidvektors pUC 18 (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert und dieser gemäß dem Verfahren von Hanahan [DNA Cloning Bd. 1 (1985), 109-136, D. M. Glover (Hrsg.), IRL Press] (Figur 3) in E. coli JM109 (Takara Shuzo) transformiert.
Das erhaltene rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pAK1, das zur Erstellung einer Restriktionskarte (1144 bp, ohne den Linker) (Figur 4) verwendet wurde.

Beispiel 8

Ermittlung der Nucleotidsequenz der Milbenallergen-cDNA

Das durch Spaltung erhaltene EcoRI-Fragment des Plasmids pAK1 wurde in die EcoRI-Stelle des gleichen Plasmidvektors pUC18 ligiert und E. coli JM109 damit in der gleichen Weise transformiert (Figur 5).
Das erhaltene rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pAKE1, das zur Erstellung einer Restriktionskarte (940 bp, ohne den Linker) (Figur 4) verwendet wurde. Anschließend wurde eine einzelsträngige DNA durch ein übliches Verfahren aus den Kulturüberständen von Transformanten der Phagenvektoren M13mp18 und mp19 (hergestellt von Takara Shuzo) hergestellt, die unterschiedliche, durch Spaltung der rekombinanten Plasmide pAK1 und pAKE1 mit Restriktionsenzymen, beispielsweise EcoRI und BamHI, erhaltene Fragmente enthielten, und ihre partielle Nucleotidsequenz durch das Didesoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung der Sequenase Version 2,0 (hergestellt von Toyobo Ltd.) (SEQ ID Nr.1) ermittelt.
Durch eine wiederholte Untersuchung der Nucleotidsequenz durch das gleiche Verfahren wurde eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr.2) von etwa 1,1 kb (ohne den Linker), die die vorstehend beschriebene Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr.1) enthielt, ermittelt.

Beispiel 9

Konstruktion eines Velktors mit hoher Expression

Das Fragment (940 bp) der EcoRI-Spaltung des rekombinanten Plasmids pAKE1 wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und unter Verwendung des Geneclean II-Kits (hergestellt von Bio 101) extrahiert. Dieser Extrakt wurde mit dem zuvor durch EcoRI gespaltenen Vektor pUEX2 (hergestellt von Amersham) ligiert, so daß der Leserahmen zur Translationsrichtung paßte (Figur 6).

Beispiel 10

Expression als Fusionsprotein

Das in Beispiel 9 erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pAEX201 bezeichnet und in E. coli pop2136 (hergestellt von Amersham) transformiert.
Diese Transformante wurde bei 28ºC in 500 ml eines SBA-Flüssigmediums (2,4 % Bacto-Hefeextrakt, 1,2 % Bacto-Polypepton, 0,5 % Glycerin, 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,5, 50 mg/ml Ampicillin) bis zu einem OD-Wert bei 600 nm von 0,6 unter Schütteln gezuchtet. Nach der Zugabe einer äquivalenten Menge von bei 56ºC gehaltenem SBA-Medium wurde die Schüttelkultur weitere 90 Minuten bei 42ºC fortgesetzt. Eine geeignete Menge an frischem SBA wurde zu geeigneten Zeiten zugesetzt, so daß der OD-Wert während der durch diese Temperaturänderung auf 42ºC induzierten Synthese des Fusionsproteins zwischen 0,6 und 1,0 blieb. Nach Abschluß der Züchtung wurde die Kulturbrühe zentrifugiert. Die Zellen wurden geerntet, mit sterilem Wasser gewaschen und in 10 ml einer Proteaseinhibitoren enthaltenden Lösung [0,1 M Tris- HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM Phenylmethansulfonylfluorid, 1 mM Iodessigsäure, 5 mM 1,2-Epoxy-3-(p-nitrophenoxy)-propan] suspendiert. Diese Suspension wurde zum Aufbrechen der Zellen 1 Minute mit 10 Cyclen Ultraschall von 10 bis 20 kHz behandelt. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet in 10 ml einer 0,02%igen SDS-Lösung suspendiert. Nach der erneuten Zentrifugation wurde das Pellet-bildende, membranständige Protein in 10 ml einer 2%igen SDS-Lösung vollständig gelöst. Das gefriergetrocknete Produkt dieses Extrakts wurde durch SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt.

Beispiel 11

Reinigung des rekombinanten mit dem Milbenallergen fusionierten Proteins

Die Ausbeute des gefriergetrockneten Produkts des Extrakts war 122 mg von 500 ml der Kulturbrühe. 5 mg gefriergetrocknetes Produkt wurden in 500 µl Wasser gelöst. und diese Lösung wurde auf zwei Säulen aus Ultrogel AcA 44 (hergestellt von LKB, 1,4 x 50 cm) und AG 11A8 (hergestellt von Bio-Rad, 1,4 x 14 cm) aufgetragen und unter Verwendung von entionisiertem Wasser als Entwicklerlösung mit einer Fließrate von 10 ml/Std. entwickelt und die im Hohlraumvolumen eluierte Fraktion wurde gesammelt (Figur 8). Die Ausbeute an gefriergetrocknetem Produkt dieser Fraktion war 0,6 mg. Das gefriergetrocknete Produkt wurde anschließend durch eine Affinitätssäule mit einem immobilisierten anti-β-Galactosidaseantikörper geschickt und anschließend unter Verwendung einer Affinitätssäule mit einem immobilisierten anti- Milbenkörper-Antikörper gereinigt. Die Affinitätssäule mit einem immobilisierten antiβ-Galactosidaseantikörper wurde durch Immobilisierung eines anti-β-Galactosidaseantikörpers (hergestellt von 5Prime T 3Prime Inc.) an ein Tresyl-GM-Gel (hergestellt von Kurita Water Industries Ltd.) hergestellt. Die Affinitätsszule mit einem immobilisierten anti-Milbenkörper-Antikörper wurde durch Fraktionierung des in Beispiel 5 beschriebenen Kaninchen-anti-Milbenkörper-Antigenserums mit Ammoniumsulfat, anschließendes Reinigen der Ammoniumsulfatfraktion unter Verwendung einer Säule mit Protein A und Immobilisierung an ein Tresyl-GM-Gel hergestellt.

Beispiel 12

Histamin-Freisetzungstest unter Verwendung von gereinigtem Fusionsprotein

Eine Lösung des gereinigten Antigens (1 mg/ml) wurde auf ein geeignetes Volumen verdünnt. Zu 200 µl dieser verdünnten Lösung wurden 200 µl einer Suspension von mit Hanks-Lösung gewaschenen Blutzellen eines Milben-Asthmapatienten zugesetzt, und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Nach einer 10-minütigen Zentrifugation mit 1 400 Upm wurden 200 µl Überstand abgenommen. Dem Überstand wurden 10 µl 60%ige Perchlorsäure zugesetzt, und dieses Gemisch wurde heftig gerührt und zur Entfernung des Proteins 10 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert. Mit 150 µl Überstand wurde eine HPLC durchgeführt, um die Histaminmenge in 100 µl Überstand zu ermitteln. Die Gesamtmenge an Histamin wurde so wie vorstehend beschrieben ermittelt, ausgenommen, daß die Blutzellen nicht durch Zentrifugation entfernt wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 9 dargestellt, in der die Antigenkonzentration auf der Abszisse und das Prozentverhältnis des freigesetzten Histamins [(Menge des freigesetzten Histamins/Gesamtmenge Histamin) x 100] auf der Ordinate angegeben sind. Ein Vergleich der Konzentration am Wendepunkt zeigt, daß dieses Milbenallergen-Fusionsprotein in einer um das 200fache geringeren Konzentration als das Rohmilbenkörperantigen reagierte.

Beispiel 13

Herstellung des rekombinanten Milbenallergenfragments

Unter Verwendung von pUEX2, das das EcoRI-cDNA-Fragment von 970 bp als Insertion enthielt, wurde mit Exonuclease III (hergestellt von Takara Shuzo, Deletion kit for Kilo-Sequence) eine Deletion des stromabwärts liegenden Teils der cDNA durchgeführt. Als Ergebnis wurden 10 Arten cDNA mit einer deletierten Nucleotidkette, wie in Figur 10 dargestellt, erhalten.
Diese deletierten cDNA-Fragmente wurden jeweils in E. coli transformiert und die Zellen auf einer Nitrozellulosemembran bei 28ºC gezüchtet. Nach einer anschließenden 2-stündigen, bei 42ºC induzierten Expression und einer Lyse durch SDS bei 100ºC wurde der Zellbestandteil, der auf der Nitozellulosemembran adsorbiert war, auf eine Antigenaktivität durch das Enzym-gebundene Immunsorbentverfahren unter Verwendung eines anti-Milben-Antigenserums sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse sind in Figur 10 dargestellt. Es wurde festgestellt, daß die Aktivität, die am 6. Fleck von links in der Figur nach Deletion bis auf etwa 400 bp blieb, bei einer Deletion bis auf etwa 270 bp am 7. Fleck zum größten Teil verschwand, und die Aktivität verschwand vollständig bei einer Deletion bis auf etwa 170 bp im 8. Fleck.
Dieses Ergebnis ließ den Schluß zu, daß für die Antikörperbindung mindestens ein Bereich von etwa 170 bp bis etwa 270 bp, von etwa 270 bp bis etwa 400 bp oder von etwa 170 bp bis etwa 400 bp des stromaufwärts liegenden Bereichs erforderlich war. Das rekombinante Milbenallergenfragment, das die Aminosäuresequenz dieses Bereichs enthielt, kann als Wirkstoff in Arzneimitteln und Diagnostika für Milbenallergieerkrankungen verwendet werden.

Beispiel 14

Herstellung eines Epitop-enthältenden Polypeptids

Auf der Basis der Ergebnisse von Beispiel 13 wurden die Epitope im 170 bis 400 bp-Bereich identifiziert, wie in Figur 11 dargestellt, indem die Reaktionszeit der Exonuclease II (hergestellt von Takara Shuzo, "Deletion kit for Kilo-Sequence") entsprechend dem Beispiel 13 eingestellt wurde. Es wurde festgestellt, daß zwei Bereiche von 181 bis 246 bp und 343 bis 378 bp als Teile des Epitops essentiell waren. Die Nucleotidsequenz bis zur Enzymspaltstelle wurde unter Verwendung von TAQuence (hergestellt von Toyobo Ltd.) ermittelt. Polypeptide, die die von diesen Nucleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr.3 und SEQ ID Nr.4) enthalten, können durch ein übliches Verfahren beispielsweise unter Verwendung eines von Applied Biosystems produzierten Peptidsynthesegeräts leicht synthetisiert werden.

Beispiel 15

Herstellung eines Arzneimittels für Milbenallergieerkrankungen

Der gereinigte Allergenwirkstoff wird getrocknet, als Pulver gesammelt und als Arzneimittel zur Hyposensibilisierung von Milbenallergiepatienten verwendet.
Der Allergenwirkstoff wird in einer 0,9%igen Kochsalzlösung, die 0,5 % Phenol enthält, auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml gelöst, wobei eine Antigen- Stammlösung zur Hyposensibilisierungstherapie erhalten wird.

Beispiel 16

Herstellung eines Diagnostikums für Milbenallergieerkrankungen

Der gereinigte Allergenwirkstoff wird getrocknet, als Pulver gesammelt und als Hautreaktions-Diagnostikum für Milbenallergieerkrankungen und als Titrationsmittel zur Diagnose von Milbenallergie verwendet.
Das Hautreaktions-Diagnostikum wird durch eine 200 000fache Verdünnung des Allergenwirkstoffs in einer 0,9%igen physiologischen Kochsalzlösung, die 0,5 % Phenol enthält, hergestellt.
Das Titrationsmittel zur Diagnose von Milbenallergie wurde durch Auflösen des Allergenwirkstoffs in Hanks-Pufferlösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml zum Erhalt einer Reagens-Stammlösung für die Titration der Histaminfreisetzung und Verdünnen der Stammlösung hergestellt.

Sequenzprotokoll

SEQ ID Nr.1

Länge: 249 Basenpaare
Typ: Nucleinsäure
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Molekültyp: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft:
Organismus: Dermatophagoides farinae
Gewebtyp: Milbenkörper

SEQ ID Nr.2

Länge: 1023 Basenpaare
Typ: Nucleinsäure
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Molekültyp: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft:
Organismus: Dermatophagoides farinae
Gewebetyp: Milbenkörper

SEQ ID Nr.3

Länge: 66 Basenpaare
Typ: Nucleinsäure
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Molekültyp: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft:
Organismus: Dermatophagoides farinae
Gewebetyp: Milbenkörper

SEQ ID Nr.4

Länge: 36 Basenpaare
Typ: Nucleinsäure
Strangform: Doppelsträngig
Topologie: Linear
Molekültyp: cDNA zu mRNA
Ursprüngliche Herkunft:
Organismus: Dermatophagoides farinae
Gewebetyp: Milbenkörper

Claims

1. Rekombinantes Milbenallergen, erhältlich durch Expression eines aus einem Milbenkörper stammenden Gens, das die in SEQ ID No. 1 gezeigte partielle Aminosäuresequenz enthält:

2. Rekombinantes Milbenallergen, erhältlich durch Expression eines aus einem Milbenkörper stammenden Gens, das die in SEQ ID No. 2 gezeigte partielle Aminosäuresequenz enthält:

3. Rekombinantes Milbenallergen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gen aus Dermatophagoides farinae stammt.

4. Rekombinantes Milbenallergen nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Molekulargewicht des Allergens etwa 40 000 beträgt, bestimmt durch SDS-PAGE.

5. Rekombinantes Milbenallergen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Gesamtlänge der Nucleotidkette der cDNA des Allergens etwa 1,2 kbp beträgt, bestimmt durch Agaroseelektrophorese, und das durch Expression eines Gens erhältlich ist, das die in Figur 4 gezeigte Restriktionskarte aufweist.

6. Fusioniertes rekombinantes Milbenallergen, wobei das rekombinante Milbenallergen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem anderen Protein verknüpft ist.

7. Fusioniertes rekombinantes Milbenallergen nach Anspruch 6, wobei das andere Protein β-Galactosidase ist.

8. Aus einem Milbenkörper stammendes Gen, das ein Allergenaktives Protein mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten partiellen Aminosäuresequenz codiert:

9. Aus einem Milbenkörper stammendes Gen, das ein Allergenaktives Protein mit der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz codiert:

Aus einem Milbenkörper stammendes Gen nach Anspruch 8, wobei das Gen die in SEQ ID No. 1 gezeigte DNA-Sequenz enthält:

11. Aus einem Milbenkörper stammendes Gen nach Anspruch 9, wobei das Gen die in SEQ ID No. 2 gezeigte DNA-Sequenz enthält:

12. Milbenallergenfragment, das mindestens eine von einer Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz enthält, die im Bereich von etwa 170 bp bis etwa 270 bp, etwa 270 bp bis etwa 400 bp oder etwa 170 bp bis etwa 400 bp der in Fig. 10 gezeigten Restriktionskarte liegt.

13. Polypeptid mit einem Epitop, das in einem aus einem Milbenkörper stammenden Milbenallergen enthalten ist, wobei das Epitop die in SEQ ID No. 3 gezeigte Aminosäuresequenz:

oder die in SEQ ID No. 4 gezeigte Aminosäuresequenz:

umfaßt.

14. Polypeptid mit einem Epitop, das mit dem Epitop nach Anspruch 13 immunologisch identisch ist.

15. Gen, das das Peptid nach Anspruch 13 oder 14 codiert, wobei das Gen die in SEQ ID No. 3 gezeigte DNA-Sequenz:

oder die in SEQ ID No. 4 gezeigte DNA-Sequenz:

enthält.

16. Expressionsvektor, der zur Expression des Gens nach einem der Ansprüche 8 bis 11 in einer transformierten Bakterien-, Hefe- oder Säugerzelle fähig ist.

17. Bakterien-, Hefe- oder Säugerzelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 16 transformiert ist.

18. Verfahren zur Produktion eines rekombinanten Milbenallergens, umfassend die Züchtung der Bakterien-, Hefe- oder Säugerzelle nach Anspruch 17 unter Bedingungen, die die Expression ihres Gens zur Produktion eines rekombinanten Milbenallergens erlauben, und die nachfolgende Gewinnung des rekombinanten Milbenallergens.

19. Verfahren zur Produktion eines rekombinanten Milbenallergens, umfassend die Züchtung der Bakterien-, Hefe- oder Säugerzelle nach Anspruch 17 unter Bedingungen, die die Expression ihres Gens zur Produktion eines fusionierten rekombinanten Milbenallergens erlauben, die Gewinnung des fusionierten rekombinanten Milbenallergens und die nachfolgende Entfernung des anderen Proteins von dem Fusionsprotein.

20. Arzneimittel zur Behandlung von Milbenallergie-Erkrankungen, das eine pharmazeutisch wirksame Menge des rekombinanten Milbenallergens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Wirkstoff und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfaßt.

21. Diagnosereagens für Milbenallergie-Erkrankungen, das eine diagnostisch wirksame Menge des rekombinanten Milbenallergens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Wirkstoff umfaßt.

22. Arzneimittel zur Behandlung einer Milbenallergie-Erkrankung, das eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Milbenallergen-Fragments nach Anspruch 12 als Wirkstoff und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfaßt.

23. Diagnosereagens für Milbenallergie-Erkrankungen, das eine diagnostisch wirksame Menge eines Milbenallergen- Fragments nach Anspruch 12 als Wirkstoff umfaßt.

24. Arzneimittel zur Behandlung einer Milbenallergie-Erkrankung, das eine pharmazeutisch wirksame Menge des Polypeptids nach Anspruch 13 als Wirkstoff und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfaßt.

25. Diagnosereagens für Milbenallergie-Erkrankungen, das eine diagnostisch wirksame Menge des Polypeptids nach Anspruch 13 als Wirkstoff umfaßt.