DE69535173T2

DE69535173T2 - Allergieauslösende Proteine aus natürlichem Gummi-Latex, ihre Herstellung und Anwendung in Nachweismethoden

Info

Publication number: DE69535173T2
Application number: DE69535173T
Authority: DE
Inventors: c/o Universiti Sains Malaysia Mary Jane Cardosa; c/o Universiti Sains Malaysia Hamid Sharifah; c/o the Rubber Research Shirley Samuel-Verghese; c/o the Rubber Research Elumalai Sunderasan; c/o the Rubber Research Hoong Yeet Yeang; c/o the Rubber Research Hamzah Samsidar
Original assignee: BOARD OF RUBBER RESEARCH INSTITUTE OF MALAYSIA; RUBBER RES INST OF MALAYSIA BO; Universiti Sains Malaysia (USM)
Current assignee: BOARD OF RUBBER RESEARCH INSTITUTE OF MALAYSIA; RUBBER RES INST OF MALAYSIA BO; Universiti Sains Malaysia (USM)
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1995-09-15
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2015-09-16
Also published as: US7576184B2; DE69535434D1; EP0704457A1; JP3747200B2; US6759517B1; US20050043518A1; JP3431371B2; EP0704457B1; DE69535173D1; EP1350798B1; DE69535378T2; JP2003268000A; EP1350797B1; US20090285859A1; JP2003267999A; DE69535434T2; EP1350798A1; DE69535378D1; JP3725872B2; US7994288B2

Description

Diese Erfindung betrifft allergene Proteine aus natürlichem Gummi-Latex in im Wesentlichen reiner Form, ihre Herstellung und ihre Verwendung, zusammen mit eben gegen diesen allergenen Proteine entwickelte monoklonale Antikörper, in Tests zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Gehalte der allergenen Proteine in natürlichem Gummi-Latex oder in aus Latex hergestellten Produkten. Tests zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von Antikörpern in Blut oder Blutprodukten, welche das Auftreten einer durch natürliches Gummi-Latex hervorgerufenen allergenen Reaktion vermitteln, werden zusammen mit in-vivo- und in-vitro-diagnostischen Tests zum Nachweis einer Überempfindlichkeit gegenüber natürlichen Gummi-Latex, welchen die Verwendung der vorstehend genannten allergenen Proteine einschließen, ebenfalls bereit gestellt. Die Erfindung stellt auch die Verwendung der vorstehend genannten Allergene als Desensibilisierungsmittel bei der Behandlung einer Latex-Protein-Allergie bereit. Weiterhin wird ein Verfahren zur Entfernung allergener Proteine aus Latex-Produkten bereitgestellt.
Die durch die vorliegende Erfindung identifizierten Proteine werden mit Hev b IV, Hev b II und Hev b III bezeichnet. Während Hev b IV in dieser Anmeldung beansprucht wird, sind Hev b II und Hev b III Gegenstand der Teilanmeldungen EP-A-1350797 bzw. AP-A-1350798.
Es folgt ein Glossar, in dem bestimmte nachstehend verwendete Begriffe definiert werden: –

Gesamtprotein: Sämtliche Proteine und Fragmente davon, die in einer Probe vorliegen.
Antigene Proteine: Eine Gruppe der Gesamtproteine. Diese Proteine rufen eine Antikörperproduktion im Tier und dem menschlichen Körper hervor. Die hervorgerufenen Antikörper können diejenigen der Klasse IgE, die zur Induktion einer allergischen Reaktion befähigt sind, und auch diejenigen einschließen, die keine Allergie induzieren. „Antigene Proteine" können sich auch auf Proteine beziehen, die durch Antikörper erkannt werden (damit reagieren).
Allergene Proteine: Eine Gruppe antigener Proteine (und daher eine Untergruppe der Gesamtproteine). Diese Proteine rufen die Produktion von Antikörpern der Klasse IgE im Tier oder menschlichen Körper hervor. Sie können eine allergische Reaktion induzieren, wenn für sie spezifische IgE vorhanden sind. „Allergene Proteine" können sich auch auf Proteine beziehen, die von IgE erkannt werden (damit reagieren).
Allergene: Substanzen (Proteine oder andere), welche die Produktion von Antikörpern der IgE-Klasse im Tier oder menschlichen Körper hervorrufen. Sie können eine allergische Reaktion induzieren, wenn für sie spezifische IgE vorhanden sind. „Allergene" können sich ebenfalls auf Substanzen beziehen, die von IgE erkannt werden (damit reagieren).

Hinsichtlich der Latex-Protein-Allergie weisen die einzigen bekannten Allergene eine proteinartige Natur auf. Daher sind in diesem Zusammenhang die Begriffe Latexallergene, Allergene, allergene Proteine und Proteinallergene Synonyme.

Antikörper: Im Serum eines Tieres vorhandene und durch Plasmazellen als Antwort auf ein Antigen synthetisierte Immunglobuline.
IgE: Eine Gruppe von Antikörpern. IgE, die spezifisch für ein Allergen sind, werden im Tier oder menschlichen Körper aufgrund dessen Kontakt mit dem Allergen hervorgerufen. Ein nachfolgender Kontakt mit dem Allergen kann eine allergische Reaktion induzieren.
Polyklonaler Antikörper: Eine Gruppe von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen. Da die meisten Antigene eine große Anzahl von Epitopen aufweisen, gibt es viele verschiedene Antikörper gegen ein gegebenes Antigen.
Monoklonale Antikörper: Ein Immunglobulin (Antikörper), das (der) von einem einzelnen Klon von Lymphozyten hergestellt wird. Ein monoklonaler Antikörper erkennt nur ein einziges Epitop auf einem Antigen.
Epitiop: Eine antigene Determinante in einem Molekül, das spezifisch durch eine Antikörper-Bindungsstelle oder durch den Antigenrezeptor einer T-Zelle erkannt wird.
Hybridom: Eine Zelllinie, die durch Fusion einer Myelomzelllinie, die in Kultur unbeschränkt wachsen kann, mit einer normalen Antikörper sezernierenden B-Zelle erhalten wird. Die resultierende Zelllinie weist die Eigenschaften beider Partner auf und sezerniert fortlaufend das Antikörperprodukt der normalen B-Zelle. Durch Selektion eines Myeloms, das aufgehört hat, sein eigenes Immunglobulinprodukt herzustellen, jedoch die Funktion dafür erhalten hat, sezerniert das Hybridom ausschließlich den normalen B-Zell-Antikörper. Da diese Zelllinie kloniert ist, ist der Antikörper monoklonal.

Allergene Proteine (Allergene) können eine allergische Reaktion im sensibilisierten Personen induzieren, die in schweren Fällen zu einem anaphylaktischen Schock, der potentiell tödlich ist, führen können. In Latexprodukten, wie Latexhandschuhen, vorhandene Proteine können eine Allergieform, die als „Typ I Hypersensibilität" bekannt ist, in einem kleinen Anteil von Personen hervorrufen, die derartige Produkte verwenden. Die Verwendung von Gummiprodukten, insbesondere Eintauch-Latex-Produkten wird daher mit gewisser Vorsicht und Sorge vom Standpunkt der Gesundheitsvorsorge aus betrachtet.
Natürliches Gummi bzw. natürlicher Kautschuk aus dem gewerblich verwendeten Gummibaum, Hevea brasiliensis, ist ein wichtiger Wirtschaftsgegenstand in vielen asiatischen und afrikanischen Ländern. Natürliches Gummi wird in Form von Ballen, Bahnen und als Latexkonzentrat vermarktet. Ein Hauptbedarf an natürlichem Gummi-Latex-Konzentrat besteht bei der Herstellung von „Eintauchlatex"-Produkten wie Handschuhen für Untersuchungs-, Chirurgie und Haushaltsanwendungen. Im Jahr 1993 exportierte allein Malaysia Eintauchlatex-Waren mit einem Gesamtwert von 880 Millionen US$. Der weltweite Bedarf insbesondere an Latexuntersuchungshandschuhen hat sich in den letzten Jahren mit der Erhöhung der Fälle des erhobenen Immundefizienzsyndroms (AIDS) aufgrund der HIV-Infektion erheblich erhöht.
Es wurde kürzliche berichtet, dass aus natürlichem Gummilatex hergestellte Handschuhe und andere chirurgische Hilfsmittel eine Kontakturticaria hervorrufen können, die in wenigen Fällen zu anaphylaktischen Reaktionen in den zuvor sensibilisierten Personen geführt hat (Nutter, 1979; Turjanmaa et al., 1984, Axelsson et al., 1987; Leynadier et al., 1989). Eine Anaphylaxis kann lebensbedrohlich sein und ist daher bei weitem schwerwiegender als die im Allgemeinen milden Hautempfindlichkeiten, die durch verschiedene chemische Verbindungen, die bei der Handschuhherstellung verwendet werden, hervorgerufen werden. Während die Kontaktdermatitis aufgrund von Chemikalien seit langem verstanden wird, bedeutet die allergische Reaktion auf Proteine in Latexprodukten wie Handschuhen und Kathetern eine potentiell schwere Bedrohung für ihre Verwender. Das größte Risiko tragen Mitarbeiter im Gesundheitswesen, die möglicherweise Latexhandschuhe mehr oder weniger kontinuierlich während ihres gesamten Arbeitstages tragen, und ihre Patienten. Schließlich spüren die Produkthersteller und die gesamte Latexindustrie die Auswirkungen der wahrgenommenen Bedrohung, obwohl der Anteil der Personen, für die tatsächlich ein Risiko besteht, sehr klein ist. Regulierungsbehörden wie die US Food and Drug Administration (FDA) haben bereits angedeutet, dass die Kennzeichnung sämtlicher natürlicher Latexwaren in naher Zukunft erforderlich sein wird. Die US-FDA könnte schon bald Grenzwerte für ungefährliche Gehalte an Gesamtproteinen in Latexprodukten festsetzen. Falls dieses Problem nicht mit der nötigen Eile und Mitteln zur Unterscheidung zwischen „sicheren" und „unsicheren" Produkten angegangen wird, ist es sogar möglich, dass die künftige Gesetzgebung ein Pauschalverbot gegen die Verwendung sämtlicher Latexprodukte im Gesundheitswesen aussprechen könnte.
Die Latexproteinallergie wurde in den letzten Jahren insbesondere von den Herstellern von Latexprodukten und den im Gesundheitswesen Tätigen mit steigender Besorgnis verfolgt. Es gibt Hinweise darauf, dass wasserextrahierbare Proteine im Latex die durch Latex induzierte anaphylaktische Reaktion auslösen, die über eine Wechselwirkung zwischen allergenen Latexproteinen und einer Klasse von Antikörpern (IgE) in einer empfindlichen Person vermittelt wird. IgE-spezifische Immuntests mit Proteinfraktionen wiesen darauf hin, dass mehr als ein spezifisches Protein daran beteiligt sein könnte (Turjanmaa et al., 1988; Slater, 1991).
In Anbetracht der Bedeutung des Latexprotein-Allergieproblems sowohl aus der Perspektive der Gesundheitspflege als auch vom Standpunkt der Latexproduktehersteller aus gesehen, werden in diesem Zusammenhang rege Forschungen in verschiedenen Laboratorien weltweit unternommen. Die Hauptziele dieser Untersuchungen sind:

(a) Die Herstellung eines Latexkonzentrats, das geringere Mengen der Allergene enthält. Die Zulieferer von Latexkonzentrat versuchen, die Allergene in für die Herstellung von Latexprodukten verwendetem Ausgangsmaterial zu reduzieren.
(b) Die Herstellung eines Latexprodukts mit geringem Allergengehalt. Latexprodukthersteller versuchen, die Allergene in ihren Endprodukten zu vermindern.
(c) Entwicklung eines Tests zur Quantifizierung von in Latexkonzentrat oder in Produkten vorhandenen Allergenen. Sowohl die Latexzulieferer als auch die Latexprodukthersteller bedürfen eines Tests zum Zwecke der Standardisierung und der Qualitätskontrolle ergänzend zu (a) und (b).

Bei der üblichen Herstellung von Latexkonzentrat wird Feldlatex mit Ammoniak stabilisiert (um eine Ausflockung oder Koagulation des Gummis zu verhindern) und dann durch Zentrifugation konzentriert, um den Gummigehalt von etwa 33 auf 60 % zu erhöhen. Derzeit gibt es im Wesentlichen zwei Vorgehensweisen zur Herstellung eines Latexkonzentrats mit geringem Proteingehalt (Subramaniam, 1992). Zum Einen können mehrfache Zentrifugationen durchgeführt werden, wobei in jedem Zyklus frisch mit Ammoniak versetztes Wasser zugegeben wird, um die löslichen Proteine in der wässerigen Phase des Latex auszudünnen. Zweitens kann das Latex mit einem proteinabbauenden Enzym (Proteinase) behandelt werden.
Zur Herstellung von Latexeintauchprodukten mit weniger löslichen Proteinen besteht das einfachste Verfahren darin, sie mit Wasser zu waschen. Proteine migrieren an die Oberfläche des Latex während seiner Trocknung (Shamsul Bahri et al., 1993) und werden daher am effizientesten entfernt, wenn der Film nach der vollständigen Trocknung gewaschen wird.
Während die vorstehend genannten Maßnahmen darauf abstellen, die Menge der Allergene im Latexkonzentrat oder in den Latexendprodukten zu vermindern, gibt es derzeit keinen verlässlichen Weg zur Bestimmung des Gehaltes solcher Allergene. In Abwesenheit eines spezifischen Latexallergentests werden derzeit Proben hinsichtlich des Gesamtproteingehalts unter der Annahme getestet, dass ein niedriger Gesamtproteingehalt geringe Allergiegehalte anzeigt. Dies ist im Allgemeinen richtig, wenn extreme Proteingehalte verglichen werden (d. h. sehr hohe Proteingehalte hängen mit einer hohen Allergenizität zusammen, und sehr geringe Proteingehalte sind mit einer geringen Allergenizität assoziiert). Gesamtproteingehalte liefern jedoch manchmal ein missverständliches Bild hinsichtlich der potentiellen Gesundheitsgefährdung durch ein Produkt ergeben, da nicht alle Proteine allergen sind (d. h. zur Induzierung einer Allergie befähigt sind); vielmehr sind viele harmlos. Ein besserer Tests würde den Gehalt an Latexenergenen spezifisch bestimmen.
Tests für Latexallergene sind im Handel erhältlich und in einer Anzahl von Variationen verfügbar, basieren jedoch sämtlich auf einer oder mehreren immunologischen Reaktionen in einem Immuntest. Ein Immuntest basiert auf der Wechselwirkung zwischen Antikörpern mit den spezifischen Proteinantigenen, an welche die Antikörper binden. Daher ist im Fall eines Immuntests für Latexallergene die wesentliche Reaktion die Bindung von Latexallergenen mit Antikörpern, welche derartige Allergene erkennen.
Auf der Immunreaktion in Bezug auf das Latexallergieproblem basierende Tests fallen in zwei Kategorien. In der ersten Kategorie quantifizieren die Tests die Antikörper (IgE) in einer Blutprobe, welche das Auftreten einer allergischen Reaktion vermitteln. Im Wesentlichen dienen diese Tests der Verwendung im Gesundheitswesen und in der Medizin, und sie dienen als diagnostische Tests für die Latexallergie. Die zweite Kategorie von Immuntests betrifft die Quantifizierung von aus Latexprodukten extrahierbaren Allergenen. Im Wesentlichen dienen derartige Tests zur Verwendung in der Latexindustrie, um die Gehalte von Latexallergenen in Latexkonzentrat und in hergestellten Latexprodukten zu überwachen und zu regulieren. Derzeit ist eine kleine Anzahl von im Handel erhältlichen Immuntests für beide Testkategorien verfügbar.
Im Handel erhältliche Immuntests in den Formaten RAST (Radioallergoabsorbanztest) und ELISA (Enzym-verknüpfter Immunabsorptionstest) werden hierzu verwendet, um zu bestimmen, ob für Latexproteine spezifische IgE vorliegen und testen daher Patienten hinsichtlich einer Latexallergie. Derartige Tests können auch als Kompositionstests (RAST-Inhibition, kompetitiver ELISA) durchgeführt werden, um die Allergenmenge in einer Latexprobe oder einem Latexprodukt zu quantifizieren.
Sämtliche dieser Immuntests erfordern die Verwendung spezifischer Latexallergene in der immunologischen Reaktion. Da bis jetzt keine Latexallergene isoliert und somit identifiziert wurden, verwenden derzeit im Handel erhältliche Tests als Allergenquelle rohes (ungereinigtes) Latexserum oder aus industriell hergestellten Latexhandschuhen extrahierte Proteine.
Rohes Latexserum ist als Allergenquelle allerdings unzuverlässig, da es außer den Allergenen selbst viele andere Proteine (und andere Substanzen) enthält. Diese Verunreinigungen können die Genauigkeit des Tests beeinträchtigen. Es ist ebenfalls keine Information hinsichtlich des Gehalts oder der Zusammensetzung der Allergene in Latex verfügbar, das aus verschiedenen Quellen, zu verschiedenen jährlichen Zeitpunkten erhalten wurde, oder hinsichtlich Latex, dass unter verschiedenen Bedingungen konserviert oder gelagert wurde. Während die Veränderlichkeit des Gehaltes an allergenen Proteinen in verschiedenen Latexchargen noch nicht untersucht wurde, ist es bekannt, dass Latexproteine allgemein und Latexenzyme (eine Klasse von Proteinen) im Besonderen mit der klonalen Quelle (Sorte), der Saison, dem physiologischen Zustand des Baumes, der Intensität des Abstichs (Latexernte) und der Verwendung von chemischen Stimulanzien zur Erhöhung der Latexausbeute veränderlich sind. Beispielsweise wurden Unterschiede bei Latexproteinen aus verschiedenen im Handel erhältlichen Klonen nach elektrophoretischer Trennung erkannt (Walujono und Suseno 1973, Yeang et al., 1977, Prematillake und Yapa, 1985), was anzeigt, dass die Proteinzusammensetzung mit dem Klon variiert. Die Tatsache, dass einige dieser Unterschiede auf Latex-B-Serumproteine zurückgeführt werden konnten (Yeang et al., 1977) ist hinsichtlich der Tatsache bedeutsam, dass, wie von den Erfindern der vorliegenden Erfindung festgestellt wurde, einige der Hauptlatexallergene aus dem B-Serum stammen. Die Latexproteinzusammensetzung könnte auch durch den physiologischen Zustand des Baumes beeinflusst werden. Prematillaka et al. (1985) berichteten das Verschwinden oder die Verminderung einer Anzahl von Latexproteinen, die von Bäumen gewonnen wurden, die von der als „Brauner Bast" (engl. „brown bast") bekannten physiologischen Störung betroffen waren.
Es wurden auch Unterschiede bezüglich der Isoformen von Enzymen von Latex gezeigt, die aus verschiedenen im Handel erhältlichen Hevea-Klonen erhalten wurden (Chevallier, 1988). Die Aktivitäten bestimmter Latexenzyme sind in Abhängigkeit von der Saison beträchtlich veränderlich (Yeang und Paranjothy, 1982). Darüber hinaus ist es bekannt, dass sich die Latexenzymaktivitäten beträchtlich in Reaktion auf die Intensität der Latexernte (Yeang und Paranjothy, 1982a) und die Ausbeutungssimulation mit der Chemikalie Etephon (Tupy, 1969; Chrestin et al., 1985) verändern. Es wurde berichtet, dass der Gehalt eines als Mikrohelix bekannten Latexproteinkomplexes in B-Serum als Ergebnis einer Etephonstimulation ansteigt (Gomez und Moir, 1979). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass sich die Mikrohelix im B-Serum sehr stark ändert und dort manchmal nicht detektierbar ist. Diese Veränderung tritt zwischen Klonen und auch zwischen Proben auf, die zu verschiedenen Zeitpunkten aus derselben Baumgruppe gewonnen wurden (Gomez und Moir, 1979; Gomez und Tata, 1977). Der letzte Punkt ist hinsichtlich der nachstehend beschriebenen Feststellung, dass eines der identifizierten Latexallergene ein Bestandteil des Mikrohelixkomplex ist, bedeutsam.
Wie vorstehend erwähnt, werden auch aus im Handel erhältlichen Latexhandschuhen eluierte bzw. extrahierte Proteine als Proteinantigenkomponente von Immuntests zur Diagnose einer Latexallergie oder zur Quantifizierung von Latexallergenen verwendet. Ein schwerwiegender Nachteil dieser Vorgehensweise liegt darin, dass verschiedene Handschuhmarken (oder sogar unterschiedliche Chargen der gleichen Marke) qualitative und quantitative Unterschiede hinsichtlich ihrer Allergenzusammensetzung aufweisen. Aufgrund dessen können die Testergebnisse von Tests, welche die Latexhandschuhproteine als Antigene verwenden, in Abhängigkeit der Auswahl der Latexhandschuhe, aus welchen die Antigene gewonnen wurden, beträchtlich variieren.
Daher ist es nicht überraschend, dass den im Handel erhältlichen Latexallergentests die Empfindlichkeit und Spezifität fehlt, und dass sie nur teilweise beim Nachweis einer Allergenizität erfolgreich sind.
Bei der Arbeit mit einer im Handel erhältlichen Latexallergenpreparation (von Stallergenes) berichtete Levy (1993), dass sich positive Ergebnisse bei 100 % von sensitiven Patienten und negative Ergebnisse in nicht-sensitiven Kontrollpatienten ergaben. Bei einer anderen Untersuchung (Lagier et al., 1992) ergaben sich jedoch bei 80 % von Testpatienten (Krankenschwestern), von denen bekannt war, dass sie eine Latexallergie hatten, mit dem im Handel erhältlichen Stallergenes-Kit negative Ergebnisse. Bei einer Untersuchung mit 40 allergischen Patienten (diagnostiziert mit dem Haut-Prick-Test) berichteten Leynadier, Autegard und Levy (1993) 5–16 % falsch negative Ergebnisse mit dem Latexallergen von Stallergenes sowie mit zwei anderen im Handel von Allerbio und Bencard erhältlichen Allergenen. Daher treten falsch negative Ergebnisse mit den derzeit im Handel erhältlichen Latexallergenen auf. Das am meisten verwendete RAST-Kit ist wahrscheinlich der Latex-RAST-k82, hergestellt von Pharmacia Diagnostics und deren enzymverknüpfter Immunabsorptionstest (Pharmacia CAP-System). Levy (1993) berichtete, dass diese Tests zur Detektion von IgE-Antikörpern im Serum von 40–90 von Patienten mit Latexallergie befähigt sind, die im Haut-Prick-Test positiv waren.
Ein anderer im Handel erhältlicher Immuntest für Latexallergene ist der „Latex ELISA for Antigenic Proteins" (LEAP), der vom Guthrie Research Institute, U.S.A. hergestellt wird (Beezehold, 1993). Der Test basiert auf einem indirekten ELISA (enzymverknüpfter Immunabsorptionstest), in dem gegen Latexproteine gerichtete polyklonale Antikörper verwendet werden. Es könnte sein, dass ein derartiger Test allgemein nicht die Latexproteinantigene (d. h. Proteine, die sowohl an die allergieinduzierenden Antikörper (IgE) und die nicht-allergieinduzierenden Antikörper binden) aus den Latexallergenen (d. h. Proteine, die an IgE spezifisch binden) unterscheiden kann. Die Verwendung dieses Tests unterliegt auch der Annahme, dass sämtliche Antigene und Allergene gleich gut an die ELISA-Platte unter den gleichen Bedingungen binden, da es erforderlich ist, dass die zu bestimmenden Antigene/Allergene durch den Endverbraucher unter Verwendung eines einzelnen Satzes an Bedingungen an die ELISA-Platte gebunden werden. Diese Annahme kann falsch sein, und daher werden Antigene und Allergene, die nicht dazu befähigt sind, unter den verwendeten Bedingungen an die Platte zu binden, nicht detektierbar oder höchstens suboptimal detektierbar sein.
Es besteht daher ein Bedarf an einem verbesserten Latexallergentest. Zur Herstellung eines derartigen Tests müssen Antikörper gegen die einzelnen Latexallergene entwickelt und verfügbar gemacht werden. Dazu müssen zunächst die spezifischen Latexallergene identifiziert werden.
Es gibt viele Publikationen, welche über das Auftreten verschiedener allergener Proteine in Latex berichten. Praktisch sämtliche Berichte über Latexallergene charakterisieren die Proteine durch das Molekulargewicht und/oder gelegentlich über deren isoelektrischen Punkt. Latexallergene, die allein durch das Molekulargewicht oder den isoelektrischen Punkt charakterisiert werden, können nicht als identifiziert gelten, da: –

(a) Proteine während der Herstellung von Latexprodukten abgebaut werden und daher ein einzelnes allergenes Protein als verschiedene Proteine mit geringerem Molekulargewicht in einem Proteintrennverfahren wie einer Gelfiltration, HPLC, isoelektrischen Fokussierung oder Elektrophorese zur Bestimmung des Molekulargewichts oder des isoelektrischen Punkts auftreten kann;
(b) Proteine zur Bildung von Proteinkomplexen aggregieren können, die aperente Molekulargewichte und isoelektrische Punkte aufweisen können, die von denjenigen der nicht-aggregierten Proteine verschieden sind; und
(c) einige verschiedene Proteine können ähnliche Eigenschaften (z. B. Molekulargewicht) aufweisen und können daher nicht leicht voneinander unterschieden werden.

Gemäß den Feststellungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung werden diese Schwierigkeiten durch: –

(i) Isolierung spezifischer allergener Latexproteine aus natürlichem Gummilatex;
(ii) Entwicklung von monoklonalen Antikörpern gegen diese spezifischen allergenen Proteine zu deren Markierung und zur Identifizierung ihrer Proteinfragmente und Untereinheiten aufgrund eines Abbaus;

Erfindungsgemäß wurden drei spezifische Latexallergene identifiziert. Die Allergene wurden gemäß dem Allergennomenklatursystem, das durch die International Union of Immunolgical Societies genehmigt und im Amtsblatt der Weltgesundheitsorganisation (Marsh et al., 1986, Marsh et al., 1987) publiziert wurde, mit Hev b IV, Hev b II und Hev b III bezeichnet. Das Protein Hev b IV wurde ursprünglich von den Erfindern mit Hev b I bezeichnet, wurde jedoch in Hev b IV umbenannt, da Hev b I zuvor durch andere Forscher für das Latexprotein, das als Gummielongationsfaktor, welches sich auf der Oberfläche von Gummipartikeln findet, bekannt ist, vergeben wurde (Czuppon et al.).
Gegen sämtliche drei Allergene wurden monoklonale Antikörper erzeugt und bedeutsamer Weise erkennen einige dieser monoklonalen Antikörper die Abbauprodukte oder Untereinheiten der Allergene. Es werden auch erfindungsgemäß Tests bereit gestellt, die auf der Wechselwirkung zwischen den vorstehend genannten spezifischen allergenen Proteinen, die aus natürlichem Gummilatex isoliert wurden, und gegen diese Proteine erzeugten monoklonalen Antikörper basieren.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein allergenes Protein aus natürlichem Gummilatex (mit Hev b IV bezeichnet) und allergene Untereinheiten oder Aggregate davon bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es in einer im Wesentlichen gereinigten Form vorliegt, und das ein Oligomer ist und aus drei Hauptspezies monomerer Polypeptide mit Molekulargewichten von 50, 55 und 57 kDa besteht, die über Disulfide zu Dimeren mit ungefähren Molekulargewichten von 100, 110 und 115 kDa verknüpft sind.
Die Erfindung stellt des Weiteren ein zweites allergenes Protein aus natürlichem Gummilatex (mit Hev b II bezeichnet), das dadurch gekennzeichnet ist, dass es im Wesentlichen in gereinigter Form vorliegt und aus zwei Polypeptidketten mit Molekulargewichten von 34/35 kDa und 36/37 kDa aufgebaut ist, und allergene Untereinheiten oder Aggregate davon bereit.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Drittes allergenes Protein aus natürlichem Gummilatex mit (Hev b III bezeichnet), dass dadurch gekennzeichnet ist, dass es in einer im Wesentlichen gereinigten Form vorliegt und das ein Molekulargewicht von 24 kDa aufweist, und allergene Untereinheiten oder Aggregate davon bereit.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung gegen die vorstehend genannten Allergene Hev b IV, Hev b II und Hev b III erzeugte monoklonale Antikörper bereit.
Die Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend genannten allergenen Proteine Hev b IV, Hev b II und Hev b III bereit.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung Tests zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Gehalte von Allergenen in natürlichem Gummilatex bereit, die auf den Wechselwirkungen zwischen spezifischen Proteinallergenen, die aus natürlichem Gummilatex oder anderem Gewebe des Gummibaums Hevea brasiliensis isoliert werden, und auf gegen diese Allergene entwickelten monoklonalen Antikörpern basieren. Die getesteten Allergene können in Latex vorliegen, das zur Verwendung bei der Herstellung von Latexprodukten gedacht ist, oder sie können in hergestellten Latexprodukten vorliegen. Die Tests können ebenfalls zur Quantifizierung von allergenen Latexproteinen in Produkten verwendet werden, die aus Trockengummi hergestellt sind.
Die Erfindung stellt des Weiteren die Anwendung von einigen oder sämtlichen der genannten Antikörper-Allergen- Wechselwirkungen zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von Antikörpern bereit, die das Auftreten einer allergischen Reaktion, die durch natürlichen Gummilatex induziert wird, vermitteln. Diese zu der als IgE genannten Antikörperklasse gehörenden Antikörper finden sich normalerweise in Blut oder Blutprodukten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden allergene Latexproteine und/oder monoklonale Antikörper gegen derartige Proteine und/oder ein Gemisch davon beispielsweise mit Biotin markiert, um so ihr Vorhandensein zu detektieren, wenn sie in einem Test verwendet werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung der vorstehend genannten Allergene Hev b IV, Hev b II und Hev b III in in-vivo- oder in-vitro- (ex-vivo-) diagnostischen Tests zur Bestimmung einer Typ-I-Hypersensitivität gegenüber natürlichem Gummilatex bereit (beispielsweise der Haut-Prick-Test oder der Histamin-Freisetzungstest).
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung der vorstehend genannten Allergene Hev b IV, Hev b II und Hev b III als Desensibilisierungsmittel bei der Behandlung der Latexproteinallergie bereit.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt das Auslaugen oder Waschen eines Latexprodukts mit der Lösung eines Salzes (z. B. Natriumchlorid) oder einer anderen Lösung mit einer Ionenstärke, die größer ist als diejenige von Wasser bereit, um Latexallergene selektiv zu entfernen, von denen es bekannt ist, dass sie in Lösungen mit einer Ionenstärke, die größer als diejenige von Wasser ist, löslich sind.
Die Erfinder sind der Auffassung, dass sie als Erste die Identität und Eigenschaften der drei Latexproteine eindeutig festgestellt, ein reproduzierbares Verfahren für ihre Reinigung aus großen Mengen aus frischem Latex vorgelegt und die allergene Natur dieser Proteine demonstriert und ihre Verwendung in Tests vorgeschlagen haben. Sie haben ebenfalls monoklonale Antikörper gegen diese Proteine entwickelt. Es wird angenommen, das Hev b II vor der vorliegenden Erfindung vollständig unbekannt war. Während die Existenz von Hev b III und Hev b IV bereits vorgeschlagen wurde, wurden sie nur in Bezug auf ihr Molekulargewicht oder den isoelektrischen Punkt identifiziert. Theoretisch können Proteine aus Latex anhand ihres Molekulargewichts extrahiert werden, selbst wenn unbekannt ist, aus welcher Komponente der Latexproteine sie stammen und ohne jegliche weitere Information. Tatsächlich ist es jedoch nicht leicht, spezifische Proteine aufgrund des Molekulargewichts allein zu extrahieren und zu reinigen, ohne dass man einen vernünftigen Anhaltspunkt dafür hat, dass keine Kontamination durch Proteine mit ähnlichen Eigenschaften (d. h. Molekulargewicht) vorliegt, die mit den erwünschten allergenen Proteinen co-gereinigt werden. Man erkennt, dass dies es schwierig macht, die genauen Mengen reiner Allergene zu bestimmen, die für quantitative immunologische Tests erforderlich wären.
Die Ergebnisse von durchgeführten Experimenten legen nahe, dass die drei spezifischen allergenen Proteine, die von den Erfindern identifiziert und mit Hev b IV, Hev b II und Hev b III bezeichnet wurden, und ihre Abbauprodukte oder Untereinheiten in sehr großen Ausmaß den Latexproteinallergenen entsprechen, die zuvor berichtet wurden.
Monoklonale Antikörper sind für die speziellen Allergene und antigenen Bindungsstellen (Epitope), die sie erkennen, sehr spezifisch. Unter Verwendung eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, der ein Epitop erkennt, das in den Abbauprodukten und Untereinheiten der Ursprungsallergene vorhanden ist, können die Identitäten derartiger Fragmente und Untereinheiten festgestellt werden.
Neben ihrer Bedeutung zur Identifizierung von Proteinallergenen und ihren Abbaufragmenten und Untereinheiten sind die monoklonalen Antikörper ebenfalls zum Zwecke der Entwicklung von gewerblich anwendbaren Allergentests dadurch (im Vergleich mit polyklonalen Antikörpern) von Bedeutung, dass sie sich für eine gleichbleibende Produktion in konsistenter Form und in einem zur gewerblichen Anwendung erforderlichen Maßstab eignen.
Ein weiterer Vorteil von monoklonalen Antikörpern besteht darin, dass sie sich in ein als „Affinitätschromatographie" bekanntes System zur Proteinaufreinigung einbauen lassen. Unter Verwendung eines derartigen Systems können die von den monoklonalen Antikörpern erkannten Allergene isoliert und in vergleichsweise großen Mengen isoliert werden, die ausreicht, um sie in einer Variante des Allergentests einzusetzen, die als „kompetitiver Bindungstest" bekannt ist, wobei sowohl die Antikörper als auch die Antigene benötigt werden. Reine Allergene können ebenfalls in immunologischen Tests zur Quantifizierung der durch Latex induzierten Antikörper (IgE) in einer Blutprobe oder zur Verwendung im Haut-Prick-Test für diagnostische Zwecke verwendet werden.
Erfindungsgemäß werden gegen die Allergene Hev b IV, Hev b II und/oder Hev b III entwickelte monoklonale Antikörper zur Entwicklung von Immuntests zur Quantifizierung von Allergenen oder Quantifizierung von Latex-spezifischen IgE verwendet. Drei monoklonale Antikörper, die die Latexallergene Hev b II, Hev b III und Hev b IV erkennen, sind USM/RB4, USM/RC2 bzw. USM/RB3.
Immuntests, welche die Verwendung spezifischer Allergene beinhalten, sind Immuntests überlegen, bei denen die Allergene in unfraktioniertem Latexserum enthalten sind. In letzterem Fall ist der genaue Allergengehalt im Serum unbekannt, während die Zusammensetzung des Allergens in Latexseren aus verschiedenen Quellen ungewiss ist.
Des Weiteren sind Immuntests, welche die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die für Allergene spezifisch sind, einschließen, solchen überlegen, die polyklonale Antikörper in Immuntests verwenden, wobei Gesamtlatexseren, Allergenangereicherte oder halbgereinigte Antigenpräparationen anstelle von gereinigten spezifischen Allergenen verwendet werden.
Beispiele von Immuntests, die Teil der Erfindung sind, sind folgende: –

(a) Ein kompetitiver Bindungstest, in welchem die Testprobe zur Inhibition der Bindung von markierten spezifischen Allergenen an eine feste Phase verwendet wird, die entweder einen oder mehrere monoklonale Antikörper oder ein polyklonales Antiserum oder polyklonale Antikörper aufweist.
(b) Ein Zwei-Bindungsstellen-Test, in welchem polyklonale Antikörper, die auf einer festen Phase gebunden vorliegen, dazu verwendet werden, ein spezifisches/spezifische Allergen(e) „abzufangen", und das Vorliegen des abgefangenen Allergens durch einen monoklonalen Antikörper detektiert wird, der direkt markiert sein kann oder nicht.
(c) Ein Zwei-Bindungsstellen-Test, in welchem monoklonale Antikörper, die auf einer festen Phase gebunden vorliegen, dazu verwendet werden, ein spezifisches/spezifische Allergen(e) „abzufangen", und die Gegenwart des abgefangenen Allergens durch einen polyklonalen Antikörper detektiert wird, der direkt markiert sein kann oder nicht.
(d) Ein Zwei-Bindungsstellen-Test, in welchem monoklonale Antikörper, die auf einer festen Phase gebunden vorliegen, dazu verwendet werden, ein spezifisches/spezifische Allergen(e) „abzufangen", und das Vorliegen des abgefangenen Allergens mit anderen monoklonalen Antikörpern detektiert wird, die direkt markiert sein können oder nicht.
(3) Jede beliebige Form eines Immuntests, in welchem die spezifischen Allergene Hev b IV, Hev b II und Hev b III gebunden oder in Lösung wie bei Nephelometrie, Radioallergenabsorptionstests (RAST) oder RAST-Inhibitionstests verwendet werden.

Die verschiedenen Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung werden nachstehend genauer mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei: –
1: sequentielle Fraktionen zeigt, die durch Sephadex G-150-Gelfiltration von C-Serum erhalten wurden. Die Hauptmaxima A, B und C sind gezeigt. Maximum A stellt das Porenvolumen bzw. den Durchfluss dar, das/der im Wesentlichen kleine Gummiteilchen (ungefähr 45 nm Durchmesser) und große Proteine, mit einem Molekulargewicht von größer als 300.000 kDa enthält.
2: zeigt einen Immunogold-Nachweis von Hev b III auf der Oberfläche kleiner Gummiteilchen, die aus dem C-Serum fraktioniert wurden. Mit Ziege-anti-Maus-IgG gekoppelte Goldpartikel zeigen die Gegenwart des monoklonalen Antikörpers USM/RC2 an, der spezifisch an Hev b III bindet.
3: zeigt eine präparative gelelektrophoretische Analyse von Hev b III. Western-Blot von sequentiellen Fraktionen eines Gemischs aus B-Serum und C-Serum aus einer präparativen elektrophoretischen Zelle. Die Proteinfraktionen wurden der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (15 % Gel) unterworfen und mit Coomassie-Blue (Teil A) gefärbt, mit dem monoklonalen Antikörper USM/RC2 (Teil B) inkubiert und mit Patientenplasma inkubiert und hinsichtlich gebundenem IgE getestet (CS = C-Serum).
3.1: zeigt einen Western-Blot von Proteinen, die aus dem Gummirahm von zentrifugiertem Latex gewonnen wurden und mit Blutserum von erwachsenen Patienten mit einer Latexallergie (links) und von Spina-bifida-Patienten mit Latexallergie (rechts) inkubiert wurden. SDS-PAGE (15 % Gel). Die Bande von Hev b II ist durch einen Pfeil markiert.
4: Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese eines Gemischs aus B-Serum und C-Serum im Verhältnis 2:5. Eine isoelektrische Fokussierung wurde in der ersten Dimension verwendet, und eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde in der zweiten Dimension verwendet. Das Gel wurde auf Nitrocellulose-Membran elektrogeblottet und mit dem monoklonalen Antikörper USM/RC2 inkubiert. Es bindet eine Reihe von Latexproteinen (hauptsächlich mit einem geschätzten pI von 4,4 bis 4,46 und mit Molekulargewichten von etwa 14 bis 24 kDa) an USM/RC2.
5: Sequentielle Proteinfraktionen, die mittels Sephacryl S3200 Gelfiltration des aus dialysiertem B-Serum erhaltenen Präzipitats gewonnen wurden. Das Präzipitat wurde in 0,35 M Natriumchlorid-Lösung vor der Gelfiltration gelöst. Die Hauptfraktionen A bis F sind gezeigt.
6: Elektrophoretische Auftrennung (15 % Gel) von Proteinen, die aus der Sephacryl 5200 Gelfiltration gewonnen wurden. Spur 1: vereinigte Maxima E und F; Spur 2: vereinigte Maxima A und B; Spur 3: Molekulargewichtsmarker. Teil A: mit Coomassie-Blue gefärbtes Gel. Teil B: Western-Blot des Gels, inkubiert mit Plasma eines Patienten mit einer Latexallergie.
7: Reinigung von Hev b IV durch Gelfiltrationschromatographie. Die Proteine in den verschiedenen Maxima wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (15 % Gel) aufgetrennt. Das Gel wurde mit Coomassie-Blue gefärbt (a). Ein entsprechender Western-Blot wurde mit homotypischem Antiserum gegen Hev b IV inkubiert (b und c). Die Testproben wurden reduziert und erhitzt (b) oder nicht reduziert und nicht erhitzt (c). (M = Molekulargewichtsmarker, BS = B-Serum).
8: Western-Blots von Latexproteinen, die mit homotypischem Antiserum gegen das Allergen Hev b IV (A) und dem monoklonalen Antikörper (USM/RB3) gegen Hev b IV inkubiert wurden. Spur 1: B-Serum, Spur 2: B-Serum + C-Serum. Spur 3: C-Serum. Alle Proben wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen ohne Erhitzen analysiert.
9: Reinigung von Hev b II durch Gelfiltrationschromatographie. Die Proteine in den verschiedenen Maxima wurden durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (15 % Gel) aufgetrennt. Das Gel wurde in Coomassie-Blue gefärbt (a). Ein entsprechender Western-Blot wurde mit dem monoklonalen Antikörper USM/RB4 inkubiert (b). (M = Molekulargewichtsmarker, BS = B-Serum).
10: Teil A: Präparative gelelektrophoretische Analyse des Allergens Hev b IV. B-Serum wurde unter nicht-reduzierenden und nicht-denaturierenden Bedingungen unter Verwendung eines 7,5%-Gels aufgetrennt. Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper USM/RB3.
Teil b: Western-Blots von gereinigtem Hev b IV. Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper USM/RB3 (oben) mit Plasma eines Patienten mit einer Latexallergie (unten). Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde mit einem 12%-Gel durchgeführt.
Teil c: Western-Blots von gereinigtem Hev b II. Inkubation mit Plasma eines Patienten mit einer Latexallergie (oben) und mit dem monoklonalen Antikörper USM/RB4 (unten). Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde auf einem 12%-Gel durchgeführt.
11: Immunogold-Nachweis von Hev b IV in den Microhelices (als auftretende Bünde gezeigt), die aus B-Serum präpariert wurden. Mit Ziege-anti-Maus-IgG konjugierte Goldpartikel zeigen die Gegenwart des monoklonalen Antikörpers USM/RB3 an, der spezifisch an Hev b IV bindet.
12: Erkennung von Microhelices durch IgE aus Blutplasma eines Patienten, der gegen Hev b IV (nicht jedoch gegen Hev b II) aus natürlichem Gummilatex bzw. natürlichem Kautschuklatex allergisch ist. Die Microhelices wurden mit Blutplasma und dann mit einem monoklonalen Anti-Mensch-IgE-Antikörper inkubiert. Die Markierung wurde nachfolgend mit einem Ziegeanti-Maus-Antikörper, der mit 10 nm kolloidalem Gold konjugiert war, durchgeführt.
13: Immunogold-Nachweis von polyklonalen Antikörpern gegen Latexhandschuhproteine. Die Antikörper wurden in Kaninchen erzeugt. Mit Ziege-anti-Kaninchen-IgG konjugierte Goldpartikel zeigen die Gegenwart von immunogenen Polypeptiden auf den Microhelices (in Bündeln auftretend gezeigt), die aus B-Serum präpariert wurden, an.
14: SDS-PAGE-(15 % Gel)Auftrennung von B-Serum, das verschiedenen Behandlungen unterworfen wurde. Ein entsprechender Western-Blot wurde mit polyklonalem homotypischen Antiserum gegen Hev b IV inkubiert (B).
Vor der elektrophoretischen Auftrennung wurden die B-Serum-Proben reduziert und erhitzt (Spur 1), reduziert und nicht erhitzt (Spur 2), nicht reduziert und erhitzt (Spur 3) und nicht reduziert und nicht erhitzt (Spur 4). Die Gele wurden in Coomassie-Blue gefärbt.
M = Molekulargewichtsmarker
15: SDS-PAGE (10 % Gel) von fraktionierten Proteinen (Fraktionen A bis F, gemäß Beschreibung im Text), die aus der Präzipitation von B-Serum durch Dialyse gewonnen wurden. Vor der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Proben reduziert und erhitzt (oberer Teil) und nicht reduziert und erhitzt (unterer Teil). Die Gele wurden in Coomassie-Blue gefärbt.
M = Molekulargewichtsmarker; BS = B-Serum.
16: Western-Blot-Streifen von Hev b II, die mit dem monoklonalen Antikörper USM/RB3 (Spur 14), USM/RB4 (Spur 15) und IgE von allergischen Patienten (Spuren 1 bis 13) inkubiert wurden.
17: Western-Blots einer elektrophoretischen Auftrennung (15 % Gel) von Proteineluaten aus sechs Handschuhmarken (mit 4 bis 9 bezeichnet). Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Die geblottete Nitrocellulosemembran wurde mit homotypischem Antiserum gegen das Allergen Hev b IV (Blot A) und mit dem monoklonalen Antikörper USM/RB4 inkubiert, der spezifisch für das Allergen Hev b II ist (Blot B).
Gegen B-Serum gerichtetes Maus-Antiserum wurde durch Immunisieren von Mäusen vom Stamm Balb/c mit 0,5 ml B-Serum intraperitoneal, gefolgt von einer zweiten Dosis drei Wochen später, erzeugt. Die Mäuse wurden durch kardiale Punktierung zwei Wochen nach der zweiten Dosis ausgeblutet und das Serum wurde in Aliquots aufgeteilt gefroren gelagert. Es wurde durch Western-Blot-Analyse festgestellt, dass das Serum für das Protein Hev b IV homotypisch war.
Dann wurden monoklonale Antikörper gegen Latexproteine erzeugt. Milzen von Balb/c-Mäusen, die mit Latexproteinen aus dem Gummibaum Hevea brasiliensis immunisiert waren, wurden mit Maus-Myelomzellen gemäß den zuvor von Köhler und Milstein (1975, 1976) beschriebenen Verfahren fusioniert. Die resultierenden Hybridomzellen wurden hinsichtlich für die Latexproteine typische Antikörper unter Verwendung verschiedener Immuntests gescreent. Ausgewählte Hybridome wurden zweimal rückkloniert und sezernierte monoklonale Antikörper wurden entweder in ungereinigter Form in Hybridomzellenüberständen oder als mittels Affinitätschromatographie gereinigte Präparationen verwendet. Proben der Hybridomzelllinien, welche die monoklonalen Antikörper USM/RB4, USM/RC2 und USM/RB3, welche die Latexallergene Hev b II, Hev b III bzw. Hev b IV erkennen, sezernieren, wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire, Vereintes Königreich, in dessen Eigenschaft als internationale Hinterlegungsbehörde hinterlegt. Die Zelllinie für USM/RB4 erhielt die Zugriffsnummer 94120727, die am 7. Dezember 1994 hinterlegt wurde. Die Zelllinien für USM/RB3 und USM/RC2 erhielten die folgenden vorläufigen Zugriffsnummern:
Die Proteine wurden als Nächstes aus Latex vom Gummibaum Hevea brasiliensis extrahiert, und es wurden spezifische Allergene identifiziert. Monoklonale und homotypische Antikörper gegen diese Proteine wurden zur Identifizierung einzelner Proteine verwendet, und ihre Molekulargewichte wurden bestimmt. Allergene Proteine wurden durch Bestimmung derjenigen Proteine identifiziert, die von IgE-Antikörpern im Blutplasma erkannt werden, das von Patienten erhalten wurde, von denen bekannt ist, dass sie allergisch gegen Latex sind. Die in dieser Weise identifizierten Allergene wurden mit Proteinen kreuzreagiert, die durch monoklonale und homotypische Antikörper identifiziert wurden.
Die identifizierten Allergene wurden dann durch verschiedene übliche Verfahren aufgereinigt, und die Identität der gereinigten Proteine wurde durch Markierung mit monoklonalen und homotypischen Antikörpern bestätigt. Die isoelektrischen Punkte (pI) der gereinigten Allergene wurden unter Verwendung des Elektrofokussierungsgeräts LKB Multiphor Modell 2117, das mit einer vorgefertigten Ampholin-PAG-Platte im pH-Bereich von 3,5 bis 9,5 ausgestattet war, entsprechend der Anleitung des Herstellers (Pharmacia LKB, Schweden) bestimmt. Etwa 15 μl Testprobe, konzentriert in 1% Glycin, wurden auf das Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Fraktionierung und Reinigung der drei Latexallergene, mit Hev b IV, Hev b II und Hev b III bezeichnet, wird nachstehend beschrieben.
Durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation wird Latex in drei Hauptfraktionen aufgetrennt: der obere Gummirahm, die „Bodenfraktion" und das C-Serum dazwischen. Hev b III befindet sich auf der Oberfläche der kleinen Gummipartikel (mittlere Größe von etwa 100 nm Durchmesser). Viele dieser Partikel, insbesondere diejenigen mit einer kleineren Größe als das Mittel, werden während der Zentrifugation nicht mit dem Gummirahm abgetrennt und verbleiben daher im C-Serum.
Da das C-Serum die wässerige Phase von Latex ist, die durch Zentrifugation von Latex erhalten wird, sind C-Serumproteine im Allgemeinen wasserlöslich. Nichtsdestotrotz ist das C-Serum keinesfalls ein homogenes Fluid, sondern enthält geringe Mengen von hauptsächlich winzigen unlöslichen Materialien, die durch den Latexzentrifugationsprozess nicht abgetrennt werden. Die Hauptmenge dieser unlöslichen Materialien bilden sehr kleine Gummipartikel, deren Vorliegen durch Elektronenmikroskopie bestätigt wurde. Da sich Hev b III auf der Oberfläche dieser kleinen Gummipartikel, die im C-Serum suspendiert vorliegen, befindet, ist es technisch gesehen ein C-Serumprotein. Es ist jedoch nicht eines der löslichen Proteine, die normalerweise mit dem C-Serum assoziiert sind. Hev b III kann durch Detergentien solubilisiert werden und wird teilweise durch Ammoniak solubilisiert.
Zur Extraktion von Hev b III wurde Latex aus dem angezapften Gummibaum in einem gekühlten Behälter gesammelt. Das Latex wurde in einer Sorvall RC 5C Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 19.000 UpM (43.000 g) für 2 Stunden zentrifugiert, und die kleinen Gummipartikel, die sich in der „Zone 2" des zentrifugierten Latex (Moir, 1959) befinden, wurden aus dem Zentrifugenröhrchen gewonnen. Der Zone-2-Gummirahm wird in einer Lösung von 30 % Sucrose resuspendiert, um kontaminierendes C-Serum zu entfernen, und die Suspension wurde dann nochmals zentrifugiert. Der Gummirahm wurde mit einem Gemisch aus 0,01 % Triton X-100 und 1 Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, um die Membranproteine zu extrahieren.
Der Zone-2-Gummirahm wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen, um sein Molekulargewicht zu bestimmen. Im Elektropherogramm des Zone-2-Gummirahms befinden sich zwei durch Coomassie-Blue-Färbung nachweisbare Hauptproteine: eine geringe Menge eines Proteins mit ungefähr 14 kDa und eine größere Menge eines Proteins mit 24 kDa, das Hev b III ist.
Trotz des apparenten Molekulargewichts von 24 kDa von Hev b III, gemäß Bestimmung durch Standardmolekulargewichtsmarker in Verbindung mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, zeigt eine Massenspektrometrie des Proteins verschiedene Molekulargewichtspezies von 22,258, 22,533, 22,790 und 23,058 kDa. Der Wert von 24 kDa wird trotz dessen in nachfolgenden Bezugnahmen auf das Molekulargewicht von Hev b III in diesem Dokument verwendet. Der tryptische Verdau von Hev b III ergab die folgenden internen Aminosäuresequenzen:
VSSYLPLLTPTEK
GDLSTVSRLK
IVLDVASSVFNTR(K/Q)E(K/Q)K
VTPVYYLGTPTV
wobei die Einzelbuchstabensymbole für die Aminosäuren gemäß Cohn (1984) verwendet werden.
Es wurde ein monoklonaler Antikörper USM/RC2 erzeugt, der Hev b III und aus dem Abbau von Hev b III stammende Polypeptidfragmente erkennt (damit spezifisch reagiert).
In einer anderen Ausführungsform kann Hev b III durch Durchleiten von C-Serum durch eine Sephadex G-150 Chromatographiesäule (2,6 cm × 81 cm) mit 0,25 M Tris-HCl mit einem pH von 8,0 als Elutionspuffer präpariert werden. Die Fraktionierung von C-Serum wird durch Überwachung der Absorption der eluierten Fraktionen bei 280 nm verfolgt. Das erste Hauptmaximum, das eluiert, stellt den Durchfluss der Säule bzw. dessen Porenvolumen dar und enthält beträchtliche Mengen kleiner Gummipartikel (Maximum A, 1). Diese Fraktion wird dialysiert, durch Gefriertrocknung konzentriert und mit einem Gemisch aus 0,01 % Triton X-100 und 1 Natriumdodecylsulfat (SDS) extrahiert.
Es wurde die Immunogold-Markierungstechnik verwendet, um zu zeigen, dass das Protein, das USM/RC2 erkennt, sich auf der Oberfläche von kleinen Gummipartikeln befindet, die im C-Serum suspendiert vorliegen. Kleine Gummipartikel (etwa 45 nm Durchmesser), die aus dem Porenvolumen von gelfiltriertem C-Serum gewonnen wurden, wurden kurz mit Osmiumtetroxid fixiert und auf Formvar-Kohlenstoff-beschichteten Nickelgittern bzw. – grids abgeschieden. Die Gitter wurden zunächst für 30 Minuten mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,2, enthaltend 1 Rinderserumalbumin (PBS-BSA), blockiert, und die Inkubation wurde mit USM/RC2 für 15 Minuten durchgeführt. Nach dem Waschen wurde die Inkubation für weitere 15 Minuten mit 5 nm Ziege-anti-Maus-Immunglobulin-(IgG)-Goldkonjugat, kontrastiert mit einer 2%-Phosphorwolframsäure-Negativfärbung (pH 6,8), durchgeführt. Bei der Beobachtung im Elektronenmikroskop wurden Goldpartikel auf der Oberfläche der kleinen Gummipartikel beobachtet (2), was anzeigt, dass das Polypeptid, das USM/RC2 erkennt (Hev b III), sich auf der Oberfläche der kleinen Gummipartikel befindet, die im C-Serum suspendiert vorliegen.
Das parentale Allergen Hev b III unterliegt dem Abbau in kleinere Polypeptidfragmente. Dieser Abbau wird durch das Vorhandensein von „B-Serum" verstärkt, welches die flüssige Phase, die aus der Bodenfraktion extrahiert wird, darstellt (siehe nachstehend hinsichtlich einer Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung von B-Serum).
Wenn C-Serum und B-Serum zusammen im Verhältnis 5:2 gemischt werden, stammen die Proteinbanden aus dem Western-Blot, der mit dem monoklonalen Antikörper USM/RC2 inkubiert wurde, nicht aus dem B-Serum, da sie in Abwesenheit von C-Serum durch USM/RC2 nicht herausgegriffen werden. Des Weiteren reagieren bei der Sephadex-Säulenfiltration von C-Serum (siehe oben) die früh eluierenden Fraktionen (das Porenvolumen, das die Gummipartikel enthält) stark mit USM/RC2 (Maximum A, 1). Andererseits zeigen die mittel und spät eluierenden Fraktionen (bei denen erwartet wird, dass sich darin lösliche Proteine befinden) eine wesentlich geringere Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper USM/RC2, was anzeigt, dass deutlich weniger Hev b III in diesen Fraktionen (Maxima B und C, 1) vorliegt. Diese Beobachtungen stimmen mit der Aussage überein, dass Hev b III mit den kleinen Gummipartikeln assoziiert ist, die sich in den früh eluierenden Fraktionen befinden.
Die Reihe der von Hev b III stammenden Polypeptide kann nach Abtrennen von C-Serumproteinen, die mit B-Serum behandelt wurden, unter Verwendung der präparativen SDS-PAGE, wodurch Fraktionen gewonnen werden, welche die Polypeptidkomponenten enthalten, einzeln beobachtet werden. Die sequentiellen Fraktionen werden der SDS-PAGE unterworfen, gefolgt von einem Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran (Western-Blot). Die Membran wird dann mit dem monoklonalen Antikörper USM/RC2 inkubiert, und der Nachweis dieser Bindung wurde durch Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit einem Enzym (Meerrettichperoxidase) konjugiert ist, der bei Reaktion mit seinem Substrat in Gegenwart von 4-Chlor-1-naphthol ein gefärbtes Produkt erzeugt, erreicht.
Bei einer Variante der obigen Prozeduren zum Test der Gegenwart von Proteinbanden, die an die monoklonalen oder homotypischen Antikörper binden, wurde die Nitrocellulose-Membran in einer Lösung, enthaltend Serum oder Plasma von Patienten mit Latexallergie, inkubiert. Die an die immobilisiert auf der Membran vorliegenden Proteine gebundenen IgE der Patienten können dann unter Verwendung eines Enzyms, das mit einem sekundären Antikörper mit einer Spezifität für die schwere Epsilon-Kette von humanem IgE konjugiert ist, detektiert werden. Gebundene Antikörper können dann wie vorstehend beschrieben unter Verwendung eines gefärbten Substrats visualisiert werden. Die Western-Blots zeigen, dass viele Abbauprodukte von Hev b III, die von einem Molekulargewicht von 5 kDa bis 24 kDa reichen, durch den monoklonalen Antikörper USM/RC2 erkannt werden (3, Teile A und B). Es werden auch Proteine mit einem Molekulargewicht von größer als 24 kDa beobachtet, was ein mögliches Auftreten einer Proteinaggregation nahelegt. Die Bindung von USM/RC2 an die verschiedenen Polypeptide zeigt eindeutig, dass sie gemeinsam aus Hev b III stammen. Von den aus Hev b III stammenden Proteinen ist mindestens eines mit einem Molekulargewicht von 12 kDa aufgrund seiner Bindung mit IgE aus Patienten mit Latexallergie allergen (3, Teil C). Ein Western-Blot mit Hev b III, hergestellt aus dem Gummirahm von zentrifugiertem, frischem Hevea-Latex, wurde mit Serum inkubiert, das Latex-IgE-positiven Spina-bifida-Patienten gesammelt wurde. Die Bindung von IgE an Hev b III zeigte, dass die Spina-bifida-Patienten besonders allergen gegenüber diesem Protein waren (3.1).
Der monoklonale Antikörper Hev b III wurde weiter durch zweidimensionale (2-D-) Polyacrylamid-Gelelektrophorese eines Gemisches aus B-Serum und C-Serum, gemischt im Verhältnis 2:5, charakterisiert. Eine isoelektrische Fokussierung wurde in der ersten Dimension und eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde in der zweiten Dimension verwendet. Die Silberfärbung ergibt eine Anzahl von Proteinen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten (pI) und Molekulargewichten. Es wurde ein entsprechendes 2-D-Gel auf eine Nitrocellulose-Membran elektrogeblottet (Western-Blot), die dann mit dem monoklonalen Antikörper gegen Hev b III inkubiert wurde. Die an den Antikörper bindenden Latexproteine werden durch eine enzymatische Reaktion unter Verwendung eines sekundären Enzymkonjugierten Antikörpers sichtbar gemacht. Es wurde festgestellt, dass die spezifisch an Hev b III gebundenen Polypeptide hauptsächlich Molekulargewichte im Bereich von 14 bis 24 kD mit den in 4 gezeigten pIs aufweisen. Die räumliche Verteilung dieser Polypeptide auf dem Western-Blot ist derjenigen von Latexproteinen sehr ähnlich, gegen die Patienten allergisch sind, die an Spina bifida leiden (Alenius, 1994).
Zur Extraktion von Hev b IV und Hev b II wurde Latex gewonnen und wie vorstehend beschrieben zentrifugiert. Die Bodenfraktion wurde aus dem zentrifugierten Latex gewonnen, und das B-Serum wurde durch alternierende Einfrier-Auftau-Zyklen zur Zerstörung der Lutoide, welche die Hauptbestandteile der Bodenfraktion sind (Hsia, 1958), präpariert. Das Serum (B-Serum), das von den zerstörten Lutoiden freigesetzt wird, wurde durch weitere Zentrifugation gewonnen. B-Serum in Aliquoten von 10 ml wurde gegen 2 l destilliertes Wasser bei etwa 5°C dialysiert. Das resultierende Präzipitat, das durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 Minuten gewonnen würde, wurde in 10 ml 0,35 M Natriumchlorid gelöst. Die Lösung wurde während der gesamten Arbeitsschritte in einem Eiswasserbad gehalten.
Ein alternatives Verfahren zur Extraktion von Hev b IV und Hev b II besteht im Mischen von B-Serum und C-Serum im Verhältnis von 2:5 und einer Präzipitation der Allergene für 15 Minuten bis über Nacht bei Raumtemperatur. Das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugation gewonnen und in 0,35 M Natriumchlorid oder Phosphat-gepufferter Salzlösung gelöst.
Der Rohextrakt von Hev b IV und Hev b II wurde auf einer Säule (70 × 1,6 cm) von Sephacryl 5–200, das mit 0,35 M Natriumchlorid äquilibriert war, chromatographiert, und es wurde im gleichen Lösungsmittel die Elution durchgeführt. Es wurden Fraktionen von 5 ml gesammelt, während die optische Dichte jeder Fraktion bei 280 nm gemessen wurde. Es werden einige derartiger Säulenchromatographieläufe durchgeführt, um erhebliche Mengen der von der Säule eluierten Komponenten zu gewinnen.
Durch die beschriebene Säulenchromatographie wurden Fraktionen von sechs Maxima A bis F erhalten (5). Diese Fraktionen wurden mit einem Enzym-Immuntest getestet, um die Gegenwart von Proteinen, die von einer Reihe von monoklonalen Antikörpern erkannt werden, sowie die Befähigung zur Bindung von IgE aus Patienten mit einer Latexallergie nachzuweisen. Diese Daten sind in der Tabelle I gezeigt. Eine Komponente oder Komponenten der Maxima A und B werden von 11 von 13 (84,6 %) Patienten mit Latexallergie erkannt, während 4 von 13 (30,8 %) eine Komponente oder Komponenten der Maxima E und F erkennen. TABELLE I. BINDUNG VON PROTEINEN IN DEN FRAKTIONEN A BIS F, ERHALTEN DURCH GELSÄULENCHROMATOGRAPHIE GEGEN IgE IN PLASMAPROBEN (a – m) UND AN DIE MONOKLONALEN ANTIKÖRPER USM/RB3 UND USM/RB4 (n und o).

++++ = starke Protein-Antikörper-Bindung
+ = schwache Protein-Antikörper-Bindung
w = sehr schwache Protein-Antikörper-Bindung

Die positive Bindung zwischen Protein und Antikörper wurde durch eine Enzymreaktion (Peroxidase) nachgewiesen, die durch einen Enzym-konjugierten Antikörper gegen humanes IgE (bei Patientenplasmaproben) und einen zweiten Antikörper gegen Maus-Immunglobulin (bei den monoklonalen Antikörpern) vermittelt wurde.
Die monoklonalen Antikörper USM/RB3 und USM/RB4 unterscheiden die Komponenten der Maxima A und B und der Maxima E und F (Tabelle I).
Die Proteine in den Maxima A bis F wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bei der die Probe durch Zugabe von Mercaptoethanol reduziert und erhitzt wurde, aufgetrennt. Die Hauptproteinbanden, die nach Färbung mit Coomassie-Blue beobachtet wurden, sind eine Hauptbande von 50–57 kDa und Nebenbanden mit 65, 22 und 18 kDa aus den Maxima A und B und 36/37, 34/35 kDa aus den Maxima E und F (6, Teil A). Das 34/35-kDa-Protein lag im Maxima F stärker als das 36/37-kDa-Protein vor, sie fanden sich aber allgemein in ähnlichen Mengen im Maximum E. Es wurde ein entsprechendes Gel elektrogeblottet und dann mit Blutplasma inkubiert, von dem bekannt ist, dass es Latex-spezifische IgE enthält. Die Proteine, von denen festgestellt wurde, dass sie allergen sind, sind diejenigen mit Molekulargewichten von 48–58 kDa, 22 kDa und 65 kDa aus den Maxima A und B und 34/35 und 36/37 aus den Maxima E und F (6, Teil B).
Die Maxima A und B enthalten ein Protein mit hohem Molekulargewicht, wenn sie unter nicht-reduzierenden Bedingungen laufengelassen werden (7, Teil a), das aus Disulfid-verknüpften Monomeren mit einem Molekulargewicht im Bereich von 48 bis 58 kDa, bestehend aus drei Hauptspezies mit Polypeptidketten mit apparenten Molekulargewichten von 50, 55 und 57 kDa, gebildet wird. Diese Untereinheiten werden von den homotypischen Antikörper gegen Hev b IV glatt erkannt (7, Teil b).
Wenn jedoch das Acrylamidgel, das unter nicht-reduzierenden Bedingungen laufengelassen wurde, elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose übertragen wird, kann gezeigt werden, dass der gleiche homotypische Antikörper gegen Hev b IV nun eine Reihe kleinerer Polypeptide mit ungefähren Molekulargewichten von 29 kDa, 32 kDa, 40 kDa, 50 kDa und 70–80 kDa erkennt. Die Polypeptide werden ebenfalls durch 10 andere monoklonale Antikörper (von denen USM/RB3 ein Beispiel ist), die von verschiedenen Hybridomklonen erhalten wurden, erkannt, wobei ein Beispiel in 8 gezeigt ist.
Es wurde in den Maxima E und F durch Colorimetrie eine β1,3-Glucanase-Aktivität nachgewiesen. Proben der Maxima E und F wurden mit Laminarin (1 mg ml^–1 in 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,2) inkubiert. Die Freisetzung reduzierender Zucker zeigte die Gegenwart einer β1,3-Glucanase-Aktivität an. Die Maxima E und F enthalten das Allergen Hev b II, das mit zwei Polypeptidketten mit Molekulargewichten von 34/35 und 36/37 kDa vorliegt, die nicht durch Disulfid-Bindungen zwischen den Ketten verknüpft sind und daher aus der Gelfiltrationssäule zu geringfügig unterschiedlichen Zeitpunkten auftreten. Beide dieser Polypeptide werden durch zwei monoklonale Antikörper, von denen einer USM/RB4 ist, erkannt (9).
Bei einer weiteren Charakterisierung der allergenen Proteine wurde B-Serum einer präparativen Gelelektrophorese unterworfen, bei der die Probe nicht reduziert und nicht erhitzt wurde, und sequentielle Fraktionen wurden nach Migration der Proteine durch ein 7,5 % Polyacrylamidgel gewonnen. Die Bestandteile dieser Fraktionen wurden unter Verwendung der beschriebenen monoklonalen und homotypischen Antikörper identifiziert, und sowohl Hev b IV als auch Hev b II können in dieser Weise gewonnen werden. Hev b IV kann als Protein mit hohem Molekulargewicht unter diesen Bedingungen gewonnen werden und wird eindeutig in drei Hauptspezies aufgetrennt, die apparente Molekulargewichte von 100, 110 bzw. 115 kDa aufweisen, und diese können in den Spuren 2, 5 und 9 der 10a beobachtet werden. Wenn diese Fraktionen einer SDS-PAGE unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen unterworfen und auf Nitrocellulose transferiert werden, zeigen die mit homotypischem Antiserum gegen Hev b IV inkubierten resultierenden Western-Blots eine breite Bande mit einem Molekulargewichtsbereich von 48–58 kDa, wie zuvor beschrieben (siehe 7), was belegt, dass die einzelnen durch präparative Gelelektrophorese unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen aufgetrennten Banden ein Protein in den Maxima A und B darstellen, die durch Gelfiltration gewonnen werden können. Dass dieses Protein auch ein humanes Allergen ist, wird in 10b gezeigt, in welcher der obere Teil ein Western-Blot der drei Fraktionen von Hev b IV darstellt, die durch präparative Gelelektrophorese gewonnen wurden, und der untere Teil IgE aus Patienten mit Latexallergie zeigt, die an die gleichen drei Banden binden. Ein weiterer Beleg, dass dieses Allergen Hev b IV drei Hauptspezies enthält, wird durch Kapillarelektrophorese (Beckman Instruments) mit diesen Proben gezeigt, die drei Maxima ergibt. Die gleiche Analyse zeigt, dass bei diesen Proben keine anderen Maxima beobachtet werden, was eindeutig belegt, dass die Erfinder Hev b IV mit seinen drei Hauptformen gereinigt haben, und dass sämtliche dieser Formen durch IgE aus Patienten mit Latexallergie erkannt werden.
Nach Präzipitation durch Dialyse und Wiederauflösen in Natriumchlorid verhalten sich Hev b IV und Hev b II ähnlich wie ein Latex-B-Serum-Proteinkomplex, der als Microhelix (Plural, Microhelices) bekannt ist. Die Microhelix ist ein Glycoprotein-Komplex mit filamentöser helikaler Struktur, das zuvor im Elektronenmikroskop beobachtet und in einigen Einzelheiten charakterisiert wurde (Archer et al., 1963; Gomez und Yip, 1975; Gomez und Tata, 1977; Tata und Gomez, 1980). Wie von Gomez und Moir (1979) zusammengefasst, weisen aus dialysiertem B-Serum präparierte Microhelices eine Länge von 1 μm oder mehr mit einem Durchmesser von 20 nm auf, die Faserweite beträgt ungefähr 5 nm und die Steigung der Helix, die offen und hohl ist, beträgt etwa 30 nm. Einzelne Microhelices liegen oft in Bündeln assoziiert vor (11). Bei hoher Auflösung im Elektronenmikroskop zeigen Microhelices eine körnige Struktur, bestehend aus sphärischen Partikeln mit einem Durchmesser von 3–3,5 nm, die in helikaler Weise mit 3 bis 4 Partikeln pro Umdrehung angeordnet sind.
Es wurde die Technik der Immunogold-Markierung verwendet, um zu bestimmen, ob eines oder beide der Proteine Hev b IV und/oder Hev b II Komponenten des Microhelix-Komplexes sind. Microhelices werden durch Dialyse von B-Serum präpariert und auf Formvar-Kohlenstoff-beschichteten Nickelgittern bzw. -grids abgeschieden. Die Gitter wurden zunächst für 30 Minuten mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,2, enthaltend 1 Rinderserumalbumin (PBS-BSA), blockiert. Es wurde eine Inkubation für 15 Minuten, getrennt mit den monoklonalen Antikörpern USM/RB3 (das spezifisch an Hev b IV bindet) und USM/RB4 (das spezifisch an Hev b II bindet), durchgeführt. Diese monoklonalen Antikörper dienen als Primärantikörper in den Immunreaktionen. Nach dem Waschen wurden erfolgreich an die Microhelices gebundene monoklonale Antikörper durch eine 15-minütige Inkubation mit 10 mm Ziege-anti-Maus-Immunglobulin(IgG)-Goldkonjugat (der sekundäre Antikörper), kontrastiert mit einer Negativfärbung mit 2 Phosphorwolframsäure (pH 6,8) und Untersuchung im Elektronenmikroskop detektiert. Wie in 11 gezeigt, sind Goldpartikel auf die Microhelices konzentriert, die mit USM/RB3 inkubiert wurden, was zeigt, dass das Polypeptid (Hev b IV), das durch diesen erkannt wird, eine Komponente des Microhelix-Komplexes ist. Andererseits liegt keine Assoziation von Goldpartikeln mit denjenigen Microhelices vor, die mit USM/RB4 inkubiert wurden, was andeutet, dass Hev b II wahrscheinlich keine Komponente des Microhelix-Komplexes ist.
Um weiter zu demonstrieren, dass die Microhelix ein Allergen ist, wurden die vorstehenden Immunogold-Markierungsverfahren wiederholt, jedoch wurde Blutplasma von allergenen Patienten, die gegenüber Hev b IV nicht, jedoch gegenüber Hev b II empfindlich sind, als primäre Antikörperquelle verwendet. Der pH bei der Inkubation betrug 8,0. Ein monoklonaler Antikörper gegen IgE diente als sekundärer Antikörper in der Immunreaktion, während Ziege-anti-Maus-Immunoglobulin-(IgG)-Goldkonjugat als tertiärer Antikörper diente. Wie in der 12 gezeigt, wurde beobachtet, das Goldpartikel (5 nm) mit Microhelices assoziiert waren, was zeigt, dass die Microhelix ein allergenes Protein ist.
Um zu bestätigen, dass Microhelices oder deren Polypeptidderivate sich in Proteinen, die aus Latexhandschuhen extrahierbar sind, befinden, wurde ein wässeriges Latexhandschuh-Eluat in Phosphat-gepufferter Salzlösung hergestellt und subkutan in Kaninchen injiziert, um polyklonale Antikörper gegen das Handschuhprotein-Gemisch zu erzeugen (Sunderasan und Yeang, 1994). Wenn eine Immunogold-Markierung der Microhelix unter Verwendung dieser polyklonalen Antikörper durchgeführt wurde, wurde eindeutig festgestellt, das 10 nm Goldpartikel, konjugiert mit Ziege-anti-Kaninchen-IgG, mit den Microhelices assoziiert vorlagen (13), was zeigt, dass Polypeptidkomponenten des Microhelix-Proteinkomplex in Latexhandschuh-Eluat auftreten.
Hev b IV liegt als ein Oligomer vor, das aus monomeren Polypeptiden mit ungefähren Molekulargewichten von 55 kDa (50, 55, 57 kDa) besteht, die über Disulfide zu -Dimeren mit einem ungefähren Molekulargewicht von 105 kDa (100, 110, 115 kDa) wie vorstehend beschrieben verknüpft sind. Eine isoelektrische Fokussierung ergab, dass Hev b IV ein saures Protein mit einem pI im Bereich von pH 4,5 ist. Seine N-terminale Aminosäuresequenz wurde mit ELDEYLFSFGDGLYDAGNA bestimmt, wobei die Einzelbuchstabensymbole für die Aminosäuren gemäß Cohn (1984) dargestellt sind. Die 14 zeigt ein mit Coomassie-Blue gefärbtes SDS-PAGE-Gel, wobei die Spuren 1–4 mit B-Serum beladen wurden. Die B-Serumproben wurden entweder reduziert oder nicht reduziert und bei 95°C für 3 Minuten erhitzt oder vor der Beladung nicht erhitzt. Ein entsprechendes Gel wurde auf Nitrocellulose-Membran elektrotransferiert, und der Western-Blot wurde mit für Hev b IV homotypischen polyklonalen Antikörpern inkubiert. Die Ergebnisse zeigen, das Hev b IV als eine breite Bande zwischen etwa 50–57 kDa vorliegt, wenn die Probe reduziert und erhitzt wurde (Spur 1). Wenn die Probe erhitzt, jedoch nicht reduziert wurde (Spur 3), wird Hev b IV als eine Bande mit höherem Molekulargewicht von etwa 105 kDa beobachtet, was anzeigt, dass Hev b IV-Monomere (Molekulargewicht 50–57 kDa) zur Bildung von Dimeren mit 105 kDa über Disulfide verknüpft sind. Wenn die Probe des Weiteren weder erhitzt noch reduziert wurde (Spur 4), trat das Protein nicht in das Gel ein, was nur eine sehr schwache reagierende Bande bei 105 kDa ergab, was nahelegt, dass die Dimere mit 105 kDa größere Oligomere bilden, die durch Erhitzen dissoziieren.
Das aus den Fraktionen A und B aus dem Gelfiltrationsprozess, der vorstehend beschrieben wurde, gewonnene Protein enthält ebenfalls eine breite Bande mit 50–57 kDa, die als Dimer von 100 bis 115 kDa vorliegt, wie in 15 gezeigt, wobei das obere Gel unter reduzierenden Bedingungen laufengelassen wurde, während das untere Gel unter nicht-reduzierenden Bedingungen laufengelassen wurde, um die Beziehungen zwischen den Banden mit 50 bis 57 kDa und denjenigen mit 100 bis 115 kDa zu zeigen.
Obwohl, wie vorstehend erwähnt, die Microhelix zuvor beschrieben wurde, stellen die vorliegenden Ergebnisse den ersten Bericht darüber dar, dass sie immunogen und allergen ist. Die Polypeptidfragmente von Hev b IV, die sich aus der Proteindenaturierung oder dem Proteinabbau ergeben, sind im Einzelnen vorliegend beschrieben.
Das Protein Hev b II wurde aus einer anderen Fraktion gewonnen, und da sein Molekulargewicht deutlich kleiner ist (34/35 und 36/37 kDa) als das von Hev b IV, wurden beide Polypeptidketten aus der gleichen Fraktion gewonnen, wobei das mit Coomassie-Blue gefärbte SDS-PAGE-Gel keine weiteren sichtbaren Banden zeigte. Wenn diese Fraktion einer Western-Blot-Analyse nach Elektrotransfer aus einem SDS-PAGE-Gel, das unter nicht-reduzierenden Bedingungen laufengelassen wurde, unterworfen wurde, zeigte sich eindeutig, dass das vom monoklonalen Antikörper USM/RB4 erkannte Protein auch von IgE aus Patienten mit Latexallergie erkannt wird. Ein Beispiel einer derartigen Reaktion ist in der 10c gezeigt, bei der der obere Teil die Bindung von IgE an mindestens 4 Banden in der Fraktion 15 (mittlere Spur) und 2 Banden in der B-Serumkontrolle (linke Spur) darstellt.
Die isoelektrische Fokussierung von Hev b II ergab eine einzelne Bande bei einem pI von etwa 9,6.
Hev b II konnte mit einem kathodischen nativen PAGE-System elektrophoretisiert werden. Durch Färbung mit Coomassie-Blue nach der Elektrophorese bei saurem pH gemäß dem Verfahren von Reisfeld et al. (1962) trat das Protein als einzelne Bande auf. Es wurde ein ähnliches Gel mit Laminarin (1,5 mg ml^–1) in 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,2, für 3 h bei 37°C inkubiert. Das Gel wurde dann in eine Lösung von 150 mM K₂HPO₄, pH 8,6, enthaltend 0,05 % Anilinblau, für 1 h gegeben (Cote et al., 1989). Es wurde eine markierte Bande beobachtet, die derjenigen entsprach, die nach Färbung mit Coomassie-Blue beobachtet wurde, was eine β1,3-Glucanase-Aktivität anzeigt. Ein internes Peptidfragment von Hev b II wies die Aminosäuresequenz FDENNXQPEVE auf, und ein weiteres Peptidfragment zeigte die Sequenz RNIHDAIRSAGLQ, wobei der Einzelbuchstaben-Code für die Aminosäuren gemäß Cohn (1984) verwendet wird. Die erste Sequenz zeigte eine Homologie von 85,2 % zu der Aminosäuresequenz der Endo-1,3-β-glucanase aus der Tabakpflanze und der Tomatenpflanze.
Es konnte eine große Menge von Hev b II mit beiden Molekulargewichtsgrößen durch Detergensextraktion von Lutoid-Membranen erhalten werden. Dies legt nahe, das Hev b II mit der Lutoid-Membran assoziiert ist.
Zum weiteren Nachweis der Bedeutsamkeit der von USM/RB4 erkannten Proteine als humane Allergene zeigt der Western-Blot unter Verwendung von Nitrocellulose-Streifen, die Hev b II-Protein enthalten, in einer Reaktion mit IgE aus Patienten mit Latexallergie, dass 8 von 13 (61,5 %) humanen Blutplasmaproben Hev b II erkennen (16). Gereinigtes Hev b II wurde in diesem Experiment verwendet, und daher war in diesem Fall die Sensitivität der Patienten-IgE gegenüber diesem größer als in dem Experiment, das in Tabelle I dargestellt ist.
Falls große Mengen von Hev b IV, Hev b II oder Hev b III erforderlich sind (z. B. für die gewerbliche Herstellung von Immuntests), können sie durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Andererseits können die monoklonalen Antikörper USM/RC2, USM/RB3 und USM/RB4 oder deren äquivalente Antikörper in „Affinitätschromatographie"-Säulen oder andere Festphasenmatrices eingebaut werden. Durch Umsetzen von Latex-C-Serum, -B-Serum oder anderen von Latex ausgehenden Präparationen mit derartigen Festphasenmatrices und Elution mit geeigneten Puffern, können die jeweiligen Allergene in hochgereinigter Form erhalten werden.
Die Tatsache, dass Hev b IV und Hev b II in Natriumchlorid löslich sind, kann in Verfahren ausgenutzt werden, um Latexprodukte auszulaugen oder zu waschen, um allergene Proteine zu entfernen. Hev b IV und Hev b II (und ihre Untereinheiten und Abbauprodukte) werden wirksamer entfernt, falls eine Lösung eines Salzes (z. B. Natriumchlorid) oder eine andere Lösung mit einer Ionenstärke, die größer ist als diejenige von Wasser, beim Auslaugen oder Waschen verwendet wird. Ein Beispiel dieses Effekts wird in der Tabelle II gezeigt, welche die Extraktion von Gesamtproteinen, Gesamtantigenen (d. h. Allergenen und Nicht-Allergenen) und allergenen Proteinen, die an USM/RB4 binden, mit Wasser und mit 0,35 M Natriumchlorid-Lösung aus einem Film von natürlichem Gummilatex bzw. natürlichem Kautschuklatex darstellt. Es ist eindeutig, dass, während Natriumchlorid-Lösung Gesamtprotein und Gesamtantigene effizienter als Wasser entfernt, die größere Effizienz von Natriumchlorid sehr viel deutlicher im Fall von an USM/RB4 bindenden Latexallergenen ist, wobei nur 4,5 % des extrahierbaren Allergens mit Wasser eluiert wird, im Vergleich zu 59,5 % des Gesamtproteins und 77,7 % des in Wasser extrahierbaren Gesamtantigens, verglichen mit 0,35 M Natriumchlorid. Daher erhöht die Verwendung von 0,35 M Natriumchlorid-Lösung selektiv die Effizienz, mit der dieses bestimmte Latexallergen extrahiert wird.
TABELLE II. EXTRAKTION VON GESAMTPROTEINEN, GESAMTANTIGENEN UND AN USM/RB4 BINDENDEN ALLERGENEN DURCH WASSER UND 0,35 M NATRIUMCHLORID-LÖSUNG.
Antigene und Allergene wurden mit einem kompetitiven Enzymverknüpften Immunadsorptionstest (ELISA) getestet. Im Gesamtantigentest wurden in Kaninchen gegen Latexhandschuhe erzeugte Antikörper verwendet. Die Prozentangaben wurden durch Gleichsetzen der mit Natriumchlorid-Elution erhaltenen Werte als 100 % berechnet.
BEISPIEL
Dies ist ein Beispiel eines erfindungsgemäßen Tests, in welchem gegen spezifische allergene Proteine erzeugte monoklonale Antikörper verwendet werden, um den Gehalt dieser Antigene in aus Latex hergestellten Produkten (Handschuhe) zu bestimmen.
Wie vorstehend erwähnt, wurden bisher aus im Handel erhältlichen Latexhandschuhen eluierte Proteine als Proteinantigen-Komponente in Immuntests zur Diagnose der Latexallergie oder zur Quantifizierung von Latexallergenen verwendet. Ein schwerwiegender Nachteil dieser Vorgehensweise besteht darin, dass unterschiedliche Handschuhmarken qualitative und quantitative Unterschiede hinsichtlich ihrer Allergenzusammensetzung zeigen, was anhand der in 17 und der nachstehenden Tabelle III dargestellten Feststellungen beobachtet werden kann. USM/RB3 und USM/RB4 sind erfindungsgemäße monoklonale Antikörper. TABELLE III. IN HANDSCHUHPROBEN GEFUNDENE ALLERGENE KORRELIEREN NICHT MIT DER GESAMPROTEINKONZENTRATION.
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Claims

Allergenes Protein aus dem Latex oder Gewebe von Hevea brasiliensis, das mit Hev b IV bezeichnet wird, dadurch gekennzeichet, dass es in im Wesentlichen gereinigter Form, oligomer vorliegt und aus drei Hauptspezies monomerer Polypeptide mit den Molekulargewichten 50, 55 und 57 kDa, die durch Disulfid-Brücken zu Dimeren mit Molekulargewichten von etwa 100, 110 und 115 kDa verknüpft sind, besteht, einen pI von 4,5 aufweist und eine N-terminale Aminosäuresequenz ELDEYLFSFGDGLYDAGNA aufweist.
Monoklonaler Antikörper gegen das allergene Protein nach Anspruch 1.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, der gegen das allergene Protein Hev b IV gerichtet ist und von der hinterlegten Hybridom-Zelllinie USM/RB3 hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung des allergenen Proteins nach Anspruch 1, welches dessen Extraktion und Gewinnung aus der/den B-Serum- und/oder C-Serum-Fraktion(en) von natürlichem Latexgummi, das der Hochgeschwindigkeitszentrifugation unterworfen wurde, umfasst.
Testkit zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung des in Latexkonzentrat, gefertigten Latexprodukten oder aus trockenem Gummi hergestellten Produkten vorliegenden Allergengehalts von natürlichem Latexgummi, dadurch gekennzeichnet, dass es das allergene Protein nach Anspruch 1 und den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 oder 3 umfasst.
Testkit zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung des Gehalts von in Blut, Blutserum oder Blutprodukten vorliegenden Antikörpern (IgE) gegen allergene Proteine von natürlichem Latexgummi, dadurch gekennzeichnet, dass es das allergene Protein nach Anspruch 1 und den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 oder 3 umfasst.
Testkit nach Anspruch 6 in Form eines diagnostischen In-Vitro-Tests für die Typ-I-Hypersensibilität gegenüber natürlichem Latexgummi.
Testkit nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das allergene Protein und/oder der monoklonale Antikörper mit Biotin markiert ist/sind.
Allergenes Protein nach Anspruch 1 zur Verwendung als Desensibilisierungsmittel bei der Behandlung von Latexproteinallergie.
Verfahren zur Beseitigung oder Verminderung des Gehalts von allergenen Proteinen in gefertigten Latexprodukten, welches das Waschen oder Extrahieren des Produkts mit einer Salzlösung oder einer anderen Lösung, deren Ionenstärke größer als diejenige von Wasser ist, umfasst, um selektiv das allergene Protein nach Anspruch 1 aus dem Latexprodukt zu entfernen.