EP0868433A1 - Identifizierung von antigenen aus post-infektiösen nematoden zur entwicklung neuer anthelmintika und vakzinen - Google Patents

Identifizierung von antigenen aus post-infektiösen nematoden zur entwicklung neuer anthelmintika und vakzinen

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EP0868433A1
EP0868433A1 EP96938168A EP96938168A EP0868433A1 EP 0868433 A1 EP0868433 A1 EP 0868433A1 EP 96938168 A EP96938168 A EP 96938168A EP 96938168 A EP96938168 A EP 96938168A EP 0868433 A1 EP0868433 A1 EP 0868433A1
Authority
EP
European Patent Office
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antigens
larvae
stage
nematodes
nematode
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96938168A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Achim Harder
Michael Londershausen
Wilhelm Friedrich Eisenbeiss
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Bayer AG
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Bayer AG
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG, Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Bayer AG
Publication of EP0868433A1 publication Critical patent/EP0868433A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
    • C07K14/4354—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from nematodes
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the invention relates to the isolation and characterization of antigens from nematodes in a substantially pure form, which react immunologically with protective antisera, and a method for obtaining these antigens. Furthermore, the present invention relates to the use of these antigens for the development of new anthelmintics and vaccines
  • Parasitic nematodes which can affect human and animal lymphatic vessels and tissues, cause chronic diseases.
  • Human pathogenic nematode species occur in tropical regions, where the WHO estimates that there are more than 100 million infected people.Nematode diseases in farm animals and pets occur throughout World and cause high economic damage and costs
  • a protective antiserum can be isolated from immunized host animals which is directed against antigenic substances which are secreted between the L3 and L4 stages during molting. However, this secretion takes place only for a very short period and in very small amounts, so that isolation of the antigens in a pure form is not possible.
  • the present invention thus relates to isolated antigens from nematodes in a substantially pure form, which react immunologically with a protective antiserum which is directed against nematode larvae at the molting stage from L3 to L4, the antigens being converted by in vitro
  • protective antiserum in the sense of the present application means that the serum is obtained from animals whose immune system can completely eliminate a new infection due to a corresponding pre-immunization.
  • antigens which react immunologically with protective antisera can be isolated from a large number of nematode species, in particular from filaria species, for example from free-living nematode species, such as Caenorhabditis elegans, or parasitic nematodes, such as, for example, Acanthocheilonema viteae, Monanemaia martini and Dirof ⁇ lar immitis,
  • Protective antisera are available from host animals which are exposed to a primary infection with live nematode larvae before the L3 / L4 skin stage, and which are at least partially inhibited in their development by a second exposure infection with nematode larvae of the same species or a different species.
  • Protective antisera from the Gerbils gerbil M unguiculatus, the African striped mouse Lemniscomys striatus or other natural hosts from nematodes are preferably used for primary infection.
  • the interval between the administration of the larvae and the number of larvae can vary depending on the nematode species Immunization of M unguiculatus can, for example, live infectious L3 larvae of the nematode species A viteae 3 times at 3-day intervals and in one
  • protective antisera can also be obtained by immunization with living L4 A vitaea larvae, with living in vitro cultivated L3 / L4 or L4 A vitaea larvae, with living in vitro cultivated "exsheathed" L3 H contortus
  • Larvae are obtained with living in vitro cultivated L3 (80% Lethargus) C elegans larvae
  • a protective antiserum obtained from the natural host of the Fila ⁇ e A viteae, the Meriones unguiculatus shows an immunological cross-reactivity against antigens from the nematode species M martini, L. sigmodontis, D. immitis, H. contortus and even the free-living nematode species C. elegans.
  • the antigens according to the invention are preferably polypeptides, which can optionally be glycosylated. Different antigens are secreted, which can be separated according to their molecular weight and obtained in isolated form. The amount of antigens obtained is easily sufficient for a partial determination of the amino acid sequence. Based on this information, recombinant DNA techniques can then also be used to isolate DNA molecules that code for the respective antigens. After isolation of the coding DNA sequences, the antigens according to the invention can also be obtained by recombinant
  • Suitable host cells e.g. Bacteria, yeast or insect cell culture lines, or with transgenic C. elegans.
  • antigens are antigens which are obtainable from A. viteae and have molecular weights of approximately 4, 14, 18, 25, 29-30, 40, 44, 52, 56, 60, 66 or 68 kD after sieve gel chromatography, or are thus immunologically cross-reactive Antigens. Also preferred are antigens which are obtainable from A viteae and have molecular weights of about 17, 40, 52, 56, 60, 63, 67, 90, 94, 1 16, 180, 212, 400 or 800 kD according to SDS-PAGE, or thus immunologically cross-reacting antigens. Immunologically cross-reacting antigens, for example, have already been found in D. immitis, M. martini, L. sigmodontis,
  • H. contortus or C. elegans can be detected
  • antigens which are obtainable from C elegans and have molecular weights of about 14, 16, 26, 28, 30, 46, 49, 58 and 66 kD according to sieve gel chromatography, or antigens which are obtainable from C. elegans and molecular weights of 46, 60, 97, 109, 212 or 400 kD according to SDS
  • PAGE exhibit, or thus immunologically cross-reactive antigens. Immunologically cross-reacting antigens have already been detected in A. vitaea, for example.
  • Antigens which have a molecular weight of approximately 60 kD and are particularly preferred
  • (b) have an N-terminal amino acid sequence which is at least 80% and in particular at least 90% homologous to the sequence from (a).
  • antigens can have serine / threonine protein kinase activity.
  • Another object of the present invention is a method for obtaining antigens from nematodes which react immunologically with a protective antiserum which is directed against nematode larvae at the molting stage from L3 to L4, larvae of nematodes at the L4 stage cultured in vitro, the culture supernatant separated and the antigens isolated from the culture supernatant.
  • the isolation preferably comprises a sieve gel chromatography step.
  • the use of A. viteae larvae at the stage 13 days after infection is preferred.
  • suitable larval stages in which the production of the antigens according to the invention takes place can be identified in a simple manner by determining the immunological activity
  • Yet another object of the present invention is a pharmaceutical composition which comprises one or more of the aforementioned antigens as an active ingredient and, optionally, pharmaceutically customary additives, carriers and auxiliaries.
  • Composition can be used for diagnosis, prevention and therapy of nematode infections.
  • the present invention thus also relates to a method for immunizing against a nematode infection, in which one or more of the aforementioned antigens are administered in pharmaceutically acceptable form.
  • the administration is preferably in a parenteral or oral formulation in a dose between 0.5 and 250 mg / kg, particularly preferably between 10 and 100 mg / kg on 1 to 4 consecutive days. Single administration is particularly preferred.
  • the invention thus also relates to a pharmaceutical composition which contains attenuated larvae of parasitic nematodes in the L4 stage as an active ingredient and, if appropriate, pharmaceutically customary additives, auxiliaries and carriers.
  • the attenuated larvae and a pharmaceutical composition containing them can be used for the prevention and therapy of nematode infections, optionally in combination with one or more of the aforementioned antigens.
  • Gerbils (M unguiculatus) were subjected to a primary infection by subcutaneous administration of 10 - 20 live infectious larvae of A viteae at intervals of three days. Serum was taken 25 days after the initial infection
  • the antisera obtained in this way recognize nematode antigens which are secreted from L3 to L4 during the skin stage Example 2
  • viteae larvae were isolated from M unguiculatus as described in Eisenbeiss, J Parasitol 77 (1991) 580-586. For this purpose, the bodies of infected and then killed gerbils in
  • RPMI1640 medium added and chopped. The larvae were isolated from the tissue fractions and stored in RPMI
  • Larvae at different stages of maturity were isolated, namely larvae in the L3 stage (0-6 days p i), larvae in the skin stage from L3 to L4 (6-7 days p i) and larvae in the L4 stage (more than 8 days p I)
  • the larvae were cultivated in vitro at a concentration of 500-1000 larvae / ml culture medium RPMI 1640 at 37 ° C. and 5% CO 2
  • antigens could be detected in the supernatant of the culture medium from 13-day-old larvae (L4 stage) in a high yield, namely with a cultivation period of 0-2, 2-4, 4-6 and 6-8 days
  • the antigens were detected by an ELISA as follows. 96-well microtiter plates were incubated with 100 ⁇ l of crude culture medium from 1000 larvae / ml overnight at 4 ° C. Three different dilutions of the crude culture medium, namely 1 10, 1 100 and 1 1000, were used in
  • Elution buffer (0.1 M K-phosphate buffer pH 7.0), used All wells were blocked with 150 ⁇ l 3% bovine serum albumin (RSA), 10% milk powder and 0.05% Tween 20 in elution buffer.
  • RSA bovine serum albumin
  • Rabbit anti-M was used as the second antibody.
  • a total of 12 fractions could be separated from the collected culture supernatants from larvae cultured in vitro using an FPLC gel filtration method. Of these, seven fractions were of particular interest because they either appeared to be dominant and / or were recognized as antigens by antibodies from the serum of 100% immune-protected animals. The separation was carried out using a Superdex 75 HR 10/30 gel filtration column in 0.5 ml fractions. Elution was carried out with a 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0. The immunologically relevant fractions were determined by means of ELISA with sera from protected animals.
  • Example 5 A culture medium isolated as a control for the FPLC column was free of protein components.
  • Proteins in the FPLC fractions obtained in Example 4 were concentrated in bands via SDS-PAGE and then transferred electrophoretically to a support membrane
  • Protein-containing FPLC fractions were then selected for the protein sequence analysis.
  • the individual fractions contained approx. 7 pmol protein in 400 ⁇ l elution buffer
  • the selected fractions were transferred in a concentrated form to PVDF membranes using a suction device with which large application volumes can be filtered through small membrane areas.
  • the filters were washed in water and stored in an argon atmosphere until protein sequencing
  • Xaa means any amino acid
  • the identified sequence region does not start with a methionine, although the native protein has been sequenced N-terminally. As a result, the protein probably originally had a leader sequence.
  • Gerbils (unguiculatus) were immunized with 15-20 mL3 larvae of the nematode species Monanema martini and Litomosoides sigmodontis. This immunization resulted in significant protection against subsequent stress infections with A. viteae.
  • Cross immunization against A viteae can be achieved in the gerbil M unguiculatus.
  • C elegans larvae in the L3 / L4 stage (L3 / S0% lethargus larvae), which had preferably been incubated in vitro beforehand for 1.5 to 3 hours, were used to immunize M. unguiculatus used against a subsequent infection of A viteae
  • the 60 kD antigen is expressed by adult C. elegans worms and molting C. elegans L3 larvae.
  • the other antigens are also expressed by adult C. elegans worms and by mL3 larvae and are immunologically cross-reactive with corresponding antigens which are expressed by 13-day-old L4-A. viteae larvae.
  • antigens with molecular weights of approx. 14, 16, 26, 28, 30, 46, 49, 58 and 66 kD could be identified by sieve gel chromatographic analysis of the culture supernatants.

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Abstract

Die Erfindung betrifft isolierte Antigene aus Nematoden in einer im wesentlichen reinen Form, die immunologisch mit einem protektiven Antiserum reagieren, das gegen Nematodenlarven im Stadium der Häutung von L3 zu L4 gerichtet ist, wobei die Antigene durch in vitro-Kultivierung von Nematodenlarven im L4-Stadium und Gewinnung aus dem Kulturüberstand erhältlich sind. Weiterhin wird ein Verfahren zur Gewinnung dieser Antigene und deren Verwendung zur Entwicklung neuer Anthelmintika und Vakzinen beschrieben.

Description

Identifizierung von Antigenen aus post-infektiösen Nematoden zur Entwicklung neuer Anthelmintika und Vakzinen
Die Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung von Antigenen aus Nematoden in einer im wesentlichen reinen Form, die immunologisch mit protektiven Antiseren reagieren, sowie ein Verfahren zur Gewinnung dieser Antigene Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Antigene zur Entwicklung neuer Anthelmintika und Vakzine
Parasitare Nematoden, die lymphatische Gefäße und Gewebe von Mensch und Tier befallen können, verursachen chronische Erkrankungen Humane pathogene Nematodenspezies kommen in tropischen Regionen vor, wo es nach Schätzungen der WHO mehr als 100 Mio infizierte Menschen gibt Nematodenerkrankungen bei landwirtschaftlichen Nutztieren und Haustieren kommen auf der gesamten Welt vor und verursachen hohe wirtschaftliche Schaden und Kosten
Handelsübliche Anthelmintika sind in der Lage, befallene Menschen und Tiere von ihren parasitären Nematoden zu kurieren, vorausgesetzt, die Nematoden haben noch keine Resistenz gegen diese Mittel entwickelt Bei prophylaktischer Gabe wurde die Entwicklung von Resistenzen bereits beobachtet Es besteht daher kein großes Bedürfnis nach der Entwicklung neuer Anthelmintika, die nicht resistenzbrechend sind
Auch eine passive protektive Immunitat durch Verabreichung von Antikörpern gegen Oberflächenstrukturen von Nematoden kann nicht ohne weiteres erreicht werden
So existieren mehrere Veroffentlichungen, in denen Mißerfolge bei der Verwen¬ dung monoklonaler Antikörper oder polyklonaler Antiseren zur passiven Immunisierung gegen Filaπeninfektionen beschrieben sind (Abraham et al (1988) J Parasitol 74 275 - 282, Vickery et al (1983) J Parasitol 69 478 - 485 sowie Tanner und Weiss (1979) Tropenmedizin und Parasitologie, 30 371 - 375) beschneben sind Eine passive Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern kann sogar zur Erhöhung der Parasitenlast fuhren (Janecharut et al (1991) Parasitology Research, 77 668 - 674) Eisenbeiss et al (J. Immunol. 152 (1994), 735-742) beschreiben, daß die wiederholte Gabe einer geringen Anzahl von Larven der parasitären Filarie A. viteae bei Wüstenrennmäusen (M. unguiculatus) eine signifikante Verringerung in der gesamten Wurmbelastung hervorruft. Diese partielle protektive Immunität scheint mit Antigenen gekoppelt zu sein, die von den post-infektiösen Larven im
L3/L4-Häutungsstadium sekretiert werden. Bei inaktivierten Larven im L3-Stadium oder lebenden Larven im L4-Stadium wurde keine derartige Wirkung festgestellt.
Aus immunisierten Wirtstieren kann ein protektives Antiserum isoliert werden, das gegen antigene Substanzen gerichtet ist, die während der Häutung zwischen dem L3- und dem L4-Stadium sekretiert werden. Diese Sekretion findet jedoch nur während eines sehr kurzen Zeitraums und in sehr geringen Mengen statt, so daß eine Isolierung der Antigene in einer reinen Form nicht möglich ist.
Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, daß die Häutungsantigene, die während des Übergangs vom L3- zum L4-Stadium sekretiert werden, in einer wesentlich größeren Menge von in vitro kultivierten Nematodenlarven im L4-
Stadium produziert werden. Die Menge der auf diese Weise erzeugten Antigene ist so groß, daß eine Isolierung mit Hilfe üblicher Techniken ohne weiteres möglich ist. Weiterhin wurde überraschend festgestellt, daß die auf diese Weise isolierten Antigene in ihren immunologischen Eigenschaften nicht spezies-spezifisch sind, sondern daß eine speziesübergreifende Kreuzreaktion zwischen verschiedenen
Antiseren und verschiedenen Nematodenspezies gefunden wird.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit isolierte Antigene aus Nematoden in einer im wesentlichen reinen Form, die immunologisch mit einem protektiven Antiserum reagieren, das gegen Nematodenlarven im Stadium der Häutung von L3 zu L4 gerichtet ist, wobei die Antigene durch in vitro-
Kultivierung von Nematodenlarven im L4-Stadium und Gewinnung aus dem Kulturüberstand erhältlich sind.
Die Angabe "protektives Antiserum" im Sinne der vorliegenden Anmeldung be¬ deutet, daß das Serum aus Tieren gewonnen wird, deren Immunsystem aufgrund einer entsprechenden Vorimmunisierung eine Neuinfektion vollständig eliminieren kann. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß immunologisch mit protektiven Antiseren reagierende Antigene aus einer Vielzahl von Nematodenspezies, ins¬ besondere aus Filarienspezies, isoliert werden können, z B aus freilebenden Nematodenspezies, wie Caenorhabditis elegans, oder parasitären Nematoden, wie etwa Acanthocheilonema viteae, Monanema martini, Dirofϊlaria immitis,
Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Loa loa, Onchocerca volvulus, Onchocerca ochengi, Dracunculus medinensis, Litomosoides sigmodontis, Haemonchus contortus, Trichinella spiralis oder Trichuris muris, stammen
Protektive Antiseren sind erhältlich aus Wirtstieren, die einer Primarinfektion mit lebenden Nematodenlarven vor dem L3/L4-Hautungsstadium ausgesetzt werden, und die bei einer zweiten Belastungsinfektion mit Nematodenlarven der gleichen Spezies oder einer unterschiedlichen Spezies, deren Entwicklung mindestens teilweise hemmen Vorzugsweise können protektive Antiseren aus der Wusten- rennmaus M unguiculatus, der afrikanischen Streifenmaus Lemniscomys striatus oder anderen naturlichen Wirten von Nematoden gewonnen werden Zur Primar¬ infektion wird vorzugsweise eine wiederholte Gabe einer genngen Anzahl von Nematodenlarven eingesetzt, wobei der Abstand der Larvenverabreichung und die Larvenanzahl je nach Nematodenspezies variieren können Bei der Immunisierung von M unguiculatus können beispielsweise lebende infektiöse L3-Larven der Nematodenspezies A viteae 3 mal im Abstand von jeweils 3 Tagen und in einer
Anzahl von 5-10 Larven verabreicht werden, um eine gute Immunisierung zu erzielen
Weiterhin können protektive Antiseren auch durch Voπmmunisierung mit lebenden L4 A vitaea Larven, mit lebenden in vitro kultivierten L3/L4 bzw L4 A vitaea Larven, mit lebenden in vitro kultivierten "exsheathed" L3 H contortus
Larven umd mit lebenden in vitro kultivierten L3 (80 % Lethargus) C elegans Larven erhalten werden
Mit dem auf diese Weise gewonnenen protektiven Antiserum können nicht nur Antigene der zur Immunisierung verwendeten Nematodenspezies, sondern auch Antigene anderer Nematodenspezies nachgewiesen und isoliert werden
So zeigt beispielsweise ein aus dem naturlichen Wirt der Filaπe A viteae, der Wustenmaus Meriones unguiculatus, gewonnenes protektives Antiserum eine immunologische Kreuzreaktivitat gegen Antigene aus den Nematodenspezies M martini, L. sigmodontis, D. immitis, H. contortus und sogar der freilebenden Nematodenspezies C. elegans.
Die erfindungsgemäßen Antigene sind vorzugsweise Polypeptide, die gegebenen¬ falls glykolysiert sein können. Es werden unterschiedliche Antigene sekretiert, die nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und in isolierter Form gewonnen werden können. Die Menge der gewonnenen Antigene reicht ohne weiteres für eine Teilbestimmung der Aminosäuresequenz aus. Auf Basis dieser Information können dann mittels rekombinanter DNA-Techniken auch DNA-Moleküle isoliert werden, die für die jeweiligen Antigene kodieren. Nach Isolierung der kodierenden DNA- Sequenzen können die erfindungsgemäßen Antigene auch durch rekombinante
Methoden in geeigneten Wirtszellen, z.B. Bakterien, Hefen oder Insektenzell- kulturlinien, oder mit transgenen C. elegans produziert werden.
Bevorzugte Antigene sind Antigene, die aus A. viteae erhältlich sind und Molekulargewichte von etwa 4, 14, 18, 25, 29-30, 40, 44, 52, 56, 60, 66 oder 68 kD nach Siebgelchromatographie aufweisen, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene. Weiterhin bevorzugt sind Antigene, die aus A viteae erhältlich sind und Molekulargewichte von etwa 17, 40, 52, 56, 60, 63, 67, 90, 94, 1 16, 180, 212, 400 oder 800 kD nach SDS-PAGE aufweisen, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene. Immunologisch kreuzreagierende Antigene konnten beispielsweise schon in D. immitis, M. martini, L. sigmodontis,
H. contortus oder C. elegans nachgewiesen werden
Ebenfalls bevorzugt sind Antigene, die aus C elegans erhältlich sind und Molekulargewichte von etwa 14, 16, 26, 28, 30, 46, 49, 58 und 66 kD nach Siebgelchromatographie aufweisen, oder Antigene, die aus C. elegans erhältlich sind und Molekulargewichte von 46, 60, 97, 109, 212 oder 400 kD nach SDS-
PAGE aufweisen, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene. Immunologisch kreuzreagierende Antigene konnten beispielsweise schon in A. vitaea nachgewiesen werden.
Besonders bevorzugt sind Antigene, die ein Molekulargewicht von ca. 60 kD und
(a) eine N-terminale Aminosäuresequenz
Xaa-Thr-(Val, Leu)-Lys-Glu- (Glu, Leu)-Ile-Ala-(Phe, Val)-Leu- (Phe, Leu)-Xaa-Leu-Leu-Gly- wobei Xaa eine beliebige Aminosäure bedeutet, oder
(b) eine zur Sequenz aus (a) zu mindestens 80 % und insbesondere mindestens 90 % homologe N-terminale Aminosäuresequenz auf- weisen.
Diese Antigene können eine Serin/Threonin-Proteinkinase-Aktivität aufweisen.
Im Zusammenhang mit den obengenannten Molekulargewichten mit der erfin¬ dungsgemäßen Antigene ist anzumerken, daß die Zahlenwerte nur ungefähre Werte sind und daher als Zahlenbereich von + 10 % und vorzugsweise + 5 % djes jeweils angegebenen Werts zu verstehen sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Ge¬ winnung von Antigenen aus Nematoden, die immunologisch mit einem protektiven Antiserum reagieren, das gegen Nematodenlarven im Stadium der Häutung von L3 zu L4 gerichtet sind, wobei man Larven von Nematoden im L4-Stadium in vitro kultiviert, den Kulturüberstand abtrennt und die Antigene aus dem Kultur¬ überstand isoliert. Vorzugsweise umfaßt die Isolierung einen Siebgelchromato¬ graphieschritt. Weiterhin ist die Verwendung von A. viteae-Larven im Stadium 13 Tage post infectionen bevorzugt. Bei anderen Organismen lassen sich geeignete Larvenstadien, in denen die Produktion der erfindungsgemäßen Antigene stattfin- det, auf einfache Weise durch Bestimmung der immunologischen Aktivität aus
Überständen von in vitro kultivierten Larven ermitteln.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharma¬ zeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere der zuvor genannten Antigene als Wirkstoff sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Zusatz-, Träger- und Hilfsstoffe umfaßt. Die Antigene oder eine diese enthaltende pharmazeutische
Zusammensetzung kann zu Diagnostik, Prävention und Therapie von Nematoden- infektionen verwendet werden. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Immunisierung gegen eine Nematodeninfektion, bei dem man ein oder mehrere der zuvor genannten Antigene in pharmazeutisch verträglicher Form verabreicht. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer parenteralen oder oralen Formulierung in einer Dosis zwischen 0,5 und 250 mg/kg, besonders bevorzugt zwischen 10 und 100 mg/kg an 1 bis 4 aufeinanderfolgenden Tagen. Besonders bevorzugt ist eine einmalige Verabreichung.
Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine Verabreichung von attenuierten Larven parasitärer Nematoden im L4-Stadium, vorzugsweise von mindestens 2 Tage in vitro kultivierten Nematodenlarven, zu einer sterilen
Immunität führt. Die attenuierten Larven können sich nach der in vitro- Kultivierung im Körper nicht mehr weiterentwickeln, führen aber zu einem wirksamen Schutz gegen nachfolgende Infektionen mit Nematoden. Auf diese Weise wird erstmals eine sterile Immunität gegen Filarienlarven erreicht. Die Erfindung betrifft somit auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die attenuierte Larven parasitärer Nematoden im L4-Stadium als Wirkstoff sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Zusatz-, Hilfs- und Trägerstoffe enthalt.
Die attenuierten Larven sowie eine diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung können zur Prävention und Therapie von Nematodeninfektionen eingesetzt werden, gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren der zuvor genannten Antigene.
Weiterhin soll die Anmeldung durch die folgenden Beispiele erläutert werden.
Beispiel 1
Gewinnung von protektiven Antiseren aus Meriones unguiculatus
Wustenrennmause (M unguiculatus) wurden einer primären Infektion durch subkutane Verabreichung von jeweils 10 - 20 lebenden infektiösen Larven von A viteae im Abstand von jeweils drei Tagen unterzogen Die Serumentnahme erfolgte 25 Tage nach der Erstinfektion
ln den infizierten Tieren wurden protektive Antikörper gebildet, die einen Schutz gegen nachfolgende Sekundarinfektionen mit A viteae-Larven verliehen Diese Prozedur ist detailliert bei Eisenbeiss et al (J Immunol 152 (1994), , 735-742) beschrieben Auf analoge Weise konnten protektive Antiseren auch durch
Verwendung von lebenden L4-Larven sowie von in vitro kultivierten L3/L4- und L4-Larven von A viteae erhalten werden
Auch durch 3 subkutane Infektionen mit je 1000 lebenden "exsheathed" H contortus L3 + 6 + 7 Larven ("exsheathed" L3 werden für 6 Tage in vitro kultiviert, das Medium verworfen und in fnschem Medium für weitere 7 Tage inkubiert) in Abstanden von jeweils 3 Tagen und Entnahme des Serums 25 Tage nach der Erstinfektion konnten protektive Antiseren aus M unguiculatus gewonnen werden
Weiterhin konnten durch 3 subkutane Infektionen mit je 1000 lebenden C elegans L3 80 % Lethargus + 3 Stunden (L3-Larven-populatιonen, die sich zu 80 % in der
Lethargusphase vor ihrer Häutung zu L4 befinden, werden für 3 h in vitro kultiviert) in Abstanden von jeweils 14 Tagen und Entnahme des Serums 46 Tage nach der Erstinfektion protektive Antiseren aus M unguiculatus gewonnen werden
Die auf diese Weise gewonnenen Antiseren erkennen Nematodenantigene, die wahrend des Hautungsstadiums von L3 zu L4 sekreüert werden Beispiel 2
In vitro-Kultivierung von Nematodenlarven
Die Isolierung von A viteae-Larven aus M unguiculatus erfolgte wie bei Eisenbeiss, J Parasitol 77 (1991) 580-586, beschrieben Hierzu wurden die Korper von infizierten und anschließend getöteten Wüstenrennmäusen in
RPMI1640-Medium gegeben und zerkleinert Die Larven wurden aus den Gewebefraktionen isoliert und in RPMI aufbewahrt
Es wurden Larven in unterschiedlichen Reifestadien isoliert und zwar Larven im L3 -Stadium (0-6 Tage p i ), Larven im Hautungsstadium von L3 zu L4 (6-7 Tage p i ) und Larven im L4-Stadium (mehr als 8 Tage p I )
Die in vitro-Kultivierung der Larven erfolgte in einer Konzentration von 500-1000 Larven/ml Kulturmedium RPMI 1640 bei 37°C und 5% CO2
Beispiel 3
Gewinnung von Antigenen aus dem Überstand von Kulturmedien
Im überstand des Kulturmediums von 13 Tage alten Larven (L4-Stadιum) konnten überraschenderweise Antigene in hoher Ausbeute nachgewiesen werden und zwar bei einer Kultivierungsdauer von 0-2, 2-4, 4-6 und 6-8 Tagen
1 1 bzw 17 Tage alte Larven im L4-Stadιum zeigten hingegen keinerlei Sekretion von Antigenen 14 Tage alte L4-Larven und 6-7 Tage alte mL3 -Larven zeigten eine schwache Sekretion von Antigenen in Mengen, die für eine Isolierung zu gering waren
Der Nachweis der Antigene erfolgte durch einen ELISA wie folgt Mikro- titerplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 100 μl Rohkulturmedium von 1000 Larven/ml über Nacht bei 4°C inkubiert Dabei wurden drei verschiedene Verdünnungen des Rohkulturmediums, namiich 1 10, 1 100 und 1 1000 in
Elutionspuffer (0,1 M K-Phosphatpuffer pH 7,0), eingesetzt Alle Vertiefungen wurden mit 150 μl 3% Rinderserumalbumin (RSA), 10% Milchpulver und 0,05% Tween 20 in Elutionspuffer blockiert Als erster Antikörper wurde protektives anti- mL3-Antiserum aus M. unguiculatus, dessen Gewinnung in Beispiel 1 beschrieben ist, 1 :400 verdünnt, in Elutionspuffer mit 1% RSA und 0,05% Tween 20 eingesetzt. Als zweiter Antikörper diente Kaninchen-Anti-M. unguiculatus- Immunglobulin IgG, 1 : 1500 verdünnt, und als dritter Antikörper ein Konjugat von Peroxidase und Anti-Kaninchen IgG aus Ziege, 1:2000 verdünnt. Zwischen den
Antikörperzugaben wurde jeweils dreimal mit 100 μl Elutionspuffer + 0,05% Tween 20 gewaschen. Zuletzt wurde als Chromogen o-Phenylendiamin (0,4 mg/ml in 200 mM Phosphatpuffer pH 5,0) und 0,05% H2O2 zugegeben und die Farbreaktion nach einer Minute mit 10 μl 11 M H2S04 gestoppt.
Bei diesen Testbedingungen konnten immunreaktive Antigene bereits bei einer Verdünnung des Rohkulturmediums von 1 : 100 nachgewiesen werden.
Beispiel 4
Gewinnung der sekretierten Antigene
Aus den gesammelten Kulturüberständen von in vitro kultivierten Larven konnten über eine FPLC-Gelfiltrationsmethode insgesamt 12 Fraktionen aufgetrennt werden. Davon waren sieben Fraktionen von besonderem Interesse, weil sie entweder dominant auftraten und/oder als Antigen von Antikörpern aus dem Serum von zu 100% immun geschützten Tieren erkannt wurden. Die Auftrennung erfolgte über eine Superdex 75 HR 10/30 Gelfiltrationssäule in 0,5 ml Fraktionen. Eluiert wurde mit einem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0. Die immunologisch relevanten Fraktionen wurden mittels ELISA mit Seren aus geschützten Tieren bestimmt.
Es waren immunologisch reaktive Komponenten mit 68 kD, 66 kD, 60 kD, 56 kD, 52 kD, 44 kD, 40 kD, 29-30 kD, 25 kD, 18 kD, 14 kD und < 4 kD zu erkennen Am stärksten waren die Peaks für die Komponenten mit Molekulargewichten
< 4 kD und 60 kD. Ein zur Kontrolle für die FPLC-Säule isoliertes Kulturmedium war frei von Proteinkomponenten. Beispiel 5
Aufbereitung von Proteinproben für die Aminosaureanalyse
Proteine in den in Beispiel 4 gewonnenen FPLC-Fraktionen wurden über SDS- PAGE in Banden konzentriert und anschließend elektrophoretisch auf eine Tragermembran transferiert
Vorexperimente mit Proben aus rohen (unfraktionierten) Kulturuberstanden von 13 Tage alten L4-Larven ergaben 14 Proteinbanden mit einer Molekulargewichtsver¬ teilung im Bereich von 800, 400, 212, 180, 1 16, 94, 90, 67, 63, 60, 56, 52, 40 und 17 kD
Die resultierenden Proteinbanden wurden auf eine Nitrocellulose-membran mit
0,1 μm Porengroße elektrophoretisch transfenert Eine anschließende "Western- Analyse" mit protektivem M unguiculatus-Antiserum, Kaninchen-Anti-M unguiculatus Immunglobulin IgG und Peroxidase-markiertem Anti-Kaninchen IgG sowie einem geeigneten Chromophor lieferte die immunologisch relevanten Proteinbanden
Proteinhaltige FPLC-Fraktionen wurden anschließend für die Pröteinsequenz- analyse ausgewählt Die einzelnen Fraktionen enthielten ca 7 pmol Protein in 400 μl Elutionspuffer
Die ausgewählten Fraktionen wurden mit einer Absaugvorπchtung, mit der große Auftragsvolumina durch kleine Membranflachen gefiltert werden können, in konzentrierter Form auf PVDF -Membranen transferiert Die Filter wurden in Wasser gewaschen und in Argonatmosphare bis zur Proteinsequenzierung aufbewahrt
Eine Sequenzierung des Antigens ergab folgende n-terminale Aminosaureteil- sequenz
Xaa-Thr-(Val, Leu)-Lys-Glu-(Glu, Leu)-Ile-Ala-(Phe, Val)-Leu-(Phe, Leu)-Xaa-
Leu-Leu-Gly- wobei Xaa eine beliebige Aminosäure bedeutet Der identifizierte Sequenzbereich beginnt nicht mit einem Methionin, obwohl das native Protein N-terminal ansequenziert wurde. Folglich besaß das Protein vermutlich ursprünglich eine Leadersequenz.
Beispiel 6
Immunisierungsexperimente
Überstände des Kulturmediums von 13 Tage alten L4-Larven (800 μl Überstand von 48 Larven als Immunisierungsdosen) zeigten einen wirksamen Schutz von M. unguiculatus gegen nachfolgende Belastungsinfektionen.
Immunisierungsdosen von 36-48 in vitro kultivierten Larven pro Inokulation ergaben einen Schutz gegen eine nachfolgende Belastungsinfektion von 80-100%. Interessanterweise überlebten keine der mindestens zwei Tage in vitro kultivierten L4-Larven im Wirt. Hierbei handelt es sich um eine "sterile Immunität", die erstmals gegen eine Filariose beobachtet wurde.
Beispiel 7
Identifizierung immunreaktiver Komponenten in anderen Nematoden
7.1. Wustenrennmause (M. unguiculatus) wurden mit jeweils 15-20 mL3-Larven der Nematodenspezies Monanema martini und Litomosoides sigmodontis immunisiert. Diese Immunisierung ergab signifikanten Schutz gegen nach¬ folgende Belastungsinfektionen mit A. viteae.
Gleichermaßen ergab eine Immunisierung von afrikanischen Streifenmäusen
(Lemniscomys striatus) mit mL3-Larven von A. viteae einen signifikanten Schutz gegen nachfolgende Belastungsinfektionen mit M. martini.
Die den vorimmunisierten Tieren bei der Belastungsinfektion verabreichten Larven wurden völlig inaktiviert oder in ihrer Entwicklung stark behindert. Die Reaktion der Wirtstiere gegen heterologe Spezies war sogar noch stärker als gegen homologe Spezies. 7.2 Auf analoge Weise konnte bei einer primären Infektion von M unguiculatus mit den Nematodenspezies Haemonchus contortus und Dirofilaria immitis Schutz gegen eine nachfolgende Belastungsinfektion mit A viteae erzielt werden
7 3 Auch mit freilebenden Nematoden, wie Caenorhabditis elegans kann eine
Kreuzimmunisierung gegen A viteae in der Wüstenrennmaus M unguiculatus erzielt werden Hierzu wurden C elegans Larven im L3/L4- Stadium (L3/S0% Letharguslarven), die vorzugsweise zuvor 1,5 bis 3 Std in vitro inkubiert worden waren, zur Immunisierung von M. unguiculatus gegen eine nachfolgende Infektion von A viteae eingesetzt Eine
Verbesserung des Immunschutzes wurde durch eine Verlängerung der Zeiträume zwischen den Immunisierungsdosen, z B Verabreichung an den Tagen 0,30 und 73, erzielt
Beispiel 8
Immunologischer Nachweis von Antigenen aus anderen Nematodenspezies
8.1 Seren von M unguiculatus, die mit mL3-Larven der Nematodenspezies M martini, L sigmodontis und H contortus immunisiert worden waren und geringe Ruckfindungsraten von A viteae nach einer Belastungsinfektion aufwiesen, zei gten i m ELISA (B ei spi el 3 ) hohe sp ezifi sch e Kreuzreaktivitaten gegen Antigene aus A viteae Vergleichbar mit dem als
Positivkontrolle verwendeten homologen Antiserum reagierten sowohl das Anti-L sigmodontis-Serum sowie das Anti-C elegans-Serum Auch die Anti-M martini und Anti H contortus-Seren erkannten Antigene im Kulturmedium von 13 Tage alten L4-A viteae-Larven
8.2 Von hautenden L3-Larven der Nematodenspezies C elegans (L3 80 %
Lethargus + 1,5 bzw 3 Stunden in vitro Kultivierung) sekretierte Antigene wurden von protektiven Antiseren erkannt, die aus M unguiculatus gewonnen wurden, die zuvor mit A viteae, M martini und L sigmodontis immunisiert wurden
Eine Western-Blot- Analyse der C elegans- Antigene ergab Banden von ca
46 kD, 60 kD, 97 kD, 109 kD, 212 kD und 400 kD (SDS-PAGE). Das 60 kD-Antigen wird von adulten C. elegans-Würmern sowie von häutenden C. elegans L3-Larven exprimiert. Auch die anderen Antigene werden von adulten C. elegans- Würmern sowie von mL3-Larven exprimiert und sind immunologisch kreuzreagierend mit entsprechenden Antigenen, die von 13 Tage alten L4- A. viteae-Larven exprimiert werden. Weiterhin konnten durch siebgel- chromatographische Analyse der Kulturüberstände Antigene mit Mole¬ kulargewichten von ca. 14, 16, 26, 28, 30, 46, 49, 58 und 66 kD identifiziert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Isolierte Antigene aus Nematoden in einer im wesentlichen reinen Form, die immunologisch mit einem protektiven Antiserum reagieren, das gegen Nematodenlarven im Stadium der Häutung von L3 zu L4 gerichtet ist, wobei die Antigene durch in vitro-Kultivierung von Nematodenlarven im
L4-Stadium und Gewinnung aus dem Kulturüberstand erhältlich sind.
2. Antigene nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus frei¬ lebenden Nematoden stammen.
3. Antigene nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Caenorhabditis elegans stammen
4. Antigene nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus parasitären Nematoden stammen.
5. Antigene nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Acanthocheilonema viteae, Monanema martini, Dirofilaria immitis, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Loa loa, Onchocerca volvulus,
Onchocerca ochengi, Dracunculus medinensis, Litomosoides sigmodontis, Haemonchus contortus, Trichinella spiralis oder Trichuris muris stammen.
6. Antigene nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß sie Molekuralgewichte von etwa 4, 14, 18, 25, 29-30, 40, 44, 52, 56, 60, 66 oder 68 kD nach Siebgelchromatographie aufweisen und aus A. viteae erhältlich sind, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene.
7. Antigene nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß sie Molekulargewichte von etwa 800, 400, 212, 180, 1 16, 94, 90, 67, 63, 60, 56, 52, 40 oder 17 nach SDS-PAGE aufweisen und aus A. viteae erhältlich sind, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene.
8. Antigene nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus D. immitis, M. martini, L. sigmodontis, H. contortus oder C. elegans stammen.
9. Antigene nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß sie Molekulargewichte von etwa 14, 16, 26, 28, 30, 46, 49, 58 und 66 kD nach Siebgelchromatographie aufweisen und aus C. elegans erhältlich sind, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene.
10. Antigene nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß
Molekulargewichte von etwa 46, 60, 97, 109, 212 oder 400 kD nach SDS- PAGE aufweisen und aus C. elegans erhältlich sind oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene.
11. Antigene nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht von etwa 60 kD und
(a) eine N-terminale Aminosäuresequenz Xaa-Thr-(Val, Leu)-Lys-Glu-
(Glu, Leu)-Ile-Ala-(Phe, Val)-Leu- (Phe, Leu)-Xaa-Leu-Leu-Gly- wobei Xaa eine beliebige Aminosäure bedeutet, oder
(b) eine zur Sequenz aus (a) zu mindestens 80 % homologe N-terminale Aminosäuresequenz aufweisen.
12. Antigene nach einem der Ansprüche 5-1 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Serin/Threonin-Proteinkinase-Aktivität aufweisen.
13. Verfahren zur Gewinnung von Antigenen nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Larven von Nematoden im L4-Stadium in vitro kultiviert, den Kulturüberstand abtrennt und die Antigene aus dem Kulturüberstand isoliert.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung einen Siebgelchromatographieschnitt umfaßt.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Larven von A. vitaea im Stadium 13 Tage post infectionem verwendet. 16 Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Antigene nach einem der Ansprüche 1-12 als Wirkstoff sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Zusatz-, Trager- und Hilfsstoffe umfaßt
17 Verwendung von Antigenen nach einem der Ansprüche 1 -12 zur
Diagnostik, Prävention und Therapie von Nematodeninfektionen
18 Verfahren zur Immunisierung gegen eine Nematodeninfektion, dadurch gekennzeicnnet, daß man ein oder mehrere Antigene nach einem der Ansprüche 1-12 in pharmazeutisch vertraglicher Form verabreicht
19 Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie attenuierte Larven parasitärer Nematoden im L4-Stadium als Wirkstoff sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Zusatz-, Hilfs- und Trager¬ stoffe enthalt
20 Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die attenuierten Larven mindestens 2 Tage einer in vitro Kultivierung unterzogen worden sind
21 Verwendung von attenuierten Larven parasitärer Nematoden im L4-Stadium zur Prävention und Therapie von Nematodeninfektionen
22 Verwendung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die attenuierten Larven mindestens 2 Tage einer in vitro Kultivierung unter¬ zogen worden sind
23 Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 in Kombination mit einem oder mehreren Antigenen nach einem der Ansprüche 1-12
24 Verfahren zur Immunisierung gegen eine Nematodeninfektion, dadurch gekennzeichnet, daß man attenuierte Larven parasitärer Nematoden in pharmazeutisch vertraglicher Form verabreicht Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die attenuierten Larven mindestens 2 Tage einer in vitro Kultivierung unterzogen worden sind
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Verabreichung in Kombination mit einem oder mehreren Antigenen nach einem der Ansprache 1-12 erfolgt
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