DD283331A5

DD283331A5 - Verfahren zur herstellung eines impfstoffes zum schutz von gefluegel vor escherichia coli-septikaemie

Info

Publication number: DD283331A5
Application number: DD88321101A
Authority: DD
Inventors: Johannes F Van Den Bosch
Original assignee: ��@�K@�Kk��
Priority date: 1987-10-26
Filing date: 1988-10-26
Publication date: 1990-10-10
Also published as: NZ226677A; IE60324B1; CN1033008A; DK593488A; JP2718523B2; ES2042718T3; DE3871489D1; PT88850B; US5593679A; JPH01149734A; HUT48122A; AU610940B2; DK593488D0; CA1331445C; EP0314224A1; IE883130L; KR890006253A; ZA887694B; KR970005333B1; DK175528B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutz von Gefluegel vor E. coli-Septikaemie. Erfindungsgemaesz enthaelt das Vakzin Fimbriae des F11-Typs oder einen immunogenen Abschnitt davon oder Organismen, die genetisches Material haben, welches die Produktion und, wahlweise, die Exkretion dieser Fimbriae oder deren immunogenen Abschnitte kodiert. Als immunogenen Abschnitt enthaelt das Vakzin ein immunogenes Polypeptid mit einer Aminosaeurefolge, welches einem Abschnitt der Aminosaeurefolge des F11-Fimbriaeuntereinheitsproteins entspricht und gegebenenfalls auch ein Adjuvans.{Fimbriae F11-Typ; Grundlage fuer Produktion Vakzin; Anwendung; Mittel zum Schutz vor E. coli-Sepsis bei Gefluegel}

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Vakzin zum Schutz von Geflügel vor Sepsis durch Escherichia coli (E. coli) sowie ein Verfahren zur Bekämpfung von E.coli-Sepsis bei Geflügel durch Verabreichung eines solchen Vakzins.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die E.coli-Sepsis oder Colibazillose ist eine Krankheit, die im allgemeinen bei Geflügel auftritt (wie Hühnern und Truthühnern) und erhebliche Verluste verursacht. Charakteristische Symptome sind bei Vögeln mit dieser Erkrankung die Entzündung des Luftsacks, Perikarditis und Perihepatitis. Die meisten Untersuchungen auf diesem Gebiet zeigen, daß mehr als die Hälfte der E.coli-Stämme, die in diesen kranken Vögeln gefunden werden, zu einem der drei Serotypen 01 :K1,02:K1 oder O78:K80 gehören. In den Vereinigten Staaten findet man häufig auch den Serotyp 035. Es wird im allgemeinen angenommen, Jaß die E. coli-Sepsis eine Sekundärinfektion ist, die üb6r den Atemweg in den Körper gelangt, nachdem ersterer geschädigt w.irde, beispielsweise durch Viren, die Erkrankungen der Atemwege verursachen, odar durch Mykoplasmen. Wenig ist über die Virulenzfaktoren bekannt, die bei der Pathogenese von Colioazillose bei Geflügel eine Rolle spielen. 2u den Virulenzfaktoren der E.coli-Stämme, die bei Infektionen von Säugetieren eine Rolle spielen, gehören beispielsweise Anhangfimbriae, Toxine und Eisensequestrationsmechanismen.

Es wurden viele verschiedene Anhangfimbriae, die im allgemeinen sehr wirtsspezifisch sind, beschrieben. So wurden die CFA-Fimbriae bei Menschen mit Diarrhöe festgestellt. Festgestellt wurden K88-Fimbriae bei Ferkeln mit Diarrhöe, K99 bei Schafen, Kälbern und Ferkeln mit Diarrhöe und P-Fimbriae (einschließlich der dos F11 -Typs) bei Menschen mit Infektionen der Harnwege. Außerdem wurde festgestellt, daß die Verabreichung der genannten Typen von Anhangfimbriae in gereinigter Form als Vakzin zu einer Schutzimmunreaktion bei dem entsprechenden Tiertyp führte. Für Geflügel wurde jedoch kein ähnlicher Virulenzfaktor identifiziert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen Vakzins, das eine Schutzimmunreaktion gegen E.coli-Sepsis bei Geflügel hervorruft.

-2- 283 Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Virulenzfaktor für Geflügel aufzufinden.

Es wurde nun ein Vakzin zum Schutz von Geflügel vor E.coli-Sepsis gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es Fimbriae des F11 -Typs oder einen immonogenen Abschnitt davon oder Organismen enthält, die genetisches Material aufweisen, welches die Produktion und wahlweise die Exkretion dieser Fimbrise oder deren immunogenen Abschnitts kodiert.

Erfindungsgemäß enthält das Vakzim als immunogenen Abschnitt ein immunogenes Polypeptid mit einer Aminosäurefolge, welches einem Abschnitt der Aminosäurefolge des F11 -Fimbriaeuntereinheitsproteins entspricht sowie ein Adjuvans.

Insbesondere war es durch Untersuchungen möglich zu zeigen, daß die E.coli-Stämme, die aus den angegriffenen Herzen von Hühnern mit Kolibazillosis isoliert worden waren, Fimbriae produzierten, die mit den Fimbriae des F11-Typs ider ;ch waren, die auch in E.coli-Stämmen auftreten, die zu Harnweginfektion.η beim Menschen führen.

Es wur möglich, serologisch nachzuweisen, daß die übergroße Mehrheit der Vögel mit einer E.coli-Sepsis durch E.coli-Stämme infiziert waren, die Fimbriae des F11-Typs enthalten.

Diese Fimbriae enthalten Untereinheitsproteine mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 18,OkD nach SDS-PAGE.

Sie können durch-Wilformen von Vogel-Ε. coli-Stämmen produziert werden, die bei 37⁰C auf festen Agar-Medien gezogen wurden, werden aber nicht nachgewiesen, wenn die E.coli in Brühe gezogen werden. Die optimale Expression der 18 kD-Fimbriae erfolgt, wenn die Bakterien auf Blut-Agar-Platten (Base) beispielsweise des Fabrikats Oxoid® gezogen werden. Geeignete Medien sind auch Penassay-Agar-Platten (Difco®). Beim Wachstum bei 20⁰C werden keine 18kD-Firnbriae gebildet.

In der Vergangenheit wurden F11 -Fimbriae bereits aus einer Wildform des uropathogenen E.coli-Stamms kloniert (de Ree, J. M.

u.a., FEMS Microbiology Lett. 29,91-97 [1985)). Der fimbriaefreie E.coli-Stamm K12 AM 1727 wird durch das Plasmid pPIL 291-15 transformiert, welches die Gene enthält, die die F11-Fimbriae kodieren, und dieser transformierte Stamm kann F11-Fimbriae produzieren. Diese F11-Fimbriae wurden nun mit den 18kD-Fimbriae verglichen, die aus dem E.coli-Stamm CH4 gereinigt wurden, der zum O2:K 1 :H-Serotyp gehört, der häufig bei Vögeln auftritt. Dieser Vergleich erfolgte bei den nachstehend genannten Parametern:

a. Morphologie: Die Fimbriae F11 und 18kD scheinen im Elektronenmikroskop identisch zu sein: in beiden Fällen sind die Fimbriae etwa 1 \xm lang und haben einen Durchmesser von etwa 7 nm;

b. Molekulargewicht: Ein scheinbares Molekulargewicht von 18kD wurde für die Untereinheiten sowohl der F11- als auch der 18kD-Fimbriae anhand von SDS-PAGE ermittelt;

c. Imiuunochemlsche Spezifizltät: Bei ELISA reagieren die F11- und die 18kD-Fimbriae identisch mit den

anti-F 11 -monoklonalen Antikörpern, die von de Ree, J. M. u. a., J. Clin. Microbiol. 24,121-125; 1986; beschrieben wurden, und nicht mit monoklonalen Antikörpern gegen Fimbriae der Typen F1 A, F1C, F7, F7₂, F8, F9, F12 oder F13;

d. Aminosäurezusammensetzung: Die Zusammensetzung der Aminosäure der 18kD-Untereinheit ist im wesentlichen identisch mit der Zusammensetzung der F11-Untereinheit (van Die, I. u.a., in: D.L. Lark [Hrsg.], Proteinkarbohydrate interactions in biological systems [Proteinkohlehydratwechselwirkungen in biologischen Systemen), Acadmic Press, London, S.39-46, 1986) (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1 Vergleich der AmlnosSurezusammensetzung von Untereinheiten der F11- und 18kD-Fimbriae

Aminosäure	F11
Asx	18
Thr	14
Ser	12
GIx	17
GIy	20
AIa	19
VaI	13
Me	6
Leu	10
Tyr	3
Phe	8
Lys	11
Arg	0
His	1
Met	1
Cys	2
Pro	6

18kD²¹

18,6

15,3

11,0

16,5

19,6

20,2

12,2

5,8

10,3

2,2

7,7

10,1

0,9

1,4

6,6

Total 161 161

1 Berechnet auf der Grundlage der Sequenz (siehe Abb. 1).

2 Bestimmt durch das SODIUM-System unter Verwendung eine' Ulirapac8-Kolonne (LKB) nach der Hydrolyse in 6N HCI.

e. Aminoterminalamlnosäurefolge: Die Sequenz der ersten 17 Aminosäuren des Aminoendes der 18kD-Untereinheit ist identisch mit der entsprechenden Sequonz, die für die F11-Untereinheit bekannt ist (van Die, I. u. a., 1986). - Abb. 1 zeigt die Aminosäurefolge des gesamten F11-Untereinheitsproteins. Aus der Sequenz kann ein tatsächliches Molekulargewicht von 16,4 kD berechnet werden.

Die Adhäsionseigenschaften der P-Fimbriae können wie F11 durch mannoseresistente Hämagglutination von menschlichen Erythrozyten (MRHA) sichtbar gemacht werden. Diese MRHA können nachgewiesen werden, nachdem E. coli-Bakterien, welche die genannten P-Fimbriae expressieren, in ausreichenden Mengen mit menschlichen Erythrozyten bei Vorhandensein von Mannose gemischt worden sind.

Als Minimalrezeptorstruktur, die für die Haftung der P-Fimbriae an den menschlichen Erythrozyten angemessen ist, wurde das Disaccharid GaIaI ->4Gelß identifiziert (Källunius, G. u.a., Lancet II, 604-606,1981). Die Kopplung dieses Disaccharids mit Latexteilchen ergibt ein Werkzeug zum spezifischen Nachweis von p-Fimbriae auf Bakterien durch Latexagglutination (de Man, P. u. a., J. Clin. Microbiool. 25,401-406,1987).

In jüngster Zeit wurde gezeigt, daß nicht die F11-Firrbriae selbst, sondern spezielle Adhäsine (auch als „kleinere Komponenten" bezeichnet), die den Fimbriae zugeordnet sind, für die Haftung verantwortlich sind (van Die, I. u.a., Microbiol. Pathogenesis, 1, 51-56,1986).

Tabelle2 zeigt den Zusammenhang zwischen der Expression von F11 -Fimbriae und den Haftungseigenschaften eines uropathogenen E.coli-Stammes, eines F11-Fimbriae erzeugenden Rekombinantklons und einer Reihe von E.coli-Stämmen, die aus angegriffenen Herzen von Hühnern isoliert wurden, welche an Coiibazillose leiden. Diese werden verglichen. Aus der Tabelle kann geschlußfolgert werden, daß die F11-Fimbriae der E.coli, die aus den Hühnern isoliert werden, wenigstens denselben Rezeptor wie die F11-Fimbriae der menschlichen E.coli erkennen.

Tabelle 2 Expression von F11-F!mbrlae, Hämagglutlnatton und P-Rezeptorerkennung Stamm-Nummer¹'¹ Expression der F11-Fimbriae, Adhäsion, gemessen in

(Serotyp) gemessen in

ELISA^(b) Western- MRHA- P-Rezep- Transfer"¹ Test^ld) tortest"¹

H291(O1:K1)	-15	>4,7
AM 1727	(O78:K80)	-
AM1727/pPIL291	(O2:K1)	>4,7
CH₂	(02:K1)	3,0
CH 4	(O1:K1)	>4,7
CH 5	(O15:K14)	2,7
CH6	(O78:K80)	4,7
CH7	(C2:K1)	-
CH 96	3,2
CH139	4,7

(a) H291 ist der menschliche E. coli, F11-Referenzstamm C1976; AM 1727/pPIL 291-15 ist ein F11-fimbraeerzeugendes Rekombinantklon des fimbriaefreien K12-Stammes AM 1727;

CH-Nummern sind E. coli-Stämme, die aus Hühnern isoliert wurden, welche an Coiibazillose leiden.

(b) ELISA-Test mit ganzen Bakterien mit Anti-F 11 -Serum; ^lolog-Titere, definiert als die höchste Serumverdünnung mit einem A₅₁₀-WeIi von wenigstens dem Doppelten des Hintergrundwertes.

(c) „Western'-Transfer des Fimbriae-Rohpräparates mit Anti-F 11-Serum.

(d) Mannoseresistente Hämagglutination mit menschlichen Erythrozyten.

(e) Agglutination von Latexteilchen, die mit Gala 1 -»4Galß überzogen sind

Bedeutung der Symbole:

-: keine Reaktivität bei den obengenannten Versuchen

+ bis einschließlich + + + + : ansteigende Grade von Reaktivität bei den oben genannten Versuchen.

Das Vakzin nach der Erfindung kann, zusammen mit den oder anstelle der F11 -Fimbriae, auch immunogene Abschnitte der F11-Fimbriae enthalten. Unter solchen immunogenen Abschnitten kann man beispielsweise die 18kD-Untereinheiten, deren Zusammenballungen oder Fragmente oder für F11-Fimbriae charakteristische Adhäsine oder deren Zusammenballungen oder Fragmente verstehen. Ein solches Fragment einer 1JkD-Untereinheit oder eines F11-Adhäsins des genannten Typs kann ein Polypeptid sein, das ein oder mehrere Epitope enthält, die Schutzantikörper gegen E.coli des F11-Typs in Geflügel stimulieren können.

Geeignete Polypeptide der 18kD-Untereinheiten oder F11-Adhäsine können beispielsweise mittels dor bekannten Techniken gewonnen werden. Eine solche Technik wurde von T. P. Hopp und K. R. Woods (Prediction of protein antiyenic determinants from amino acid sequences [Vorhersage der proteinantigenen Determinanten aus Aminosäurefolgen], Proc. Natl. Acad. Sei. 78, 3824-3828,1981) beschrieben, bei welcher die mittlere Hydrophilizität von aufeinanderfolgenden Segmenten der Aminosäurekette bestimmt wird. Die Ergebnisse einer solchen Bestimmung werden in der Abb. 2 gezeigt. In dieser Abbildung wird das Hydrophilizitätsprofil der F11 -Untereinheit auf der Grundlage der bekannten Aminosäurefolge dargestellt. Das hier dargestellte Profil zeigt den progressiven, bewerteten Mittelwert der Hydrophilizität über jeweils 7 Aminosäuren. Die Bereiche mit der am stärksten ausgeprägten Hydrophilizität werden als die Bereiche betrachtet, die vermutlich antigene Determinanten darstellen. In der Abb. 2 sind diese Bereiche durch schwarze Blöcke gekennzeichnet, und sie entsprechen den folgenden Aminosäuresegmenten:

24-33 Ile-Ser-Gln-Lys-Ser-Ala-Asp-Gln-Ser-Ile

45-57 Ala-Gly-Gly-Thr-Ser-Lys-Pro-Met-Asp-Leu-Asp-Ile-Glu

67-78 Lys-Gln-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Asn-Gly-Lys-Val-Gln

87-95 Thr-Gly-Gln-Ala-Glu-Glu-Leu-Ala-Thr 123-130PrO-LeU-LyS-ASp-GIy-ASp-ASn-VaI 136-142 Leu-Val-Lys-Lys-Ala-Asn-Gly.

Es kann erwartet werden, daß sich die antigenen Determinanten der 18kD-Untereinheiten der F11-Fimbriae auch in diesen Bereichen befinden. Zu ähnlichen Schlußfolgerungen gelangten I. van Die, W.Hoekstra und H.Bergmans (Microbiol.

Pathogenesis 3,149-154,1987) unter Anwendung desselben Modells für die F11 -Fimbriae.

Geeignete immunochemisch aktive Polypeptidfragmente von 18kD-Untereinheiten oder F11-Adhäsinen können auch mittels der Methode gefunden werden, die in der Patentanmeldung WO 84/03506 beschrieben wird - der sogenannten Pep-Scan-Methode, bei der eine Reihe von sich partiell überlagernden Polypeptiden, die den partiellen Sequenzen des entsprechenden Proteins entsprechen, synthetisiert und ihre Reaktivität mit den Antikörpern untersucht werden.

Um den immunogenen Charakter zu verstärken, kann ein solches Polypeptidfragment wahlweise an einen Träger gebunden werden.

F11-Fimbriae oder deren immunogone Abschnitte können auch ausgehend von Zellen erzeugt werden, die mit Rekombinant-DNA transformiert wurden, welche das genetische Material enthält, das die Produktion und wahlweise die Exkretion von F11-Fimbriae oder deren immunogenen Sektionen kodiert.

Außerdem ist es auch möglich, besonders bei kleineren Polypeptidfragmenten, sie vollständig synthetisch herzustellen, beispielsweise nach der Merrifield-Methode, welche mit einer festen Phase arbeitet.

Das Vakzin nach der Erfindung kann auch einen Organismus enthalten, in welchem sich genetisches Material befindet, welches die Produktion und/oder Sekretion von F-Fimbriae oder deren immunogenen Abschnitten kodiert.

Dazu verwendet man vorzugsweise apathogene Organismen.

Diese Organismen sind auf Grund ihres Charakters in der Lage, dieses antigene Material zu produzieren, oder sie haben ein Rekombinantpolynukleotid, das die Kodierung für das gewünschte antigene Material vornimmt.

Viren oder Bakterien können, unter anderen, verwendet werden als Rekombinantorganismen. Diese Rekombinantorganismen können selbst in der Lage sein, das gewünschte antigene Material zu produzieren und wahlweise zu exkretieren.

Das Vakzin nach der Erfindung wird vorzugsweise parenteral, beispielsweise subkutan oder intramuskulär, verabreicht. Das Vakzin kann auf diese Weise sowohl zur aktiven Immunisierung von vakzinierten Vögeln als auch an legende Vögel zur passiven Immunisierung verabreicht werden. Bei immunisierten Legevögeln werden die in diesen entwickelten Antikörper natürlich in das Eigelb von ihren Eiern eingeführt und damit anschließend in die ausgebrüteten Küken.

Das Vakzin nach der Erfindung kann auch oral, intranasal oder durch Inhalieren eines Aerosols verabreicht werden - in diesem Fall kann das Vakzin vorzugsweise lebende apathogene Organismen enthalten, die das genetische Material aufweisen, welches die Produktion und Exkretion der F11 -Fimbriae oder deren immunogener Abschnitte kodiert.

Ein Vakzin nach der Erfindung kann so hergestellt werden, daß zuerst die Proteine oder die davon abgeleiteten Polypeptide bereitgestellt werden oder die F11 -Fimbriae oder Mikroorganismen, welche diese F11 -Fimbrioe, Proteine oder Polypeptide enthalten, werden wie oben beschrieben hergestellt.

Der letztgenannte Fall, wonach die Fimbriae aus E.coli gewonnen werden, ist das am meisten bevorzugte Ausführungsbeispiel.

Im allgemeinen werden nach der Züchtung der E.coli mit F11-Fimbriae die letzteren von den Bakterien getrennt, beispielsweise durch mechanische Abtrennung (Schneiden) und/oder Erhitzen und Entfernung der Zellen (durch Zentrifugieren und/oder [Ultra-JFiltern). Anschließend können die Fimbriae durch die Beseitigung der Kontaminationen aus dem Kulturmedium und/oder der Bakterienmembran weiter gereinigt werden, z. B. durch Ultrafiltern, Kolonnenchromatrgraphie oder spezifische Ausfällung (unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder anderen Salzen oder durch Änderung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt der Fimbriae).

Zur parenteralen Vakzinierung ist die aktive Komponente im allgemeinen in einer wäßrigen Lösung oder Suspension enthalten, oft mit anderen Bestandteilen vermischt, um die Aktivität oder die Haltbarkeitsdauer zu erhöhen, beispielsweise Salzen, Formalin, pH-Wertpuffern, Emulgiermitteln oder Adjuvantien, um die Immunreaktion zu verbessern. Geeignete Adjuvantien sind beispielsweise Mineralöle, Muramyldipeptid, Aluminiumhydroxid, Saponin, Polyanionen und amphipatische Substanzen.

Sowohl die Zusammensetzung des Vakzins als auch das Vakzinierungssystem können geändert werden und sind vom Typ des zu schützenden Vogels, dem Alter und Gewicht des Vogels, der gewünschten Dauer des Schutzes, der Verabreichungsmethode und der Frage, ob eine aktive Immunisierung oder eine passive Immunisierung durch mütterliche Antikörper gewünscht ist, abhängig. Die effektive Menge der aktiven Komponente im Vakzin beträgt bei parenteraler Vakzinierung etwa 10 bis lOOpg je Dosis.

Die oben beschriebene aktive Immunisierung g^gen E. coli mit F11 -Fimbriae wird hauptsächlich als Schutzbehandlung bei gesunden Vögeln angewendet. Es versteht sich von selbst, daß bereits durch E.coli mit F11-Fimbriae infizierte Vögel mit Antikörpern behandelt werden können, die gegen F11-Fimbriae gerichtet sind, oder mit deren Sektionen oder Zusammenballungen.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wi.-d nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Reinigen der Fimbriae

Um Fimbriae zu reinigen, wurden bei 37°C über Nacht drei Wildtypen von E. coli-Stämmen auf Blut-Agar-Basen-Platten (Oxoid») gezogen. Für diesen Zweck wurden die E. coli-Stämme CH2(O78:K80:H4), CH4(O2:K1 :H-) und CH6(O1 :K1 :H-) verwendet, die aus den befallenen Herzen von Hühnern isoliert wurden, welche an Kolibazillose litten. Außerdem wurde das F11-Fimbriae-Klon AM 1727-pPLI291 -15 (De Ree u.a., 1985) 16 Stunden lang in einem Biostat*-Fermentor (Braun) in einer „Hirn-Herz-Infusions"-Bi ühe gezogen, die 50pg/ml Ampicillin enthielt, bei einer konstanten Temperatur von 37⁰C, einem pH-Wert von 7,4 und einer Sauerstoffsättigung von etwa 40%.

Die Bakterien wurden in einen 1OmM Tris-HCI-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 geerntet.

Die Fimbriae wurden dadurch von den Bakterien freigesetzt, daß entweder die Bakterien 15mal hintereinander eine Minute lang in einem Sorval-Omnimixer auf Eis behandelt wurden; oder die Bakterien 15 Minuten lang auf 65°C erhitzt wurden oder die Bakterien einer Kombination der beiden oben genannten Behandlungen ausgesetzt wurden.

Dann wurden die Bakterien durch Zentrifugieren und Filtern entfernt, die Fimbriae-Rohlösunr wurde konzentriert, und die Fimbriae wurden intensiv in Amicon-Zelle mit einem Filter YM100 gewaschen.

Anschließend wurden die Fimbriae gereinigt, beispielsweise durch eine etwas modifizierte Form der von Korhonen u. a.

beschriebenen Methode (Infect. Immun. 27,568-575,1980), die darin besteht, die Fimbriae mit Ammoniumsulfat auszufüllen, sie mit Natriumdeoxycholat aufzulösen und in einem Sukrosegradienten zu zentrifugieren.

Die auf diese Weise gereinigten Fimbriae-Ausfällungen wiesen im Elektronenmikroskop identische Fimbriastrukturen auf (wie das von Van den Bosch, J. F. u. a., !n'ect. Immun, 29,226-233,1980, beschrieben wurde). Alle Fimbriae-Präpar ate wiesen ein einzelnes Band bei IRkU in der SDS-PAGE-Untersuchung auf (wie das von Lugtenberg, B. u.a., FEBS Lett. 58,254-258,1975, beschrieben wurde), wie auch beim „Western"-Transfer (der von Muilerman, H.G. u. a„ Anal. Biochem. 120,46-51,1982, beschrieben wurde), wobei alle Antiseren gegen die verschiedenen Fimbriae gezogen wurden).

Beispiel 2

A. Ein Vakzin, das Eimbriae nach der Erfindung enthielt, wurde als Wasser-in-ÖI-Emulsion auf der Grundlage von Mineralöl (Paraffin mit niedriger Viskosität) mit Polysobat 80 und Sorbitanmonooleat als Emulgiermitteln hergestellt.

B. Es wurde ein Vakzin wie unter 2A hergestellt, das 50pg je ml F11-Fimbriae enthielt, die aus dem Wildtyp des E.coli-Stamms CH4(O2:K1:H-) gereinigt worden waren.

C. Es wurde ein Vakzin wie unter 2 A hergestellt, das 50μρ je ml F11-Fimbriae enthielt, die aus dem Klon AM 1727-pPIL291-15 gereinigt worden waren. Proben dieses Klons wurden in der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes des Pasteur-Instituts unter der Nr. I-709 am 19. Oktober 1987 in Paris deponiert.

Beispiel 3 Aktive Immunisierung

Für Experimente zur aktiven Immunisierung wurde ein Vakzin wie im Beispiel 2 hergestellt, intramuskulär an die zu untersuchenden Vögel verabreicht und die Entwicklung der spezifischen Antifimbriaeserenantikörpertitere anhand einer

ELISA-Untersuchung bestimmt.

A. ELISA-Untersuchung

Für die ELISA-Untersuchung wurden Mikrotiter-PVC-Platten eine Nacht lang bei Zimmertemperatur mit 100μΙ einer gereinigten Fimbriaelösung inkubiert, die nach Beispiel 1 hergestellt worden war und 2^g Fimbriae je Milliliter von 0,04 M PBS (pH-Wert 7,2) in jeder Vertiefung enthielt.

Dann wurden die Platten durch zwanzigminütiges Inkubieren bei 37°C mit 200 μI einer 5%igen BSA-Lösung in PBS in jeder Vertiefung, Waschen mit Wasser und Trocknen an der Luft behandelt. Die Antifimbriaeseren wurden untersucht, wozu 100 μΙ der Reihenverdünnungen des Serums in einem Puffer (pH-Wert 7,4,0,2 M Na₂HPO₄,0,2 M NaCI, 0,1 % BSA und 0,05% Tween

80) in jeder Vertiefung eine Stunde lang bei 37"C inkubiert wurden.

Nach dem Waschen wurden die Platten 30min mit 100μΙ verdünntem Konjugat (Kaninchen-Antihuhn-lgG/PO [H + L], [Nordic]) in jeder Vertiefung inkubiert und anschließend noch einmal gewaschen.

Die Antikörperaktivität wurde kolorimetrisch durch den Zusatz von 100μΙ einer Enzymsubstratlösung (die 15 ml destilliertes Wasser, 1,5 ml einer 0,14%igen Harnstoffperoxidlösung in Natriumazetat/Zitronensäurepuffer (pH-Wert 5,5) und 0,2 ml einer 0,6%igen TMB-Lösung in DMSO enthielt) zu jeder Vertiefung bestimmt.

Die enzymatische Reaktion wurde im Dunkeln ausgeführt und durch den Zusatz von 50 μΙ von 4 N H₂SO₄ je Vertiefung nach 10 Minuten gestoppt, und anschließend wurde die Absorption bei 450 nm (A₄₅₀) in einem Microelisa®-Gerät (Organon Teknika)

gemessen.

Die erste Serumverdünnung betrug 1:50.

Der Hintergrund wurde bei jeder Platte durch Einbeziehung von Serum gemessen, das vor der Vakzinierung gewonnen und im Verhältnis von 1:50 verdünnt worden war. Das wurde in mindestens 8 Vertiefungen so gemacht. Das Antikörpertiter wurde als die maximale Serumverdünnung definiert, welche einen A₄₅O-WeIi von wenigstens dem 1,15fachen des mittleren Aj₆₀-

Hintergrundes ergab.

B. Vakzinierung von SPF-Mastbroilern

Sechs Wochen alte SPF-Broiler (Gezondheitsdienst voor Pluimvee [Geflügelgesundheitsdienst), Doorn, Niederlande) wurden intramuskulär mit 1 ml des Vakzins aus Beispiel 2 B behandelt. Nach 4 Wochen wurde eine Ergänzungsinjektion unter Verwendung des gleichen Materials gegeben. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Serumantikörperproduktion nach dem Vakzinieren von 6 Wochen alten Broilern; Logarithmen der ELISA-Titere

Huhn Nr. Wochen nach der ersten Injektion

0 2 4» 6 8

1 <1,7

2 <1,7

3 <1,7

4 <1,7

5 <1,7 * Unterstülzungsinjektion

3,2	4,4	4,1	4,7
3,8	4,4	4,1	4,7
3,2	>4,7	4,7	4,7
4,4	>4,7	>4,7	>4,7
4,4	>4,7	>4,7	>4,7

C. Vakzinierung von Brutmasthennen

Zwei Gruppen von jeweils 8 Brutmasthennen im Alter von 20 Wochen (Euribrid, Boxmer, Niederlande) wurden intramuskulär mit 1 ml der Vakzine nach den Beispielen 2B bzw. 2C behandelt. Sechs Wochen nach der ersten Injektion wurde unter Verwendung der jeweils gleichen Vakzine eine Unterstützungsinjektion gegeben.

Wie aus der Tabelle 4 hervorgeht, wurde im Serum der Brutmasthennen eine hohe Antikörperproduktion festgestellt, begleitet von der Übertragung der Antikörper auf das Eigelb und das Serum der ausgebrüteten Küken.

Tabelle 4

Antikörperproduktion nach der Vakzinierung von 20 Wochen alten Hennen; mittlerer Logarithmus der ELISA-Titere (±SD) im Serum der Bruthennen, dem Eigelb und dem Serum der ausgebrüteten Küken

Fimbriae.gerei- Serum der Eigelb²¹ Serum der nigt aus Stamm Brutmast- ausgebrüteten nennen" Küken³¹

CH4(O2:K1:H-) 4,58 ±0,50 5,29 + 0,39 3,98 ±0,27 AM1727-pPIL291-15 5,48 ±0,21 5,14 + 0,47 4,16 ±0,39

1 Serumproben, 10 Wochen nach der ersten Injektion entnommen.

2 Mittel von 8 Eiern, 11 Wochen nach der ersten Injektion.

3 Mittel von 5 eine Woche alten Küken, die aus Eiern ausgebrütet wurden, die 12 Wochen nach der ersten Injektion genommen wurden.

Identische Ergebnisse wurden für die Vakzinierung mit F11-Fimbriae des CH4-Stammes und des Klons AM 1727-pPIL291-15 ermittelt. Bei einer ELISA-Untersuchung wurde eine vollständige Querreaktion zwischen den beiden Präparaten festgestellt.

Beispiel 4 Schutz von Mastbroilern durch Vakzinierung der Bruthennen

Broiler-Bruthennen wurden mit F11-Fimbriae vakziniert, die aus dem Klon AM 1727-pPIL291-15 (siehe Beispiel 3C) gereinigt worden waren.

Broilerküken, die ausgebrütet wurden aus Eiern dieser vakzinierten Bruthennen und aus Eiern vqn nichtvakzinierten Kontrollhennen, würden im Alter von 3 Wochen durch Einspritzen von 0,2 ml von Bakteriensuspensionen in den rechten hinteren thorakalen Luftsacke infiziert. Die verwendeten Bakterienstämme wurden alle von befallenen Herzen von Hühnern mit Kolibazillose isoliert. Die Bakterien wurden über Nacht auf Blut-Agar-Basenplatten (Oxoid®) gezogen, anschließend wurden sie in PBS auf die entsprechende Konzentration zur Suspension gebracht. Die Broilerküken wurden in Isolationskäfigen mit vermindertem Druck bei freier Nahrungs- und Wasserzufuhr untergebracht.

Wie in der Tabelle 5 gezeigt wird, wurde von den vakzinierten Bruthennen ein guter Schutz auf die ausgebrüteten Broilerküken übertragen. Verglichen mit den nichtvakzinierten Kontrollproben betrug der Wirkungsgrad des Schutzes durch Vakzinierung mit F11 -Fimbriae für alle Stämme zusammen 85%.

Es ist überraschend, daß der Schutz auch bei einer Infektion mit Stamm CH7 wirksam wurde, der scheinbar In-vitro keine F11 -Fimbriae expression. Es könnte möglich sein, daß dieser Stamm tatsächlich In-vivo F11 -Fimbriae expressiert, die Invitro-Expression aber unter der Feststellungsgrenze bei den angewendeten Methoden liegt.

Tabelle 5

Schutz von Broilern, die von Bruthennen stammen, welche mit F11 -Fimbriae vakziniert wurden, vor E. coli-lnfektion

Vakzin	CH 2 O78:K80 FlI + (5X10⁶)	CH4 O2:K1 F11 + 2x10«)	CH 5 O2:K1 F11 + (10")	CH 6 O:K1 F11 + (5 X 10")	CH 7 O15:K14 FII- (10^e)	CH 245 O35:K- F11 + (5 X 10")	Alle Stämme
F11 Kontr.	2/10²¹ 6/10	2/10 6/10	1/10 10/10	0/10 5/10	0/10 7/10	1/10 5/10	6/60³¹ 39/60³¹

1) Für jeden Stamm-Serotyp werden F11 -Expression und Infektionsdosis angegeben

2}Anzahl der toten Tiere innerhalb von 7 Tagen nach Infektion/Gesamtinfektion

3)Chi-Quadrat-Test: P < 0,0001.

Beispiel 5 Schutz von Broilern durch passive Immunisierung

Antiseren wurden durch Impfen von Kaninchen mit gereinigten F11-Fimbriae und anschließendes Inaktivieren für die Dauer von 30 min bei 56°C hergestellt.

Es wurde 1 ml dieses unverdünnten F11-Antiserums intravenös in drei Wochen alte Broiler (Euribrid, Boxmer, Niederlande) gespritzt.

Innerhalb von einer Stunde nach der intravenösen Injektion von Antiserum wurden die Küken durch die Injektion von 0,2 Milliliter Bakteriensuspension in den rechten hinteren thorakalen Luftsack infiziert. Zur Kontrolle wurden Küken, denen das Antiserum nicht verabreicht worden war, ebenfalls mit der gleichen Bakteriendosis infiziert. Die verwendeten Bakterienstämme wurden alle aus den Herzen von Hühnern mit Kolibazillose isoliert. Die Bakterien wurden eine Nacht auf Blut-Agar-Basenplatten (Oxid*) gezogen, in PBS zur Suspension gebracht und auf die entsprechende Konzentration verdünnt.

Die Hühner wurden in Isolationskäfigen mit reduziertem Druck bei freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.

Aus diesen Experimenten wurde deutlich, daß das F11-Fimbriae-Antiserum einen guten Schutz vor 5 der 6 E. coli-Stämme, die für die Infektion verwendet wurden (Tabelle 6), bei Broilern bietet. Der Schutz vor einer Infektion mit dem CH6-Stamm war

ziemlich gering, obwohl dieser Stamm F11-Fimbriae erzeugt. Möglicherweise erzeugt dieser Stamm neben den F11-Fimbriae auch einen oder mehrere andere starke Virulenzfaktoren, möglich ist es aber auch, daß der Antikörperpegel einfach zu niedrig war, um einen Schutz vor diesem Bakterienstamm zu bieten.

Ein überraschendes Merkmal besteht darin, daß ein beachtlicher Schutz vor Infektion selbst mit dem CH7-Stamm erreicht wurde, der selbst keine F11-Fimbriae zu erzeugen scheint. Möglicherweise produziert dieser Stamm in vivo tatsächlich F11 -Fimbriae, aber die F11-Fimbriaeproduktion in vitro ist für die angewendete Nachweismethode zu gering.

Tabelle β

Schutz von Broilern vor E. coli-lnfektion durch passive Immunisierung mit F11-Fimbriae-Antiserum Infekiion mit Stamm

Nr.	Serotyp	Dosis	Anti-F11-	Anz.d. toten
			Antiserum	Hühner
			verabreicht	innerh.von
				7Tg. nach
	•			Infektion/
				Total
CH 2	O78:K80:H4:F11 +	5 χ 10⁸	₊	2/17
CH 2		5x10"	_	15/17
CH 5	O2:K1:H7:F11 +	10'	+	0/8
CH 5		10'	_	6/9
CH 6	O1:K1:H—:F11 +	10'	+	13/24
CH 6		10'	—	19/29
CH 7	O15:K14:H10:F11-	2x10'	+	1/8
CH 7		2X10'	—	6/9
CH 245	O35:K-:H?:F11 +	5X10'	+	2/17
CH 245		5x10*	_	11/19

Chi-Quadrat-Test

Abb. 1 -Aminosäurefolge der F1 !-Untereinheit

1 AIa

Pro

Thr

Ne

Pro

GIn

GIy

GIn

GIy

Lys

VaI

Thr

Phe

Asn

GIy

16

Thr

VaI

Asp

AIa

Pro

Cys

Sar

lie

Ser

Gin

Lys

Ser

Ala

Asp

31

GIn

Ser

Ue

Asp

Phe

GIy

GIn

Leu

Ser

Lys

Ser

Phe

Leu

GIu

Ala

46

GIy

Thr

Ser

Lys

Pro

Met

Asp

Leu

Asp

lie

GIu

Leu

VaI

Asn

61

Cys

Asp

He

Thr

AIa

Phe

Lys

Gin

GIy

Gin

Ala

Lys

Asn

GIy

76

Lys OI

VaI

GIn

Leu

Ser

Phe

Thr

GIy

Pro

GIu

VaI

Thr

GIy

Gin

Ala

α I GIu

GIu

Leu

AIa

Thr

Asn

GIy

Thr

GIy

Thr

Ala

He

VaI

106

Gin

AIa

GIy

Lys

Asn

VaI

Ser

Phr

Asp

GIy

Thr

Ala

GIy

Asp

121

Ala

Tyr

Pro

Leu

Lys

Asp

GIy

Asp

Asn

VaI

Leu

His

Tyr

Thr

Ala

136

Leu

VaI

Lys

AIa

Asn

GIy

Thr

VaI

Ser

GIu

GIy

Ala

Phe

151

161

Ser

AIa

VaI

AIa

Thr

Phe

Asn

Leu

Ser

Tyr

Gin

Abb.2

Amino acid index

- Aminosäureindex

Hydrophilicity

- Hydrophilizität

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutz von Geflügel vor Escherichia co!¹ (E. coli)-Septikämie, gekennzeichnet durch

a) die Bereitstellung von E. coli Fimbriae des Typs F11 oder eines immunogenen Abschnitts davon als immunogenes Material oder von Organismen, die genetisches Material haben, das die Pi oduktion und wahlweise die Exkretion dieser Fimbriae oder eines immunogenen Abschnitts davon kodiert,

b) das Vermischen dieses Materials mit einem geeigneten Träger und

c) das wahlweise Mischen mit anderen Bestandteilen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß in Schritt a Fimbriae des Typs F11 Verwendetwerden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, gekennzeichnet dadurch, daß etwa 10 bis 100Mg des immunogenen Materials pro Dosis verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Material in Schritt c mit einem oder mehreren Bestandteilen, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden, vermischt wird:

a) Salze

b) Formalin

c) pH-Puffer

d) Emulgiermittel

e) Zusatzstoffe.

5. Verwendung von Fimbriae des F11 -Typs oder eines immunogenen Abschnitts davon oder von Organismen, die genetisches Material aufweisen, welches die Produktion und wahlweise die Exkretion dieser Fimbriae oder deren immunogenen Abschnitte kodiert, gekennzeichnet dadurch, daß es für die Produktion eines Impfstoffes eingesetzt wird, das beim Schutz von Geflügel vor E.coli-Septikämie wirksam ist.