DE69110997T2 - Haemophilus Paragallinarum-Impfstoffe. - Google Patents
Haemophilus Paragallinarum-Impfstoffe.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff zum Schutz von Geflügel vor Infektion mit Haemophilus paragallinarum, antigenes Material von Haemophilus paragallinarum, Antikörper oder Antiserum spezifisch für besagtes Material und Verfahren zur Herstellung eines Haemophilus paragallinarum-Impfstoffes.
- Haemophilus paragallinarum (H. paragallinarum) verursacht eine Infektion der oberen Atemwege von Hühnern, genannt Infektiöse Coryza (IC). Die wichtigsten Merkmale sind das Betroffensein der Nasengänge und Nasenhöhlen mit einem serösen bis schleimigen nasalen Ausfluss, Gesichtsödeme und Konjunktivitis. Infektionen der unteren Atemwege, z.B. der Luftsäcke und Lungen, können vorkommen. Obwohl die Erkrankungsrate hoch ist, ist die natürliche Sterberate relativ gering. Oft verursacht IC eine erhöhte Ausfallrate, Kleinwuchs und verminderte Eierproduktion, was zu hohen wirtschaftlichen Verlusten führt. Darüberhinaus ist IC üblicherweise schlimmer und dauert länger, was in einer erhöhten Sterberate resultiert, wenn sie durch andere Agentien wie Hühnerpocken, Mycoplasma gallisepticum, infektiöse Bronchitis, Pasteurella und infektiöse Laryngotracheitis kompliziert wird. Vögel, die eine IC überlebt haben, bleiben häufig Ansteckungsherde und halten die Krankheit in der Population.
- Zur Zeit werden für die Impfung gegen IC ganze Bakterien verwendet. Diese Impfstoffe können auflebenden, vorzugsweise abgeschwächten Stämmen, oder inaktivierten virulenten Stämmen basieren. Abgeschwächte Lebendimpfstoffe beinhalten jedoch immer das Risiko der Ansteckung der Tiere mit ungenügend abgeschwächten, krankheitserregenden Bakterien, welche das angesteckte Tier erkranken lassen, und die mögliche Ausbreitung der Krankheit in der Population. Zusätzlich können abgeschwächte Bakterien in einen virulenten Zustand zurückkehren.
- Inaktivierte Impfstoffe können auch weitere Nachteile haben, z.B. die Nebenwirkungen, die auftreten können nach der Verabreichung von ganzen Bakterien als Folge des Vorhandenseins von Zellwand-Stoffen, z.B. Lipopolysacchariden (LPS).
- Drei verschiedene Serotypen von H. paragallinarum können unterschieden werden, nämlich Serotypen A, B oder C. Innerhalb jedes Serotyps existiert eine auf Kreuzschutz basierende Beziehung zwischen den verschiedenen H. paragallinarum-Stämmen. Vögel die mit einem H. paragallinarum-Stamm eines bestimmten Serotyps geimpft sind, sind jedoch nicht vor Infektion durch H. paragallinarum-Stämme der anderen Serotypen geschützt, d.h. Immunität ist typspezifisch. Für einen genügenden Schutz vor IC müssen Vögel daher vorzugsweise mit einem Impfstoff immunisiert werden, der immunogene Stoffe von mehreren H. paragallinarum-Serotypen enthält.
- Ausser den oben geschilderten Nachteilen der auf ganzen Bakterien basierenden H. paragallinarum-Impfstoffe, besteht ein zusätzlicher Nachteil eines solchen Impfstoffes darin, dass besagter Impfstoff, der ganze Bakterien des B- oder C- Serotyps enthält, die geimpften Vögel nur teilweise gegen anschliessende Infektionen mit virulenten Stämmen der Serotypen 3 oder C schützt.
- Ein filamentöses Hämagglutinin des H. paragallinarum- Serotyps A wurde durch Iritani et al. [Am. J. Vet. res., 41 (1980), 2114 und Deutsche Pat. Anm. DE-A-2 906996 (Shionogi & Co., LTD.)] isoliert und charakterisiert. Dieses filamentöse Hämagglutinin hat Schutzwirkung gegen eine Infektion mit H. paragallinarum-Stämmen vom Serotyp A.
- Iritanis Verfahren für die Isolation der schützenden Komponente des H. paragallinarum-Serotyps A, d.h. das Herauslösen der schützenden Aktivität aus der Zelle durch die Anwendung von Trypsin und nachfolgender Isolierung des Trägers besagter schützender Aktivität, ist jedoch auf Serotyp C nicht anwendbar, da in Übereinstimmung mit diesem Isolierungsverfahren keine schützende Komponente aus H. paragallinarum-Stämmen dieses Typs isoliert werden konnte.
- Ein neues Verfahren für die Isolierung einer schützenden Fraktion von H. paragallinarum, die bei allen Serotypen angewendet werden kann, wurde jetzt gefunden.
- Besagtes Verfahren resultiert in einer neuen, gereinigten Membranfraktion von H. paragallinarum-Zellen, ein Protein von 38±3 kd beinhaltend, gemessen in SDS-PAGE (wie hierin beschrieben), welches in hohem Masse vor H. paragallinarum- Infektion bei Geflügel schützend ist und welches im wesentlichen frei von Zellen und filamentösen Stoffen ist.
- Gemäss der vorliegenden Erfindung kann ein Untereinheitsimpfstoff, d.h. ein Impfstoff der nur die zum Schutze nötigen und relevanten Komponenten umfasst, hergestellt werden, der von einer Membranfraktion von H. paragallinarum-Zellen abgeleitet ist, welcher das Protein von etwa 38 kD (38-kD- Protein angereicherte Membranfraktion) umfasst. Hühner, die mit einem solchen Impfstoff immunisiert wurden, sind gegen homologen Challenge mit einem virulenten H. paragallinarum- Stamm gut geschützt.
- Ein noch vollständigerer Schutz kann erreicht werden, wenn Hühnern ein Impfstoff verabreicht wird, der von einer Fraktion der äusseren Membran von H. paragallinarum-Zellen abgeleitet ist, in der ein 38-kD-Äusseres-Membran-Protein (OMP) angereichert ist (38-kD-OMP-Präparat).
- Dieses gereinigte 38-kD-OMP-Präparat ist im wesentlichen frei von Zellen und filamentösen Stoffen.
- Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann weiter dadurch charakterisiert werden, dass die schützende Aktivität
- - empfindlich gegen Hitze,
- - empfindlich auf Trypsin-Behandlung und
- - empfindlich auf Proteinase K-Behandlung ist.
- Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann auch ein Fragment des besagten 38-kD-OMP beinhalten, welches noch immer immunisierende Eigenschaften hat, d.h. ein immunologisches Äquivalent.
- Die mit dem 38-kD-Protein angereicherte Membranfraktion kann durch Kultivieren vom H. paragallinarum-Bakterien in Medium unter Bedingungen erhalten werden, welche die Expression des 38-kD-OMP fördern, Sedimentation der Zellmembran-Fraktion nach Aufbrechen der H. paragallinarum- Zellen, z.B. enzymatisch oder mechanisch (beispielsweise durch Ultraschallbehandeln, Mahlen oder French-Press), wonach die mit 38-kD-Protein angereicherte Membranfraktion isoliert werden kann, z.B. durch Zentrifugation.
- Das 38-kD-OMP-Präparat kann durch Reinigen der oben erwähnten Membranfraktion in innere und äussere Membranen isoliert werden, z.B. durch Dichtegradienten-Sedimentation oder durch differentielles Auflösen der inneren Membran durch Detergenzien wie Triton X-100 oder Sarcosin, gefolgt von Zentrifugation.
- Ein anderes Verfahren zum Isolieren der oben erwähnten Fraktion oder des Präparats kann durch Verwendung von Antiserum (z.B. monoklonale Antikörper) angewendet werden, das für das 38-kD-OMP spezifisch ist. Ein Membranextrakt von H. paragallinarum kann auf ein Säulenmaterial aufgetragen werden, welches das genannte spezifische Antiserum für das 38-kD-OMP enthält, die adsorbierte Fraktion des Extraktes wird von nicht-adsorbierten Stoffen getrennt und die adsorbierte Fraktion wird anschliessend vom Säulenmaterial abgelöst.
- Wenn gewünscht, kann das 38-kD-OMP durch im Stand der Technik bekannte Verfahren bis zur Homogenität gereinigt werden, z.B. durch Solubilisieren des 38-kD-OMP aus genanntem 38-kD-OMP-Präparat durch Extraktion mit einem oder mehreren Detergenzien, gefolgt von weiteren Reinigungsschritten, z.B durch Ionenaustauscher- oder Molekularsieb-Chromatographie, unter Bedingungen, welche die schützenden Eigenschaften des 38-kD-OMP nicht beeinflussen.
- Die gereinigten, mit 38-kD-Protein angereicherten Fraktionen können geeigneterweise aus H. paragallinarum-Stämmen aller zugänglichen Serotypen, z.B. Serotypen A, B und C oder entsprechenden Serotypen, die im Stand der Technik bekannt sind, isoliert werden.
- Das 38-kD-OMP, das in einen der Erfindung gemässen Impfstoff eingebaut werden soll, kann durch chemische Synthese, Reinigung aus H. paragallinarum-Zellen oder durch rekombinante Technologie erhalten werden.
- In letzterem Fall können Nukleinsäuresequenzen, die für das oben erwähnte Protein oder Teile davon kodieren, beispielsweise durch Screening einer genomischen H. paragallinarum DNA-Bank nach einzelnen Klonen identifiziert werden, die besagte Sequenzen beinhalten, z.B. durch Verwendung einer spezifischen Reaktion mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die gegen das 38-kD-OMP hervorgerufen werden. Die Nukleinsäuresequenzen können mit verschiedenen, die Expression beeinflussenden DNA-Sequenzen ligiert werden, in einem sogenannten rekombinanten Nukleinsäuremolekül resultierend, das für die Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet werden kann. Solche hybriden DNA-Moleküle können beispielsweise von Plasmiden oder von in Viren vorkommenden Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sein. Die Wirtszelle kann prokaryontischen Ursprungs, z.B. Bakterien, oder eukaryontischen Ursprungs, z.B. Säugerzellen, sein. Die transformierten Wirtszellen können verwendet werden um das 38-kD-OMP zu produzieren, wonach besagtes Protein oder 38-kD-OMP enthaltendes Material isoliert und nachfolgend in einen der Erfindung gemässen Impfstoff eingebaut werden kann.
- In einer anderen Ausführungsform kann ein Vektor-Lebendimpfstoff hergestellt werden, der nicht-pathogene Mikroorganismen umfasst, z.B. Viren oder Bakterien, die die Nukleinsäuresequenz beinhalten, welche für das 38-kD-OMP oder einen Teil davon kodiert, die in den Mikroorganismus kloniert ist.
- Ein der Erfindung gemässer Impfstoff ist von einer mit 38-kD-Protein angereicherten Membranfraktion oder von einem 38-kD-OMP-Präparat von mindestens einem Serotypen von H. paragallinarum abgeleitet, d.h. Impfstoffe, welche die besagte Fraktion oder Präparation beinhalten oder Impfstoffe, welche immunologische Äquivalente des 38-kD-OMP beinhalten, liegen im Geltungsbereich der Erfindung.
- Überdies kann ein der Erfindung entsprechender Impfstoff in der Form eines rekombinanten DNA-Impfstoffes vorliegen, wie oben ausgeführt.
- Vorzugsweise enthält ein Impfstoff, gemäss der vorliegenden Erfindung, mehr als eine von H. paragallinarum- Stämmen der verschiedenen Serotypen abgeleitete, mit 38-kD- Protein angereicherte Membranfraktion oder 38-kD-OMP-Präparation. Der vollständigste Schutz vor H. paragallinarum-Infektion wird erreicht, wenn Vögeln ein Impstoff verabreicht wird, der besagte Membranfraktionen oder Präparate enthält, die von H. paragallinarum-Stämmen der Serotypen A, B und C abgeleitet wurden. Ein solcher dreiwertiger Impstoff ist die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Ein der Erfindung gemässer dreiwertiger Impfstoff schützt mit diesem Impfstoff geimpfte Vögel vollständig vor Infektion mit H. paragallinarum im Gegensatz zu bisher verwendeten, auf ganzen Bakterien basierenden, Impfstoffen.
- Ausser den H. paragallinarum-Stoffen, welche die schützende Aktivität tragen, kann ein der Erfindung gemässer Impfstoff auch ein wässriges Medium oder eine Wasser enthaltende Suspension beinhalten, oft gemischt mit anderen Inhaltsstoffen, z.B. um die Aktivität zu erhöhen und/ oder die Haltbarkeit zu verlängern. Diese Inhaltstoffe können sein: Salze, pH-Puffer, Stabilisatoren (wie Magermilch oder Casein-Hydrolysat), Emulgatoren, Adjuvantien, um die Immunantwort zu erhöhen (z.B. Mineralöle, Muramyl-Dipeptid, Aluminiumhydroxid, Saponin, Polyanionen und amphipatische Substanzen) und Konservierungsstoffe wie Thimerosal.
- Ein der Erfindung gemässer Impfstoff kann zusätzlich auch von anderen für Geflügel infektiösen Bakterien oder Viren, z.B. Mycoplasma, Newcastle Disease Virus und Infektiöses Bronchitis Virus, abgeleitetes immunogenes Material enthalten.
- Vorzugsweise wird der Impfstoff parenteral verabreicht, beispielsweise subkutan oder intramuskulär. Der Impfstoff kann auf diese Weise sowohl für die aktive Immunisierung der geimpften Vögel als auch, bei legenden Vögeln, für die passive Immunisierung ihrer Nachkommen verabreicht werden. Die in immunisierten legenden Vögeln gezüchteten Antikörper werden natürlich in den Dotter ihrer Eier eingeführt und demzufolge nachher auch in die geschlüpften Küken.
- Sowohl die Zusammensetzung des Impfstoffes als auch das Impfsystem können geändert werden und hängen von der Art des Tieres ab, das geschützt werden soll, von Alter und Gewicht des Tieres, von der gewünschten Dauer des Schutzes, vom Verfahren der Verabreichung und von der Frage, ob aktive Immunisierung oder passive Immunisierung mittels maternaler Antikörper gewünscht wird. Die optimal wirkungsvolle Menge der aktiven Komponente im Impfstoff ist näherungsweise 0,1 - 100 ug pro Dosis für parenterale, d.h. intramuskuläre oder subkutane, Impfung von Geflügel. Die bevorzugteste Dosis ist im Bereich zwischen 0,3 und 1,0 ug Protein.
- Die oben beschriebene aktive Immunisierung gegen H. paragallinarum wird in erster Linie als Schutzbehandlung von gesunden Vögeln angewendet werden. Selbstverständlich können Vögel, die bereits mit H. paragallinarum infiziert sind, mit Antikörpern, die gegen eine der Erfindung entsprechende Membranfraktion oder Präparation gerichtet sind, behandelt werden.
- Gegen eine der Erfindung gemässe Membranfraktion gerichtetes Antiserum kann durch Immunisierung von Vögeln mit einer wirksamen Menge von besagter Fraktion, vorzugsweise in Gegenwart eines Adjuvans, hergestellt werden. Falls erwünscht können die Tiere mit einer zweiten Impfung geboostert werden, um eine entsprechende Immunantwort hervorzurufen. Danach werden die Tiere ausgeblutet und das Antiserum kann hergestellt werden.
- Das Antiserum oder die Antikörper können mit einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz gemischt werden.
- Für die von einem H. paragallinarum-Stamm eines spezifischen Serotyps abgeleitete Membranfraktion spezifisches polyklonales Antiserum kann durch Inkubation des gegen besagte Membranfraktion hervorgerufenen Antiserums mit einem Gemisch aus Membranfraktionen von H. paragallinarum-Stämmen der anderen Serotypen hergestellt werden. Antikörper, die für die besagte H. paragallinarum-Membranfraktion nicht spezifisch sind, werden an die zugegebenen H. paragallinarum-Fraktionen adsorbieren und können so vom Inkubationsgemisch abgetrennt werden, woraus ein für eine H. paragallinarum-Membranfraktion eines bestimmten Serotyps spezifisches Antiserum-Präparat resultiert.
- Gegen eine der Erfindung gemässe Membranfraktion oder Präparation gerichtete monoklonale Antikörper können auch für die passive Immunisierung von mit H. paragallinarum infizierten Vögeln verwendet werden. Besagte monoklonale Antikörper können mittels im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Immunisierung von Mäusen mit einer der Erfindung gemässen Membranfraktion, Immortalisierung von Mäuse-Milz-Zellen und Selektion von Hybridoma-Zellen, die verwendbare Antikörper produzieren.
- Oben erwähnte Antiseren und monoklonale Antikörper können auch für die immunologische Diagnose von mit H. paragallinarum Bakterien infizierten Vögeln verwendet werden.
- Bakterienstämme wurden auf Schokolade-Agar ausgestrichen, 24 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre, in der eine Kerze verbrannt wurde, bebrütet und danach in mit 0,01% NADH supplementiertem TPB kultiviert.
- 230 ml einer konzentrierten H-18 (Serotyp C) Zellsuspension (4 x 10¹&sup0; Zellen pro ml 40 mM PBS + 0,01% Thimerosal enthaltend) wurden 6 Minuten bei 4ºC und 100 Watt in einem Branson-B12-Sonifier ultraschallbehandelt (30 Sekunden Ultraschallbehandlung wurden mit 30 Sekunden Kühlen abgewechselt). Danach wurden nicht-aufgebrochene Zellen abzentrifugiert (10 Minuten, 5000 x g) und 20 ml des Überstandes wurden in Mineralöl Wasser-in-Öl Adjuvans (W/O) emulgiert. Dieser Impfstoff heisst SUP-USO (C) . Die verbleibenden 210 ml Überstand wurden eine Stunde bei 167 000 x g in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert um die ganze Membranfraktion von der löslichen Fraktion zu trennen. Das Membranpellet (bräunliche Farbe) wurde in 60 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 resuspendiert. 10 ml dieser Suspension wurden dreifach mit dem gleichen Puffer verdünnt und in W/O-Adjuvans emulgiert.
- Dieser Impfstoff heisst 38-kD-Protein angereicherte Membranfraktion (C) . Die verbleibenden 50 ml der Suspension wurden 1:1 mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 + 2% Natrium-N-Lauroyl- Sarcosin gemischt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um die inneren Membranen zu solubilisieren. Danach wurde das Gemisch erneut 1 Stunde bei 167 000 x g zentrifugiert, um die solubilisierten inneren Membranen von den äusseren Membranen zu trennen.
- Das Pellet wurde in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 suspendiert. Ein Teil dieser Suspension wurde dann im selben Puffer dreifach verdünnt und in W/O-Adjuvans emulgiert. Dieser Impfstoff heisst 38-kD-OMP-Präparat (C).
- Die Schutzrate der verschiedenen gereinigten und in W/O- Adjuvans emulgierten Fraktionen ist in Tabelle 1 gezeigt.
- Kommerzielle Isabrown Hühner wurden einmal im Alter von 10 Wochen mit 0,5 ml der verschiedenen Impfstoffe geimpft und 4 Wochen später wurde ein homologer Challenge mit H. paragallinarum-Stamm H-18 (Serotyp C) homolog durchgeführt. Für jeden Impfstoff wurden 6 Hühner verwendet. Tabelle 1 Schutz von Hühnern vor H. paragallinarum-Infektion durch Immunisierung mit gereinigten Fraktionen Impfstoff Klinischer Befund Reisolation Ratea % Schutz Anzahl positive Hühnerb Kontrolle SUP-USO (C) 38-kD-Protein angereicherte Membranfraktion (C) 38-kD-OMP-Präparat a Die Rate ist als die Gesamtzahl Hühner mit nasalem Ausfluss aus drei Beobachtungen dargestellt: 24 Stunden, 48 Stunden und 5 Tage post Challenge. b Reisolierung aus Sinus infraorbitalis, 5 Tage post Challenge (Satelliten-Wachstum).
- Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, erschienen die gereinigte Membranfraktion von H. paragallinarum und speziell das gereinigte 38-kD-OMP-Präparat (C) einen hohen Schutz zu vermitteln, vermutlich dank einer durch besagte Fraktion hervorgerufenen optimalen Immunantwort.
- Für die Herstellung eines einwertigen 38-kD-OMP-Präparat (A)-Impfstoffes wurde der Stamm 083 (A) auf Schokoladeagar ausgestrichen und 24 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre, in der eine Kerze verbrannt wurde, bebrütet und danach in mit 0,01% NADH supplementiertem TPB kultiviert. Nach 24 Stunden Bebrüten bei 37ºC wurden die Zellen abzentrifugiert und das gereinigte 38-kD-OMP-Präparat (A) wurde genauso isoliert wie für das 38-kD-OMP-Präparat (C) beschrieben.
- Isoliertes OMP (A) wurde in W/O-Adjuvans emulgiert, um Impfstoffe, die 10 ug/0,5 ml und 1 ug/0,5 ml beinhalten, herzustellen. Um diese Impfstoffe zu testen, wurden kommerzielle Isabrown Hühner (10 Wochen alt) intramuskulär (Brust) mit einer einzelnen 0,5-ml-Dosis geimpft. Am Impftag und vier Wochen nach der Impfung wurden Blutproben entnommen und die Seren nach Standard-Antikörperverfahren auf Hämagglutinations-Inhibition (HI) getestet (Mass für die Schutzwirkung). Tabelle 2 HI-A Antikörper-Titer in Hühnern nach Impfung mit 38-kD-OMP- Präparat (A) Impfstoffdosis HI-A Titera Kontrolle a ²log Titer, 4 Wochen nach Impfung gemessen, 5 Hühner pro Gruppe.
- Aus den Ergebnissen (Tabelle 2) kann geschlossen werden, dass 100% der mit der 10-ug- und der 1-ug-Dosis geimpften Hühner geschützt gewesen wären (HI-A > 2&sup0;).
- Ein einwertiges 38-kD-OMP-Präparat (B) wurde genauso wie oben beschrieben hergestellt, ausser dass Stamm Spross (B) kultiviert wurde und als Ausgangsmaterial für die Isolation des 38-kD-OMP-Präparats verwendet wurde.
- In einem Experiment wird ein dreiwertiger Untereinheitsimpfstoff (in W/O Adjuvans) hergestellt und der Schutz gegen Challenge mit Stämmen der Serotypen A, B oder C getestet.
- Weiter wird ein einwertiger H-18 (C)-Impfstoff gegen heterologen Challenge mit Stamm 083 (A) und Stamm Spross (B) getestet. Die für den dreiwertigen Untereinheitsimpfstoff verwendeten 38-kD-OMP-Präparate der Stämme 083 (A), Spross (B) und H-18 (C) wurden genauso wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Der dreiwertige Impfstoff enthielt 100 ug von jedem Protein pro Dosis von 0,5 ml. Einwertiger H-18 (C)- Impfstoff ist identisch mit dem 38-kD-OMP-Präparat-Impfstoff, der in Beispiel 1 verwendet wird.
- Kommerzielle Isabrown Hühner wurden einmal im Alter von 10 Wochen mit 0,5 ml des Impstoffes geimpft und vier Wochen später wurde der Challenge durchgeführt. Für jede Challengegruppe wurden 7 Hühner verwendet. Tabelle 3 Schutzrate eines dreiwertigen Untereinheitsimpfstoffes und eines einwertigen (Typ C) Untereinheitimpfstoffes Klinischer Befund Resisolierung Challenge-Stämme (Serotyp) Impstoff Ratea % Schutz Anzahl positiver Hühnerb Spross Modesto Kontrolle dreiwertig einwertig a Die Rate ist als die Gesamtzahl Hühner mit nasalem Ausfluss aus drei Beobachtungen dargestellt: 24 Stunden, 48 Stunden und 5 Tage post Challenge. b Reisolierung aus Sinus infraorbitalis, 5 Tage post Challenge (Satelliten-Wachstum).
- Aus Tabelle 3 geht hervor, dass nur homologer Schutz durch Impfung mit dem einwertigen Impfstoff H-18 (C) verursacht wird. Der dreiwertige Impfstoff schützte vollständig gegen einen Challenge mit allen getesteten Stämmen.
- Die Reinigung der von Serotyp A, B and C Stämmen von H. paragallinarum (Stamm 083, Stamm Spross und Stamm H-18) abgeleiteten, mit 38-kD-Protein angereicherten Membranfraktionen und der 38-kD-OMP-Präparate wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
- Gereinigte Präparationen wurden nach dem Verfahren von Laemmli in SDS-PAGE laufen gelassen (Nature (1970), 227, 680- 685).
- Das SDS-PAGE mit CBB-Färbung der gereinigten Präparationen offenbarte eine etwa 38-kD Bande als das dominante Protein in den OMP-Präparationen (Figur 1) . Figur 1 zeigt die SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Profile von verschiedenen Präparaten, d.h. SUP-USO beziehungsweise 38-kD-OMP-Präparate, abgeleitet von Stamm 083 (A) (Spuren A-B), Spross (B) (Spuren D-E) und H-18 (C) (Spuren G-H). Molekulargewichts-Standardproteine sind in Spuren C, F und I.
- Cytochrom C, Pferd 12,3 kD
- Myoglobin, Pferd 17,2 kD
- Carbonische Anhydrase, Rind 30,0 kD
- Ovalbumin, Hühnerei 43,0 kD
- Albumin, Rinderserum 66,3 kD
- Ovotransferrin, Hühnerei 78,0 kD
- Um weitere Eigenschaften der schützenden Aktivität der 38-kD-OMP-Präparate zu bestimmen, wurden diese Präparate aus den Stämmen 083 (A), Spross (B) und H-18 (C) gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und Hitzebehandlung und enzymatischer Verdauung unterzogen (Trypsin und Proteinase-K).
- Trypsin spaltet Proteine nach positiv geladenen Aminosäureresten (z.B. Lysin, Arginin). Proteinase-K ist ein starkes Enzym und spaltet die meisten Proteine in kleine Peptide. Erhitzen auf 100ºC lässt die Aminosäurekette intakt, führt aber zu (meist irreversibler) Entfaltung der tertiären oder quaternären Struktur der meisten Proteine.
- Für die enzymatischen Verdauungen wurden 2 mg Protein mit 200 ug Enzym in 1 ml 40 mM PBS, 1.5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Kontrollpräparate wurden gleich behandelt, ausser dass das Enzym weggelassen wurde. Um hitzedenaturierte Proteine zu erhalten, wurden 2 mg Protein in 1 ml 40 mM PBS 10 Minuten auf 100ºC erhitzt.
- Impfstoff-Zusammensetzungen wurden hergestellt, die in einer O/W-Emulsion resultierten, die 50 mg Protein per 0,5- ml-Dosis umfassten, und wurden gegen homologen Challenge getestet.
- Kommerzielle Isabrown Hühner (10 Wochen alt) wurden einmal geimpft, und 4 Wochen später wurde ein Challenge durchgeführt. Für jede Challengesgruppe wurden 6 Hühner verwendet (Tabelle 4).
- Aus den Schutzversuchen kann geschlossen werden, dass die schützende Aktivität empfindlich auf Hitze und enzymatische Behandlung reagiert, da solche Behandlungen in einer starken Verminderung der Schutzkapazität für alle drei Serotypen resultieren. Tabelle 4 Auswirkung von enzymatischer und Hitzebehandlung auf die Schutzrate von 38-kD OMP Präparationen Typ A Challenge Impstoff Klin. Befunda Reisolierungb OMP-Behandlung Rate % Schutz Anz.pos.Hühner Kontrolle Trypsin Proteinase a Die Rate ist als die Gesamtzahl Hühner mit nasalem Ausfluss aus drei Beobachtungen dargestellt: 24 Stunden, 48 Stunden und 5 Tage post Challenge. b Reisolierung aus Sinus infraorbitalis, 5 Tage post Challenge (Satelliten-Wachstum).
Claims (11)
1. Impfstoff zum Schutz von Geflügel vor Infektion mit
Haemophilus paragallinarum, dadurch gekennzeichnet, dass
der Impfstoff im wesentlichen frei von Zellen ist und von
einer Membranfraktion von Haemophilus paragallinarum
Zellen stammt, welche ein nicht-filamentöses Protein von
38 kD (+/- 3 kD), gemessen in SDS-PAGE, oder ein
immunologisches Äquivalent besagten Proteins umfasst.
2. Impfstoff gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
er von einem äusseren Membranpräparat, welches das 38-kD-
Protein als Haupt-Proteinkomponente besitzt, stammt.
3. Impstoff gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass er von Membranfraktionen von Haemophilus
paragallinarum-Zellen von mindestens zwei verschiedenen
Serotypen stammt.
4. Impfstoff gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass
er von Membranfraktionen von Haemophilus paragallinarum
Zellen der Serotypen A, B und C stammt.
5. Impfstoff gemäss Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet,
dass er zusätzlich mindestens einen für Geflügel
infektiösen Mikroorganismus oder immunogenes Material davon
enthält.
6. Impfstoff gemäss Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet,
dass er ein Adjuvans umfasst.
7. Antigenes Material von Haemophilus paragallinarum,
dadurch gekennzeichnet, dass es eine Membranfraktion von
Haemophilus paragallinarum-Zellen, die ein
nichtfilamentöses
Protein von 38 kD (+/- 3 kD), in SDS-PAGE
gemessen, oder ein immunologisches Äquivalent besagten
Proteins umfasst, im wesentlichen frei von Zellen ist.
8. Antigenes Material gemäss Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass es ein äusseres Membranpräparat mit dem
38-kD-Protein als hauptsächliche Proteinkomponente ist.
9. Antikörper oder Antiserum, das mit dem antigenen Material
von Haemophilus paragallinarum gemäss Anspruch 7 oder 8
immunreaktionsfähig ist.
10. Pharmazeutisches Präparat, das einen Antikörper oder ein
Antiserum gemäss Anspruch 9 umfasst.
11. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gemäss
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Haemophilus
paragallinarum-Bakterien in Medium kultiviert werden,
wonach membranöses Material, das ein nicht-filamentöses
Protein von 38 kD (+/- 3 kD) umfasst, daraus extrahiert
wird und in ein Präparat mit immunisierender Aktivität
verarbeitet wird.
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