HU210851B - Method for the preparation of vaccine against haemophilus paragallinarum - Google Patents
Method for the preparation of vaccine against haemophilus paragallinarum Download PDFInfo
- Publication number
- HU210851B HU210851B HU912864A HU286491A HU210851B HU 210851 B HU210851 B HU 210851B HU 912864 A HU912864 A HU 912864A HU 286491 A HU286491 A HU 286491A HU 210851 B HU210851 B HU 210851B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- vaccine
- paragallinarum
- cells
- membrane
- haemophilus paragallinarum
- Prior art date
Links
- 241000606767 Avibacterium paragallinarum Species 0.000 title claims description 51
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 42
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 6
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims 2
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 38
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 33
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 23
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 23
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 19
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 17
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 5
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000011318 facial edema Diseases 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002151 serous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1242—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/826—Bacterial vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás baromfiak Haemophilus paragallinarum fertőzése elleni védelmére szolgáló vakcina, Haemophilus paragallinarum antigén anyag, ez elleni antitest és antiszérum előállítására.
A Haemophilus paragallinarum (H. paragallinarum) a felső légúti traktus fertőzését okozza csirkéknél, a betegséget fertőző roncsoló orrhurutnak is nevezik (IC). A betegség legjellemzőbb tünetei az onjáratok és melléküregek savós-nyálkás orrváladékkal való borítottsága, arcödéma és kötőhártyagyulladás. Az alsó légúti traktus, például a légzsákok és a tüdők fertőzése szintén bekövetkezhet. Bár a morbiditás nagy, a természetes mortalitás viszonylag alacsony. Az IC gyakran okozza a selejtszám emelkedését, satnya növekedést és a tojáshozam csökkenését, mindezek jelentős gazdasági veszteséget eredményeznek. Ezenfelül ha az IC más kórokozókkal, pl. madárhimlővel, Mycoplasma gallisepticummal, fertőző bronchitisszel, Pasteurellával vagy fertőző légcsőhuruttal társul, súlyosabb és elhúzódóbb betegséget okoz, ami általában magasabb mortalitást is eredményez. Az IC-ből kigyógyult madarak gyakran a fertőzés hordozói maradnak, és hozzájárulnak ahhoz, hogy a fertőzés fennmaradjon az állományban.
Jelenleg az IC elleni vakcinálást teljes baktériumból készült vakcinákkal végzik. Ezek a vakcinák élő, előnyösen legyengített törzsekből vagy inaktivált virulens törzsekből készülnek. A legyengített élő vakcinák használatakor azonban mindig fennáll annak a veszélye, hogy az állatokat nem kellő mértékben legyengített patogén baktériumokkal oltjuk be, ami azután az oltott állatok megbetegedését és a betegség esetleges elterjedését okozza az állományban. Ezenkívül a legyengített baktériumok visszaalakulhatnak virulens állapotba.
Az inaktivált vakcináknak is van egy sor hátránya, pl. olyan mellékhatások megjelenése, amelyek a teljes baktériumok beadása után fordulhatnak elő annak következtében, hogy a sejtfal anyagai, pl. lipopoliszacharidok (LPS) jelen vannak.
A H. paragallinarumnak három jól elkülönült szerotípusát lehet megkülönböztetni, azaz az A, B és C szerotípust. A különböző H. paragallinarum törzsek között az egyes szerotípusokon belül rokonságon alapuló kereszt-védelem létezik. Ha azonban egy madarat egy adott szerotípushoz tartozó H. paragallinarum törzzsel vakcináinak, nem lesz védve olyan H. paragallinarum törzsek fertőzése ellen, amelyek más szerotípusokhoz tartoznak, vagyis az immunitás típus-fajlagos. Ezért az IC elleni megfelelő védelem érdekében a madarakat olyan vakcinával kell immunizálni, amely többféle H. paragallinarium szerotípusból származó immunogén anyagot tartalmaz.
A teljes baktériumon alapuló H. paragallinarum vakcinák említett hátrányai mellett az ilyen vakcináknak további hátránya az, hogy a B vagy C szerotípusú teljes baktériumokat tartalmazó vakcina csak részben védi a vakcináit madarakat a B vagy C szerotípusú virulens törzsekkel való későbbi fertőzés ellen.
Az A szerotípusú H. paragallinarum egyik rostos hemagglutininjét Iritani és munkatársai izolálták és jellemezték [Am. J, Vet. Rés. 47,2114 (1980) és DE-OS2906996]. Ennek a rostos hemagglutininnek védőhatása van az A szerotípusú H. paragallinarum fertőzés ellen.
Iritani eljárása azonban az A szerotípusú H. paragallinarum védő komponensének izolálására, amelynek során a védő aktivitást a sejtből tripszin alkalmazásával, majd a védő aktivitás hordozójának izolálásával juttatják ki, nem alkalmazható a C szerotípus esetén, mivel az ilyen szerotípusú H. paragallinarum törzsekből ezzel az izolálási munkamenettel védő hatású komponens nem lenne izolálható.
Kísérleteink során egy új eljárást dolgoztunk ki a H. paragallinarum védő frakciójának az izolálására, ami a H. paragallinarium összes szerotípusa, azaz A, R és C szerotípus esetén alkalmazható.
Ezzel az új eljárással a H. paragallinarum sejtekből egy új, tisztított membrán-frakciót kapunk, amely egy 38+3 kD-s fehérjét tartalmaz (SDS-PAGE-val, vagyis nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel mérve), és amely nagy mértékben védő hatású a H. paragallinarum fertőzés ellen a baromfiakra nézve, és amely lényegében véve sejtektől és rostos anyagoktól mentes.
A találmány értelmében egy alegység vakcinát állítunk elő, vagyis olyan vakcinát, amely csak a védelem szempontjából szükséges és fontos komponenseket tartalmazza, amelyek a H. paragallinarum sejtek membrán frakciójából származnak, amely a mintegy 38 kD-s fehérjét tartalmazza (38 kD-s fehérjében dúsított membrán-frakció, lásd az 1. példát). Az ilyen vakcinával immunizált csirkék a virulens H. paragallinarum törzsekkel való homológ fertőzés ellen jól védettek.
Még teljesebb védelem érhető el, ha a csirkéknek olyan vakcinát adagolunk, amely a 38 kD-s külső membrán proteinben (OMP) dúsított, H. paragallinarum sejtek külső membrán frakciójából áll (38 kD-s OMP készítmény, lásd az 1. példát).
Ez a tisztított 38 kD-os OMP készítmény lényegében véve sejtektől és rostos anyagoktól mentes.
A találmány szerinti vakcinára jellemző továbbá, hogy a védő aktivitás
- hőre érzékeny,
- tripszines kezelésre érzékeny és
- K-proteináz kezelésre érzékeny.
A találmány szerinti vakcina tartalmazhatja az említett 38 kD-s OMP olyan fragmentumát is, amelynek még vannak immunizáló tulajdonságai, vagyis immunológiai ekvivalens.
A 38 kD-s fehérjében dúsított membrán frakciót úgy állítjuk elő, hogy H. paragallinarum baktériumokat alkalmas tápközegben olyan körülmények között tenyésztünk, amelyek elősegítik a 38 kD-s OMP kifejeződését, majd a H. paragallinarum sejteket feltárjuk, pl. enzimes vagy mechanikus feltárással (például ultrahangos kezeléssel, őrléssel vagy francia prés segítségével), a sejtmembrán frakciót ülepítjük, és ezután a 38 kD-s fehérjében dúsított membrán frakciót elválasztjuk, pl. centrifugálással.
A 38 kD-s OMP készítményt úgy izolálhatjuk, hogy
HU 210 851 Β a fentebb említett membrán frakciót további, belső és külső membrán frakcióra választjuk szét, pl. sűrűség gradiens ülepítéssel, vagy a belső membrán detergenssel, pl. Triton Χ-100-zal vagy szarkozinnal történő eltérő szolubilizálódása alapján, amit centrifugálás követ.
Az említett frakció vagy preparátum izolálására eljárhatunk úgy is, hogy a 38 kD-s OMP-re fajlagos antiszérumot (pl. monoklonális antitestet) használunk. A H. paragallinarum membrán-extraktumát egy olyan oszlop-töltetre vihetjük fel, amely az említett 38 kD-s OMP-re fajlagos antiszérumot tartalmazza, az extraktum adszorbeálódott frakcióját elválasztjuk a nem adszorbeálódott anyagtól, majd az adszorbeált frakciót az oszlop-töltetről leoldjuk.
Kívánt esetben a 38 k D-os OMP-t homogenitásig tisztíthatjuk a szakterületen ismert eljárásokkal, így pl. a 38 kD-s OMP-t szolubilizáljuk az említett 38 kD-s OMP készítményből egy vagy több detergenssel végzett extrahálással, majd tovább tisztítjuk pl. ioncserélővagy molekulaszűró-kromatográfiával olyan körülmények között, amelyek nincsenek káros hatással a 38 kD-s OMP védő tulajdonságaira.
A tisztított, 38 kD-s fehérjében dúsított frakciókat a H. paragallinarum ismert szerotípusaitól, például az A, B, C és a megfelelő, a technika állása szerint ismert szerotípusoktól megfelelően elválaszthatjuk.
A találmány szerinti vakcinában alkalmazandó 38 kD-s OMP-t H. paragallinarum sejtekből végzett tisztítással vagy rekombináns technikákkal állíthatjuk elő.
Az utóbbi esetben a fehérjét vagy fragmentumait kódoló nukleinsav-szekvenciákat pl. olyan módon azonosíthatjuk, hogy egy genomiális H. paragallinarum DNS bankot olyan egyedi kiónokra nézve vizsgálunk át, amelyek az említett szekvenciákat tartalmazzák, ehhez pl. a 38 k D-s OMP ellen képződött poliklonális vagy monoklonális antitestekkel való fajlagos reakciót használjuk ki. A nukleinsav-szekvenciákat különböző, kifejezésre ható DNS szekvenciákkal ligálhatjuk, így úgynevezett rekombináns nukleinsav molekulát kapunk, amellyel megfelelő gazdaszervezetet transzformálhatunk. Byen hibrid DNS molekulák pl. vírusokban jelen levő nukleinsavakból vagy plazmidokból származhatnak. Gazdasejtként prokarióta eredetű, pl. baktérium vagy eukarióta eredetű, pl. emlős sejteket alkalmazhatunk. A transzformált gazdasejteket felhasználhatjuk a 38 kD-s OMP termelésére, ezután pedig az említett fehérjét vagy a 38 kD-s OMP-t tartalmazó anyagot izolálhatjuk, majd a találmány értelmében vakcina előállítására alkalmazhatjuk.
Egy másik kiviteli mód szerint élő vektor vakcinát készíthetünk, amely valamely nem-patogén mikroorganizmust, pl. vírust vagy baktériumot tartalmaz, ahol a mikroorganizmusba klónozva megtalálható a 38 kD-s OMP-t vagy fragmentumát kódoló nukleinsav-szekvencia.
A találmány szerinti vakcinák legalább egy szerotípusú H. paragallinarum 38 kD-s fehérjében dúsított membrán-frakcióját vagy 38 kD-s OMP készítményét tartalmazzák, azaz az olyan vakcinák, amelyek ilyen frakciót vagy OMP készítményt tartalmaznak, vagy ezek immunológiai ekvivalensét tartalmazzák, a találmány oltalmi körébe tartoznak.
A találmány szerinti vakcina ezenkívül rekombináns DNS vakcina formájában is lehet, amint ezt fentebb körvonalaztuk. A találmány szerinti vakcina előnyösen egynél több, különböző szerotípusú H. paragallinarum törzsből származó, 38 kD-s fehérjében dúsított membrán-frakciót vagy 38 kD-s OMP készítményt tartalmaz. A H. paragallinarum ellen a legteljesebb védelmet úgy érhetjük el, ha olyan vakcinát adunk a madaraknak, amely tartalmaz mind A, mind B, mind C szerotípusú H. paragallinarum törzsből származó membrán-frakciót vagy készítményt. Az ilyen háromértékű (trivalens) vakcina a találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja. A találmány szerinti háromértékű vakcinával végzett vakcinálás teljes mértékben megóvja a madarakat a H. paragallinarum fertőzésekkel szemben, ellentétben az eddig alkalmazott, teljes baktériumokon alapuló vakcinákkal.
A védő aktivitást hordozó H. paragallinarum anyagon kívül a találmány szerinti vakcina tartalmazhat valamely vizes közeget vagy vizet tartalmazó szuszpenziós közeget, gyakran más alkotórészekkel keverve, például abból a célból, hogy megnöveljük az aktivitást és/vagy az eltarthatóságot. Ezek az alkotórészek lehetnek sók, pH pufferek, stabilizálószerek (pl. sovány tej vagy kazein hidrolizátum), emulgeálószerek, adjuvánsok az immunválasz fokozására (pl. ásványolajok, muramil-dipeptid, alumínium-hidroxid, szaponin, polianionok és amfipatikus vegyületek) és tartósítószerek, pl. timerozál.
A találmány szerinti vakcina tartalmazhat továbbá más baromfiakra nézve fertőző baktériumokból vagy vírusokból származó immunogén anyagot is, pl. Mycoplasma, Newcastle-betegség vírus vagy fertőző bronchitis vírus anyagot. A vakcinát előnyösen parenterálisan, pl. szubkután vagy intramuszkulárisan adagoljuk. A vakcinát ilyen módon mind a vakcináit madarak aktív immunizálása céljából, mind a tojó madarak utódainak passzív immunizálása céljából adagolhatjuk. Az immunizált tojó madarakban a bennük kialakult antitestek természetesen bejutnak tojásaik sárgájába, és így a kikelt csirkékbe is.
Mind a vakcina összetétele, mind a vakcinálási rendszer változtatható a védendő állat típusától, az állat korától és testtömegétől, a védelem kívánt időtartamától és az adagolás módjától függően, valamint attól függően, hogy aktív immunizálást vagy az anyai antitestek révén passzív immunizálást kívánunk-e elérni. Az aktív komponens optimálisan hatékony mennyisége a vakcinában baromfiak parenterális, például intramuszkuláris vagy szubkután vakcinálásához dózisonként mintegy 0,1-100 pg.
H. paragallinarum ellen az említett aktív immunizálást elsősorban védő kezelésként alkalmazzuk egészséges madarak esetén. Nyilvánvaló, hogy a H. paragallinarummal már fertőződött madarakat a találmány szerinti membrán-frakció vagy készítmény elleni antitestekkel kezelhetjük.
HU 210 851 Β
A találmány szerinti membrán-frakció elleni antiszérumot úgy állítjuk elő, hogy madarakat immunizálunk az említett frakció hatásos mennyiségével, előnyösen valamely adjuváns jelenlétében. Kívánt esetben az állatoknak egy második vakcinálással emlékeztető oltást adunk a megfelelő immunválasz kialakítása céljából. Ezután az állatokat elvéreztetjük és a vérből antiszérumot állítunk elő.
Az antiszérumot vagy antitesteket gyógyászatilag elfogadható hordozókkal keverhetjük.
Egy adott szerotípusú H. paragallinarum törzsből származó membrán-frakcióra fajlagos poliklonális antiszérumot úgy állíthatunk elő, hogy az említett membrán-frakció elleni antiszérumot más szerotípusú H. paragallinarum törzsek membrán-frakcióinak keverékével együtt inkubáljuk. Azok az antitestek, amelyek nem fajlagosak az említett H. paragallinarum membránfrakcióra, adszorbeálódnak a hozzáadott H. paragallinarum frakcióban, és így elkülöníthető az inkubálási keverékből, így olyan antiszérum készítményt kapunk, amely egy bizonyos szerotípusú H. paragallinarum membrán-frakcióra fajlagos.
A találmány szerinti membrán-frakció vagy készítmény elleni monoklonális antitesteket alkalmazhatjuk H. paragallinarummal fertőzött madarak passzív immunizálására is. Az említett monoklonális antitesteket ismert módon állíthatjuk elő, például úgy, hogy egereket immunizálunk a találmány szerinti membrán-frakcióval, az egér lépsejteket immortalizáljuk, és az alkalmas antitesteket termelő hibridómákat kiválasztjuk.
Az antiszérumok és monoklonális antitestek alkalmazhatók a H. paragallinarum baktériumokkal fertőzött madarak immunológiai diagnosztizálásához is.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük, a korlátozás szándéka nélkül.
7. példa
H. paragallinarum membrán-frakciók tisztítása és csirkék immunizálása
Baktérium törzseket szélesztünk csokoládé-agaron, és 24 órán át 37 ’C hőmérsékleten olyan atmoszférában inkubáljuk, amelyben egy gyertyát hagytunk kiégni, majd 0,01% NADH-val kiegészített TPB-ben tenyésztjük.
230 ml koncentrált H-18 (C szerotípusú) sejtszuszpenziót (amely 4 · 10,θ sejtet tartalmaz ml-enként 40 mmól/l-es, 0,01% timerozált tartalmazó PBS-ben (foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat)] ultrahanggal kezelünk 6 percen át 4 °C hőmérsékleten 100 wattal, Branson B12 Sonifier készülék segítségével (váltakozva 30 másodperces ultrahangos kezelés és 30 másodperces hűtés). Ezt követően az össze nem zúzott sejteket centrifugálással eltávolítjuk (10 perc, 5000 g), és 20 ml felülúszót ásványolaj víz-az-olajban (W/0) adjuvánssal emulgeálunk. Ezt a vakcinát SUP-USO (C)-nek nevezzük, A további 210 ml felülúszót 1 órán át ultracentrifugában 167 000 g-vel centrifugáljuk, így a teljes membrán-frakciót megtisztítjuk az oldható frakciótól.
A membrán-üledéket (barnás színű) újra szuszpendáljuk 60 ml 50 mmól/literes trisz.HCl pufferben (pH = 8,0). Ebből a szuszpenzióból 10 ml-t ugyanazzal a pufferrel háromszorosára hígítunk, és W/0 adjuvánssal emulgeáljuk. Ezt a vakcinát 38 kD-s fehérjében dús (C) membrán-frakciónak nevezzük. A megmaradt 50 ml szuszpenziót 1:1 arányban összekeverjük 50 mmól/1 trisz.H Cl-t (pH = 8,0) és 2 % nátrium-N-lauroil-szarkozint tartalmazó pufferral, és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, igy a belső membránokat szolubilizáljuk. Ezt követően a keveréket 1 órán át 167 000 g-vel ismét centrifugáljuk, így a szolubilizált belső membránokat elválasztjuk a külső membránoktól.
Az üledéket újra szuszpendáljuk 50 ml 50 mmól/literes trisz.HCl-ben (pH = 8,0). Ennek a szuszpenziónak egy részét azután ugyanolyan pufferrel háromszorosára hígítjuk, és W/0 adjuvánssal emulgeáljuk. Ezt a vakcinát (C) 38 kD-s OMP készítménynek nevezzük.
A különböző tisztított, W/0 adjuvánssal emulgeált frakciók védelmi képességét az 1. táblázatban mutatjuk be.
Kereskedelmi forgalomban kapható Isabrown csirkéket 10 hetes korukban egyszer vakcinálunk különböző vakcinák 0,5 ml-ével, és egyforma fertőzésnek vetjük alá négy héttel később H-18 (C szerotípusú) H. paragallinarum törzzsel. Az egyes vakcinákhoz 6 csirkét alkalmazunk.
7. TÁBLÁZAT
Csirkék védelme H. paragallinarum fertőzés ellen tisztított frakciókkal végzett immunizálással
| vakcina | klinikai jelzések | újra izolálás | ||
| pontszám3 | % védelem | a pozitív csirkék számab | % védelem | |
| Kontroll | 17 | 0 | 6 | 0 |
| SUP-USO (C) | 12 | 29 | 4 | 33 |
| 38 kD-s fehérjében dús membránfrakció (C) | 1 | 94 | 1 | 83 |
| 38 kD-s OMP készítmény (C) | 0 | 100 | 0 | 100 |
3 A pontszám az orrváladékkal bíró csirkék teljes számát képviseli 3 megfigyelésből: 24 órával, 48 órával és 5 nappal a fertőzés után bÚjra izolálás az infraorbitális üregből 5 nappal a fertőzés után (szatellit növekedés)
Amint az 1. táblázatból látható, a H. paragallinarium tisztított membrán-frakciója, és különösen a tisztított 38 kD-s OMP (C) készítmény nagy mértékben védő hatásúnak tűnik, valószínűleg az említett frakció által kiváltott optimális immunválasz következtében.
Monovalens 38 kD-s OMP (A) készítmény előállítása érdekében 083 (A) törzset szélesztünk csokoládé4
HU 210 851 Β agaron, és 24 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten olyan atmoszférában, amelyben egy gyertyát hagytunk kiégni, majd 0,01 % NADH-val kiegészített TPB-ben tenyésztjük. 37 °C hőmérsékleten 24 órán át végzett inkubálás után a sejteket centrifugáljuk, és a tisztított 38 kD-s külső membrán fehérje (A) készítményt ugyanúgy izoláljuk, ahogyan a 38 kD-s OMP (C) készítménynél leírtuk.
Az izolált OMP (A)-t W/0 adjuvánssal emulgeáljuk, így olyan vakcinákat kapunk, amelyek 10 pg/0,5 ml, illetve 1 pg/0,5 ml hatóanyagot tartalmaznak. Ezen vakcinák vizsgálatához kereskedelmi forgalomban kapható 10 hetes Isabrown csirkéket intramuszkulárisan (mellbe) vakcinálunk egyszeri 0,5 ml-es dózissal. A vakcinálás napján és 4 héttel a vakcinálás után vérmintákat veszünk, és a szérumokat ismert módszerekkel, antitestek alapján hemagglutináció gátlására (Hl) (amely antitestek a védelem jelzői) megvizsgáljuk.
2. TÁBLÁZAT
Hl-A antitest-titerek csirkékben 38 kD-s OMP(A) készítménnyel végzett vakcinálás után
| Vakcina dózis | HI-A titer3 | ||||
| 10 Pg | 7 | 5 | S | 7 | 10 |
| Ipg | 5 | 5 | 8 | 7 | 8 |
| kontroll | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
02lóg titer, 4 héttel a vakcinálás után mérve, csoportonként 5 csirkével
Az eredményekből (2. táblázat) arra a következtetésre juthatunk, hogy a 10 pg illetve 1 pg dózissal vakcináit csirkék 100%-a védelemben részesült (HI-A>2°).
Monovalens 38 kD-s OMP(B) készítményt állítunk elő pontosan ugyanúgy, ahogyan fentebb leírtuk, azzal a különbséggel hogy Spross(B) törzset tenyésztünk és használunk fel kiindulási anyagként a 38 kD-s OMP készítmény izolálásához.
2. példa
Trivalens vakcinával immunizált csirkék védelme
Ebben a kísérletben trivalens alegység-vakcinát (W/0 adjuvánsban) készítünk, és megvizsgáljuk a védelmet az A, B vagy C szerotípusú törzsekkel végzett fertőzés ellen.
Ezenkívül megvizsgálunk egy monovalens H-l8 (C) vakcinát is 083 (A) törzzsel és Spross (B) törzzsel végzett heterológ fertőzés ellen. A 083 (A) törzs, Spross (B) törzs és a H-l 8 (C) törzs 38 kD-s OMP készítményeit, amelyeket a trivalens alegység vakcina készítéséhez alkalmazunk, ugyanúgy tisztítjuk, ahogyan az 1. példában leírtuk. A trivalens vakcina az egyes fehérjékből 100 pg-ot tartalmaz 0,5 ml-es dózisonként. A monovalens H-l8 (C) vakcina azonos a 38 kD-s OMP készítmény vakcinával, amelyet az 1. példában alkalmaztunk.
Kereskedelmi forgalomban kapható 10 hetes Isabrown csirkéket vakcinálunk egy alkalommal 0,5 ml vakcinával, és 4 héttel később fertőzzük őket. Az egyes fertőzési csoportokhoz 7-7 csirkét alkalmazunk.
3. TÁBLÁZAT
Trivalens alegység vakcina és egy monovalens (C típusú) alegység vakcina védő hatása
| fertőző törzs (szerotí- pus)c | vakcina | klinikai jelzések | újra izolálás | ||
| pontszá- ma | % védelem | a pozitív csirkék száma*’ | % védelem | ||
| 083 (A) | Kontroll | 18 | 0 | 7 | 0 |
| 083 (A) | trivalens | 0 | 100 | 0 | 100 |
| 1645 (A) | Kontroll | 18 | 0 | 7 | 0 |
| 1645 (A) | trivalens | 0 | 100 | 0 | 100 |
| Spross (B) | Kontroll | 19 | 0 | 7 | 0 |
| Spross (B) | trivalens | 0 | 100 | 0 | 100 |
| H-l 8(C) | Kontroll | 20 | 0 | 7 | 0 |
| H-l 8(0 | trivalens | 0 | 100 | 1 | 86 |
| Modesto (O | Kontroll | 20 | 0 | 7 | 0 |
| Modesto (O | trivalens | 21 | 100 | 1 | 86 |
| 083 (A) | monova- lens | 21 | 0 | 7 | 0 |
| Spross (B) | monova- lens | 19 | 0 | 7 | 0 |
a A pontszám az orrváladékkal bíró csirkék teljes számát képviseli 3 megfigyelésből: 24 órával, 48 órával és 5 nappal a fertőzés után b Újra izolálás az infraorbitális üregből 5 nappal a fertőzés után (szatellit növekedés) c Az említett fertőző törzsek ismertetése a következő helyeken található
083: Page, L.A.; Am. J. Vet. Rés. 85-94 (1962)
1645 : Hinz, K. H.; Avian Pathol. 4,213-226 (1975) Spross: Rimler és munkatársai; Am. J. Vet. Rés. 38,
1587-1589 (1977) H18: Kume és munkatársai; Jap. J. Vet. Sci. 40, 65-73 (1978)
Modesto: Rimler, R. B.; Ge. Microbiol. 92,405-409 (1976)
Rimler és munkatársai; Am. J. Vet. Rés. 38,15871589(1977)
A 3. táblázatból kitűnik, hogy a monovalens H-l 8 (C) vakcinával végzett vakcinálás után csak homológ védelem indukálódik. A trivalens vakcina teljes mértékben véd az összes vizsgált törzzsel végzett fertőzés ellen.
3. példa
A 38 kD-sfehétjében dús membrán-frakciók jellemzése
A 38 kD-s fehérjében dús membrán-frakciók és az A, B és C szerotípusú H. paragallinarum törzsekből (083 törzs, Spross törzs, illetve H-l8 törzs) származó
HU 210 851 B kD-s OMP készítmények tisztítását az 1. példa szerinti módon végezzük.
A tisztított készítményeket SDS-PAGE-val futtatjuk Laemmli eljárása szerint [Natúré 227, 680-685 (1970)].
A tisztított készítmények SDS-PAGE vizsgálata CBB festéssel együtt az OMP készítményekben domináns fehérjeként egy mintegy 38 kD-s csíkot mutat ki (1. ábra). Az 1. ábra a különböző készítmények, vagyis a 083 (A) törzsből (A-B vonalak), Spross (B) törzsből (D-E vonalak) és a H-18(C) törzsből (G-H vonalak) származó SUP-USO, illetve 38 kD-s OMP készítmények SDS-gélelektroforézis profiljait mutatja. A C, F és I vonalakban az alábbi molekulatömeg markerek találhatók:
Citokróm C, ló-eredetű 12,3 kD
Mioglobin, ló-eredetű 17,2 kD
Szénsav-anhidráz, szarvasmarha-eredetű 30,0 kD
Ovalbumin, tyúktojásból 43,0 kD
Albumin, szarvasmarha szérumból 66,3 kD
Ovotranszferrin, tyúktojásból 78,0 kD
A 38 kD-s OMP készítmények védő aktivitásának további jellemzőinek a meghatározásához a készítményeket az 1. példa szerinti módon 083 (A), Spross (B) és H-18 (C) törzsekből tisztítjuk, és hőkezelésnek, valamint enzimes emésztésnek (tripszinnel és K-proteinázzal) vetjük alá.
A tripszin a fehérjéket a pozitívan töltött aminosavmaradékaik (vagyis lizin, arginin) után hasítja. A K-pro5 teináz erős enzim, és a legtöbb fehérjét kis peptidekké hasítja. A 100 °C-ig végzett hőkezelés az aminosavláncot épen hagyja, de a legtöbb fehérje harmadlagos és negyedleges szerkezetét (a legtöbbször irreverzíbilisen) elroncsolja. Az enzimes emésztéshez 2 mg fehérjét inkubá10 lünk 200 g enzimmel 1 ml 40 mmól/l-es PBS-ben 1,5 órán át 37 °C hőmérsékleten. A kontroll készítményeket ugyanilyen módon kezeljük, azzal a különbséggel, hogy az enzimet elhagyjuk. Hővel denaturált fehérjék előállítására 2 mg fehérjét melegítünk 1 ml 40 mmól/l-es PBS15 ben 100 °C hőmérsékleten 10 percen át.
Vakcina kompozíciókat állítunk elő, amelyben 0/W emulzióban 50 pg fehérje található 0,5 ml-es dózisban, és ezt vizsgáljuk homológ fertőzés ellen. Kereskedelmi forgalomban kapható 10 hetes Isabrown csirkéket vak20 cinálunk egy alkalommal, és 4 héttel később fertőzzük őket. Az egyes fertőzési csoportokban 6-6 csirkét alkalmazunk (4. táblázat).
A kísérletekből arra a következtetésre juthatunk, hogy a védő aktivitás érzékeny a h- és enzimes keze25 lésre, mivel az ilyen kezelések a védő kapacitás erős csökkenését eredményezik mindhárom szerotípusnál.
4. táblázat
Az enzimes- és hókezelés hatása a 38 kD-s OMP készítmények védő hatására
| Vakcina | A típusú fertőzés | B típusú fertőzés | C típusú fertőzés | |||||||||
| klinikai jelzések3 | újra izolálásb | klinikai jelzések3 | újra izolálásb | klinikai jelzések3 | újra izolálásb | |||||||
| OMP- kezelés | pont- szám | % védelem | pozitív csirkék száma | % védelem | pont- szám | % védelem | pozitív csirkék száma | % védelem | pont- szám | % védelem | pozitív csirkék száma | % védelem |
| Kontroll | 18 | 0 | 6 | 0 | 17 | 0 | 6 | 0 | 18 | 0 | 6 | 0 |
| 1,5 h 37 °C | 0 | 100 | 0 | 100 | 9 | 47 | 4 | 33 | 0 | 100 | 0 | 100 |
| 1,5 h 37 °C tripszin | 15 | 17 | 6 | 0 | 12 | 29 | 5 | 17 | 12 | 33 | 5 | 17 |
| 1,5 h 37 °C KProteináz | 17 | 6 | 6 | 0 | 16 | 6 | 6 | 0 | 9 | 50 | 3 | 50 |
| 10 perc 100 °C | 10 | 44 | 5 | 17 | 17 | 0 | 6 | 0 | 17 | 6 | 6 | 0 |
3 A pontszám az orrváladékkal bíró csirkék teljes számát képviseli 3 megfigyelésből: 24 órával, 48 órával és 5 nappal a fertőzés után b Újra izolálás az infraorbitális üregből 5 nappal a fertőzés után (szatellit növekedés)
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás baromfiak Haemophilus paragallinarum fertőzés elleni védelmére szolgáló vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a Haemophilus paragallinarum baktériumokat alkalmas tápközegen tenyésztünk, majd a sejtek membránfrakcióját, amely egy mintegy 38 kD molekulatömegű fehérjét vagy annak immunológiai ekvivalensét tartalmazza továbbá sejtektől és rostos anyagtól mentes, alkalmas farmakológiailag elfogadható hordozóanyaggal keverve vakcinává alakítjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy membránfrakcióként külső membrán készítményt60 alkalmazunk, amely fő fehérjekomponensként a 38 kDHU 210 851 Β molekulatömegű fehérjét vagy annak immunológiai ekvivalensét tartalmazza.
- 3. Az. 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a membránfrakciót legalább két különböző szerotípusú Haemophilus paragallinarum sejtekből állítjuk elő.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a membránfrakciót A, B és C szerotípusú Haemophilus paragallinarum sejtekből állítjuk elő.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcinához legalább egy további, baromfiakra nézve fertőző mikroorganizmust vagy annak immunológiai anyagát is hozzákeverjük.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy a vakcinához adjuvánst is keverünk.
- 7. Eljárás Haemophilus paragallinarum antigén anyag előállítására azzal jellemezve, hogy Haemophilus paragallinarum baktériumokat alkalmas tápközegen tenyésztünk, és azok sejtektől és rostos anyagoktól mentes membránanyagát, amely egy38 kD molekulatömegű fehérjét mintegy tartalmaz, vagy annak immunológiai ekvivalensét a sejtek enzimatikus ultrahangos vagy francia préssel végzett kezelésével vagy zúzásával, majd centrifugálással kinyerjük.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a membránanyagból további tisztítással egy külső membrán készítményt állítunk elő, amely fő fehérjekomponensként a 38 kD molekulatömegű fehérjét vagy annak immunológiai ekvivalensét tartalmazza.
- 9. Eljárás Haemophilus paragallinarum membránfrakciója elleni antitestek vagy antiszérum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas állatnak valamely a 7. vagy 8. igénypont szerinti antigén anyag hatékony mennyiségét adagoljuk, majd az állatból antitesteket vagy antiszérumot választunk el.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90202358 | 1990-09-05 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU912864D0 HU912864D0 (en) | 1992-01-28 |
| HUT61488A HUT61488A (en) | 1993-01-28 |
| HU210851B true HU210851B (en) | 1995-08-28 |
Family
ID=8205111
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU912864A HU210851B (en) | 1990-09-05 | 1991-09-04 | Method for the preparation of vaccine against haemophilus paragallinarum |
| HU95P/P00562P HU211829A9 (en) | 1990-09-05 | 1995-06-29 | Haemophilus paragallinarum vaccine |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00562P HU211829A9 (en) | 1990-09-05 | 1995-06-29 | Haemophilus paragallinarum vaccine |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5240705A (hu) |
| EP (1) | EP0475478B1 (hu) |
| JP (1) | JPH0592929A (hu) |
| KR (1) | KR920006004A (hu) |
| CN (1) | CN1059471A (hu) |
| AU (1) | AU640516B2 (hu) |
| CA (1) | CA2049129A1 (hu) |
| DE (1) | DE69110997T2 (hu) |
| HU (2) | HU210851B (hu) |
| IL (1) | IL99097A0 (hu) |
| MX (1) | MX9100654A (hu) |
| NZ (1) | NZ239654A (hu) |
| ZA (1) | ZA916237B (hu) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994005783A1 (en) * | 1992-09-07 | 1994-03-17 | Bioproperties (Australia) Pty. Limited | Novel haemophilus organism and vaccines containing the same |
| HU219311B (en) * | 1992-10-14 | 2001-03-28 | Akzo Nobel Nv | New bacterium causing poultry disease and vaccine derived thereof |
| GB9521568D0 (en) * | 1995-10-20 | 1995-12-20 | Lynxvale Ltd | Delivery of biologically active polypeptides |
| JPH1084969A (ja) * | 1996-09-19 | 1998-04-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ヘモフィルス・パラガリナルム由来新規ポリペプチド及びその製法 |
| US7780961B2 (en) * | 2001-05-03 | 2010-08-24 | Actogenix N.V. | Self-containing Lactococcus strain |
| ATE389415T1 (de) * | 2002-06-19 | 2008-04-15 | Actogenix Nv | Verfahren und mittel zur erhöhung der darmabsorption |
| EP1560935A2 (en) * | 2002-11-15 | 2005-08-10 | VIB vzw | Self-containing lactobacillus strain |
| WO2007063075A1 (en) | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Actogenix Nv | Induction of mucosal tolerance to antigens |
| CA2675297C (en) | 2007-01-25 | 2019-05-07 | Actogenix Nv | Treatment of immune disease by mucosal delivery of antigens |
| WO2010074126A1 (ja) * | 2008-12-25 | 2010-07-01 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 組換え鶏伝染性コリーザワクチン及びその製造方法 |
| CN104212736A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-12-17 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种副鸡嗜血杆菌、灭活疫苗及其制备方法 |
| CN107354114A (zh) * | 2017-09-02 | 2017-11-17 | 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一株副鸡嗜血杆菌及其应用 |
| CN111471619A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-07-31 | 北京家禽育种有限公司 | 一种用于副鸡禽杆菌实验室分离培养的培养基及其制备方法和应用 |
| RU2752315C1 (ru) * | 2020-07-31 | 2021-07-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Вакцина против гемофилеза птиц инактивированная в форме суспензии "гемовак" |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4823893B1 (hu) * | 1970-12-29 | 1973-07-17 | ||
| US3876763A (en) * | 1970-12-29 | 1975-04-08 | Shionogi & Co | Infectious coryza infectious bronchitis and newcastle disease vaccines and production thereof |
| JPS6047650B2 (ja) * | 1976-06-22 | 1985-10-23 | ソニー株式会社 | 磁気記録媒体とその製法 |
| JPS54113422A (en) * | 1978-02-22 | 1979-09-05 | Shionogi & Co Ltd | Hemagglutinin of haemophilus gallinarum |
-
1991
- 1991-08-06 IL IL99097A patent/IL99097A0/xx unknown
- 1991-08-07 ZA ZA916237A patent/ZA916237B/xx unknown
- 1991-08-08 EP EP91202039A patent/EP0475478B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-08 DE DE69110997T patent/DE69110997T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-13 CA CA002049129A patent/CA2049129A1/en not_active Abandoned
- 1991-08-14 MX MX9100654A patent/MX9100654A/es not_active IP Right Cessation
- 1991-08-28 AU AU83474/91A patent/AU640516B2/en not_active Ceased
- 1991-08-29 US US07/751,492 patent/US5240705A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-03 NZ NZ239654A patent/NZ239654A/en unknown
- 1991-09-04 JP JP3224128A patent/JPH0592929A/ja active Pending
- 1991-09-04 HU HU912864A patent/HU210851B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 KR KR1019910015409A patent/KR920006004A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-09-04 CN CN91108663A patent/CN1059471A/zh active Pending
-
1995
- 1995-06-29 HU HU95P/P00562P patent/HU211829A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5240705A (en) | 1993-08-31 |
| KR920006004A (ko) | 1992-04-27 |
| CA2049129A1 (en) | 1992-03-06 |
| DE69110997T2 (de) | 1995-12-07 |
| IL99097A0 (en) | 1992-07-15 |
| AU8347491A (en) | 1992-03-12 |
| NZ239654A (en) | 1993-01-27 |
| JPH0592929A (ja) | 1993-04-16 |
| CN1059471A (zh) | 1992-03-18 |
| AU640516B2 (en) | 1993-08-26 |
| EP0475478B1 (en) | 1995-07-05 |
| HUT61488A (en) | 1993-01-28 |
| ZA916237B (en) | 1992-05-27 |
| HU211829A9 (en) | 1995-12-28 |
| HU912864D0 (en) | 1992-01-28 |
| DE69110997D1 (de) | 1995-08-10 |
| EP0475478A1 (en) | 1992-03-18 |
| MX9100654A (es) | 1992-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7722884B2 (en) | Vaccines and methods to treat canine influenza | |
| AU635062B2 (en) | Escherichia coli vaccine | |
| US10174084B2 (en) | Fusion polypeptides and vaccines | |
| HU210851B (en) | Method for the preparation of vaccine against haemophilus paragallinarum | |
| CA1109393A (en) | Vaccine and its preparation | |
| NO175735B (no) | Fremgangsmåte ved fremstilling av Pasteurella-vaksine | |
| US5593679A (en) | Poultry vaccine against E. coli air sac inflammation and septicaemia | |
| KR0127116B1 (ko) | 전염성 점액낭 질병의 예방을 위한 왁찐 | |
| US10190099B2 (en) | IBV strains and uses thereof | |
| CN115243715A (zh) | 保护以对抗血清型9、序列型16的猪链球菌的疫苗 | |
| WO2021105167A1 (en) | Triple vaccine against avibacterium paragallinarum and avian encephalomyelitis virus and fowl pox virus | |
| CN114573708A (zh) | 副鸡禽杆菌ha融合蛋白及其三聚体、制备的疫苗组合物、制备方法和应用 | |
| US8628947B2 (en) | Potomac horse fever isolates | |
| KR20210120898A (ko) | 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이의 용도 | |
| SEYFIABAD et al. | Vaccination of Chicks with an Experimental Oil-emulsion Vaccine against Infectious Bursal Disease Virus | |
| Goh | Molecular and biochemical analysis of a 105 kDa Mycoplasma gallisepticum cytadhesin protein (MGP1) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |