JPH1084969A - ヘモフィルス・パラガリナルム由来新規ポリペプチド及びその製法 - Google Patents

ヘモフィルス・パラガリナルム由来新規ポリペプチド及びその製法

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JPH1084969A
JPH1084969A JP8271408A JP27140896A JPH1084969A JP H1084969 A JPH1084969 A JP H1084969A JP 8271408 A JP8271408 A JP 8271408A JP 27140896 A JP27140896 A JP 27140896A JP H1084969 A JPH1084969 A JP H1084969A
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ser
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Eiji Tokunaga
英治 徳永
Masashi Sakaguchi
正士 坂口
Kazuo Matsuo
和夫 松尾
Fukusaburo Hamada
福三郎 濱田
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Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、鶏伝染性コリーザ病を阻止するの
に有用なヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規ポリ
ペプチを提供する。 【構成】 ＨＩ抗体産生を誘導し、鶏伝染性コリーザの
感染と発症を防御するヘモフィルス・パラガリナルム由
来の新規ポリペプチド、これをコードする遺伝子及びそ
の遺伝子を発現させるための組換えベクター、該ベクタ
ーによって形質転換された宿主、同宿主により産生され
るポリペプチドの製法及び該ポリペプチドを主成分とす
る鶏伝染性コリーザワクチン、該ポリペプチドを免疫抗
原として得られるモノクローナル抗体並びに上記ペプチ
ド及び抗体を利用する鶏伝染性コリーザの診断薬及び治
療薬。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明は鶏伝染性コリーザ
を阻止するポリペプチドに関する。さらに詳細には、鶏
伝染性コリーザを引き起こす因子であるヘモフィルス・
パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチド、該ポリペプ
チドをコードする遺伝子及び該ポリペプチドを認識する
抗体蛋白質に関する。更には、上記該ポリペプチドの製
造方法並びにワクチン、診断薬及び治療薬への利用に関
する。
【０００２】
【従来技術】家禽の重要な呼吸器官系疾病として伝染性
コリーザがある。この鶏伝染性コリーザは、ヘモフィル
ス・パラガリナルム（Haemophilus paragallinarum：以
下、ＨＰＧと称することもある）の感染によって起こ
る、鼻汁の漏出、顔面の腫脹あるいは流涙を主な症状と
する急性呼吸器伝染病である。鶏伝染性コリーザは、家
禽の育成率の低下、産卵開始の遅延、産卵率の低下ある
いは産卵停止をもたらすため、その経済的損失は大き
い。従来、鶏伝染性コリーザの予防には、ヘモフィルス
・パラガリナルムを培養し、回収した菌体をホルマリ
ン、チメロサール等で不活化したワクチンが広く応用さ
れている。しかし、これらのワクチンを投与した場合、
接種鶏の局所に壊死病巣を形成することが報告される
（M.Matsumoto and R.Yamamoto, Avian Dis., 15:109-1
17, 1971）など、ワクチンの副作用が問題となってお
り、安全性の高いワクチンの開発が強く待望されてい
る。
【０００３】また、近年、養鶏規模の拡大に伴って飼養
管理の省力化が進められており、その一環としてワクチ
ン接種に対する省力化の要望が強く、これに応えて、数
種のワクチンを混合することにより接種回数を減らすこ
とを狙った混合ワクチンが既に開発され、野外で広く用
いられている。
【０００４】混合ワクチンにおいて、注射量を増やすこ
となくそれぞれの単味ワクチンと同等の免疫原性を得る
ためには、混合するそれぞれの抗原量を増やすか、ある
いは、良いアジュバントを探し用いることが必要とな
る。しかしながら、ＨＰＧのようなグラム陰性菌は、抗
原量を増やした場合には、それに伴って接種局所の腫脹
のような注射反応も強まる傾向がある。従って、菌体あ
るいは培養上清から感染防御抗原すなわち有効な成分
（コンポーネント）のみを取り出すか、遺伝子組換え技
術により感染防御抗原をコードする遺伝子をクローニン
グし、該遺伝子を細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆
虫細胞等に発現させ、大量に発現した発現産物を精製
し、これを他のワクチンとともに適当なアジュバントと
混合する等して、上記の副反応を低減することが望まれ
る。
【０００５】一方、ワクチン接種の省力化の方法とし
て、ウイルスや細菌をベクターとして使用することも試
みられている。すなわち、一つの弱毒ウイルスあるいは
細菌に１ないし複数の病原体の感染防御抗原をコードす
る遺伝子を組み込むことで多価の生ワクチンを作製する
という方法である。これまでに鳥類ではベクターとして
ポックスウイルスやマレック病ウイルス等を使用した研
究が実施されており、鶏痘ウイルスにニューカッスル病
ウイルスのＨＮ及びＦ蛋白遺伝子を組み込んだウイルス
ベクターワクチンが実用化されている。
【０００６】従って、これからの鶏伝染性コリーザに対
する安全で有効なワクチンの開発には、コンポーネント
ワクチン、ベクターワクチンに関わらず、ＨＰＧの感染
防御抗原を同定することが重要と考えられる。
【０００７】ＨＰＧの感染防御抗原として赤血球凝集素
（ＨＡ）、外膜蛋白などが報告されているが、その中で
も、鶏にＨＰＧを免疫すると赤血球凝集抑制抗体（ＨＩ
抗体）が上昇し、ＨＩ抗体が高い鶏ほど感染防御能が高
いことなどから、ＨＡが最も重要な感染防御抗原と考え
られている（K. Otsuki and Y. Iritani, Avian Dis.,
18:297-304, 1974及びK. Kume et al., Jpn. J. Vet. S
ci., 46:843-850, 1984）。
【０００８】ＨＰＧの血清型は凝集反応に基づいて、Pa
ge（Am. J. Vet. Res., 23:85-95,1962）によりＡ、Ｂ
及びＣ型に、またSawataら（Jpn. J. Vet. Sci., 40:6
45-652, 1978）により１及び２型に型別されているが、
PageのＡ型はSawataらの１型に、PageのＣ型はSawataら
の２型に相当すると考えられている（K. Kume et al.,
Am. J. Vet. Res., 41:757-760, 1980及びA. Sawata et
al., Am. J. Vet.Res., 41:1901-1904, 1980）。Kume
らは、Ａ型（１型）菌にはＨＡ−Ｌ（易熱性、トリプシ
ン感受性）、ＨＡ−ＨＬ（易熱性、トリプシン耐性）及
びＨＡ−ＨＳ（耐熱性、トリプシン耐性）の少なくとも
３種類のＨＡが存在すること及びこれらのうち、ＨＡ−
Ｌのみが、通常行われている新鮮鶏赤血球に対するＨＡ
活性以外に、グルタルアルデヒド固定鶏赤血球に対して
もＨＡ活性を有し、且つ、Ａ型菌の感染防御に関与する
ことを報告している（K. Kume et al., Jpn. J. Vet. S
ci., 45:783-792, 1983及びA. Sawata et al., Jpn.
J. Vet. Sci., 46:21-29, 1984）。また、Iritaniら
は、Ａ型菌にはタイプ１ＨＡ（易熱性、蛋白分解酵素感
受性）及びタイプ２ＨＡ（易熱性、蛋白分解酵素耐性）
の２種類のＨＡが存在し、易熱性、蛋白分解酵素感受性
で分子量約３９ｋｄのポリペプチドをサブユニットとす
るタイプ１ＨＡが感染防御に関与すると報告しており
（T. Yamaguchi and Y. Iritani, Jpn. J. Vet. Sci.,
42:709-711, 1980及びY. Iritani et al., Am. J. Vet.
Res., 41:2114-2118, 1980）、KumeらのＨＡ−Ｌ及び
ＨＡ−ＨＬは、それぞれIritaniらのタイプ１ＨＡ及び
タイプ２ＨＡに相当すると考えられている。Ｃ型（２
型）菌においても、Sawataらは、易熱性、トリプシン感
受性でグルタルアルデヒド固定鶏赤血球に対してＨＡ活
性を示す抗原が存在し、Ａ型菌のＨＡとは抗原性を異に
すると報告している（A. Sawata et al., Am. J. Vet.
Res., 43:1311-1314, 1982）。しかし、Iritaniらが報
告したＡ型菌の産生するタイプ１ＨＡを除いて、感染防
御抗原は物質として明確に同定されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、従来
のヘモフィルス・パラガリナルム菌体をチメロサール、
ホルマリン等で不活化したワクチンを鶏に大量に使用し
た場合には、感染防御に関与する抗原以外に、菌体に由
来する種々の物質が含まれているために、上記の様な副
作用を生じるという問題点があった。本発明は、ヘモフ
ィルス・パラガリナルムを病因菌とする鶏伝染性コリー
ザに対する、副作用の少ない、より安全で、有効なワク
チン及びその製造方法を提供することを目的としてい
る。
【００１０】すなわち、本発明の目的は、ヘモフィルス
・パラガリナルムＡ型菌の新規なポリペプチド及びその
一部のアミノ酸配列を含むペプチドを提供することにあ
る。
【００１１】また、本発明の他の目的は、ヘモフィルス
・パラガリナルムＡ型菌の新規なポリペプチド及びその
一部のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする遺伝子
及びその遺伝子を発現させるための組換えベクターを提
供することにある。
【００１２】本発明の更に他の目的は、上記組換えベク
ターで形質転換された微生物及び細胞形質転換体から、
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌の新規なポリペプ
チド及びその一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドを
製造する方法を提供することにある。
【００１３】本発明の更に他の目的は、かくして得られ
たヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌の新規なポリペ
プチド及びその一部のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を免疫原として作製されるモノクローナル抗体及びポリ
クローナル抗体を提供することにある。
【００１４】本発明の更に他の目的は、上記のペプチ
ド、ＤＮＡ断片、形質転換体、もしくは抗体の組み合わ
せによるヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌及び該菌
体に対する抗体を検出する方法を提供することにある。
【００１５】本発明の更に他の目的は、ヘモフィルス・
パラガリナルムＡ型菌の新規なポリペプチドに対する抗
体を主成分とする鶏伝染性コリーザの治療剤を提供する
ことにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヘモフィル
ス・パラガリナルムＡ型菌の培養液中に、ＨＩ抗体産生
を誘導し、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌による
鶏伝染性コリーザを防御する該Ａ型菌に由来する分子量
約１３０Ｋｄのポリペプチドを発見した。更に、該Ａ型
菌よりゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、この中から
上記の１３０Ｋｄポリペプチドをコードする遺伝子断片
をクローニングし、これを大腸菌にて発現させ、得られ
た該ポリペプチドがヘモフィルス・パラガリナルムＡ型
菌による鶏伝染性コリーザを阻止することを見い出し、
本発明を完成するに至った。
【００１７】また、本発明は、上記の新規なポリペプチ
ド又はその一部のアミノ酸配列を含有するペプチドを免
疫原として作製されるポリクローナル抗体及びモノクロ
ーナル抗体を包含する。
【００１８】また、本発明は、上記の新規なポリペプチ
ドをコードし、配列番号：１で示される遺伝子断片ある
いは該ポリペプチドの一部のアミノ酸配列を含有するペ
プチドをコードする遺伝子断片並びにこれらの遺伝子断
片を含む組換えＤＮＡ分子を包含する。
【００１９】更に、上記組換えＤＮＡ分子によって形質
転換された組換え微生物及び細胞を包含する。また、こ
れらの形質転換体を用いて、目的とする新規なポリペプ
チド又はその一部のアミノ酸配列を含むペプチドを製造
する方法を包含する。
【００２０】以下に、本発明について更に詳述する。本
発明のＨＩ抗体産生を誘導するヘモフィルス・パラガリ
ナルムＡ型菌由来のポリペプチドは、ＨＩ活性を有する
モノクローナル抗体をリガンドとするアフィニティーク
ロマトグラフィーを行うことにより該Ａ型菌の培養上清
又は菌体の破砕液から調製される。
【００２１】ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（以
下、ＨＩ−ＭＣＡと称することもある）は、今日では常
法となっている細胞融合法により、ヘモフィルス・パラ
ガリナルムＡ型菌に結合するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを作製し、次いで、この中からＨＩ
試験により、ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを選択することにより取得できる。
【００２２】上記の抗体を作製する際の免疫原として用
いられるヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌は、通常
のヘモフィルス・パラガリナルムの培養に用いられる方
法に準じて得られる。例えば２２１株は、鶏血清加鶏肉
汁培地（培地１０００ｍｌ中、鶏肉水３００ｍｌ、鶏血
清１０ｍｌ、ポリペプトン５ｇ、ブドウ糖１ｇ、カザミ
ノ酸１ｇ、グルタミン酸ナトリウム５ｇ、塩化ナトリウ
ム５ｇ、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
０．０２５ｇを含む）中で３７℃、一夜振盪培養し、遠
心分離することによって回収できる。
【００２３】免疫は一般的方法により、例えば、上記の
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌をチメロサール、
ホルマリン等で不活化した後、これを通常のアジュバン
トを併用してＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与、皮下投
与、皮内投与あるいは静脈内投与することにより行われ
る。免疫原としては、菌体そのものあるいはロダン化カ
リウム、超音波、ヒアルロニダーゼ等で処理した菌体も
しくはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等の界面
活性剤で処理した加工抗原であってもよい。アジュバン
トとしてはフロインド完全アジュバント、フロインド不
完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲル等が使用さ
れる。より具体的には以下のように行う。鶏血清加鶏肉
汁培地中で培養したヘモフィルス・パラガリナルムＡ型
菌２２１株をチメロサールで不活化した後、これを超音
波処理する。得られた破砕液とフロインド完全アジュバ
ントを混合して得たエマルジョンをＢＡＬＢ／ｃマウス
の背部皮下に投与し、その後２〜４週間おきに同量を不
完全アジュバントとともに調整したエマルジョンを背部
皮下に投与する。血清抗体をチェックし、抗体価があが
っていることを確認した後、最終免疫として、更に、２
〜４週間後に、超音波破砕液を静脈内投与する。
【００２４】モノクローナル抗体を作製する際の免疫細
胞としては、最終投与の２〜４日後に摘出した脾臓細胞
を用いるのが好ましい。マウスミエローマ細胞として
は、例えば、ＮＳＩ−Ａｇ４／１（Eur. J. Immunol.,
6:511, 1976）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Curr. Top
ics Microbiol. Immunol., 81:1, 1978）、Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３（J. Immunol., 123:1548, 1979）等を使
用することができる。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞
との融合反応はMilsteinらの方法（Method Enzymol., 7
3, 3−46, 1981）に準じて行うことができる。すなわ
ち、融合する際には、マウスミエローマ細胞に対し、１
〜１０倍程度の脾臓細胞が用いられる。また、融合促進
剤としては、分子量１，０００〜６，０００のポリエチ
レングリコールが３０〜５０％（w/v）の濃度で使用さ
れる。より具体的には、細胞融合は、約１０8個の脾臓
細胞と約 １０7個のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１ミエロー
マ細胞を用いて、予め３７℃に加温した４５％ポリエチ
レングリコール４，０００を含むリンパ細胞の培養に通
常に用いられる培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０ 培地
中で行うのが好ましい。
【００２５】ハイブリドーマは、未融合細胞が死滅する
のに十分な時間、通常数日〜数週間ＨＡＴ培地中で培養
することにより得られる。かくして得られるハイブリド
ーマに対し、その培養上清を用いて、通常の限界希釈法
に従い、目的とする抗体産生株の選択及びクローン化が
行われる。
【００２６】ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌を認
識する抗体を産生する株の検索は、通常使用されるＥＬ
ＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法等に従って
行われる。上記方法に使用される抗原はヘモフィルス・
パラガリナルムＡ型菌体の懸濁液、該菌体をロダン化カ
リウム、超音波、ヒアルロニダーゼ等で処理した菌体、
該菌体の界面活性剤による抽出液のいずれであっても良
い。
【００２７】次いで、ＨＩ活性を有する抗体を産生する
株が、上記ハイブリドーマの培養上清もしくは該ハイブ
リドーマを投与したマウスの腹水を用い、通常に行われ
ているＨＩ試験に従って検索される。ＨＡ抗原として
は、ヘモフィルス・パラガリナルム菌体の懸濁液あるい
は該菌体をロダンカリ、超音波、ヒアルロニダーゼ等で
処理した菌体が使用される。ＨＩ試験に用いる赤血球
は、０．５％新鮮鶏赤血球、グルタルアルデヒド固定１
％鶏赤血球あるいはホルマリン固定１％鶏赤血球のいず
れでも良いが、好ましくは、グルタルアルデヒド固定鶏
赤血球が用いられる。
【００２８】より具体的には、５倍量の２５％カオリン
溶液で処理した腹水の遠心上清をグルタルアルデヒド固
定鶏赤血球の沈澱に加え、３７℃で６０分間振盪感作す
る。この上清の２倍階段希釈液に４赤血球凝集単位を含
む２２１株の菌懸濁液を等量加えて混和後１５分間静置
する。次に、グルタルアルデヒド固定１％鶏赤血球懸濁
液を加え、室温に６０分間静置した後、管底像により判
定する。赤血球凝集を阻止する最高希釈倍数をＨＩ抗体
価とする。
【００２９】かくして得られたＨＩ活性を有するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマからの該抗体の
採取には、該ハイブリドーマを大量に培養し、その培養
上清から又は該ハイブリドーマに適合するマウスにこれ
を投与して増殖させ、その腹水から得る方法等がとられ
る。
【００３０】モノクローナル抗体の精製は、蛋白質化学
において通常使用される方法、例えば、塩析法、限外濾
過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト
グラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィ
ニティークロマトグラフィー法等を適宜選択して行えば
よい。より具体的には、腹水からのモノクローナル抗体
の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア製 ）及びＭＡＰＳ−IIマウ
スモノクローナル抗体精製キット（バイオ・ラッド製）
を用い、製造業者のプロトコールに従うことによって達
成される。
【００３１】本発明のＨＩ抗体産生を誘導するヘモフィ
ルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドの精製
に使用されるＨＩ活性を有する抗体をリガンドとするア
フィニティーカラムは、一般的な方法、例えば、製造業
者のプロトコールに従い、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄカラム（ファルマシア製）に、精製した
上記抗体を結合させることにより得られる。
【００３２】かくして調製されたアフィニティークカラ
ムを用いることにより、該Ａ型菌の培養上清又は菌体の
破砕液から、ＨＩ抗体産生を誘導するヘモフィルス・パ
ラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドを得ることがで
きる。具体的には、２２１株を鶏血清加鶏肉汁培地中で
３７℃、２日間培養した上清から、高いＨＩ抗体産生能
と鶏伝染性コリーザを防御する活性を有する分子量約１
３０Ｋｄのポリペプチドを取得した。
【００３３】このようにして得られたポリペプチドのア
ミノ酸配列は、エドマン分解法など一般的な方法（P. E
dman, Acta Chem.Scand., 4:283, 1950）により決定す
ることができる。該ポリペプチドのＮ末端側アミノ酸配
列を配列表の配列番号：２に示す。
【００３４】ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来
のポリペプチドをコードする遺伝子又はその断片のクロ
ーン化は、Sambrookらが述べている一般的な方法（Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. ,198
9）に従い行うことができる。すなわち、上述した方法
によりヘモフィルス・パラガリナルムＡ型２２１株を培
養、回収した後、セパジーンキット（三光純薬社製）を
用い、添付のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを抽出
・精製し、これを適当な制限酵素（好ましくは、Ｅｃｏ
ＲＩが使用される）で切断し、市販のクローニングベク
ター（例えば、λｇｔ１１）に挿入し、ＤＮＡライブラ
リーを調製する。この中から、ＨＩ活性を有する適当な
抗体と反応する抗原を発現しているクローンを選択す
る。ＨＩ活性を有する抗体としては、上記の方法により
得られたモノクローナル抗体を含むハイブリドーマの培
養上清又はマウスの腹水等が挙げられるが、好ましく
は、ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体をリガンドと
するアフィニティークロマトグラフィーによって得られ
たヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプ
チドで免疫した抗血清が使用される。このようにして得
られた組換えλｇｔ１１ファージＤＮＡ中の外来ＤＮＡ
断片の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７型）によ
り決定することができる。また、得られた外来ＤＮＡ断
片の新規性は、その全塩基配列と既存のデータベース
（例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ、ＥＭＢＬなど）とのホモ
ロジー検索を行うことにより確認できる。
【００３５】例えば実施例３に示すように、ＤＮＡライ
ブラリーからは、１０個の陽性λｇｔ１１ファージが得
られ、これらのファージＤＮＡは、アガロース電気泳動
法の結果から、いづれも約１．２ｋｂの外来ＤＮＡ断片
（以下、ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡと称することもある）を
含有する。その外来ＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番
号：１に記載の１９８８番目から３１５７番目の塩基配
列に相当する。このＨＰＧ１．２ｋＤＮＡ断片には、開
始及び終止コドンが見い出されないので、該ＤＮＡ断片
は上記のヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来ポリ
ペプチドの一部をコードしていると考えられる。該ポリ
ペプチドの全長をコードする遺伝子は、ＨＰＧ１．２ｋ
ＤＮＡ断片をプローブとし、より長鎖のＤＮＡ断片を
得、その断片の塩基配列を調べ、配列内に開始コドン及
び終止コドンを見い出すことにより達成される。
【００３６】より具体的には、ヘモフィルス・パラガリ
ナルムＡ型菌２２１株ゲノムＤＮＡを１．２ｋｂＤＮＡ
断片の内部で切断しない制限酵素（例えばＨｉｎｄ II
I）で切断した後、これをアガロース電気泳動法によ
り、各ＤＮＡ断片を分離する。ＤＩＧ−ＤＮＡ標識キッ
ト（ベーリンガーマンハイム製）を用いて、ジゴキシゲ
ニンで標識した１．２ｋｂＤＮＡ断片をプローブとし
て、サザンハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮ
Ａ断片を検出する。その結果、１．２ｋbＤＮＡ断片と
ハイブリダイズする約３．５ｋｂのＨｉｎｄ III 消化
ＤＮＡ断片（以下ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡ断片と呼ぶこと
もある）を得た。このＨＰＧ３．５ｋＤＮＡ断片の塩基
配列及び該塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列表の
配列番号：１に示す。前述のＨＰＧｐ１３０ポリペプチ
ドのＮ末端側アミノ酸配列と一致する配列を、配列表の
配列番号：１に記載の１番目から１３番目のアミノ酸配
列に見いだした。
【００３７】上記のヘモフィルス・パラガリナルムＡ型
菌由来ＤＮＡ断片は、これをプローブとして、血清型の
異なるモフィルス・パラガリナルムＢ型菌及びＣ型菌由
来のＤＮＡ断片、更には該ＤＮＡ断片がコードするポリ
ペプチドを取得するために使用することができる。
【００３８】かくして得られたＤＮＡ断片あるいはその
一部を適当な発現ベクターに組み込み、これを用いて、
微生物又は動物細胞を形質転換し、形質転換体を培養す
ることにより、本発明のヘモフィルス・パラガリナルム
Ａ型菌由来のポリペプチドあるいはその一部のアミノ酸
配列を含むペプチドを生産することができる。このよう
な一部のペプチドを生産する場合は、ペプチド合成機を
利用することもできる。
【００３９】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の上流に、分泌のための微生物用又は動物細胞用の適当
なシグナル配列を接続すれば、該ポリペプチドを培地中
に分泌発現させることも可能である。このように分泌型
に改変したＤＮＡは、培地中に分泌した該ポリペプチド
の精製を容易にする点で有用である。シグナル配列とし
ては、大腸菌用としてｐｅｌＢシグナル(S. P. Lei et
al., J. Bacteriology,169:4379−4383, 1987)、酵母用
としてαｆａｃｔｏｒのシグナル(A. J. Brake, Yeast
Genetic Engineering, p269 Butterworth, 1989)、動物
細胞用としてイムノグロブリンのシグナルＳＧ−１(H.
Maeda et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 2:124−13
4, 1991)、Ｃ２５のシグナル(特許、国際公開番号WO 94
/20632)などが挙げられる。
【００４０】発現ベクターとしては、プラスミド、ウイ
ルスベクター等を用いることができる。該発現ベクター
に含まれるプロモーターは、宿主として用いる微生物又
は動物細胞との組み合わせにより、lａｃ、ｔａｃ、ｐ
ｈｏ５、ａｄｈ、ＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期、βアク
チンなど、最終的に鶏伝染性コリーザを防御する活性を
有するポリペプチドが得られるのであればどのようなも
のでも良い。また、他の蛋白質やペプチド、例えば、β
−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ、マルトース結合蛋白、プロテインＡ、ヒスチジ
ンヘキサマー等との融合蛋白として発現させることもで
きる。マーカー遺伝子として、微生物細胞用発現ベクタ
ーを用いる場合は、宿主として大腸菌を用いる場合アン
ピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、宿
主として酵母を用いる場合β−イソプロピルリンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２）遺伝子などが利用される。
また、動物細胞用発現ベクターを用いる場合は、アミノ
グリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺
伝子やジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、グル
タミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子などを利用できる。選択
用添加物質としては、Ｇ４１８、ネオマイシン、メソト
レキセート等が例示される。
【００４１】宿主細胞の形質転換は公知の方法、例え
ば、塩化カルシウム法、燐酸カルシウム共沈澱法、ＤＥ
ＡＥデキストラン法、リポフェクチン法、プロトプラス
トポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法など
が利用でき、用いる宿主細胞により適当な方法を選択す
ればよい。
【００４２】本発明のヘモフィルス・パラガリナルムＡ
型菌由来の新規ポリペプチドあるいはその一部のアミノ
酸配列を含むペプチドは、以下の方法により製造され
る。例えば、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ社製）にＨＰＧ３．５ｋＤＮＡ断片を組み
込み、これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換を
行う。形質転換細胞の中から、該ポリペプチドに対する
抗体との反応性を指標とするドットブロット法により、
目的の新規ポリペプチドを生産する形質転換細胞をスク
リーニングする。この細胞の超音波破砕液の遠心上清で
免疫された鶏は，Ａ型菌２２１株の攻撃に対し、高い防
御能を有する。新規ポリペプチドの精製は、該ポリペプ
チドを産生する形質転換細胞を大量培養し、回収したそ
の細胞抽出液又は培養上清から、前述した蛋白質化学に
おいて通常使用される方法を適宜選択することにより達
成される。
【００４３】かくして得られるヘモフィルス・パラガリ
ナルムＡ型菌由来の新規なポリペプチドは、鶏伝染性コ
リーザを防御する活性を有するものである。ヘモフィル
ス・パラガリナルムＡ型菌由来の該新規ポリペプチド、
該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体及びポリク
ローナル抗体並びに上記の発現ベクターは、鶏伝染性コ
リーザのワクチン及び治療薬として、単独であるいは薬
剤として投与可能な適当な担体、希釈液又は安定剤を添
加することにより、注射剤、経口剤等の任意慣用の方法
で医薬品に使用される。
【００４４】上述のヘモフィルス・パラガリナルムＡ型
菌由来の新規ポリペプチド及びその一部のアミノ酸配列
を含むポリペプチドは、上述した方法により、ポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体を作製するための免
疫原として使用される。また、該ポリペプチド及びこれ
らとの結合能を有する抗体は、ウエスタンブロット法、
ＥＬＩＳＡ法などの抗原及び抗体検出系に利用すること
ができ、診断薬を構築する材料となる。また、上記の抗
体を適当な担体に結合させ、これを用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーにより、上記のポリペプチドを精
製することができる。
【００４５】
【発明の効果】本発明によると、鶏伝染性コリーザを予
防するためのヘモフィルス・パラガリナルム由来の新規
なポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする遺伝子
断片並びに治療薬として使用可能なＨＩ活性を有する抗
体が提供される。
【００４６】本発明者が見い出したヘモフィルス・パラ
ガリナルム由来のポリペプチドは、分子量が約１３０Ｋ
ｄで、ＨＩ抗体産生を誘導する活性を有し、ヘモフィル
ス・パラガリナルムによる鶏伝染性コリーザを防御する
ための重要な新規なポリペプチドである。該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子の単離、発現ベクターの構築、発
現細胞の作製、上記ポリペプチドの精製法など、該ポリ
ペプチドを実用化するための技術的な問題は本発明によ
り解決され、従来技術に比較してより効果的なワクチン
を提供することが可能になった。更に、これらは、迅速
かつ簡便な鶏伝染性コリーザ診断薬を提供するための材
料としても有用である。以下に実施例を挙げて本発明を
さらに具体的に説明する。
【００４７】
【実施例】実施例１：モノクローナル抗体の作製及び性状 １）モノクローナル抗体の作製 ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株を鶏血清
加鶏肉汁培地１００ｍｌに接種し、３７℃で一夜振盪培
養した後、遠心分離（８，０００回転、２０分間）によ
り菌体を回収した。得られた菌体をＰＢＳで遠心洗浄
後、約５ｘ１０10個／ｍｌとなるように０．０１％チメ
ロサールを含むＰＢＳに懸濁した。この懸濁液をＢｒａ
ｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ３５０を使用して２０ｋ
Ｈｚで、４℃、１０分間超音波にかけた（０．５秒間超
音波にかけ、０．５秒間の冷却を交互に実施）。このよ
うにして得られた超音波破砕液とフロインドの完全アジ
ュバントとを等量ずつ混合し、ｗａｔｅｒ ｉｎ ｏｉ
ｌの状態になるまで充分混和した。このエマルジョン
０．１ｍｌずつをＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下２箇所
に投与し、４週間後に、フロインドの不完全アジュバン
トで上記と同様に調製したエマルジョン０．１ｍｌずつ
を背部皮下２箇所に投与した。さらに１８日後に超音波
破砕液０．１ｍｌを静脈内投与した。
【００４８】最終投与の３日後に脾臓細胞を採取した。
１ｘ１０8個の該脾臓細胞と１ｘ１０7個のマウスミエロ
ーマ細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１をパディングにより
混合し、これに予め３７℃に加温した４５％ポリエチレ
ングリコール４,０００を含むＲＰＭＩ１６４０培地を
加え、細胞融合を行わせた。この融合反応後の細胞をＨ
ＡＴ培地（１ｘ１０-4Ｍヒポキサンチン、４ｘ１０-7Ｍ
アミノプテリン、１．６ｘ１０-5Ｍチミジンを添加した
５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁
し、細胞培養用９６ウエルマイクロプレート（コーニン
グ製）に分注後、３７℃、５％炭酸ガスの条件下で培養
した。
【００４９】ハイブリドーマの増殖が認められたウエル
について、以下に記載するＥＬＩＳＡ法を用いて、培養
上清中のヘモフィルス・パラガリナルムを認識する抗体
の存在の有無を検索した。上記の方法により調製したヘ
モフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株の超音波破
砕液をＰＢＳで３００倍希釈し、ＥＬＩＳＡ用マイクロ
プレート（イムロンII、ダイナテック製）のウエルに１
００ｕｌずつ分注し、４℃で一夜放置した後、５％スキ
ムミルクを含むＰＢＳ（１ウエル当たり２００ｕｌ）で
室温、２時間マスキングを行った。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、５％スキ
ムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈したハイブリド
ーマ培養上清を１００ｕｌ加え室温で２時間反応させ
た。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％スキムミルクを含むＰＢ
Ｓ−Ｔで１０，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識
抗マウスＩｇＧ（バイオ・ラッド製）を１００ｕｌずつ
加え室温で２時間反応させた。さらに、ＰＢＳ−Ｔで洗
浄後、１１ｍｌ当たりオルト−フェニレンジアミン二塩
酸塩（ＯＰＤ、片山化学製）６ｍｇ及び過酸化水素水
（Ｈ2Ｏ2 ３１％含有、三菱瓦斯化学製）４．７５ｕｌ
を含む０．０５Ｍクエン酸−０．１Ｍリン酸水素二ナト
リウムバッファー（ｐＨ５．０）を１００ｕｌずつ加え
室温で３０分間反応させた。３Ｍ硫酸を５０ｕｌずつ加
え反応停止後、各ウエルの吸光度（４９０ｎｍ）をＥＬ
ＩＳＡ用オートリーダーで測定した。
【００５０】培養上清中にヘモフィルス・パラガリナル
ムＡ型菌に対する抗体が認められたウエルのハイブリド
ーマは、さらに限界希釈法でクローニングを行い、単ク
ローンとした。このようにして、ヘモフィルス・パラガ
リナルムＡ型菌に対するモノクローナル抗体を産生する
株９クローンを得た。
【００５１】２）モノクローナル抗体のＨＩ活性 これらのハイブリドーマを大量に培養し、免疫抑制剤の
プリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペンタ
デカン、アルドリッチ製）で前処理したＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に投与して増殖させ、１０〜２０日後に産
生された腹水を屠殺開腹したマウスより採取し、得られ
た腹水中のＨＩ活性を調べた。
【００５２】ＨＩ試験に用いるＨＡ抗原としてヘモフィ
ルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株のチメサール不活
化菌懸濁液を用い、ＨＡ価を基に調整した。まず、Ｖ型
マイクロプレート（三光純薬製）を用い、上記のＨＡ抗
原の２倍階段希釈液０．０５ｍｌにグルタルアルデヒド
固定１％鶏赤血球懸濁液０．０５ｍｌを加え、室温に６
０分間静置した後、管底像により判定した。赤血球を凝
集させる最高希釈倍数をＨＡ価とし、このときのＨＡ抗
原濃度を１単位とし、ＨＩ試験には４単位になるように
該ＨＡ抗原液を調整した。
【００５３】次に、マウス腹水０．２ｍｌに５倍量の２
５％カオリン溶液を加えて３７℃で３０分間振盪感作
し、遠心分離により上清を得た。グルタルアルデヒド固
定１０％鶏赤血球２ｍｌを遠心し得られた沈澱に、この
カオリン処理済の遠心上清を加え、３７℃で６０分間振
盪感作した。感作後、遠心により上清を得、５倍希釈マ
ウス腹水としてＨＩ抗体の測定に使用した。Ｖ型マイク
ロプレートを用い、この上清の２倍階段希釈液０．０２
５ｍｌに上記の４赤血球凝集単位を含む２２１株のチメ
ロサール不活化菌懸濁液を等量加えて混和後１５分間静
置した。充分感作したのちグルタルアルデヒド固定１％
鶏赤血球懸濁液０．０５ｍｌを加えた。室温に６０分間
静置した後、管底像により判定した。赤血球凝集を阻止
する最高希釈倍数をＨＩ抗体価とした。９クローンの内
３クローン（ＨｐｇＡ ５９−４０、ＨｐｇＡ ５９−
１４５、ＨｐｇＡ ５９−１８０）のモノクローナル抗
体が高いＨＩ活性を示した（表１）。尚、クローンＨｐ
ｇＡ ５９−１８０はＦＥＲＭ Ｐ−１５８３７とし
て、工業技術院生命工学工業技術研究所に出願人により
寄託されている。
【００５４】
【表１】
【００５５】３）モノクローナル抗体の防御活性 これらの抗体を含むマウス腹水０．３ｍｌを一群８〜１
０羽の４〜６週齢の白色レグホンＳＰＦ鶏の腹腔内にそ
れぞれ注射し、翌日にヘモフィルス・パラガリナルムＡ
型菌２２１株約１０8個を鼻腔内に滴下し攻撃した。対
照としてマウス腹水非投与群をおき、同様な攻撃を行
い、コリーザ症状（鼻汁の漏出、顔面腫脹、流涙）の有
無について１０日間観察した。あらかじめＨＩ活性を有
するモノクローナル抗体（以下、ＨＩ−ＭＣＡと称する
こともある）を投与していた群は３クローンとも、対照
群に較べて発症時期が遅れる傾向が見られた。一方、他
のクローンを投与していた群は、いずれも対照群との差
は認められなかった（図１〜４）。
【００５６】実施例２：ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原の
精製及び性状 １）ＨＩ−ＭＣＡの精製 ＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８０）をマウス腹水
からＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４
Ｂ（ファルマシア製）及びＭＡＰＳ−IIマウスモノクロ
ーナル抗体精製キット（バイオ・ラッド製）を利用し
て、添付のプロトコールに従い精製した。まず、マウス
腹水４ｍｌに等量の抗体精製キットに含まれる結合バッ
ファーを加え、０．４５ミクロンのステリベックス・フ
ィルター（ミリポア製）で濾過後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラム（ゲルベッド
ボリューム５ｍｌ）にかけ、結合バッファーで２８０ｎ
ｍの吸光度が０．０５以下になるまで充分洗浄した。次
いでキットに含まれる溶出バッファーでカラムに結合し
た抗体を溶出した。溶出した抗体は、０．５Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ
８．３）に対して透析し、精製ＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ
５９−１８０）４０ｍｇを得た。ＨＩ−ＭＣＡ（Ｈｐ
ｇＡ ５９−４０）についても同様に精製し１２ｍｇを
得た。
【００５７】２）ＨＩ−ＭＣＡの担体への結合 次に、精製したＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８
０）をリガンドとして、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄカラム（ファルマシア製）に、添付のプロ
トコールに従い結合させた。まず、ＨｉＴｒａｐ ＮＨ
Ｓ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄカラム（ゲルベッドボリューム
１ｍｌ）を１ｍＭ塩酸で洗浄後、これに前記の精製ＨＩ
−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ ５９−１８０）１０ｍｇの０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶
液（１０ｍｌ）を室温で３０分間循環させることにより
ＨＩ−ＭＣＡを結合させた。得られたＨＩ−ＭＣＡ結合
ＨｉＴｒａｐカラムを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．５Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー
（ｐＨ４．０）で交互に３回洗浄後、ＰＢＳで平衡化
し、ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原の精製に供試した。
【００５８】３）ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原の精製 ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株の培養液
から、ＨＩ−ＭＣＡをリガンドとしたアフィニティーク
ロマトグラフィーにより、抗原の精製を行った。尚、抗
原の検出は、以下に記載するＥＬＩＳＡ法を利用して行
った。
【００５９】前記の精製したＨＩ−ＭＣＡ（ＨｐｇＡ
５９−４０）を０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー
（ｐＨ９．０）で１．６ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈し、Ｅ
ＬＩＳＡ用マイクロプレートのウエルに入れ、４℃で一
夜放置した後、５％スキムミルクを含むＰＢＳで室温、
２時間マスキングを行った。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％
スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１０倍に希釈したカラ
ム溶出液を室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄
後、５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１０，０００
倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ＨＩ−ＭＣＡ抗体
（ＨｐｇＡ ５９−１８０）を室温で２時間反応させ
た。さらに、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＯＰＤ及び過酸化水
素水を含む基質液を加え室温で３０分間反応させた。ペ
ルオキシダーゼ標識ＨＩ−ＭＣＡ抗体（ＨｐｇＡ ５９
−１８０）はYoshitakeらの方法（J. Biochem., 92:141
3-1424, 1982）に準じて、前記の精製したＨＩ−ＭＣＡ
（ＨｐｇＡ ５９−１８０）に西洋わさびペルオキシダ
ーゼ（東洋紡製）を結合させることにより調製した。
【００６０】ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２
１株を鶏血清加鶏肉汁培地１００ｍｌに接種し、３７℃
で２日間振盪培養した。次に８，０００回転、２０分間
の遠心により菌体を除去した培養上清に、直ちにセリン
プロテアーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオリ
ドを１ｍＭになるように加え、０．４５ミクロンのステ
リベックス・フィルターにて濾過した。予めＰＢＳで平
衡化したＨＩ−ＭＣＡ結合ＨｉＴｒａｐカラムに、上記
の濾液６０ｍｌを添加後、ＰＢＳで洗浄し、２８０ｎｍ
の吸光度が０．０５以下になった時点で、ＨＩ−ＭＣＡ
と結合する抗原を３Mチオシアン酸ナトリウムで溶出し
た。ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原は素通り画分には認め
られず、ほとんどが３Mチオシアン酸ナトリウム溶出画
分に回収された。この溶出液を５０ｍＭ塩化ナトリウム
を含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に
対して透析した。
【００６１】４）ＨＩ−ＭＣＡが認識する抗原のＮ末端
側アミノ酸分析 アフィニティーカラムからの溶出液について２−メルカ
プトエタノール処理後、５−２０％ポリアクリルアミド
ゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をLaemmliの方法（Nat
ure, 227:680-685, 1970）に準じて行い、５０％メタノ
ール−１０％酢酸で溶解した０．２５％クマジーブリリ
アントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）で染色を行ったとこ
ろ、分子量約１３０Ｋｄのバンドが確認できた（図
５）。そこでこのポリペプチドをＨＰＧｐ１３０と名付
け、そのＮ末端側アミノ酸配列の決定を以下の方法に従
って行った。
【００６２】まず該精製ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドを
２−メルカプトエタノール処理後、５％ポリアクリルア
ミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動終了
後、ゲルをトランスファーバッファー（１０ｍＭ Ｎ−
サイクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、１
０％メタノール、ｐＨ１１）で洗浄し、あらかじめ１０
０％メタノール及びトランスファーバッファーの順に浸
しておいたポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜
（ミリポア製）上に重ね、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＣＥ
ＬＬ（バイオ・ラッド製）を用いて２０Ｖ、一夜転写を
行った。転写後のＰＶＤＦ膜を水洗し、４５％メタノー
ル−１０％酢酸に溶解した０．１％アミドブラックで３
０秒間染色後、蒸留水で脱色を行った。
【００６３】染色された分子量１３０Ｋｄのバンドを切
り出し、この膜をプロテインシークエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａ型）を用いて
分析した。Ｎ末端側の１３アミノ酸残基を解読した結
果、そのアミノ酸配列は配列番号：２で示されるＬｙｓ
−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒであ
った。
【００６４】５）ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドのＨＩ抗
体産生の誘導 ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドがＨＩ抗体産生を誘導する
かを調べた。該ＨＰＧｐ１３０ポリペプチド溶液（約４
０ｕｇ／ｍｌ）を同量のフロインドの完全アジュバント
と混合して調製したエマルジョン１ｍｌ（１匹当たりＨ
ＰＧｐ１３０ポリペプチド約２０ｕｇ）をモルモットの
背部皮下２箇所に注射し、免疫した。約３週間後に、フ
ロインドの不完全アジュバントで上記と同様に調製した
エマルジョン１ｍｌを背部皮下２箇所に注射した。さら
に２週間後に、フロインドの不完全アジュバントで調製
した同エマルジョンを背部皮下２箇所に追加投与し、そ
の４週間後に採血した。前記と同様の方法で、得られた
抗血清中のＨＩ抗体価を調べたところ、高いＨＩ抗体価
（５，１２０倍）を有していた。このように、ＨＰＧｐ
１３０ポリペプチドは、鶏伝染性コリーザの防御に深く
関わりがあると言われているＨＩ抗体の産生を誘導する
ことが明らかとなった。
【００６５】６）抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモ
ット血清が認識するペプチド 次に抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット血清が認
識するポリペプチドの解析をウエスタンブロット法で調
べた。まず、精製ＨＰＧｐ１３０ポリペプチド及び前述
の鶏血清加鶏肉汁培地中で培養したＡ型菌２２１株を２
ーメルカプトエタノール処理後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、泳動終了後、ゲルをトランスファーバッファー（２
５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノー
ル、ｐＨ８．３）に５分間浸し、あらかじめ１００％メ
タノール及びトランスファーバッファーの順に浸してお
いたＰＶＤＦ膜上に重ね、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＳＤ
ＣＥＬＬ（バイオ・ラッド製）を用いて７Ｖで１時間
転写を行った。この膜を５％スキムミルクを含むＰＢＳ
で４℃、一夜マスキングの後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、５
％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで１，０００倍に希釈
した抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット血清を室
温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％スキ
ムミルクを含むＰＢＳ−Ｔで２，０００倍に希釈したペ
ルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ
製）を室温で２時間反応させた。さらに、ＰＢＳ−Ｔで
洗浄後、１０ｍｌ当たり、３，３’−ジアミノベンジジ
ン四塩酸塩（ＤＡＢ、同仁化学製）５ｍｇ及び過酸化水
素水３ｕｌを含む０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ
７．５）に浸し反応させた。その結果、抗ＨＰＧｐ１３
０ポリペプチドモルモット血清はＨＰＧｐ１３０ポリペ
プチド及びその前駆体と考えられる分子量約１６０Ｋｄ
のバンドを認識した（図６）。
【００６６】７）ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドの免疫原
性 前記と同様の方法に従い、ＨＰＧｐ１３０ポリペプチド
溶液（約４０ｕｇ／ｍｌ）を同量のフロインドの完全ア
ジュバントで調製したエマルジョン ０．５ｍｌ（約１
０ｕｇのＨＰＧｐ１３０ポリペプチドを含有する）を１
０羽の５週齢の白色レグホンＳＰＦ鶏脚部皮下に注射
し、免疫した。３週間後に、フロインドの不完全アジュ
バントで上記と同様に調製したエマルジョン０．５ｍｌ
を脚部皮下に注射した。さらに２週間後に、フロインド
の不完全アジュバントで調製した同エマルジョンを脚部
皮下に追加投与し、初回免疫後７週目にヘモフィルス・
パラガリナルムＡ型菌２２１株で攻撃した。他に対照と
して、水酸化アルミニウムゲル（アルミニウム量換算で
０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した０．２５％ホルマリン不
活化Ａ型菌２２１株（不活化前生菌数４ｘ１０8個／ｍ
ｌ）０．５ｍｌを３週間の間隔で２回免疫した群及び非
免疫群をおき、同様な攻撃を行った。ＨＰＧｐ１３０ポ
リペプチドあるいはホルマリン不活化菌を免疫した群は
いずれも全羽について発症防御が認められた。尚、非免
疫群は全羽発症した（表２）。
【００６７】
【表２】
【００６８】実施例３：ヘモフィルス・パラガリナルム
Ａ型菌由来のポリペプチド（ＨＰＧｐ１３０）をコード
する遺伝子のクローニング １）ゲノムライブラリーからのスクリーニング ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株を鶏血清
加鶏肉汁培地５ｍｌに接種し、３７℃で一夜振盪培養し
た後、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を
ＰＢＳで遠心洗浄後、セパジーンキット（三光純薬製）
を用い、添付のプロトコールに従って該菌体のＤＮＡを
抽出・精製した。これを５０ｕｌのＴＥバッファー（１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸バッファー、
ｐＨ８．０）に溶解してゲノムＤＮＡ溶液とした。次
に、ｃＤＮＡ ｒａｐｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｏｄｕ
ｌｅ−λｇｔ１１（アマシャム製）を用い、添付のプロ
トコールに従って、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した該ゲ
ノムＤＮＡ０．２ｕｇを、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩで
処理したλｇｔ１１アーム０．５ｕｇに連結させ、さら
にλ−ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ
ｍｏｄｕｌｅ（アマシャム製）を用い、添付のプロト
コールに従って、ラムダファージに導入した。得られた
リコンビナントファージ液をゲノムライブラリーとし
た。
【００６９】上記ゲノムライブラリー液を、１０ｍＭ硫
酸マグネシウム水溶液に懸濁した大腸菌Ｙ１０９０株
（アマシャム製）約１０8個に加え、３７℃で１５分間
吸着させた。さらに４５℃に加温した重層用ＬＢ軟寒天
培地（１０００ｍｌ中、トリプトン１０ｇ、酵母エキス
５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン５０ｍｇ、
マルトース４ｇ、寒天８ｇを含む、ｐＨ７）を加え、Ｌ
Ｂ寒天培地（１０００ｍｌ中、トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン５０
ｍｇ、寒天１５ｇを含む、ｐＨ７）に重層し、４２℃で
３時間インキュベートした。次に、１０ｍＭイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶
液に浸し、風乾したニトロセルロース膜を上記のプレー
トに重層し、さらに３７℃で一夜インキュベートした。
ニトロセルロース膜をプレートより剥がし、ＰＢＳ−Ｔ
で洗浄後、５％スキムミルクを含むＰＢＳで室温、２時
間マスキングを行った。以後、実施例２の６）と同様の
方法に従い、抗ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドモルモット
血清、ペルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＧ及び基
質を順次反応させた。これらの一連の操作により、ヘモ
フィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株由来の抗ＨＰ
Ｇｐ１３０モルモット血清と特異的に反応する抗原を発
現しているプラークを得た。約５，０００プラークを上
記イムノスクリーニングすることで４３個の陽性プラー
クが得られた。該陽性プラークをＳＭバッファー（０．
１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム及び
０．０１％ゼラチンを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファ
ー、ｐＨ７．５）に回収し、クロロホルムを数滴加え４
℃に保存した。回収した陽性プラックのうち１０個につ
いて、一次スクリーニングと同様な操作で二次、三次ス
クリーニングを行った。
【００７０】イムノスクリーニングで陽性となった組換
えλｇｔ１１ファージを、１０ｍＭ硫酸マグネシウム水
溶液に懸濁した大腸菌Ｙ１０９０株約１０8個に加え、
３７℃で１５分間吸着させた。さらに０．４％マルトー
ス、５ｍＭ塩化カルシウム及びアンピシリン５０ｕｇ／
ｍｌを含むＬＢ液体培地１０ｍｌを加え、３７℃で一夜
培養した。クロロホルムを数滴加え溶菌させた後、遠心
により未溶菌の大腸菌及びその老廃物等を除去した培養
上清５ｍｌに等量の２０％ ポリエチレングリコール６,
０００を含む２．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、氷
中に１時間放置した後、１０，０００ｒｐｍの遠心によ
りλｇｔ１１ファージを沈殿させ、フェノール処理、イ
ソプロパノール沈澱により該ファージＤＮＡを回収し
た。得られたファージＤＮＡ約１５０ｕｇをＥｃｏＲＩ
で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行うこと
により、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株
由来のＤＮＡ断片を分離し、ＳｅｐｈａｇｌａｓTMＢａ
ｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ファルマシア製）を用い、添付
のプロトコールに従って、ゲルから該ＤＮＡ断片を溶
出、回収した。１０個の陽性ファージから得られたＤＮ
Ａ断片はいずれも約１．２ｋｂであった。そのうちの１
個のクローン（クローン２）のファージから得られたＤ
ＮＡ断片（以下、ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡと称する）を以
下の試験に用いた。
【００７１】２）ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡ断片の塩基配列 プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）をＥｃｏＲＩで消
化した後、５’末端リン酸をアルカリフォスファターゼ
処理により除去し、開裂したｐＵＣ１１９ＤＮＡをフェ
ノール・クロロホルム処理、エタノール沈澱により回収
した。開裂したｐＵＣ１１９と上記のＨＰＧ１．２ｋＤ
ＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝
酒造製）を用いて連結し、コンピーテントな大腸菌ＪＭ
１０９株（宝酒造製）を形質転換後、５０ｕｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むサークルグロウ寒天培地（ＢＩＯ
１０１製）で３７℃、一夜培養した。寒天培地上に生育
したコロニーを５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサ
ークルグロウ培地０．５ｍｌに接種し３７℃で５時間培
養後、アルカリ法で菌体内のプラスミドを抽出し、Ｅｃ
ｏＲＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動によ
ってヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株由来
の１．２ｋｂＤＮＡ断片と同じ長さのＤＮＡ断片を含む
組換えプラスミドを検出することにより形質転換大腸菌
を得た。
【００７２】得られた形質転換大腸菌を５０ｕｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含むサークルグロウ培地で培養後、Ｐ
ＥＧ沈澱法によって菌体内の組換えプラスミド（以下、
ｐＵＡ１．２と称する）を回収し、Ｐｒｉｍｅｒ Ｗａ
ｌｋｉｎｇ法により、ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡ断片の塩基
配列をＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ ３７７型）を用いて解析した。その結
果、１１７０塩基の配列が決定された。配列番号：１
に、後述のＨＰＧ３．５ｋＤＮＡの塩基配列を示すが、
ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡの塩基配列はこの配列の１９８８
番目から３１５７番目に相当し、３８９アミノ酸をコー
ドできること、開始及び終始コドンはこの配列内に存在
しないことが明らかになった。対応するアミノ酸配列も
示すが、ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドのＮ末端側アミノ
酸配列に相当する配列も認められなかった。従って、Ｈ
ＰＧ１．２ｋＤＮＡはＨＰＧｐ１３０ポリペプチドの一
部をコードしていると考えられた。
【００７３】３）ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡ遺伝子のクロー
ニング 上記のＨＰＧ１．２ｋＤＮＡ断片約０．３ｕｇをＤＩＧ
−ＤＮＡ標識キット（ベーリンガーマンハイム製）を用
い、添付のプロトコールに従って、ジゴキシゲニン（Ｄ
ＩＧ）で標識した。ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型
菌２２１株ゲノムＤＮＡを数種の制限酵素で切断後、適
当量を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、泳動後
ハイボンドＮ＋膜（アマシャム製）にトランスファーし
た。次に上記のＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡをプロ
ーブとして、ＤＩＧ標識核酸検出キット（ベーリンガー
マンハイム製）を用い、添付のプロトコールに従ってサ
ザンハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡを検
出した。その結果、ＨｉｎｄIIIで消化した約３．５ｋ
ｂ断片が、ＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡとハイブリ
ダイズしたことから、この断片を０．８％アガロースゲ
ル電気泳動で各断片から分離し、ＳｅｐｈａｇｌａｓTM
ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔを用い、添付のプロトコール
に従って、ゲルからＤＮＡ断片を溶出、回収した。
【００７４】一方、プラスミドｐＵＣ１１９を同じくＨ
ｉｎｄIIIで消化した後、５’末端リン酸をアルカリフ
ォスファターゼ処理により除去し、開裂したｐＵＣ１１
９ＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理、エタノール
沈澱により回収した。開裂したｐＵＣ１１９とヘモフィ
ルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株ゲノム由来の前記
ＨｉｎｄIII消化物（約３．５ｋｂ）をＤＮＡライゲー
ションキットｖｅｒ．２を用いて連結し、コンピーテン
トな大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換後、５０ｕｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含むサークルグロウ寒天培地で３７
℃、一夜培養した。形質転換大腸菌が生育した寒天培地
にハイボンドＮ＋膜をのせコロニーをリフト後、上記の
ＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡをプローブとして、常
法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い、Ｄ
ＩＧ標識核酸検出キットを用い陽性クローンを選別し
た。
【００７５】この陽性クローンを５０ｕｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むサークルグロウ培地で培養し、ＰＥＧ沈
澱法によって菌体内のプラスミドを回収した。得られた
組換えプラスミド（以下、ｐＵＡ３．５と称する）をＨ
ｉｎｄIIIで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動
を行うことにより、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型
菌２２１株由来の３．５ｋｂＤＮＡ断片を分離し、Ｓｅ
ｐｈａｇｌａｓTMＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔを用い、ゲ
ルから該ＤＮＡ断片（以下、ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡと称
する）を溶出、回収した。尚、組換えプラスミドｐＵＡ
３．５はＦＥＲＭ Ｐ−１５８３６として、工業技術院
生命工学工業技術研究所に出願人により寄託されてい
る。
【００７６】４）ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡの発現 発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
製）をＨｉｎｄIIIで消化後、５’末端リン酸をアルカ
リフォスファターゼ処理により除去し、開裂したｐＴｒ
ｃＨｉｓＣＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理、エ
タノール沈澱により回収した。開裂したｐＴｒｃＨｉｓ
Ｃと上記のＨＰＧ３．５ｋＤＮＡをＤＮＡライゲーショ
ンキットｖｅｒ．２を用いて連結し、コンピーテントな
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換後、５０ｕｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むサークルグロウ寒天培地で３７℃、一
夜培養した。寒天培地上に生育したコロニーを５０ｕｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地０．５
ｍｌに接種し３７℃で５時間培養後、アルカリ法で菌体
内のプラスミドを抽出し、ＨｉｎｄIIIで消化後、０．
８％アガロースゲル電気泳動によってヘモフィルス・パ
ラガリナルムＡ型菌２２１株由来の３．５ｋｂＤＮＡ断
片と同じ長さのＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを検
出することにより形質転換大腸菌を得た。
【００７７】さらに、得られた形質転換大腸菌を５０ｕ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むサークルグロウ培地１ｍ
ｌに接種し３７℃で３時間培養した後、ＩＰＴＧ（終濃
度１ｍＭ）を加えさらに３７℃で３時間培養した。培養
液より菌体を遠心で集菌し、ＰＢＳ５０ｕｌに懸濁し
た。１０ｕｌの菌懸濁液と等量の２％ＳＤＳを混合し、
５分間煮沸後、２ｕｌをニトロセルロース膜にスポット
した。ニトロセルロース膜を風乾後、５％スキムミルク
を含むＰＢＳで４℃、一夜マスキングを行った。以後、
実施例２の６）と同様の方法に従い、抗ＨＰＧｐ１３０
ポリペプチドモルモット血清、ペルオキシダーゼ標識抗
モルモットＩｇＧ及び基質を順次反応させた。これらの
一連の操作により、ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡが正方向に連
結した組換えプラスミドで形質転換された、抗ＨＰＧｐ
１３０モルモット血清と特異的に反応する抗原を発現し
ている大腸菌を得た。
【００７８】５）ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチド
の免疫原性 得られた形質転換大腸菌を５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むサークルグロウ培地２００ｍｌに接種し３７℃
で３時間培養した後、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え
さらに３７℃で３時間培養した。培養液より菌体を遠心
で集菌し、ＰＢＳ１０ｍｌに懸濁した。この懸濁液にリ
ゾチームを１００ｕｇ／ｍｌになるように加え、４℃で
１時間反応させた後、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓ
ｏｎｉｆｉｅｒ ３５０）を４℃で１０分間行い、溶菌
させた。遠心により未破砕の菌を除去し、得られた上清
を粗ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチドとした。
【００７９】粗ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチド溶
液と同量のフロインドの完全アジュバントを充分混和し
たエマルジョン ０．５ｍｌを１０羽の８週齢の白色レ
グホンＳＰＦ鶏脚部皮下に注射し、免疫した。約３週間
後に、フロインドの不完全アジュバントで上記と同様に
調製したエマルジョン０．５ｍｌを脚部皮下に注射し
た。さらに２週間後に、フロインドの不完全アジュバン
トで調製した同エマルジョンを脚部皮下に追加投与し、
初回免疫後７週目にヘモフィルス・パラガリナルムＡ型
菌２２１株で攻撃した。他に対照として、実施例２の
７）と同様に、ホルマリン不活化Ａ型菌２２１株免疫群
及び非免疫群をおき、同様な攻撃を行った。粗ＨＰＧ
３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチド免疫群は１０羽中７羽に
発症防御が認められた。尚、ホルマリン不活化菌を免疫
した群は全羽発症防御し、非免疫群は全羽発症した（表
３）。
【００８０】
【表３】
【００８１】６）ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡ断片の塩基配列 ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡ断片の塩基配列は、前述と同様
に、ＤＮＡシークエンサーにより解析した。その結果、
３４５０塩基の配列が決定された。配列表の配列番号：
１にその塩基配列を示すが、ＨＰＧｐ１３０ポリペプチ
ドのＮ末端側アミノ酸配列と一致するアミノ酸配列をコ
ードする領域を見いだした。ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡから
ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドと同じフレームでオープン
リーディングフレームを求めたところ、塩基番号２４３
から翻訳され１０６９個のアミノ酸をコードすることが
明らかとなった。該ＤＮＡ断片の配列内には終止コドン
はなく、ＨＰＧ３．５ｋＤＮＡはＨＰＧｐ１３０ポリペ
プチドの一部をコードするＤＮＡと推測された。対応す
るアミノ酸配列も示す。既存のデータベース（Ｇｅｎｅ
Ｂａｎｋ 及びＥＭＢＬ）とのホモロジー検索を行った
ところ、既知の塩基配列あるいはアミノ酸配列とのホモ
ロジーが認められなかったことから、ＨＰＧ３．５ｋＤ
ＮＡがコードするポリペプチドは新規物質と考えられ
た。
【００８２】実施例４：ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡとハイブ
リダイズするＤＮＡ断片のヘモフィルス・パラガリナル
ム２２１株以外からの検索 実施例３の１）と同様の方法に従い、Ａ型菌の２２１
株、０８３株、Ｗ株、Ｇｅｒｍａｎｙ株及びＧｅｏｒｇ
ｉａ株、Ｂ型菌のＳｐｒｏｓｓ株及び０２２２株、Ｃ型
菌のＭｏｄｅｓｔｏ株及び５３−４７株の計９株からゲ
ノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡを制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断後、実施例３の３）と同様の方法に
従い、ＤＩＧ標識ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡをプローブとし
て、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結
果、血清型によってサイズが異なるものの、いずれの株
にもＨＰＧ１．２ｋＤＮＡとハイブリダイズする断片が
検出された（図７）。
【００８３】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３４５０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株 配列 AA 2 GCTTTTTCGG GCGATTGAAG ACGGAATGTT ACTTTGGCAA GCGGTTTGAA ACCTTTGAAC 62 AGCTTGAAAA AGTGATTCAC GAGTACATTC ATTACTACAA CAATGAGCGT ATTCAAGTGA 122 AGCTCAAAGG ACTAAGCCCT GTGGAATACA GAACTCAGTC CTTGAATGAA ATTAGAATAT 182 AGTCTAACTT TTTGGGGCAG ATCAACACTC ATTTTTAATA TTAATATAGG AAAATGATTT 242 ATG AAT AAA GTT TTT AAA ATT AAA TAT TCT GTT GTA AAA CAA GAA 287 Met Asn Lys Val Phe Lys Ile Lys Tyr Ser Val Val Lys Gln Glu -70 -65 -60 ATG ATT GTG GTT TCA GAG CTA GCA AAT AAT AAA GAT AAA ACA GCT 332 Met Ile Val Val Ser Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp Lys Thr Ala -55 -50 -45 AGC CAA AAA AAC ACA CAT AAT ACT GCA TTT TTT CAA CCG CTA TTT 377 Ser Gln Lys Asn Thr His Asn Thr Ala Phe Phe Gln Pro Leu Phe -40 -35 -30 ACA AAG TGT ACA TAT CTT GCT CTT CTC ATT AAT ATC GCA CTA GGA 422 Thr Lys Cys Thr Tyr Leu Ala Leu Leu Ile Asn Ile Ala Leu Gly -25 -20 -15 GCA TCA TTA TTC CCT CAA TTA GCT AAT GCG AAG TGG TTA GAG GTT 467 Ala Ser Leu Phe Pro Gln Leu Ala Asn Ala Lys Trp Leu Glu Val -10 -5 -1 1 5 TAT AGT AGC TCC GTA AAA CTA TCT ACT GTT AGT GCA CAA AGT AAT 512 Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Ser Thr Val Ser Ala Gln Ser Asn 10 15 20 AGT GTT AAT CTT AAT CCA TCG GGA GCT GAG AGT GTT GGC ACA AAT 557 Ser Val Asn Leu Asn Pro Ser Gly Ala Glu Ser Val Gly Thr Asn 25 30 35 AGC CCA CAA GGG GTT GCT ATT GGC TAT GGT GCA ACC AAC GAT AGA 602 Ser Pro Gln Gly Val Ala Ile Gly Tyr Gly Ala Thr Asn Asp Arg 40 45 50 TCT GCA ACA GGA GCT ATT GCT CTT GGG GTT GGG GTA AAA AAT GAA 647 Ser Ala Thr Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val Gly Val Lys Asn Glu 55 60 65 ACT TTA GCG AAA GAC TCT ATT GCC ATT GGT TAT GGG GCA AAA AAT 692 Thr Leu Ala Lys Asp Ser Ile Ala Ile Gly Tyr Gly Ala Lys Asn 70 75 80 GAA AGC ACA GCA CCA AGT TCT GTG ACT ATT GGA AAA CAG GCG ATT 737 Glu Ser Thr Ala Pro Ser Ser Val Thr Ile Gly Lys Gln Ala Ile 85 90 95 AAC CGT TTT GAA AAA TCT ATT GTG ATG GGT CTT AAT GCT TAT ACA 782 Asn Arg Phe Glu Lys Ser Ile Val Met Gly Leu Asn Ala Tyr Thr 100 105 110 CAA TTA GAT CCC CGT GGA ACT AGT AAA GAA ACC CGT CAA GGT TCT 827 Gln Leu Asp Pro Arg Gly Thr Ser Lys Glu Thr Arg Gln Gly Ser 115 120 125 GTA GTG ATT GGG GAA AAT GCG AAA AGT GCT GGG AAT CAA TCT GTT 872 Val Val Ile Gly Glu Asn Ala Lys Ser Ala Gly Asn Gln Ser Val 130 135 140 TCT TTA GGG CAA AAT TCG TGG TCA AAA ACC AAT TCT ATT TCT ATT 917 Ser Leu Gly Gln Asn Ser Trp Ser Lys Thr Asn Ser Ile Ser Ile 145 150 155 GGG GCA GGA ACC TTT GCG GAA GGA AAA TCA AGC ATT GCT ATA GGG 962 Gly Ala Gly Thr Phe Ala Glu Gly Lys Ser Ser Ile Ala Ile Gly 160 165 170 ACT GAT AAA ATA TCA GGG ACT AAG TAT AAT GAC AAA TTG CCT GCT 1007 Thr Asp Lys Ile Ser Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Ala 175 180 185 ACT GCT TGG AAT GGA ACA GGC ACT GTT CCG AAA AAC TCC ATT TGG 1052 Thr Ala Trp Asn Gly Thr Gly Thr Val Pro Lys Asn Ser Ile Trp 190 195 200 GAT ATA TTT TCT GAG TTA TAT ATG GGG AAA CAG ACT AAC GGC AGA 1097 Asp Ile Phe Ser Glu Leu Tyr Met Gly Lys Gln Thr Asn Gly Arg 205 210 215 GAT TAT GAT ACA ACT ACT CGA GAC CCT AAT AAA CCG GAG GCA TTT 1142 Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Arg Asp Pro Asn Lys Pro Glu Ala Phe 220 225 230 TAT AAA TTT AGC GAT TTT AAA GGA AAA TAT GTC AAT ACC CCA ACT 1187 Tyr Lys Phe Ser Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Val Asn Thr Pro Thr 235 240 245 GCT TCA CCT ACT TAT GCA GGG AAA TTA GGG GCA ATT GCT CTA GGT 1232 Ala Ser Pro Thr Tyr Ala Gly Lys Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly 250 255 260 TCC CGC ACC ATT GCC GCG GGG GAA ATG TCC ACC GCA GTG GGT TCG 1277 Ser Arg Thr Ile Ala Ala Gly Glu Met Ser Thr Ala Val Gly Ser 265 270 275 TTA GCC TTT GCA TTG GCA GAT AGA TCC ACC GCA ATG GGG TTA CGT 1322 Leu Ala Phe Ala Leu Ala Asp Arg Ser Thr Ala Met Gly Leu Arg 280 285 290 TCT TTT GTT GCT AAA GAC GCC GTA GGT GGA ACG GCG ATC GGG GAA 1367 Ser Phe Val Ala Lys Asp Ala Val Gly Gly Thr Ala Ile Gly Glu 295 300 305 GAA TCT CGA ACC TTT GCT AAA GAT TCC GTT GCC ATT GGT AAT AAA 1412 Glu Ser Arg Thr Phe Ala Lys Asp Ser Val Ala Ile Gly Asn Lys 310 315 320 ACT GAA GCC TCA AAT GCT GGC TCA ATG GCT TAT GGT TAT AAG GCG 1457 Thr Glu Ala Ser Asn Ala Gly Ser Met Ala Tyr Gly Tyr Lys Ala 325 330 335 AAA GCA GTA GGT GCG GGA GCA ATC GCA ATT GGG ACA GAA GTC GCA 1502 Lys Ala Val Gly Ala Gly Ala Ile Ala Ile Gly Thr Glu Val Ala 340 345 350 GCA GGG GCT AAA TTT AAT AGC CAT CAA ACA GGA AAT TTA CTA CAG 1547 Ala Gly Ala Lys Phe Asn Ser His Gln Thr Gly Asn Leu Leu Gln 355 360 365 GAT AAT AAT GCT TAT GCT ACC TTA AAA AAT GCC GAT AAA TCA GAT 1592 Asp Asn Asn Ala Tyr Ala Thr Leu Lys Asn Ala Asp Lys Ser Asp 370 375 380 GAT ACT AAA ACC GGA AAT GCG ATT ACT GTA TTT ACC CAG TCT TTT 1637 Asp Thr Lys Thr Gly Asn Ala Ile Thr Val Phe Thr Gln Ser Phe 385 390 395 GAT AAT ATG CTT ACT AAT GGA TTA CCG CTG GTA AGT GAA AAC GAA 1682 Asp Asn Met Leu Thr Asn Gly Leu Pro Leu Val Ser Glu Asn Glu 400 405 410 ACC TAT TTA ACG ACC TCA GCG GGA GCA ATT AAA AAA ACT GCA ACA 1727 Thr Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Gly Ala Ile Lys Lys Thr Ala Thr 415 420 425 ACA GAC AGC AGT GCG GGG GGA GGT AAA AAT GCC ATT GCA ATT GGT 1772 Thr Asp Ser Ser Ala Gly Gly Gly Lys Asn Ala Ile Ala Ile Gly 430 435 440 AGT AAA ACC TTT GCC TCT AAA GCA AAT TCT GTG GCA TTA GGG AGC 1817 Ser Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ala Asn Ser Val Ala Leu Gly Ser 445 450 455 TAT GCC TTA GCC GAT GCC CAA AAT GCC TTT GCA CTA GGT TCT TAT 1862 Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Gln Asn Ala Phe Ala Leu Gly Ser Tyr 460 465 470 TCT TTT GTG GAA TCT TCA GCA ACA AAT ACA ATC ACA ATT GGT GTG 1907 Ser Phe Val Glu Ser Ser Ala Thr Asn Thr Ile Thr Ile Gly Val 475 480 485 GGA AGT TAT GCC AAA GGG AAA AAC AGT TTC TTA GGG GGG ACT TGG 1952 Gly Ser Tyr Ala Lys Gly Lys Asn Ser Phe Leu Gly Gly Thr Trp 490 495 500 GCA TCA ACC CTT TCA GAT CGG ACA GTT GTG CTA GGG AAT TCC ACT 1997 Ala Ser Thr Leu Ser Asp Arg Thr Val Val Leu Gly Asn Ser Thr 505 510 515 TCA ATT AGC TCA GGT TCT CAG AAT GCA TTA GCA ATC GGG GTG AAT 2042 Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gln Asn Ala Leu Ala Ile Gly Val Asn 520 525 530 GTC TTT ATT GGT AAT GAT AGT GCT TCT TCA TTG GCA TTA GGT ATG 2087 Val Phe Ile Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ser Leu Ala Leu Gly Met 535 540 545 GGT TCT ACT ATT GCG AAA AGT GCC AAA TCC CCT GAC AGC TTA GCC 2132 Gly Ser Thr Ile Ala Lys Ser Ala Lys Ser Pro Asp Ser Leu Ala 550 555 560 ATT GGT AAA GAG GCA CGA ATT GAC GCT AAA GAT ACA GAT AAT GGT 2177 Ile Gly Lys Glu Ala Arg Ile Asp Ala Lys Asp Thr Asp Asn Gly 565 570 575 ACT TTG TAT CAG CCT CAA GTT TAT GAT GAA ACT ACT CGA GCC TTT 2222 Thr Leu Tyr Gln Pro Gln Val Tyr Asp Glu Thr Thr Arg Ala Phe 580 585 590 AGA AAC TTT AAT GAA AGT AGC GAT TAT ATG CGT CAA GCA ATG GCA 2267 Arg Asn Phe Asn Glu Ser Ser Asp Tyr Met Arg Gln Ala Met Ala 595 600 605 TTA GGT TTT AAT GCT AAA GTT TCG CGT GGG GTG GGC AAA ATG GAA 2312 Leu Gly Phe Asn Ala Lys Val Ser Arg Gly Val Gly Lys Met Glu 610 615 620 ACG GGG ATT AAC TCG ATG GCG ATT GGT GCT TAT GCT CAA GCA ACT 2357 Thr Gly Ile Asn Ser Met Ala Ile Gly Ala Tyr Ala Gln Ala Thr 625 630 635 TTG CAA AAT TCC ACC GCA CTT GGG GTA GGC TCT AAA ACA GAT TAC 2402 Leu Gln Asn Ser Thr Ala Leu Gly Val Gly Ser Lys Thr Asp Tyr 640 645 650 ACT TGG GAA CAG TTA GAA ACC GAT CCT TGG GTA TCT GAA GGG GCA 2447 Thr Trp Glu Gln Leu Glu Thr Asp Pro Trp Val Ser Glu Gly Ala 655 660 665 ATC AGT ATC CCA ACT TCA GGT AAA ACT GGG GTT ATC TCT GTG GGT 2492 Ile Ser Ile Pro Thr Ser Gly Lys Thr Gly Val Ile Ser Val Gly 670 675 680 TCA AAA GGT TCA GAA CGT CGT ATT GTG AAT CTT GCT TCG GGT TCT 2537 Ser Lys Gly Ser Glu Arg Arg Ile Val Asn Leu Ala Ser Gly Ser 685 690 695 TCT GAT ACT GAT GCC GTG AAT GTT GCT CAG TTA AAA ACC GTT GAA 2582 Ser Asp Thr Asp Ala Val Asn Val Ala Gln Leu Lys Thr Val Glu 700 705 710 GAA CGT TTC CTA TCT GAA ATT AAT TTA TTA CAA AAT GGC GGT GGG 2627 Glu Arg Phe Leu Ser Glu Ile Asn Leu Leu Gln Asn Gly Gly Gly 715 720 725 GTG AAA TAT CTC TCT GTT GAA AAA ACG AAT ATC AAT GGA CAA TCG 2672 Val Lys Tyr Leu Ser Val Glu Lys Thr Asn Ile Asn Gly Gln Ser 730 735 740 GGG AGA GTG GCT AGC CAA ATT CGT AAA GGG GAA AAT TAT GAG CGA 2717 Gly Arg Val Ala Ser Gln Ile Arg Lys Gly Glu Asn Tyr Glu Arg 745 750 755 TAT GTG AAA TTA AAA ACA CAA TTG CTC TAT TTA GAT GCA CGA GGA 2762 Tyr Val Lys Leu Lys Thr Gln Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Gly 760 765 770 AAA TTA AAT GGA GAG AAG TTT GAT CAA AAT TCA TTA AAC AAA ATT 2807 Lys Leu Asn Gly Glu Lys Phe Asp Gln Asn Ser Leu Asn Lys Ile 775 780 785 CGT GCG GTA GTG CAA GAA CTT GAA GCG GAA TAT AGT GGC GAG TTA 2852 Arg Ala Val Val Gln Glu Leu Glu Ala Glu Tyr Ser Gly Glu Leu 790 795 800 AAA ACA ACC GCG TCA GCT CTC AAT CAG GTT GCA ACA CAA TTA GAG 2897 Lys Thr Thr Ala Ser Ala Leu Asn Gln Val Ala Thr Gln Leu Glu 805 810 815 CAA GAA GTA ACC ACA AAT AAC TTC GAC AAA TTT AAT CAA TAT AAA 2942 Gln Glu Val Thr Thr Asn Asn Phe Asp Lys Phe Asn Gln Tyr Lys 820 825 830 ACG CAG ATT GAG AAT GCA AGC AAT GCG GAT TCA GCA AGA AAT GTA 2987 Thr Gln Ile Glu Asn Ala Ser Asn Ala Asp Ser Ala Arg Asn Val 835 840 845 GGC GGC TTA ACC CCT CAA GCA ATT GCA CAG TTA AAA GCC AAT AAT 3032 Gly Gly Leu Thr Pro Gln Ala Ile Ala Gln Leu Lys Ala Asn Asn 850 855 860 AAC TAT CTT AAT GAT GGT GCA AAA GGG CAA GAC AGT ATT GCA TTT 3077 Asn Tyr Leu Asn Asp Gly Ala Lys Gly Gln Asp Ser Ile Ala Phe 865 870 875 GGC TGG CAG GCA AAA ACC TCA GGA GCT AAT AAT GGA TTA GCA GGG 3122 Gly Trp Gln Ala Lys Thr Ser Gly Ala Asn Asn Gly Leu Ala Gly 880 885 890 AAA CAA GCC ATT GCG ATT GGT TTC CAA GCG AAT TCT TCC GCT GAA 3167 Lys Gln Ala Ile Ala Ile Gly Phe Gln Ala Asn Ser Ser Ala Glu 895 900 905 AAT GCC ATT TCA ATC GGC ACG AAT TCG GAT ACC TCA ATG ACA GGG 3212 Asn Ala Ile Ser Ile Gly Thr Asn Ser Asp Thr Ser Met Thr Gly 910 915 920 GCA GTG GCG ATT GGT AAA GGT GCA ACG GTT ACT GCG GGT GGA AAA 3257 Ala Val Ala Ile Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Ala Gly Gly Lys 925 930 935 CCT TCC ATT GCA TTG GGG CAA GAT TCG ACG GTT GCC AAT TCC GCA 3302 Pro Ser Ile Ala Leu Gly Gln Asp Ser Thr Val Ala Asn Ser Ala 940 945 950 ATT AGC CGT ACA AGT TCA CCG ATG ATA AAT GGT TTA ATA TTC AAT 3347 Ile Ser Arg Thr Ser Ser Pro Met Ile Asn Gly Leu Ile Phe Asn 955 960 965 AAT TTT GCA GGT TCC CCT GAA ACA CTC GGT GTG TTA AGT ATC GGA 3392 Asn Phe Ala Gly Ser Pro Glu Thr Leu Gly Val Leu Ser Ile Gly 970 975 980 ACG GCT GGG AGA GAG CGT AAA ATT GTT AAT GTT GCA GCA GGC GAT 3437 Thr Ala Gly Arg Glu Arg Lys Ile Val Asn Val Ala Ala Gly Asp 985 990 995 GTT TCG CAA GCT T 3450 Val Ser Gln Ala
【００８4】
【配列表】
配列番号：２ 配列の長さ１３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株 配列 Lys Trp Leu Glu Val Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Ser 1 5 10
【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体（ＨｐｇＡ ５９−４０、
ＨｐｇＡ ５９−１８０、ＨｐｇＡ ５９−２８４）を
鶏に受身免疫した後、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ
型菌２２１株で攻撃した成績を示した図で、あらかじめ
ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クローンＨｐｇ
Ａ ５９−４０、ＨｐｇＡ ５９−１８０）を投与して
いた群は発症時期が遅れることを示す。
【図２】モノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９
−３３、ＨｐｇＡ５９−４８Ｂ、ＨｐｇＡ ５９−１８
０）を鶏に受身免疫した後、ヘモフィルス・パラガリナ
ルムＡ型菌２２１株で攻撃した成績を示した図で、あら
かじめＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クローン
ＨｐｇＡ ５９−１８０）を投与していた群は発症時期
が遅れることを示す。
【図３】モノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９
−４８Ａ、ＨｐｇＡ５９−１４５、ＨｐｇＡ ５９−１
８０）を鶏に受身免疫した後、ヘモフィルス・パラガリ
ナルムＡ型菌２２１株で攻撃した成績を示した図で、あ
らかじめＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クロー
ンＨｐｇＡ ５９−１４５、ＨｐｇＡ ５９−１８０）
を投与していた群は発症時期が遅れることを示す。
【図４】モノクローナル抗体（クローンＨｐｇＡ ５９
−１８８、ＨｐｇＡ５９−２３６、ＨｐｇＡ ５９−１
８０）を鶏に受身免疫した後、ヘモフィルス・パラガリ
ナルムＡ型菌２２１株で攻撃した成績を示した図で、あ
らかじめＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クロー
ンＨｐｇＡ ５９−１８０）を投与していた群は発症時
期が遅れることを示す。
【図５】ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体（クロー
ンＨｐｇＡ ５９−１８０）をリガンドとするアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製したＨＰＧｐ１３
０ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動し
た後、ＣＢＢ染色した結果を示す写真。
【図６】a)２−メルカプトエタノール処理した精製ＨＰ
Ｇｐ1３０ポリペプチド及びヘモフィルス・パラガリナ
ルムＡ型菌２２１株をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳
動した後、ＣＢＢ染色した結果を示す写真。b)２−メル
カプトエタノール処理した精製ＨＰＧｐ1３０ポリペプ
チド及びヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株
をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により電気泳動した後、薄膜（Ｐ
ＶＤＦ）に転写し、精製ＨＰＧｐ１３０ポリペプチドに
対するモルモット抗血清を用いて、これと反応する蛋白
質を検出した結果を示す写真。
【図７】制限酵素ＥｃｏＲＩ消化したヘモフィルス・パ
ラガリナルムＡ型菌、Ｂ型菌及びＣ型菌由来ゲノムＤＮ
Ａ断片をアガロース電気泳動した後、薄膜（ハイボンド
Ｎ＋）に転写し、ＨＰＧ１．２ｋＤＮＡをプローブと
し、これとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出した結
果を示す写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｆ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表の配列番号：１で示されるアミノ
    酸配列を有することを特徴とする新規ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 配列表の配列番号：１で示されるアミノ
    酸配列に対し、１もしくは数個がアミノ酸残基の欠失、
    付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有することを
    特徴とする新規ポリペプチド。
  3. 【請求項３】 配列表の配列番号：１で示されるアミノ
    酸配列の一部からなる新規ポリペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載のポリペプチドのアミノ
    酸配列に対し、１もしくは数個がアミノ酸残基の欠失、
    付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有することを
    特徴とする新規ポリペプチド。
  5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれかに記載のポ
    リペプチドのアミノ酸配列を有し、分子量が約１３０も
    しくは約１６０Ｋｄ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による）であ
    ることを特徴とする新規ポリペプチド。
  6. 【請求項６】 当該ポリペプチドがヘモフィルス・パラ
    ガリナルム由来であることを特徴とする請求項１ないし
    ５のいずれかに記載の新規ポリペプチド。
  7. 【請求項７】 ヘモフィルス・パラガリナルムがＡ型菌
    であることを特徴とする請求項６に記載の新規ポリペプ
    チド。
  8. 【請求項８】 当該ポリペプチドが遺伝子組換え技術に
    より得られる組換え型ポリペプチドであることを特徴と
    する請求項１ないし５のいずれかに記載の新規ポリペプ
    チド。
  9. 【請求項９】 請求項１ないし８のいずれかに記載の新
    規ポリペプチドをコードする塩基配列を含有することを
    特徴とする新規ＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】 前記ＤＮＡが配列表の配列番号：１に
    記載の塩基配列を含有する請求項９に記載の新規ＤＮ
    Ａ。
  11. 【請求項１１】 前記ＤＮＡが配列表の配列番号：１に
    記載の塩基配列の一部である請求項９に記載の新規ＤＮ
    Ａ。
  12. 【請求項１２】 配列表の配列番号：１に記載の塩基配
    列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズ
    することを特徴とする新規ＤＮＡ。
  13. 【請求項１３】 請求項９ないし１２のいずれかに記載
    の新規ＤＮＡを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分
    子。
  14. 【請求項１４】 組換えＤＮＡ分子のベクターがプラス
    ミド、ウイルスベクター、コスミドより選ばれる請求項
    １３に記載の組換えＤＮＡ分子。
  15. 【請求項１５】 請求項９ないし１２のいずれかに記載
    の新規ＤＮＡ又は請求項１３もしくは１４に記載の組換
    えＤＮＡ分子で形質転換した形質転換体。
  16. 【請求項１６】 形質転換体が、細菌、酵母、昆虫細
    胞、動物細胞、植物細胞より選ばれる宿主である請求項
    １５に記載の形質転換体。
  17. 【請求項１７】 請求項１ないし８のいずれかに記載の
    新規ポリペプチドを認識することを特徴とする新規抗
    体。
  18. 【請求項１８】 前記抗体がモノクローナル抗体である
    請求項１７に記載の新規抗体。
  19. 【請求項１９】 前記抗体がポリクローナル抗体である
    請求項１７に記載の新規抗体。
  20. 【請求項２０】 ＨＩ活性を有するモノクローナル抗体
    を用いることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか
    に記載の新規ポリペプチドの製造方法。
  21. 【請求項２１】 当該ポリペプチドがヘモフィルス・パ
    ラガリナルム由来であることを特徴とする請求項２０に
    記載の製造方法。
  22. 【請求項２２】 ヘモフィルス・パラガリナルムがＡ型
    菌であることを特徴とする請求項２１に記載の製造方
    法。
  23. 【請求項２３】 当該ポリペプチドが遺伝子組換え技術
    により得られる組換え型ポリペプチドであることを特徴
    とする請求項２０に記載の製造方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１５もしくは１６に記載の形質
    転換体を培養し、該形質転換体に請求項１ないし８のい
    ずれかに記載の新規ポリペプチドを生産させ、該新規ポ
    リペプチドを精製することを特徴とする請求項１ないし
    ８のいずれかに記載の新規ポリペプチドの製造方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１ないし８のいずれかに記載の
    新規ポリペプチドを主成分とする鶏伝染性コリーザのワ
    クチン。
  26. 【請求項２６】 請求項９ないし１２のいずれかに記載
    の新規ＤＮＡを主成分とする鶏伝染性コリーザのワクチ
    ン。
  27. 【請求項２７】 請求項１３もしくは１４に記載の組換
    えＤＮＡ分子を主成分とする鶏伝染性コリーザのワクチ
    ン。
  28. 【請求項２８】 請求項１５もしくは１６に記載の形質
    転換体を主成分とする鶏伝染性コリーザのワクチン。
  29. 【請求項２９】 請求項１７ないし１９のいずれかに記
    載の新規抗体を主成分とする鶏伝染性コリーザの治療
    剤。
  30. 【請求項３０】 請求項１ないし８のいずれかに記載の
    新規ポリペプチド、請求項９ないし１２のいずれかに記
    載の新規ＤＮＡ、請求項１３もしくは１４に記載の組換
    えＤＮＡ分子、請求項１５もしくは１６に記載の形質転
    換体又は請求項１７ないし１９のいずれかに記載の新規
    抗体を用いることを特徴とするヘモフィルス・パラガリ
    ナルムの検出方法。
  31. 【請求項３１】 請求項１ないし８のいずれかに記載の
    新規ポリペプチド、請求項１５もしくは１６に記載の形
    質転換体又は請求項１７ないし１９のいずれかに記載の
    新規抗体を用いることを特徴とするヘモフィルス・パラ
    ガリナルムに対する抗体の検出方法。
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