CN105198991A - 一种鸡传染性鼻炎单克隆抗体制备方法 - Google Patents
一种鸡传染性鼻炎单克隆抗体制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种鸡传染性鼻炎单克隆抗体制备方法，该技术方案利用B型菌株制备出副鸡禽杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，其所分泌的抗体为只针对B型菌株，与A、C型副鸡禽杆菌均不发生反应，从而保证了该单抗能够专门针对B型血清型疾病。与此同时，本发明利用该株单克隆抗体的特性，建立ELISA方法和免疫胶体金的方法，其特异性和敏感性好。可用于临床检测。此外，本发明制备的单抗效价高、特异性较好，尤其适用于进一步制备B型副鸡禽杆菌抗原诊断试剂盒或B型副鸡禽杆菌抗原诊断胶体金试纸。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有突出的推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种鸡传染性鼻炎单克隆抗体制备方法。
背景技术
鸡传染性鼻炎(IC)是由副鸡禽杆菌引起的一种上呼吸道传染病，主要影响蛋鸡产蛋率下降(10％-40％)以及育成鸡和肉鸡的生长，给养鸡业造成较大的经济损失。按照Page的分型方法，可将副鸡禽杆菌分为A、B和C三个血清型，各型之间几乎不产生交叉保护。预防该病最常见的方法是疫苗免疫，但由于无法区分三种血清型的病原，导致大量滥用疫苗，从而使得病原加速变异或免疫逃避，给该病的控制造成阻碍。因此建立一个能区分不同血清型的病原检测方法尤为重要。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡传染性鼻炎单克隆抗体制备方法，以解决现有技术中鸡传染性鼻炎预防方法难以区分其所针对的病原分型的技术问题。
本发明解决的另一技术问题是现有技术中副鸡禽杆菌单克隆抗体不能单一的针对B型菌株。
本发明解决的再一技术问题是现有技术中副鸡禽杆菌单克隆抗体效价较低。
本发明解决的又一技术问题是现有技术中副鸡禽杆菌单克隆抗体特异性不佳。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种鸡传染性鼻炎单克隆抗体制备方法，包括以下步骤：
1)取B型副鸡禽杆菌菌液作为抗原，与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射小鼠，再于2周后、4周后以相同方法各免疫1次，6周后以相同剂量抗原腹腔注射小鼠；
2)3天后，取上述小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞按5:1的细胞量比混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，混匀，在37℃水浴中45s内加入1mLPEG到融合管中，混匀，而后在90s内滴加30mL的DMEM培养基，37℃静止10min，而后1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基悬浮沉淀细胞，再加入腹腔巨噬细胞，置37℃5％CO2培养箱内培养；
3)利用间接ELISA检测的方法，对步骤2)上清液中的抗体进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞；
4)取小鼠，以0.5mL/只的剂量腹腔注射灭菌液体石蜡，1周后以1×106CFU/只的剂量对小鼠腹腔注射步骤3)得到的杂交瘤细胞，而后从小鼠腹腔采集腹水，离心取上清，即得到鸡传染性鼻炎单克隆抗体。
优选的，步骤1)所述的小鼠是6周龄BALB/c小鼠。
优选的，步骤2)中所述PEG的温度是37℃。
优选的，步骤2)中所述DMEM培养基的温度是37℃。
优选的，步骤2)中所述的DMEM培养基是不完全DMEM培养基。
优选的，步骤2)中置37℃5％CO2培养箱内培养5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基，10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基。
优选的，步骤3)中用免疫小鼠血清作为阳性对照，用非免疫小鼠血清作为阴性对照。
优选的，步骤3)筛选出抗体阳性杂交瘤细胞后，先制备其亚克隆细胞株，再利用所述亚克隆细胞株执行步骤4)。
优选的，步骤4)所述的小鼠是8周龄的BALB/c小鼠。
优选的，所述离心的操作条件是2500rpm离心10min。
本发明技术方案利用B型菌株制备出副鸡禽杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，其所分泌的抗体为只针对B型菌株，与A、C型副鸡禽杆菌均不发生反应，从而保证了该单抗能够专门针对B型血清型疾病。与此同时，本发明利用该株单克隆抗体的特性，建立ELISA方法和免疫胶体金的方法，其特异性和敏感性好。可用于临床检测。此外，本发明制备的单抗效价高、特异性较好，尤其适用于进一步制备B型副鸡禽杆菌抗原诊断试剂盒或B型副鸡禽杆菌抗原诊断胶体金试纸。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有突出的推广前景。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
1.1抗原的制备
取B型副鸡禽杆菌进行培养，以其培养液作为抗原。
1.2动物免疫
取适量的菌液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射6周龄BALB/c小鼠，每只0.2ml；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。
1.3融合
将加强免疫后3天的小鼠，眼眶采血作为阳性血清，颈脱臼将小鼠致死，无菌打开腹腔取出脾脏，用研磨棒挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。选择生长状态良好的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)和制备好的脾淋巴细胞按1:5混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37℃水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL37℃预热的无抗不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去作用，37℃静止10min，1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞；分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃5％CO2培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。
1.4杂交瘤细胞的筛选
通过间接ELISA检测的方法，对融合细胞上清液中的抗体进行检测。取经纯化并灭活后的抗原与碳酸盐缓冲液(pH9.0)按1:1000稀释。将此稀释液加入酶标反应板中，每孔100ul，置于4℃冰箱过夜或37℃温箱2小时。弃去液体用PBST洗液洗涤3次。拍干后每孔加入200ul封闭液，37℃温箱封闭2小时，弃去液体，用PBST洗液洗涤3次后拍干作为抗原包被板。
将融合细胞上清液加入抗原包被板中，37℃孵育1小时，同上用PBST洗液洗涤3遍；加入终浓度1:10000稀释的羊抗鼠HRP-IgG50μl/孔，37℃孵育1h，同上洗涤3遍；加入TMB显色液50μl/孔，37℃反应10-15min；加入2MH2SO450μl/孔终止反应。测定孔内的OD450。用免疫小鼠血清作为阳性对照，用非免疫小鼠血清作为阴性对照，同时设立空白对照孔。
1.5杂交瘤细胞的亚克隆
用有限稀释法将间接ELISA方法检测出的阳性杂交瘤细胞吹下，按1个细胞/孔、3个细胞/孔、10个细胞/孔加入到装有饲养细胞的96孔板中；37℃5％CO2培养箱培养7-10天，对出现单个细胞克隆孔的上清再用间接ELISA方法进行检测；连续进行3～4次亚克隆，至每个细胞孔上清均为阳性时可以定株。对得到的细胞株进行扩大培养和冻存。
1.6腹水的制备
取8周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只；一周后取处于对数生长期的、步骤1.5得到的株细胞，用PBS稀释后腹腔注射上述小鼠，1×106CFU/只；待小鼠腹部明显隆起时，用16号针头从腹腔采集腹水，2500rpm离心10min，去除脂肪组织，将上清取出，-70℃保存备用。
实施例2(实施例1所制备单抗的特性鉴定)
2.1单抗腹水效价的测定
采用间接ELISA的方法，将所制得腹水先按1:1000稀释，再按2倍倍比稀释，依次加入包被抗原的酶标孔内，其他步骤同前。结果本株单抗效价为1：6.4*104。
2.2单抗亚类的鉴定
按单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法进行。具体方法如下：酶标板内分别加入四种单抗腹水1:5000稀释100uL/孔，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入工作浓度羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA亚类血清100μL/孔，每株单抗加每种亚类两孔，37℃孵育30min，PBST洗涤3次，每次5min；加入1:1000稀释的兔抗羊辣根过氧化物酶结合物100uL/孔，37℃孵育15min，PBST洗涤3次，每次5min；加TMB显色液100μL/孔，37℃避光显色5-10min；用2MH2S04100uL/孔终止反应；在450nm波长下测定OD值。以OD值明显高于其他孔者所加亚类血清为单抗亚类。结果本单抗为IgG3。
2.3单抗的特异性鉴定
将B型副鸡禽杆菌、A型副鸡禽杆菌、C型副鸡禽杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌进行包被在96孔酶标板中按照实施例一中方法进行间接ELISA检测。结果如表1所示，表明纯化后的腹水只与B型副鸡禽杆菌反应，与其他菌株均不反应。
表1单抗与不同抗原特异性反应结果
表1中数值为ELISA实验OD值。
以上实施例中间接ELISA试验所需相关溶液配方如下：
洗涤液(PBST)：0.01MPBS(0.2gKH2PO4、0.2gKCl、2.92gNa2HPO4、8.0gNaCl)。加0.5mlTween-20加超纯水至1000ml。
封闭液：10％小牛血清PBS。
酶标抗体稀释液：4％小牛血清PBS。
显色液：进口TMB显色液。
终止液(2MH2SO4)：浓硫酸22.2ml、蒸馏水177.8ml。
实施例3(B型副鸡禽杆菌抗原诊断试剂盒的制备)
以实施例1制备的单抗作为原料，利用抗原检测试剂盒制备技术领域的公知技术制备得到B型副鸡禽杆菌抗原诊断试剂盒，该试剂盒诊断原理为ELISA法。
1.1特异性试验
用确立的ELISA方法，加样时分别加入相同菌数(109CFU/ml)的A型副鸡禽杆菌、
B型副鸡禽杆菌、C型副鸡禽杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌，同时设空白对照。结果如表2所示：
表2实施例1所制备单抗的特异性实验结果
1.2敏感性试验
将已计数好的B型副鸡禽杆菌，其浓度为109CFU/ml，连续10倍稀释，用所建立的ELISA方法测定，同时设阴性和空白对照，以确定最低检出量。结果如表3所示：
表3实施例1所制备单抗的敏感性实验结果
| 108 | 107 | 106 | 105 | 104 | 103 | 102 | 阴性对照 | |
| OD值 | 1.782 | 1.017 | 0.611 | 0.352 | 0.248 | 0.221 | 0.151 | 0.111 |
根据阳性判定依据为样品OD值/阴性对照值>2.1，最低检出浓度为104CFU/ml，由于每孔加样量为100ul，因此最低检测量可定为103CFU。
实施例4(B型副鸡禽杆菌抗原诊断胶体金试纸的制备)
以实施例1制备的单抗作为原料，利用抗原检测试纸制备技术领域的公知技术制备得到B型副鸡禽杆菌抗原诊断胶体金试纸，该试纸的诊断原理为胶体金法。
1.1免疫胶体金试纸的特异性检测
将A型副鸡禽杆菌、B型副鸡禽杆菌、C型副鸡禽杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌(均为108CFU/mL)每孔各60ul，同时设空白对照。结果表明只有B型副鸡禽杆菌试纸出现阳性标记。
1.2免疫胶体金试纸的敏感性检测
将已计数好的B型副鸡禽杆菌，其浓度为109CFU/ml，连续10倍稀释，用所建立的方法测定，同时设阴性和空白对照，以确定最低检出量。结果表明在105CFU/ml仍存在相应条带，但104CFU/ml已无任何印迹。由于每孔加样50ul，因此其最低检出量为5*103CFU。
实施例5(ELISA方法与胶体金方法和细菌分离法的比较)
来自不同鸡场的鸡传染性鼻炎疑似病例27例，且具有都使用过A型、C型疫苗仍发病、有较典型的病理特征如流泪、肿头等，无菌取病禽的鼻窦渗出物，放入加入青链霉素的1mLPBS中，用细菌分离法、双抗体夹心ELISA法和免疫胶体金试纸法进行检测。并将分离出的细菌进行血清型鉴定，结果表明其中有21例由B型副鸡禽杆菌引起；双抗夹心ELISA法检出22例为阳性，免疫胶体金法检出21例为阳性。结果见表4～6。
表4不同方法对致病菌血清型检测结果的比较
表5ELISA法和细菌分离检测结果的比较
表6免疫胶体金试纸法和细菌分离检测结果的比较
两个方法与传统方法的比较表明，ELISA法与细菌分离法的符合率为96。3％，免疫胶体金法与细菌分离法的符合率为92.6％。均适用于临床中，且细菌分离法的用时在48-72小时，而ELISA法的用时大约3小时，免疫胶体金法的平均用时仅为几分钟。以上结果表明，本发明所制备的单抗对B型副鸡禽杆菌具有良好的特异性和敏感性，在此基础上所制备的B型副鸡禽杆菌抗原诊断试剂盒、胶体金试纸准确灵敏，使用体验良好。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鸡传染性鼻炎单克隆抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取B型副鸡禽杆菌菌液作为抗原，与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射小鼠，再于2周后、4周后以相同方法各免疫1次，6周后以相同剂量抗原腹腔注射小鼠；
2)3天后，取上述小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞按5:1的细胞量比混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，混匀，在37℃水浴中45s内加入1mLPEG到融合管中，混匀，而后在90s内滴加30mL的DMEM培养基，37℃静止10min，而后1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基悬浮沉淀细胞，再加入腹腔巨噬细胞，置37℃5％CO2培养箱内培养；
3)利用间接ELISA检测的方法，对步骤2)上清液中的抗体进行检测，筛选出抗体阳性杂交瘤细胞；
4)取小鼠，以0.5mL/只的剂量腹腔注射灭菌液体石蜡，1周后以1×106CFU/只的剂量对小鼠腹腔注射步骤3)得到的杂交瘤细胞，而后从小鼠腹腔采集腹水，离心取上清，即得到鸡传染性鼻炎单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述的小鼠是6周龄BALB/c小鼠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述PEG的温度是37℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述DMEM培养基的温度是37℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的DMEM培养基是不完全DMEM培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中置37℃5％CO2培养箱内培养5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基，10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)中用免疫小鼠血清作为阳性对照，用非免疫小鼠血清作为阴性对照。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)筛选出抗体阳性杂交瘤细胞后，先制备其亚克隆细胞株，再利用所述亚克隆细胞株执行步骤4)。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)所述的小鼠是8周龄的BALB/c小鼠。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述离心的操作条件是2500rpm离心10min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151230 |